Planta (Berl.) 92, 50--56 (1970)

Dunkel-Assimilation von Nitrat bei Lemna minor L. REZ~HARD ]~OR2ffKAMM Institut fiir Angewandte Botanik der Teehnischen Universiti~t Berlin

Eingegangen am 18. Februar 1970 Assimilation of Nitrate in the Dark by L e m n a minor L. Summary. 1. Lemna minor is able to reduce nitrate in the dark when the nutrient medium contains yeast extract and glucose in addition to minerals salts. 2. When organic N is offered as a source of N in addition to nitrate, the former is assimilated preferentially, but both assimilation processes take place simultaneously. 3. Assimilation of nitrate in the dark under ecological conditions eanbeexcluded.

Einleitung ~3ber die Frage, ob grfine Blgtter nur im Licht oder auch im Dunkeln Nitrat zu assimilieren verm6gen, liegen widersprfichliche Angaben vor. Einerseits beobachtete Schimper schon (1888), dab nur im Licht der Nitratgehalt grfiner B1/itter merklieh abnahm; I n der Folgezeit wurde in einer Reihe yon Arbeiten gezeigt, dab die I~itratassimilation bei einer grSl3eren Zahl yon Objekten lichtabh/s ist (besonders Warburg und Negelein, 1920; Burstr6m, 1943; Zusammenfassung: Beevers and Hagcman, 1969). Unter Nitratassimilation wird dabei der Gesamtvorgang verstanden, der Nitrataufnahme, Nitratreduktion i.w.S, und Einbau des Stickstoffs in organischc Bindung umfal~t. IAcht ist neben lXlitrat notwendig zur Induktion der Nitratreductase in B1/ittern (Candela et al., 1957), zumindest bei Perilla wird auch CO S benStigt (Kannangara and Woolhouse, 1967). Die Aktivit/~t dieses Enzyms wird dutch Erh6hung der Beleuchtungsst/irke gesteigert (tiageman et al., 1961 ; Beevers et al., 1965), verschwindet nach liingerer Verdunkelung (Candela et al., 1957 ; Hageman and Flesher, 1960; Sanderson and Cocking, 1964; Kannangara and Woolhouse, 1967) und zeigt infolgedessen einen Tagesgang (ttageman et al., 1961; Wallace and Plate, 1965). AndererseiSs ergaben Einbauvcrsuche mit ~sN, dab Tabakbl/itter (Delwiche, 1951) und Tomatenblgtter (Mendel and Visser, 1951) Nitrat im Dunkeln fast ebenso rasch reduzierten wie im Licht, und Beevers et al. (1965) konnten in Rettich-Kotyledonen eine Nitratreductase auch im Dunkeln induzieren, wenn sie hohe Xitratkonzentrationen anboten.

Dunkel-Assimilation yon Nitrat bei Lemna

51

~OO

300

2oo

J

\

~oo

J Sept.

Okt.

Nov.

Dez1967

Jen.

Feb,1968

Abb. 1. Substanzproduktion yon Lemna minor bei Kultur im Dunkeln (. Einzelwert, o Mittelwert aus drei Einzelwerten)

Ffir Versuche zu dieser F r a g e schien Lemna minor ein geeignetes O b j e k t zu sein, d a sic sich leieht axenisch aueh i m D u n k e l n k u l t i v i e r e n 1/s (Gorham, 1950) u n d eine a k t i v e N i t r a t r e d u k t a s e besitzt (Sims et al., 1968). Y o s h i m u r a (1952) erhielt in einer U n t e r s u c h u n g fiber den Einflu6 des Lichtes auf den N i t r a t - u n d A m m o n i u m - V e r b r a u c h y o n Spirodela polyrrhiza u n d Lemna valdiviana u n k l a r e Ergebrdsse, die er auf den untersehiedlichen Ern/~hrungszustand der Pflanzen zurfiekffihrte. I n der vorliegenden A r b e i t soll d a h e r fiber weitere Versuehe b e r i e h t e t werden, die die F r a g e b e a n t w o r t e n sollen, ob Lemna minor i m D u n k e l n N i t r a t zu reduzieren vermag.

Material und Methoden Lemna minor wurde nach autotropher Vorkultur bei 25 ~ C im Dauerdunkel auf 125 ml einer IqiihrlSsung weiterkultivicrt, die sowohl anorganische als auch organische Bestandtefle enthielt (pro Kolben: 625 txM KN03, 250 izM CaCl~ x 2 H20, 187,5 ~IV[KI-I2PO~, 125 tzM MgSO 4 X 7 H20, 3,1 ~M FeSO~ • 7 H20, 0,6 izM H3B03, 0,2 ~M MnSO 4 X 1 tI20, 5 mg Hefe-Extrakt, 100 mg Casein-Itydrolysat (Merck) und 625 rag Glucose). Gesamtstickstoff wurde nach der Mikro-Kjeldahl-Methode bestimmt, Protein als das Produkt der Menge an Trichloressigs~ure-un]Sslichem Stickstoff mit dem Faktor 6,25 ermittelt. Die Bestimmung des Nitrats erfolgte nach Haar (1961), die des Gesamtkohlenhydrates nach Roe (1955), Chlorophyll wurde nach BSger (1964) bestimmt.

Ergebnisse Die S u b s t a n z p r o d u k t i o n folgte einer ~ypischen dreiphasigen W a c h s t u m s k u r v e (Abb. 1). N a c h einer A n l a u f p h a s e von e t w a 2 M o n a t e n D a u e r setzte die M a s s e n p r o d u k t i o n ein, die n u r d u r c h wenige P u n k t e e r f a S t wurde, d a sic rasch in die station~re P h a s e iiberging. 4*

52

R. Bornkamm: 1 /.

rn~ ~

N (Ndhrl('sung)

//~

I0 9

7 Nitrat-N(~ 6 5. z

,/

/

oo'..

3.

I. 0 0

N (Oflan:'en) 100

200

300 ~00 mg rrockengewicht

Abb. 2. Von Lemna minor assimilierter Stickstoff sowie organ. N- und NitratN-Gehalt der Nghrl6sung bei Kultur im Dunkeln I n jedem Kolben wurde nach der Ernte der Gehalt der Nahrl6sung an Nitrat und orgalfisehem Stiekstoff sowie der Gesamt-N-GehMt der Pflanzen bestimmt. Um die unterschiedliehen Entwieklungsgesehwindigkeiten der einzelnen Knlturen zu eliminieren, wurde bei der Darstellung der Werte (Abb. 2) auf die produzierte Trockensubstanz bezogen, wobei jeweils (3-)4 Werte zu einem Mittelwert vereinigt wurden, Wie die Werte zeigen, wurde anf~nglieh von den Pflanzen nut der organisehe Stickstoff verwandt, erst nach einer lgngeren Zeit nahm auch der Nitratgehalt der N/ihrl6sung ab. Der von den Pflanzen assimilierte Stiekstoff stammt in der Anlaufphase zu 100 %, in der logarithmischen und der station/~ren Phase zu etwa 75 % aus den organischen N-Quellen nnd zu etwa 25 % aus dem Nitrat. Bei Ende des Versuches waren etwa 73 % des organisehen N und etwa 40 % des Nitrat-N verbraueht. Bevorzugt wurde somit die Assimilation yon organisehem N, yon dem aber noeh etwa 80 % vorhanden war, als die Nitratassimilation einsetzte, so dal3 dann beide Prozesse nebeneinander abliefen. Die Inkorporation yon N in die Pflanzen folgte nieht linear der Trokkensubstanzproduktion. Es kam daher im Bereieh der st~rksten Substanzproduktion zu einem Absinken des N-Gehaltes (statistiseh gesiehert, P < 0 , 0 0 1 ) , bis die Werte in der station/~ren Phase wieder zunahmen (Abb. 3).

Dunkel-Assimilationvon Nitrat bei Lemna 3,5 %Ni

o .,o

53

..~..---o_

25 Nov.

Dez. 1967

Jan.

Feb 1968

Abb. 3. Gesamt-N-Gehalt yon Lemna minor bei Kultur im Dunkeln

I n weiteren Versuchen w u r d e n die organischen Zus/~tze zu der N/~hr16sung varfiert. Dabei war die S u b s t a n z p r o d u k t i o n u n d d a m i t aueh die N-Assimilation stark abh/~ngig y o n der Menge des g e b o t e n e n A t m u n g s substrats. Die Abhgngigkeit war nahezu linear, wie die VVerte i n Tabelle 1 zeigen. Tabelle 1. Substanzproduktion und Proteingehalt yon Lemna minor in Dunkelkultur bei unterschiedlichen Glucosegaben (Versuchsdauer 149 Tage; Mittelwerte aus je 4 Kolben)

Glucose in der N~hrl5sung (%)

Glucose/ Kolben (g)

Trockensubstanz/ Kolben (rag)

Protein/ Troekensubst~nz (%)

Gesamtkohlenhydrat/ Trockensubstanz ( %)

0,0 0,04 0,2 1,0

0,0 0,2 1,0 5,0

0,2 14,5 152,8 658,0

-6,3 6,2 4,5

-46,6 47,1 49,5

Tabelle 2. Substanzproduktion und Zusammensetzung yon Lemna minor in Dunkelkultur bei untemchiedlichen Zugaben organischer Substanzen zur N~ihrlSsung

Mineralsalze Glucose Casein-gyda'olysat Hefe-Extr~kt

+ + -+

+ + -+

+ + + --

+ + ---

Troekensubstanz/Kolben (rag) ProteingehMt (% des Trockengewichts) Kohlenhydratgehalt (% des Trockengewichts)

390

439

16,8

4,9

5,8

3,8

5,0

--

44,1

61,1

78,4

--

W u r d e Casein-Hydrolysat weggelassen, das mehr als 90 % des organischen N der N~hrlSsung enthielt, u n d bot m a n auBer Mineralsalzen n u t Glucose u n d H e f e - E x t r a k t , so verlief die S u b s t a n z p r o d u k t i o n ungeh i n d e r t (Tabelle 2). I n diesem Falle muBte der grSl]te Tell des in die Pflanzen inkorporierten Stickstoffes durch N i t r a t r e d u k t i o n assimiliert worden

54

R. Bornkamm: I0

~hydraf/Profein

"-=---o

~0 ~ l e n h y d m t

(%

Trgw.)

so

20

.1

ProteinI (% Trgwj

o

0

10

20

30

40

50

60

70 Lux

Abb. 4. Protein-, Kohlenhydrat- und Chlorophyllgehalt yon Lemna Kultur im Dunkeln und im extremen Schwachlicht

minor bei

sein. Allerdings war der Proteingehalt erniedrigt, und das Verh~ltnis Kohlenhydrat:Protein betrug 16:1 gegenfiber 8:1 bei den Kolben mit vollsti~ndiger N~hrl6sung. Wurde der Hefe-Extrakt weggelassen, so land selbst dann fast kein Wachstum start, wenn organischer Stickstoff angeboten wurde. I n allen Fi~llen war der Proteingehalt der Pflanzen relativ niedrig, wis der gr66te Tell der Trockensubstanz, wie immer bei LemnaDunkelkulturen (Bornkamm, 1965, Tab. 10), aus Kohlenhydraten bestand (Tabelle 1 und 2). Schon ~uJ~erst geringe Beleuchtungssti~rken ver~nderten die Zusammensetzung der Pflanzen erheblich : Bei etwa 20 Lux verdoppelte sich der Proteingehalt (Abb. 4), bei etwa 50 Lux war er verdreifacht und das Verh~ltnis Kohlenhydrat/Protein auf etwa ein Sechstel abgesunken. Chlorophyll wurde mit zunehmenden Beleuchtungsst/irken in immer gr613eren Mengen ausgebildet, w~hrend es den Dunkelkulturen fehlte. Besprechung der Ergebnisse Die grfinen B1/~tter zahlreicher Pflanzen verlieren ihre Nitratreduktase-Aktivit~t vollst/~ndig, wenn sie l~ngere Zeit verdunkelt werden

Dunkel-Assimilation yon Nitrat bei Lemna

55

( s . o . S . 50). Lemna minor hingegen v e r m a g , wie in der vorliegenden A r b e i t gezeigt wird, auch i m D a u e r d u n k e l N i t r a t zu assimilieren. Sicher ist diese F s i m Z u s a m m e n h a n g d a m i t zu sehen, d a b sich i m L i c h t a u t o t r o p h angezogene Lemna-Pflanzen, wenn sie auf N~hrl6sung m i t b e s t i m m t e n organischen Zuss iiberffihrt werden, i m D a u e r d u n k e l auI einen h e t e r o t r o p h e n Stoffwechsel umstellen k6nnen, wie schon seit li~ngerem b e k a n n t ist (Gorham, 1945). D a b e i k 6 n n e n sie offensichtlich y o n p h o t o s y n t h e t i s c h gewonnenen auf durch A t m u n g gewonnene Elekt r o n e n d o n a t o r e n fiir die N i t r a t r e d u k t i o n u m s e h a l t e n (s. d a z u die Zus a m m e n f a s s u n g bei Beevers u n d H a g e m a n , 1969). Auf das V e r h a l t e n griiner B1/~tter k6rmen wir naeh unseren Versuehen keine Riieksehliisse ziehen, da die Lemna-Pflanzen in D u n k e l k u l t u r naeh ihrer Stoffweehselu m s t e l l u n g ehlorophyllfrei sind u n d in vielerlei H i n s i e h t n i e h t m e h r m i t griinen B1/~ttern vergliehen werden kSnnen. Die D u n k e l - A s s i m i l a t i o n y o n N i t r a t ist bei Lemna an die G e g e n w a r t y o n H e f e - E x t r a k t gebunden. Zwar ist sie so stark, d a b sieh ein Weglassen der wiehtigsten organisehen N - Q u e l l e ( C a s e i n - t I y d r o l y s a t ) n i e h t auf die S u b s t a n z p r o d u k t i o n auswirkt, a b e r der P r o t e i n g e h a l t der Pflanzen ist d a b e i verringert. Bei allen D u n k e l k u l t u r e n zeigt das sehr hohe Verhgltnis K o h l e n h y d r a t / P r o t e i n energetiseh ungiinstige B e d i n g u n g e n a n ; sehon i m e x t r e m e n Sehwaehlieht y o n wenigen L u x Beleuehtungss t a r k e v e r r i n g e r t es sieh raseh. B e d e n k t m a n ferner die lange D a u e r der n o t w e n d i g e n U m s t e l l u n g des Stoffweehsels auf h e t e r o t r o p h e Bedingungen u n d den h o h e n B e d a r f a n A t m u n g s s u b s t r a t , so k a n n m a n sehliel3en, dal3 eine D u n k e l a s s i m i l a t i o n y o n N i t r a t u n t e r 6kologisehen B e d i n g u n g e n n i e h t in B e t r a e h t k o m m t . Frgulein Heidemarie Beeker und Fraulein Elke l~ussman danke ich fiir sorgf~ltige technische Mitarheit, der DFG fiir eine Saehbeihilfe.

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