716
深 在 性 カ ンジ タ症 の マ ウス感 染 モデ ル にお け る血 中抗 原 の検 出 長崎大学第2内科 光武耕太郎
河野
茂
松田
治子
吉富
祐子
宮嫡
義継
東山
康仁
田中
研一
岩本
雅典
前崎
繁文
賀来
満夫
古賀
宏延
原
耕平
agglutination
test,
Key
words:
(平成4年1月13日
受 付)
(平 成4年1月23日
受 理)
candidiasis, mannan,
要 マ ウ ス感 染 モ デ ル を 用 い て,深
latex
Cand-Tec(R)
旨
在 性 カ ン ジ ダ 症 に お け る 血 中 カ ン ジ ダ 抗 原 の 検 出 をCand-Tec(R)お
び マ ン ナ ン抗 原 検 出 用 ラ テ ッ ク ス 凝 集 テ ス トに よ り検 討 し た.Candida 製 し た マ ウ ス播 種 性 カ ン ジ ダ症 に お い て,感 感 染2∼3日
染2時
間 後 に は,マ
albicansの
ン ナ ン抗 原 は 全 例 で 陽 性 と な った が,
後 に は 臓 器 内 菌 数 の 減 少 に 伴 い 陽 性 率 は 一 時 低 下 し(29%),4日
な っ た.一 方,Cand-Tec(R)で
は マ ウ ス血 清 は す べ て 陽 性 を 示 した た め,2倍
後 よ り再 び 全 例 陽 性 と 希釈 以上 で凝 集 した場 合 を
陽 性 と し た と こ ろ,抗 原 の検 出 率 は マ ン ナ ン 抗 原 の 検 出 法 に 比 べ 低 率 で あ っ た(12時 で10%,6日
目で25%).ま
投 与 した マ ウス で は,糞
た,C.albicansを
間 で50%,24時
間
経 口的 に 接 種 し,消 化 管 内 に定 着 さ ぜ た 後,免 疫 抑 制 剤 を
便 中 の カ ン ジ ダ の 増 加 に 伴 い血 中 の マ ン ナ ン抗 原 が 陽 性 と な り,や や 遅 れ て 血
液 か ら も カ ン ジ ダ が 分 離 さ れ,Cand-Tec(R)も 体 成 分 で は 凝 集 を 示 さ ず,宿
序
よ
尾 静 脈 接 種 に よ り作
陽 性 と な っ た.な お,Cand-Tec(R)は
培 養 菌 液 や 破 砕 した 菌
主 に よ り修 飾 さ れ た 抗 原 を 検 出 して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た.
文
症 モ デ ル を 用 い て,経
深 在 性 真 菌 症 は 増 加 傾 向 に あ り,特 に カ ン ジ ダ
ト(LA)に
時 的 に ラ テ ッ ク ス凝 集 テ ス
よ る 抗 原 検 出 お よ び 各 臓 器(心
臓,肝
症 の 占 め る 割 合 は 高 く,臨 床 上 問 題 と な って い
臓,腎
る1).深 在 性 カ ン ジ ダ症 の 主 た る原 因 真 菌 で あ る
二 種 の カ ン ジ ダ抗 原 検 出法 の 有 用 性 を 比 較 検 討 し
Candida
た の で 報 告 す る.
albicansは
口腔 や 消 化 管 な ど に 常 在 し
臓,脾
臓)に
て お り,本 来 無 菌 的 で な い検 体 か らの 本 菌 の分 離
材 料 と方 法
は,必 ず し も感 染 症 を意 味 し な い.こ の よ うに 定 着 と感 染 の鑑 別 な ど,臨 床 診 断 は 困難 で あ る が, 補 助 診 断 法 と して 種 々 の血 清 学 的 検 査 法 が 開 発 さ
お け る 生 菌 数 の 測 定 を 行 い,
1.
マ ウ ス播 種 性 カ ン ジ ダ症 に お け る抗 原 の 検
出 サ ブ ロ ー 寒 天 培 地 に て30℃,48時
れ2),抗 原 の 経 時 的 な変 化 に よ っ て 治 療 効 果 や 予
Candida
後 の 判 定 に利 用 で き る こ と も示 唆 され た3).し か
1.5×107CFU/mlに
し,深 在 性 カ ン ジ ダ症 に お い て抗 原 が 血 中 に認 め
(各1群10匹)に
られ るの は一 過 性 で あ り,そ の検 出 は し ぼ しば 困
性 カ ン ジ ダ 症 を 作 製 し た.静
難 と さ れ る4).今 回 我 々は 実 験 的 マ ウ ス カ ン ジ ダ
び1,2,3,4,5,6,7日
別 刷 請 求先(〒852)長
原
耕平
を減菌 生 食 水 にて
調 整 し,BALB/c5週 尾 静 脈 よ り0.1mlを
て 得 た 血 清 を56℃
崎 市坂 本 町7-1
長 崎 大学 医 学 部 第2内 科
albicansIFM4009株
間培 養 した
分 間 煮 沸 し た 後,抗
齢 の雄 静 注 し,播
注 後2,12時
種
間お よ
目 に脱 血 屠 殺 し で15分 間 プ ロ ナ ー ぜ処 理 し,5 マ ン ナ ン ポ リク ロナ ール 抗 体 感 染 症 学 雑誌
第66巻
第6号
マ ウ ス カン ジ ダ症 モ デル に お け る血 中抗 原 で 被 覆 し た マ ン ナ ン ラ テ ッ ク ス 凝 集 テ ス ト(極 製 薬 よ り分 与,Lot (Ramco.Lab社 た.マ
東
C.albicans
用 い カ ンジ ダ抗 原 を測 定 し
ウ ス 血 清 と試 薬 を1:1の
た 凝 集 を 観 察 し た.陽
カ ン ジ ダ菌 体 お よ び 上 清 に お け る ラ テ ック
ス凝集反応
No.004)と,Cand-Tec(R)
製)を
3.
717
割 合 で 反 応 させ
性 を 示 した もの は段 階 希 釈
IFM40009株
trose brothに m1に
をSabouraud
て37℃,24時
dex-
間 培 養 後,1×107CFU/
調 整 し,10倍 段 階 希 釈 し た 菌 液,お
よ び3,000
を 行 い,凝 集 を 示 す 最 大 希 釈 倍 数 を 抗 原 価 と した.
rpmで5分
ま た24,72時
ン ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 お よ びCand-Tec(R)に
器(心
間 後,4,5日
臓,肝
臓,腎
目に 血 液 培 養 と各 臓
臓,脾
の 生 菌 数 を 測 定 し た.対 neoformans
YC-11株
臓)に
TIMM1335株,4.0×106を 種 後5な
2.カ
bicansを
を1.7×107,Aspergillus
注 入 し,接
尾静脈 よ り
い し7日
カ ン ジ ダ 抗 原 の 検 出 を 試 み た.同
ンナ よる
時 に減 菌 チ ュ ー
ブ に 減 菌 生 食 水 と ガ ラ ス ビ ー ズ を 入 れ,Cal-
照 と し てCryptococcus
fumigatus
に お い て,上
お けるカ ンジダ
間 遠 沈 後 の 培 養 上 清 を 用 い て,マ
目の 感 染 マ ウス 血 清
加 え た 後 約10分
間 強 く撹 拝 し,カ
応 を 観 察 し た. 成
記 ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 を 行 っ た. 1.
ン ジ ダ経 口感 染 マ ウス に お け る抗 原 の 検
出
ンジダ
の 破 砕 を 顕 微 鏡 で 確 認 した 検 体 に つ い て も凝 集 反
績
マ ウス 播 種 性 カ ン ジ ダ 症 に お け る カ ン ジ ダ
抗原検 出 BALB/c5週
齢 の 雄 に あ ら か じ め ク ロ ラ ム
フ ェ ニ コ ー ル5mgを1回,ゲ mgを3日
ン タ マ イ シ ン1日1
間 経 口 投 与 後,Candida
IFM40009株1×106CFU/mlを 的 に 接 種 し た 後,4週 マ イ ド2mgを
週1回2週
albicans 間経 口
目 よ りサ イ ク ロ フ ォ ス フ ァ
週3回1週
Cand-Tec(R):希
釈 し な い血 清 で は す べ て 疑 陽
性 を 示 し た た め,2倍
間 腹 腔 内 投 与 し,免 疫 抑
希 釈 以 上 を 陽 性 と し た.カ
ン ジ ダ 静 注 に よ る播 種 性 カ ン ジ ダ症 に お げ る抗 原 検 出 率 をTable1に 染12時
間 後10匹
示 した.Cand-Tec(R)で 中5匹(50%)に
は,感
陽 性 を 認 め た が,
感 染24時
間 後 で は 陽 性 を 示 し た も の は わ ず か1匹
制 マ ウ ス に お け る カ ン ジ ダ感 染 モ デ ル を 作 製 し
(10%)で
あ っ た.そ
た.ま た ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル5mg,ゲ
陽 性 を し め し た も の で は な く,感
ソ1mgを
実 験 経 過 中5週
投 与 し た.血
ンタマイシ
間 そ れ ぞ れ 隔 日 に経 口
中抗 原 の 検 出 は マ ン ナ ン ラテ ック ス
凝 集 テ ス トお よ びCand-TeC(R)に
便培
2日
目に再 び
陽 性 と な っ た.マ
ンナ ンラ
陽 性 を 示 し た が,Cand-Tec(R)と
目,3日
Table
1
murine
Candida candidiasis
antigen infected
detection
by
by intravenous
latex
中7匹 同様 に
目 で は 陽 性 率 が 一 時 低 下 し,4日
agglutination
inoculation
目ま で は
染6日
よ り 再 び 全 て の マ ウ ス で 陽 性 と な っ た.同
養 を 同 時 に 施 行 し た.
平 成4年6月20日
間 か ら5日
テ ッ ク ス 凝 集 反 応 は 感 染 直 後 よ り7匹 (100%)で
て 測 定 し た.ま
た 血 液 培 養 と と も に 代 謝 ケ ー ジ を 用 い て,糞
8匹 中2匹(25%)で
の 後48時
tests
in
目
時 に測
光武耕太郎 他
718
Fig.
1
The
organs
number
Kindney
(■-■),
Liver
of
C.
(•›-•›),
albicans Spleen
in
Table
various
(0-0),
2
murine
Heart
Mycological candidiasis
and
serological
infected
tests
in
by oral inoculation
(▲-▲).
目で20%(1/5)が
陽 性 とな った.抗 原 検 出 率 は,
マ ンナ ン ラ テ ック ス凝 集 反 応 で は,3週 4週 目お よ び5週
目で40%(2/5)の
目で60%,
陽 性 率 を示 し
た. 3. カ ン ジ ダ菌 体 お よ び培 養 上 清 に お け る凝 集 反応 定 し た 各 臓 器 の 生 菌 数 に つ い てFig.1に
示 し た.
菌 数 は 感 染 初 期 に は 脾 臓 で 最 も 多 く,12時 は3.3×106CFU/g(2.6×105/脾)で,つ
い で 腎臓
に4.7×105CFU/g(7.4×104/腎)と 感 染3日 た.し
多 く認 め ら れ,
後 まで はすべ ての臓 器 で 菌 数 は減 少 し か し,4日
目 よ り増 加 傾 向 を 示 し,腎
は2.4×107CFU/g(5.1×106/腎),脾
で 陽 性 で あ っ た が,72時
目,7日
中
中1匹
ま た 病 理 学 的 に は,カ
目で は 各 々
目 でPAS
た破砕 した菌体 に対 して も
Cand-Tec(R)は 凝 集 を示 さ な か った.
こ とは 少 な く,ま た 従 来 の血 液 培 養 で は 検 出率 が
の た め 補 助 診 断法 と して,代 謝 産 物
や 抗 原 検 出 な ど血 清 学 的 検 査 法 が 試 み られ,中
目で も 腎 臓,特
に 腎孟 に炎 症
も ラテ ック ス凝 集 反 応 は簡 便 な 方 法 と して,臨 床
臓 と脾 臓
色 に て 菌 糸 は ほ とん ど見 られ な か っ
ご と く カ ン ジ ダ の 経 口 接 種 後,糞
中 の カ ン ジ ダ 菌 数 は,2週 目 で1.5×104CFU/9で
か ら は 培 養 さ れ な か っ た.し
今 回,我 々 は2種 の ラテ ック ス凝 集 法 を用 い て, マ ウ ス カ ン ジ ダ症 に お け る カ ン ジ ダ抗 原 の 検 出率 製 のCand-Tec(R)で
は,易 熱 性 の 糖 蛋 白抗 原 を 検 出 す る と され て い る 便
目 で3.4×103CFU/g, あ っ た が,血 液 や 臓 器 か し,サ
で
的 に も有 用 な方 法 と考 え られ る.
の 比 較 を 行 った.Ramco社 経 口接 種 に よ る マ ウス カ ン ジ ダ 症
Table2の
察
カ ン ジ ダ は 口腔 や 消 化 管 等 の 常 在 菌 で あ り,深
とが多 い.そ
た.
3週
認 め な か った.ま
カ ン ジ ダ の増
で は臓 器 培 養 で は 多 数 の カ ンジ ダが 分 離 され た も
2.
Tec(R)は 培 養 上 清 お よ び 菌 液 の い ず れ に も凝 集 を
に 皮 質)に
細 胞 を 伴 う多 数 の 菌 糸 が 認 め ら れ た.肝
の の,PAS染
に な る と凝 集 が 認 め られ た.そ れ に対 して,Cand-
低 い た め5)6),治療 に 結 びつ く早 期 診 断 は 困 難 な こ
ン ジ ダ 静 注2日
染 色 に て 心 臓 や 腎 臓(特
上
在 性 カ ン ジ ダ症 で は,特 徴 的 な 臨 床 症 状 を 呈 す る
の み 陽 性 で あ っ た.
殖 が 認 め ら れ,7日
ン ナ ン ラテ ック ス凝 集 反 応 が培 養 上 清 で 強
い凝 集 を示 し,菌 液 で は 菌 量 が1.0×104/ml以
考
間 後 で は,6匹 間 で は5匹
陽 性 率 は 低 下 し,4日
4匹 中1匹
培 養 上 清 や 菌 液 に お け る カ ン ジ ダ抗 原 の検 出 で は,マ
増 加 し た.
血 液 培 養 は カ ン ジ ダ 静 注24時
(20%)と
臓 で
臓 で は3.9×
106CFU/g(2.5×105/腎)と
4匹
間後 に
イ クロフ ォ
が,マ
ウス に お け る播 種 性 カ ンジ ダ症 で は,カ
ジ ダ接 種 後,臓
ン
器 内菌 数 とほ ぼ相 関 し て血 中 カ ン
ジ ダ抗 原 は 増 減 す る もの の,マ
ンナ ン抗 原 を 検 出
す る マ ン ナ ン ラ テ ッ ク ス凝 集 反 応(極 東)に 比 べ,
ス フ ァ マ イ ド投 与 後 の 糞 便 中 カ ン ジ ダ 菌 数 は ,4
や や 低 い 検 出 率 で あ った.Gentryら
週 目で1.4×106CFU/9,5週
Cand-Tec(R)を 用 い た 臨 床 的 検 討 で は,血 液 培 養 で
と な り,血
液 培 養 で も4週
目 で8.9×105CFU/9 目 で40%(2/5),5週
に よる
カ ン ジ ダ が 分 離 さ れ た 患 者 は高 い 陽 性 率(91%) 感 染 症 学 雑誌
第66巻
第6号
719
マ ウス カ ン ジダ症 モデ ル に お け る血 中抗 原
を 示 し た が7),Baileyら
の 報 告 で は28%8),
Lewieuxの
陽 性 率 は 低 く9),Ness
報 告 で は44%と
やPillipsら
2) Kohno, S.: Serological diagnosis of deep seated mycosis. Asian Med. J., 34 : 460-466, 1991. 3)
も 感 度 や 特 異 性 に 問 題 が 多 く,臨 床 応
前 崎 繁 文, 山 秀 徳,
河野
堀
茂,
博 之,
山田
洋,
賀 来 満 夫,
光 武 耕 太 郎,
古 賀 宏 延,
用 に は 大 き い 疑 問 が あ る と 述 べ て い る10)11).
平,
Greenfieldの
る 抗 原 検 出 法 と し て の 血 清 診 断 法 の 検 討.
ラ ッ トを 用 い た 実 験12)で は,23匹
全 て に 陰 性 で あ り,宮
崎 らの 家 兎 の実 験 で も検 出
率 は 低 く13),そ の 理 由 と し て,種 の,あ
中
の違 い に よ る も
る い は 宿 主 が カ ン ジ ダ 抗 原 をprocessし
neoantigenを
た
検 出 して い る の で は な い か と推 定
さ れ て い る.我
々 の 今 回 の 実 験 で も,カ
養 上 清 や 菌 液,破 め な か っ た.ま
ン ジ ダ培
砕 した 菌 体 い ず れ で も凝 集 を認
た,Gentryが
ウサ ギ に 抗 体 を 作 成
す るた め に用 い た 熱 処 理 した 抗 原 菌 液 そ の も の に
誌,
瀬 戸 牧 子,
65:
豆 谷 源 一 郎:
1091-1096,
原
杉 耕
カン ジ ダ血症 に お け 感染症
1991.
4) Kappe, R. & Muller,J.: Rapid clearance of Candida albicans mannan antigens by liver and spleen in contrast to prolonged circulation of Cryptococcus neoformans antigens. J. Clin. Microbiol., 29 : 1665-1669, 1991. 5) Francoise, M.C., Timothy, E.K. & Donald, A. : Fungemia in the immunocompromised host. Am. J. Med., 71: 363-370, 1981. 6) 安 岡 彰, 河 野 茂, 前 崎 繁 文, 山 田 洋, 笹 山 一 夫 , 宮 崎 幸 重, 賀 来 満 夫, 古 賀 宏 延, 原 耕 平:
対 し て も 凝 集 し な か った こ と は 興 味 深 く思 わ れ
Lysis
た.そ
出 に お け る 基 礎 的 な ら び に 臨 床 的 検 討. 感 染 症 誌,
れ に 対 し て,マ
ンナ ン ラ テ ック ス凝 集 反 応
65:
は カ ン ジ ダ細 胞 壁 の主 成 分 の ひ とつ で あ る マ ンナ ン を 検 出 す る 方 法 で,深
在 性 カ ン ジ ダ症 の 患 者 血
中 の マ ン ナ ン 抗 原 量 は0.5ng/ml以 ml以
下 や1,000ng/
上 な ど と報 告 さ れ て い る14)∼17).マ ン ナ ン 抗
原 は ク リ プ トコ ッ ク ス の 莢 膜 多 糖 抗 原 に 比 べ,ク リ ア ラ ン ス が 比 較 的 早 い た め4)18),検 出 感 度 に 加 え 検 体 が 採 取 さ れ た 時 期 や,そ
の基 礎 疾 患 お よび 重
症 度 が 検 出 率 に 大 き く 関 係 し て い る と考 え ら れ て い る.マ
ウ ス播 種 性 カ ン ジ ダ症 モ デ ル は致 死 的 実
験 モ デ ル で あ る が,カ
ン ジ ダ 接 種 後,臓
は 一 時 的 に 減 少 し,抗
原 検 出 率 も 一 時 低 下 し た.
器 内菌数
ま た ヒ トの カ ン ジ ダ 症 に よ り類 似 し た モ デ ル で あ る 経 口接 種 モ デ ル で は,糞
便 中 の カ ン ジ ダ菌 数 の
増 加 に 伴 い 血 中 の 抗 原 が 陽 性 と な っ て お り,消
化
管 粘 膜 か ら の カ ン ジ ダ の血 中 お よ び リンパ 管 へ の 侵 入 が 起 こ り,抗
原 血 清 が 見 ら れ た と推 定 さ れ,
経 時 的 な 検 体 の 採 取 や,頻
回な検査 が深在性真菌
症 の 抗 原 検 出 に お い て は重 要 で あ る こ とが 示 唆 さ れ た.ま た 同 じ壁 構 成 成 分 で あ る(1→3)-D-β-グ カ ン の 測 定 や,47kDa抗
ル
原 や 抗 体,D-arabinitol
な ど の 検 出 法 を 組 み 合 わ せ て い る こ と が,血
清診
断 の 信 頼 性 を さ ら に高 め るた め に 現 状 で は必 要 で あ る と考 え ら れ た. 文
献
1) 奥 平 雅 彦: OPPortunistic 理. 日病 会 誌, 74: 61-91,
平 成4年6月20日
1985.
infectionの 病
838-843,
よ る血 液 培 養 法 の 真 菌 検
1991.
7) Gentry, L.O., Wilkinson,I. D., Lea, A.S. & Price, M. E.: Latex agglutination test for detection of candida antigen in patient with disseminated disease. Eur. J. Clin. Microbiol., 2: 122-128, 1983. 8) Bailey, J. W., Sada, E., Brass, C. & Bennett, J. E.: Diagnosis of systemic candidiasis by latex agglutination for serum. J. Clin. Microbiol., 21: 749-752, 1985. 9) Lemieux, C., St-Germain, G., Vincelette, J., Kaufman, L. & Repentigny, L.: Collaborative evaluation antigen detection by a commercial latex agglutination test and enzyme immunoassay in the diagnosis of invasive candidiasis. J. Clin. Microbiol., 28: 249-253, 1990. 10) Ness, M. J., Vaughan, W. P. & Woods, G.L.: Candida antigen latex test for detection of invasive candidiasis in immunocompromised patients. J. Infect. Dis., 159: 495-502, 1989. 11) Phillips, P., Dowd, A., Jewesson, P., Radigan, G., Tweeddale, M.G., Clarke, A., Geere, I. & Kelly, M.: Nonvalue of antigen detection immunoassays for diagnosis of candidemia. J. Clin. Microbiol., 28: 2320-2326, 1990. 12) Greenfield, R. A., Troutt, D.L., Rickard, R. C. & Altmiller, D. H.: Comparison of antibody, antigen, and metabolite assays in rat models of systemic and gastrointestinal candidiasis. J. Clin. Microbiol., 26: 409-417, 1988. 13)
fungus
centrifugationに
宮 崎 幸 重, 洋,
河野
道 津 安 正,
茂,
安岡
山 口恵 三,
彰,
笹 山 一 夫,
廣 田 正 毅,
家 兎 カ ン ジ ダ 症 に お け るLimulus
原
山田 耕 平:
test,
D-
光武耕太郎 他
720
arabinitol測 染 症 誌,
定 及 びLatex凝
64: 474-478,
集 法 の 比 較 検 討. 感
1989.
14) Lew, M. A., Siber, G.R., Donahue, D.M. & Maiorca, F.: Enhanced detection with an enzyme linked immunosorbent assasy of candida mannan in antibody-containing serum after heat extraction. J. Infect. Dis., 145: 45 56, 1982. 15) Hopweed, V., Evans, E.G.V. & Carney, J. A.: A comparison of methods for the detection of candida antigens. Evaluation of a new latex reagent. J. Immunol. Methods, 80: 199-210, 1985. 16) Kahn, W. F. & Jones, J. M.: Latex agglutina-
Antigen
Detection
in the Murine
tion tests for detection of candida antigens in sera of patients with invasive candidiasis. J. Infect. Dis., 153 : 579-585, 1986. 17) de Repentigny, L., Marr, L.D., Keller, J. W., Kaufman, L. & Reiss, E.: Comparison of enzyme immunoassay and gas-liquid chromatography for the rapid diagnosis of invasive candidiasis in cancer patients. J. Clin. Microbiol., 21: 972-979, 1985. 18) Jones, J. M.: Kinetics of antibody responses to cell wall mannan and major cytoplasmic antigen of Candida albicans in rabbits and humans. J. Lab. Clin. Med., 96: 845-860, 1980.
Models
of Systemic
Candidiasis
Kotaro MITSUTAKE, Shigeru KOHNO, Haruko MATSUDA, Yuko YOSHITOMI Yoshitsugu MIYAZAKI, Yasuhito HIGASHIYAMA, Ken-ichi TANAKA, Masanori IWAMOTO, Shigefumi MAESAKI, Mitsuo KAKU, Second Department
,
Hironobu KOGA & Kohei HARA of Internal Medicine, School of Medicine, Nagasaki University
We compared two latex agglutination tests for serum candidal antigen in murine models of systemic infection and gastrointestinal colonization. In the intravascular-infection model , mannan detection test was positive at 2 hours after inoculation, but Cand-Tec was less sensitive than mannan detection test in this model. In the gastrointestinal colonization model followed by systemic infection in neutropenic mice , the mannan antigen test became positive after 3 weeks of colonization with increased number of Candida of the stool, and Cand-Tec became positive after 5 weeks in neutropenic mice .
感 染 症学 雑 誌
第66巻
第6号
深 在 性 カ ンジ タ症 の マ ウス感 染 モデ ル にお け る血 中抗 原 の検 出 長崎大学第2内科 光武耕太郎
河野
茂
松田
治子
吉富
祐子
宮嫡
義継
東山
康仁
田中
研一
岩本
雅典
前崎
繁文
賀来
満夫
古賀
宏延
原
耕平
agglutination
test,
Key
words:
(平成4年1月13日
受 付)
(平 成4年1月23日
受 理)
candidiasis, mannan,
要 マ ウ ス感 染 モ デ ル を 用 い て,深
latex
Cand-Tec(R)
旨
在 性 カ ン ジ ダ 症 に お け る 血 中 カ ン ジ ダ 抗 原 の 検 出 をCand-Tec(R)お
び マ ン ナ ン抗 原 検 出 用 ラ テ ッ ク ス 凝 集 テ ス トに よ り検 討 し た.Candida 製 し た マ ウ ス播 種 性 カ ン ジ ダ症 に お い て,感 感 染2∼3日
染2時
間 後 に は,マ
albicansの
ン ナ ン抗 原 は 全 例 で 陽 性 と な った が,
後 に は 臓 器 内 菌 数 の 減 少 に 伴 い 陽 性 率 は 一 時 低 下 し(29%),4日
な っ た.一 方,Cand-Tec(R)で
は マ ウ ス血 清 は す べ て 陽 性 を 示 した た め,2倍
後 よ り再 び 全 例 陽 性 と 希釈 以上 で凝 集 した場 合 を
陽 性 と し た と こ ろ,抗 原 の検 出 率 は マ ン ナ ン 抗 原 の 検 出 法 に 比 べ 低 率 で あ っ た(12時 で10%,6日
目で25%).ま
投 与 した マ ウス で は,糞
た,C.albicansを
間 で50%,24時
間
経 口的 に 接 種 し,消 化 管 内 に定 着 さ ぜ た 後,免 疫 抑 制 剤 を
便 中 の カ ン ジ ダ の 増 加 に 伴 い血 中 の マ ン ナ ン抗 原 が 陽 性 と な り,や や 遅 れ て 血
液 か ら も カ ン ジ ダ が 分 離 さ れ,Cand-Tec(R)も 体 成 分 で は 凝 集 を 示 さ ず,宿
序
よ
尾 静 脈 接 種 に よ り作
陽 性 と な っ た.な お,Cand-Tec(R)は
培 養 菌 液 や 破 砕 した 菌
主 に よ り修 飾 さ れ た 抗 原 を 検 出 して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た.
文
症 モ デ ル を 用 い て,経
深 在 性 真 菌 症 は 増 加 傾 向 に あ り,特 に カ ン ジ ダ
ト(LA)に
時 的 に ラ テ ッ ク ス凝 集 テ ス
よ る 抗 原 検 出 お よ び 各 臓 器(心
臓,肝
症 の 占 め る 割 合 は 高 く,臨 床 上 問 題 と な って い
臓,腎
る1).深 在 性 カ ン ジ ダ症 の 主 た る原 因 真 菌 で あ る
二 種 の カ ン ジ ダ抗 原 検 出法 の 有 用 性 を 比 較 検 討 し
Candida
た の で 報 告 す る.
albicansは
口腔 や 消 化 管 な ど に 常 在 し
臓,脾
臓)に
て お り,本 来 無 菌 的 で な い検 体 か らの 本 菌 の分 離
材 料 と方 法
は,必 ず し も感 染 症 を意 味 し な い.こ の よ うに 定 着 と感 染 の鑑 別 な ど,臨 床 診 断 は 困難 で あ る が, 補 助 診 断 法 と して 種 々 の血 清 学 的 検 査 法 が 開 発 さ
お け る 生 菌 数 の 測 定 を 行 い,
1.
マ ウ ス播 種 性 カ ン ジ ダ症 に お け る抗 原 の 検
出 サ ブ ロ ー 寒 天 培 地 に て30℃,48時
れ2),抗 原 の 経 時 的 な変 化 に よ っ て 治 療 効 果 や 予
Candida
後 の 判 定 に利 用 で き る こ と も示 唆 され た3).し か
1.5×107CFU/mlに
し,深 在 性 カ ン ジ ダ症 に お い て抗 原 が 血 中 に認 め
(各1群10匹)に
られ るの は一 過 性 で あ り,そ の検 出 は し ぼ しば 困
性 カ ン ジ ダ 症 を 作 製 し た.静
難 と さ れ る4).今 回 我 々は 実 験 的 マ ウ ス カ ン ジ ダ
び1,2,3,4,5,6,7日
別 刷 請 求先(〒852)長
原
耕平
を減菌 生 食 水 にて
調 整 し,BALB/c5週 尾 静 脈 よ り0.1mlを
て 得 た 血 清 を56℃
崎 市坂 本 町7-1
長 崎 大学 医 学 部 第2内 科
albicansIFM4009株
間培 養 した
分 間 煮 沸 し た 後,抗
齢 の雄 静 注 し,播
注 後2,12時
種
間お よ
目 に脱 血 屠 殺 し で15分 間 プ ロ ナ ー ぜ処 理 し,5 マ ン ナ ン ポ リク ロナ ール 抗 体 感 染 症 学 雑誌
第66巻
第6号
マ ウ ス カン ジ ダ症 モ デル に お け る血 中抗 原 で 被 覆 し た マ ン ナ ン ラ テ ッ ク ス 凝 集 テ ス ト(極 製 薬 よ り分 与,Lot (Ramco.Lab社 た.マ
東
C.albicans
用 い カ ンジ ダ抗 原 を測 定 し
ウ ス 血 清 と試 薬 を1:1の
た 凝 集 を 観 察 し た.陽
カ ン ジ ダ菌 体 お よ び 上 清 に お け る ラ テ ック
ス凝集反応
No.004)と,Cand-Tec(R)
製)を
3.
717
割 合 で 反 応 させ
性 を 示 した もの は段 階 希 釈
IFM40009株
trose brothに m1に
をSabouraud
て37℃,24時
dex-
間 培 養 後,1×107CFU/
調 整 し,10倍 段 階 希 釈 し た 菌 液,お
よ び3,000
を 行 い,凝 集 を 示 す 最 大 希 釈 倍 数 を 抗 原 価 と した.
rpmで5分
ま た24,72時
ン ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 お よ びCand-Tec(R)に
器(心
間 後,4,5日
臓,肝
臓,腎
目に 血 液 培 養 と各 臓
臓,脾
の 生 菌 数 を 測 定 し た.対 neoformans
YC-11株
臓)に
TIMM1335株,4.0×106を 種 後5な
2.カ
bicansを
を1.7×107,Aspergillus
注 入 し,接
尾静脈 よ り
い し7日
カ ン ジ ダ 抗 原 の 検 出 を 試 み た.同
ンナ よる
時 に減 菌 チ ュ ー
ブ に 減 菌 生 食 水 と ガ ラ ス ビ ー ズ を 入 れ,Cal-
照 と し てCryptococcus
fumigatus
に お い て,上
お けるカ ンジダ
間 遠 沈 後 の 培 養 上 清 を 用 い て,マ
目の 感 染 マ ウス 血 清
加 え た 後 約10分
間 強 く撹 拝 し,カ
応 を 観 察 し た. 成
記 ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 を 行 っ た. 1.
ン ジ ダ経 口感 染 マ ウス に お け る抗 原 の 検
出
ンジダ
の 破 砕 を 顕 微 鏡 で 確 認 した 検 体 に つ い て も凝 集 反
績
マ ウス 播 種 性 カ ン ジ ダ 症 に お け る カ ン ジ ダ
抗原検 出 BALB/c5週
齢 の 雄 に あ ら か じ め ク ロ ラ ム
フ ェ ニ コ ー ル5mgを1回,ゲ mgを3日
ン タ マ イ シ ン1日1
間 経 口 投 与 後,Candida
IFM40009株1×106CFU/mlを 的 に 接 種 し た 後,4週 マ イ ド2mgを
週1回2週
albicans 間経 口
目 よ りサ イ ク ロ フ ォ ス フ ァ
週3回1週
Cand-Tec(R):希
釈 し な い血 清 で は す べ て 疑 陽
性 を 示 し た た め,2倍
間 腹 腔 内 投 与 し,免 疫 抑
希 釈 以 上 を 陽 性 と し た.カ
ン ジ ダ 静 注 に よ る播 種 性 カ ン ジ ダ症 に お げ る抗 原 検 出 率 をTable1に 染12時
間 後10匹
示 した.Cand-Tec(R)で 中5匹(50%)に
は,感
陽 性 を 認 め た が,
感 染24時
間 後 で は 陽 性 を 示 し た も の は わ ず か1匹
制 マ ウ ス に お け る カ ン ジ ダ感 染 モ デ ル を 作 製 し
(10%)で
あ っ た.そ
た.ま た ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル5mg,ゲ
陽 性 を し め し た も の で は な く,感
ソ1mgを
実 験 経 過 中5週
投 与 し た.血
ンタマイシ
間 そ れ ぞ れ 隔 日 に経 口
中抗 原 の 検 出 は マ ン ナ ン ラテ ック ス
凝 集 テ ス トお よ びCand-TeC(R)に
便培
2日
目に再 び
陽 性 と な っ た.マ
ンナ ンラ
陽 性 を 示 し た が,Cand-Tec(R)と
目,3日
Table
1
murine
Candida candidiasis
antigen infected
detection
by
by intravenous
latex
中7匹 同様 に
目 で は 陽 性 率 が 一 時 低 下 し,4日
agglutination
inoculation
目ま で は
染6日
よ り 再 び 全 て の マ ウ ス で 陽 性 と な っ た.同
養 を 同 時 に 施 行 し た.
平 成4年6月20日
間 か ら5日
テ ッ ク ス 凝 集 反 応 は 感 染 直 後 よ り7匹 (100%)で
て 測 定 し た.ま
た 血 液 培 養 と と も に 代 謝 ケ ー ジ を 用 い て,糞
8匹 中2匹(25%)で
の 後48時
tests
in
目
時 に測
光武耕太郎 他
718
Fig.
1
The
organs
number
Kindney
(■-■),
Liver
of
C.
(•›-•›),
albicans Spleen
in
Table
various
(0-0),
2
murine
Heart
Mycological candidiasis
and
serological
infected
tests
in
by oral inoculation
(▲-▲).
目で20%(1/5)が
陽 性 とな った.抗 原 検 出 率 は,
マ ンナ ン ラ テ ック ス凝 集 反 応 で は,3週 4週 目お よ び5週
目で40%(2/5)の
目で60%,
陽 性 率 を示 し
た. 3. カ ン ジ ダ菌 体 お よ び培 養 上 清 に お け る凝 集 反応 定 し た 各 臓 器 の 生 菌 数 に つ い てFig.1に
示 し た.
菌 数 は 感 染 初 期 に は 脾 臓 で 最 も 多 く,12時 は3.3×106CFU/g(2.6×105/脾)で,つ
い で 腎臓
に4.7×105CFU/g(7.4×104/腎)と 感 染3日 た.し
多 く認 め ら れ,
後 まで はすべ ての臓 器 で 菌 数 は減 少 し か し,4日
目 よ り増 加 傾 向 を 示 し,腎
は2.4×107CFU/g(5.1×106/腎),脾
で 陽 性 で あ っ た が,72時
目,7日
中
中1匹
ま た 病 理 学 的 に は,カ
目で は 各 々
目 でPAS
た破砕 した菌体 に対 して も
Cand-Tec(R)は 凝 集 を示 さ な か った.
こ とは 少 な く,ま た 従 来 の血 液 培 養 で は 検 出率 が
の た め 補 助 診 断法 と して,代 謝 産 物
や 抗 原 検 出 な ど血 清 学 的 検 査 法 が 試 み られ,中
目で も 腎 臓,特
に 腎孟 に炎 症
も ラテ ック ス凝 集 反 応 は簡 便 な 方 法 と して,臨 床
臓 と脾 臓
色 に て 菌 糸 は ほ とん ど見 られ な か っ
ご と く カ ン ジ ダ の 経 口 接 種 後,糞
中 の カ ン ジ ダ 菌 数 は,2週 目 で1.5×104CFU/9で
か ら は 培 養 さ れ な か っ た.し
今 回,我 々 は2種 の ラテ ック ス凝 集 法 を用 い て, マ ウ ス カ ン ジ ダ症 に お け る カ ン ジ ダ抗 原 の 検 出率 製 のCand-Tec(R)で
は,易 熱 性 の 糖 蛋 白抗 原 を 検 出 す る と され て い る 便
目 で3.4×103CFU/g, あ っ た が,血 液 や 臓 器 か し,サ
で
的 に も有 用 な方 法 と考 え られ る.
の 比 較 を 行 った.Ramco社 経 口接 種 に よ る マ ウス カ ン ジ ダ 症
Table2の
察
カ ン ジ ダ は 口腔 や 消 化 管 等 の 常 在 菌 で あ り,深
とが多 い.そ
た.
3週
認 め な か った.ま
カ ン ジ ダ の増
で は臓 器 培 養 で は 多 数 の カ ンジ ダが 分 離 され た も
2.
Tec(R)は 培 養 上 清 お よ び 菌 液 の い ず れ に も凝 集 を
に 皮 質)に
細 胞 を 伴 う多 数 の 菌 糸 が 認 め ら れ た.肝
の の,PAS染
に な る と凝 集 が 認 め られ た.そ れ に対 して,Cand-
低 い た め5)6),治療 に 結 びつ く早 期 診 断 は 困 難 な こ
ン ジ ダ 静 注2日
染 色 に て 心 臓 や 腎 臓(特
上
在 性 カ ン ジ ダ症 で は,特 徴 的 な 臨 床 症 状 を 呈 す る
の み 陽 性 で あ っ た.
殖 が 認 め ら れ,7日
ン ナ ン ラテ ック ス凝 集 反 応 が培 養 上 清 で 強
い凝 集 を示 し,菌 液 で は 菌 量 が1.0×104/ml以
考
間 後 で は,6匹 間 で は5匹
陽 性 率 は 低 下 し,4日
4匹 中1匹
培 養 上 清 や 菌 液 に お け る カ ン ジ ダ抗 原 の検 出 で は,マ
増 加 し た.
血 液 培 養 は カ ン ジ ダ 静 注24時
(20%)と
臓 で
臓 で は3.9×
106CFU/g(2.5×105/腎)と
4匹
間後 に
イ クロフ ォ
が,マ
ウス に お け る播 種 性 カ ンジ ダ症 で は,カ
ジ ダ接 種 後,臓
ン
器 内菌 数 とほ ぼ相 関 し て血 中 カ ン
ジ ダ抗 原 は 増 減 す る もの の,マ
ンナ ン抗 原 を 検 出
す る マ ン ナ ン ラ テ ッ ク ス凝 集 反 応(極 東)に 比 べ,
ス フ ァ マ イ ド投 与 後 の 糞 便 中 カ ン ジ ダ 菌 数 は ,4
や や 低 い 検 出 率 で あ った.Gentryら
週 目で1.4×106CFU/9,5週
Cand-Tec(R)を 用 い た 臨 床 的 検 討 で は,血 液 培 養 で
と な り,血
液 培 養 で も4週
目 で8.9×105CFU/9 目 で40%(2/5),5週
に よる
カ ン ジ ダ が 分 離 さ れ た 患 者 は高 い 陽 性 率(91%) 感 染 症 学 雑誌
第66巻
第6号
719
マ ウス カ ン ジダ症 モデ ル に お け る血 中抗 原
を 示 し た が7),Baileyら
の 報 告 で は28%8),
Lewieuxの
陽 性 率 は 低 く9),Ness
報 告 で は44%と
やPillipsら
2) Kohno, S.: Serological diagnosis of deep seated mycosis. Asian Med. J., 34 : 460-466, 1991. 3)
も 感 度 や 特 異 性 に 問 題 が 多 く,臨 床 応
前 崎 繁 文, 山 秀 徳,
河野
堀
茂,
博 之,
山田
洋,
賀 来 満 夫,
光 武 耕 太 郎,
古 賀 宏 延,
用 に は 大 き い 疑 問 が あ る と 述 べ て い る10)11).
平,
Greenfieldの
る 抗 原 検 出 法 と し て の 血 清 診 断 法 の 検 討.
ラ ッ トを 用 い た 実 験12)で は,23匹
全 て に 陰 性 で あ り,宮
崎 らの 家 兎 の実 験 で も検 出
率 は 低 く13),そ の 理 由 と し て,種 の,あ
中
の違 い に よ る も
る い は 宿 主 が カ ン ジ ダ 抗 原 をprocessし
neoantigenを
た
検 出 して い る の で は な い か と推 定
さ れ て い る.我
々 の 今 回 の 実 験 で も,カ
養 上 清 や 菌 液,破 め な か っ た.ま
ン ジ ダ培
砕 した 菌 体 い ず れ で も凝 集 を認
た,Gentryが
ウサ ギ に 抗 体 を 作 成
す るた め に用 い た 熱 処 理 した 抗 原 菌 液 そ の も の に
誌,
瀬 戸 牧 子,
65:
豆 谷 源 一 郎:
1091-1096,
原
杉 耕
カン ジ ダ血症 に お け 感染症
1991.
4) Kappe, R. & Muller,J.: Rapid clearance of Candida albicans mannan antigens by liver and spleen in contrast to prolonged circulation of Cryptococcus neoformans antigens. J. Clin. Microbiol., 29 : 1665-1669, 1991. 5) Francoise, M.C., Timothy, E.K. & Donald, A. : Fungemia in the immunocompromised host. Am. J. Med., 71: 363-370, 1981. 6) 安 岡 彰, 河 野 茂, 前 崎 繁 文, 山 田 洋, 笹 山 一 夫 , 宮 崎 幸 重, 賀 来 満 夫, 古 賀 宏 延, 原 耕 平:
対 し て も 凝 集 し な か った こ と は 興 味 深 く思 わ れ
Lysis
た.そ
出 に お け る 基 礎 的 な ら び に 臨 床 的 検 討. 感 染 症 誌,
れ に 対 し て,マ
ンナ ン ラ テ ック ス凝 集 反 応
65:
は カ ン ジ ダ細 胞 壁 の主 成 分 の ひ とつ で あ る マ ンナ ン を 検 出 す る 方 法 で,深
在 性 カ ン ジ ダ症 の 患 者 血
中 の マ ン ナ ン 抗 原 量 は0.5ng/ml以 ml以
下 や1,000ng/
上 な ど と報 告 さ れ て い る14)∼17).マ ン ナ ン 抗
原 は ク リ プ トコ ッ ク ス の 莢 膜 多 糖 抗 原 に 比 べ,ク リ ア ラ ン ス が 比 較 的 早 い た め4)18),検 出 感 度 に 加 え 検 体 が 採 取 さ れ た 時 期 や,そ
の基 礎 疾 患 お よび 重
症 度 が 検 出 率 に 大 き く 関 係 し て い る と考 え ら れ て い る.マ
ウ ス播 種 性 カ ン ジ ダ症 モ デ ル は致 死 的 実
験 モ デ ル で あ る が,カ
ン ジ ダ 接 種 後,臓
は 一 時 的 に 減 少 し,抗
原 検 出 率 も 一 時 低 下 し た.
器 内菌数
ま た ヒ トの カ ン ジ ダ 症 に よ り類 似 し た モ デ ル で あ る 経 口接 種 モ デ ル で は,糞
便 中 の カ ン ジ ダ菌 数 の
増 加 に 伴 い 血 中 の 抗 原 が 陽 性 と な っ て お り,消
化
管 粘 膜 か ら の カ ン ジ ダ の血 中 お よ び リンパ 管 へ の 侵 入 が 起 こ り,抗
原 血 清 が 見 ら れ た と推 定 さ れ,
経 時 的 な 検 体 の 採 取 や,頻
回な検査 が深在性真菌
症 の 抗 原 検 出 に お い て は重 要 で あ る こ とが 示 唆 さ れ た.ま た 同 じ壁 構 成 成 分 で あ る(1→3)-D-β-グ カ ン の 測 定 や,47kDa抗
ル
原 や 抗 体,D-arabinitol
な ど の 検 出 法 を 組 み 合 わ せ て い る こ と が,血
清診
断 の 信 頼 性 を さ ら に高 め るた め に 現 状 で は必 要 で あ る と考 え ら れ た. 文
献
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fungus
centrifugationに
宮 崎 幸 重, 洋,
河野
道 津 安 正,
茂,
安岡
山 口恵 三,
彰,
笹 山 一 夫,
廣 田 正 毅,
家 兎 カ ン ジ ダ 症 に お け るLimulus
原
山田 耕 平:
test,
D-
光武耕太郎 他
720
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Models
of Systemic
Candidiasis
Kotaro MITSUTAKE, Shigeru KOHNO, Haruko MATSUDA, Yuko YOSHITOMI Yoshitsugu MIYAZAKI, Yasuhito HIGASHIYAMA, Ken-ichi TANAKA, Masanori IWAMOTO, Shigefumi MAESAKI, Mitsuo KAKU, Second Department
,
Hironobu KOGA & Kohei HARA of Internal Medicine, School of Medicine, Nagasaki University
We compared two latex agglutination tests for serum candidal antigen in murine models of systemic infection and gastrointestinal colonization. In the intravascular-infection model , mannan detection test was positive at 2 hours after inoculation, but Cand-Tec was less sensitive than mannan detection test in this model. In the gastrointestinal colonization model followed by systemic infection in neutropenic mice , the mannan antigen test became positive after 3 weeks of colonization with increased number of Candida of the stool, and Cand-Tec became positive after 5 weeks in neutropenic mice .
感 染 症学 雑 誌
第66巻
第6号
