Archives of Virology 48, 191--194 (1975) © by Springer-Verlag 1975

Ein sensitives Gewebekultur-Antifen des Friihsommer=Meninfloenzephalitis-Virus zur Yerwendunfl im H~imaflflutinationshemmunfstest Von

F. HEINZ und CH. KuNz Institut ffir Virologic der Universit~t Wien, Osterreich Mit 2 Abbitdungen Angenommen am 27. M~rz 1975

Zusmnmenfassunfl Ein P E G gef~lltes Gewebekultur-Hiimagglutinin des Friihsommer-Meningoenzephalitis-(FSME)-Virus wurde mit einem durch Saccharose-Aceton-Extraktion aus infiziertem Babymansgehirn hergestellten Hgmagglutinin verglichen. I)as Gewebekultur-Antigen reagierte im Hgmagglutinationstest (HHT) vor allem IgMAntikSrpern gegenfiber empfindlicher und ist daher bei der Friihdiagnose der FSME dem Saccharose-Aceton-Antigen iiberlegen. Zur Diagnostik der FSME hat sieh der Naehweis yon IgM-Antik6rpern dureh eine Kombination des HI-IT mit dem 2-Mereapto~ithanol (2-MJi_)-Tesg ganz ausgezeiehneg bew/ihrg und ist daher heute die Meghode der Wahl ffir die Friiherkennung dieser Erkrankung (9). Als Antigen wird dabei iiblieherweise ein aus infiziertem Babymausgehirn dutch Saeeharose-Aeeton Extraktion gewonnenes H/imagglutinin verwendet (1). Da die Herstellung dieses Antigens jedoeh reeht aufwendig ist, versuehten wir, ein mSgliehst sensitives und hoehtiteriges Antigen fiir den HI-IT aus Gewebekultur zu gewinnen. Hiihnerembryonalzellen (HE-Zellen) wurden naeh einer Standardmethode dureh Trypsinieren yon 10--11 Tage Mten Embryonen hergestellt. Als Aussaatmedium verwendeten wit Medium 199 (Gibeo E-12) mit 10% KS, das Erhaltungsmedium enthielt kein Serum. Sowohl 180 ml Vierkantflasehen (1 ml Inoeulum/10 ml Medium) Ms aueh 1,6 1 Rollerflasehen (Belleo) (5 ml Inoeulum/150 ml Medium) wurden als KulturgefgBe verwendet. Die Adsorptionszeit betrug 1 Stunde, Inkubationstemperatur war 37 ° C. Erste Versuehe zeigten, dab bei Verwendnng eines serumfreien ErhMtungsmediums und nentralem p H die I.iA-Titer aueh bei hohen Inoculumsdosen kaum 1:32 iiberstiegen. Dutch Zugabe yon 2% KS wurde zwar die Ausbeute an infekti6sere Virus yon t07, o MICLDso/0,02 ml auf 107,5 MICLDso/0,02 ml erh6ht, racist

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F. HEt~Z und Cm Ku~z:

war jedoch auf Grund im Serum enthaltener unspezifischer Inhibitoren k e n Hgmagglutinin mehr nachweisbar. DARWIStI und HA~rMO~ (2) konnten hochtiteriges JBE-Virus-Hgmagglutinin aus Gewebekultur dutch nine Methode gewinnen, welehe sowohl der pH-Empfindlichkeit des Togavirus-It/~magglutinins (4, 5, 10) als auch im Serum enthaltenen unspezifischen Inhibitoren Reehnung tr/~gt. Es wird dabei in der 1. Phase der Virusvermehrung ein Medium mit min.destens 2% KS verwendet, welches beim ersten Auftreten nines CPE dutch ein serumfreies Medium ersetzt wird. Beste Ausbenten wurden bei p i t 8,0 erreieht. Wit versuchten, diese Methode fflr das System FS~[E~Virus HE-Zellen anzuwenden. Die Bildtmg yon H/imagglutinin und infektiSsem Virus war jedoeh nieht mit dem gleichzeitigen Auftreten yon cytopathischen Vergnderungen der Zellen verbunden, sondern erfolgte wie auch in anderen Zellsystemen (8) etwas friiher. Der Mediumwechsel wurde daher nicht win beim JBEVirus bei beginnendem CPE, sondern zu einem friiheren, experimentell als optimal bestimmten Zeitpunkt durehgefiihrt. Win zu erwarten, war dieser Zeitpunkt yon der Viruskonzentration im Inoculum abh~ngig (z. B. 107,5 MICLDs0/0,02 ml - - 2i Stunden p. i. ; 10s,s MICLDs0/0,02 ml - - 16 Stunden p.i.). Nach dem Mediumwechsel stiegen sowohl HA-Titer als auch der Titer des infekti6sen Virus sehr rasch an und erreiehten nach weiteren 6 bis 8 Stunden Inkubationszeit ihr Maximum: 256--51.2 HA-Einheiten/0,2 ml nnd 107,°--107,5 MICLD50/0,02 ml. Das so erhaltene Antigen. wurde dutch F//llung mit PEG6000 (3, 6, 7) konzentriert sowie gereinigt nnd d~nn im I-IHT mit dem Saecharose-Aeeton (SA)-Antigen vergliehen. Tabelle ] zeigt die Ergebnisse nines Tests, in dem 23 Seren jeweils v o r u n d naeh 2-MX-Behandlung mit beiden Antigenen gepriift wurdea. Nit dem Gewebekultur(GK)-Antigen wurden dabei fast durchwegs hShere AK-Titer erreicht als mit dem SA-Antigen (Unterschied bis zu 3 Titerstufen). Bei den Seren 1--18 konnte mit beiden Antigenen nine frisehe Infektion mit dem FSME-Virus verifiziert werden (Titerabfall yon mindestens 2 Stufen nach 2-MX-Behandlung). Die Titerunterschiede jedoch waren vor 2-MA-Behandlung deutlich grSBer als naehher (Tab. 1), was auf nine grSBere Sensitivit/~t des GK-Antigens, vor allem IgM-Antik6rpern gegeniiber, hinweist. Daftir sprieht auch, d~l~ in 5 Fgllen (Serum 19--23) mit dem GK-Antigen, nicht abet mit dem SA-Antigen noch nine frische Infektion nachgewiesen werden konnte. Auch nach Auftrennung charakteristiseher Seren dutch Sephudex G-200 Chromatographic zeigten vor allem die IgM-haltigen Fraktionen mit dem GK-Antigen hShere Titer als mit dem SA-Antigen. Sedimentation in vorgeformten, linearen (5--30%) Saeeharose-Gradienten zeigte, dal3 das PEG-gef//llte H//magglutinin hauptsgehlich aus dem infekti6sen Virus besteht und daneben einen kleinen Anteil eines Iangsam sedimentierenden, nicht infekti6sen H/~magglutinins enth/~lt (Abb. 1). J~hnlich langsam sedimentierende H/~magglutinine wurden aueh fiir andere Viren der serologisehen Gruppe B der Togaviren besehrieben (3, 12). Ermittlung der S-Werte mit Hilfe der Tabellen yon MeEwEN (I l) ergab fiir das infekti6se GK-Virus einen }Iittelwert yon 220S (ST~OgSIAIE~ 1965:217S) und ungef/ihr 1008 fiir das langsam sedimentierende Hgmagglutinin, w/H~rend das SA-Antigen einen reeht breiten Raum zwisehen etwa 95 und 145 S einnahm. Unter-

G e w e b e k u l ~ u r - A n t i g e n des F S M E - V i r u s

193

Tabelle 1. Vergleichende Untersuchung des GK-Antigens und SA-Antigens im H H T vor

und naeh Behandlung der Testseren mit 2-Mercaptogithanol Vor 2-MA-Behandlung

Nach 2-MA-Behandlung

Ser.Nr.

SA-AG

GK-AG

Titer untersehied

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

320 a 80 320 40 160 320 40 320 160 160 160 640 640 40 160 160 160 320

1280 160 640 160 640 1280 80 1280 640 320 640 1280 1280 320 1280 320 1280 640

2b 1 1 2 2 2 t 2 2 1 2 1 1 3 3 1 3 1

40 20 10 10 20 40 10 20 10 10 10 10 80 10 20 20 20 10

80 40 20 10 20 80 10 20 40 20 20 10 80 20 20 10 40 20

1 1 1 0 0 1 1 0 2 1 1 0 0 1 0 --1 1 i

19 20 21 22 23

20 20 20 40 10

2 3 2 2 2

20 10 10 20 10

20 10 20 40 10

0 0 1 t 0

80 160 80 160 40

SA-AG

GK-AG

Titeruntersehied

I{eziproker W e r t der Ax~tik6rper-Titer i m H H T . A n z a h l der T i t e r s t u f e n Differenz z w i s e h e n d e m m i t d e m G K - A n t i g e n bzw. SAAntigen erhaltenen Antik6rpertiter.

/ 2s6f ,

95S ~"

145S

1,17 4.

220S

~"

~,

256

1,20

/

i

1,25~ 1,20"~'~

~ I

1,15

e.

J-1,10 ~ 128

,2j, 2 'S i ~6r-:LJ

I

6~ 32 16

,"~_.~%

5

10

........

15

20

F r a k t i o n Nr,

A b b , 1. S e d i m e n t a t i o n y o n O K - A n t i g e n (o--®) u n d S A - A n t i g e n (. . . . . . ) in linearen Saecharose-Gradienten ( 5 - - 3 0 % Saceharose in B o r a t - P u f f e r p i t 9,0) bei 30.000 U . p , M . / 7 5 M i n u t e n / 2 0 ° C in N43127-111 (6× 14 m l Ti) M S E - 6 5 R o t o r

5

10

15 20 Fraktion Nr.

A b b . 2. D i c h t e b e s t i m m u n g v o n G K - A n t i gen (o .) u n d S A - A n t i g e n ( . - - - . ) d u r e h G l e i e h g e w i e h t s - G r a d i e n t e n z e n t r i f ug a t i o n in v o r g e f o r m t e n S a e e h a r o s e - G r a d i e n t e n . [20,,-55% Saecharose in B o r a t P u f f e r pI-I 9,0, 30,000 U. p. M./4 ° C/24 S t u n d e n i n n 59589 (3 × 5,5 mlA1) M S E - 65 R o t o r ]

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F. H E ~ z u n d Cm K u ~ z : Gewebekultur-Antigen des FSME-Virus

schiedliches Verhalten zeigten die beiden A n t i g e n e auch n a c h Gleiehgewichtszentrifugation in Saccharose- oder K a l i u m t a r t r a t - G r a d i e n t e n (Abb. 2). Das GKH g m a g g t u t i n i n befand sieh n a e h einer Z e n t r i f u g a t i o n s d a u e r y o n 24 oder 48 S t u n den/75.000 × g i n einem einzigen scharfen Peal: bei einer Dichte y o n 1,20 w g h r e n d das SA-Antigen wiederurn sehr uneinheitlich erschien u n d D i c h t e n zwisehen 1,17 u n d 1,20 aufwies. M6glieherweise ist die I n t a k t h e i t u n d relative R e i n h e i t des PEG-gefgllten GK-Virus ftir die gr6ftere Sensitivit/it im Vergleich z u m S A - A n t i g e n v e r a n t w o r t lich. Vor Mlem die Tatsaehe, daft der Naehweis y o n I g M - A n t i k 6 r p e r n d u r e h das G K - A n t i g e n erleichtert wird, scheint es besonders fiir die Friihdiagnose der F S M E geeignet zu maehen,

Literatur 1. CLARKE,D. A., CASALS,J. : Techniques for hemagglutination and hemagglutination inhibition with Arthropode-borne viruses. Amer. J. trop. Med. Hyg. 7, 561--573 (1958). 2. DAt~WISI%M. A., H A ~ O ~ , ~V. McD. : A high titered hemagglutinin in tissue culture prepared from Japanese B encephalitis virus. Prec. See. exp. Biol. Med. 122, 809--813 (1966). 3. DELLA-PoI~A, A . J . , WES~AWAY, E . G . : Rapid preparation of hemagglutinins of Togaviruses from infected cell culture fluids. Appl. Microbiol. 23, 158---160 (1972). 4. F~ISOI~-NmoE~EYER, W.: Inaktivierung der H/imagglutinationsf/ihigkeit des Frfihsommer-Meningoenzephalitis (Tick-Borne Encephalitis)-Virus. Arch. ges. Virusforsch. 18, 163--171 (1966). 5. GIcEsn~ovn, M., VAe'XXLKOVA.: Influence of pH, heat, deoxycholate and ether on Arbovirus hemagglutinin. Acta virol. 15, 143--147 (1971). 6. IOAI~ASHI,A., FIrI~IrOKA, T., SASAO, F., SIn~I~AI~V% S., FVKAI, K.: Purification of Japanese encephalitis virus grown in B H K 2 1 and Singh's Aedes Albopietus cells by polyethylene glycol precipitation. Biken J. 16, 67--73 (1973). 7. I~'GLOT, A. D., C~IV~)ZlO,T., ALBIN, M. : AnaIysis of Sindbis virus and its soluble antigens in preparations concentrated b y precipitation with polyethylene glycol or ammonium sulfate. Aeta virol. 17, 4t6--425 (1973). 8. KA~POWClL L. G., Izo~ov, V. K. : Study of hemagglutinating properties of viruses of the Tick-borne encephalitis complex propagated in various cell cultures. Aeta virol. 8, 376--377 (1964). 9. KuNz, CH., HOF~i'AJrN,H. : Die Frfihdiagnose der Fr/ihsommer-Meningoenzephalitis (FSME) im H/~magglutinationshemmtest dutch Behandlung des Serums mit 2-Mercaptogthanol. Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 2i8, 273--279 (1971). t0. MAYER, V., SL-~VIK,I. : Thermostabilization of the Tick-borne encephalitis virus. Virology 29, 492--493 (1966). 11. lVIeEwEN, C. I%. : Tables for estimating sedimentation through linear concentration gradients of sucrose solution. Anal. Biochem. 29, 114--14:9 (1967). 12, STINSKI,iV[. F., GRIJBE~g,J. : Distribution of Arbovirus antigens in density gradients. Prec. Soc. exp. Biol. Med. 136, 1340--1346 (1970). 13. S~OHlm~Eg, K., STRE~SSZE, G., CLEMJi DE NO]~ONKn, S. : Zur GrJt3enbestimmung des Virus der Frfihsommer-Meningoenzephalitis. Arch. ges. Virusforsch. 17, 300 bis 303 (1965). Anschrift der Verfasser: Mag. pharm. Y. Heinz und :Prof. Dr. Ch. Kunz, I n s t i t u t ffir Virologic der Universit/~t Wien, Kinderspitalgasse 15, A-1095 Wien, 0sterreich. Eingegangen am 27. November 1974: Herausgeber, Eigenttlmerund ¥erleger: Springer-Verlag,~I6tkerbastei5. A-t011 Wien.Ftir den Textteil verantwortlich: Dr. Wilhelm Sehwabl, l~fJIkerbastei5, A-1011 Wien. Fiir den Anzeigenteilverantwortlich: Bruno Sehweder, ?¢161kerbastei 5, A-1011Wien.Druck: ]?~.Spies & Co., Straugengasse16, A-1050Wien. Printed in Austria.