Histochemistry 48, 111- 119 (1976)

Histochemistry 9 by Springer-Verlag 1976

Azoindoxylverfahren zum histochemischen Hydrolasennachweis I. Lactase (Lactase-/J-glucosidase-Komplex) R. Gossrau Anatomisches Institut (Lehrstuhl: Prof. Dr. T.H. Schiebler)der Universit~itWtirzburg, Koellikerstrage 6, D-8700 Wtirzburg

Azoindoxyl Methods for the Histochemical Investigation of Hydrolases. I. Lactase (Lactase-p-glucosidase Complex) Summary. An azoindoxyl method for the histochemical demonstration of lactase (lactase-13-glucosidase complex) is described. The incubation medium consists of 5 mg 5-Br-4-C1-3-indolyl-fl-D-fucoside (dissolved in 0.5 ml N,N-dimethylformamide) and 0.02 mI hexazotized prosaniline in 10 ml 0.1 M citric acid phosphate buffer, pH 6-6.5. By means of this method lactase can be exactly localized in the brush border of the enterozytes in the jejunum of suckling rats. Compared to the corresponding indigogenic method the azoindoxyl reaction proceeds faster and the reaction product is often precipitated more precisely. Zusammenfassung. Es wird eine Azoindoxylmethode zum histochemischen Nachweis der Laetase (Lactase-fl-glucosidase-Komplex) beschrieben. Das Inkubationsmedium enth/ilt 5 mg 5-Br-4-C1-3-Indolyl-J?-D-fucoside (gelSst in 0,5 ml N,N-Dimethylformamid) und 0,02 ml Hexazonium-p-rosanilin in 10 ml 0,1 M Citronens~iure-Phosphat-Puffer, pH 6-6,5. Mit diesem Verfahren kann die Lactase im Jejunum yon Rattens/iuglingen exakt im Bfirstensaum der Enterozyten dargestellt werden. Verglichen mit der entsprechenden Indigogenmethode 1/iuft die Azoindoxylreaktion schneller ab und lokalisiert in frischem und fixiertem Material h/iufig prfiziser.

Einleitung Indolylderivate (Barrnett und Seligman, 1951 ; Holt, 1952; Pearson et al., 1961, 1963a, b, 1967; Esterly et al., 1967; Pugh, 1972; Tsou et al., 1974) kSnnen zum histochemischen Hydrolasennachweis in Kombination mit Oxidationsmitteln eingesetzt werden (sog. Indigogenverfahren). Meistens handelt es sich um Eisenionen, die das yon Enzym freigesetzte farblose Indoxyl zu tiirkisfarbenem

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Indigo oxidieren (Pearse, 1972). Zur Darstellung von Lactase (Lojda, 1970a; Lojda und Kraml, 1971 ; Lojda et al., 1973) und saurer/~-Galactosidase (Lojda, 1970b) gelten die Indigogenmethoden als Verfahren der Wahl (Lojda, 1972); auBerdem lassen sich damit die unspezifischen Esterase (Holt, 1958; Holt und Withers, 1958), saure Phosphatase (Evans et al., 1966), fl-Glucuronidase (Lojda, 1971) und fl-N-Acetylglucosaminidase (Pugh, 1972; Lojda und Havr~mkovfi, 1976) nachweisen. Von tier M6glichkeit, Indolylderivate simultan mit Diazoniumsalzen zu verwenden (sog. Azoindoxylverfahren), wurde kaum Gebrauch gemacht. Hierbei wird Indoxyl simnltan gekuppelt und es entstehen farbige Azoindoxyle. Lediglich zur Untersuchung der unspezifischen Esterase existiert eine wenig eingesetzte Azoindoxylmethode (Hess und Pearse, 1961 ; Delellis und Fishman, 1965). Ursache ftir die serene Anwendung des Verfahrens ist die verglichen mit den 1Naphthyl- und Naphthol-AS-Derivaten geringe Spaltungsrate der Indoxylacetate zum Esterase-Nachweis. Andere Indolylsubstrate zur Darstellung von Hydrolasen, z.B. Indolyl-flfucosid oder -galactosid, werden jedoch schneller als die entsprechenden substituierten und unsubstituierten Naphthole umgesetzt (Lojda et al., 1973; Gossrau, 1976 b) und k6nnten in Verbindung rnit Diazoniumsalzen gute Resultate liefern. Deshalb haben wir mit Untersuchungen darfiber begonnen, inwieweit Azoindoxylverfahren mehr als bisher f~ir histochemische Hydrolasenstudien nutzbar sin& Vorliegende Arbeit besch/iftigt sich mit dem Nachweis der Lactase nach diesem Reaktionsprinzip. Untersuchungsobjekt war der Dfinndarm yon Rattens~iuglingen, der wiihrend der ersten 14 Lebenstage besonders lactase-aktiv ist (Koldovsk~, 1969; Lojda und Kraml, 1971 ; Gossrau, 1973a, b, 1975).

Material und Methoden Verwendet wurde das Jejunum yon 30 Rattens/iugtingen (Wistar) eigener Zucht zwischen dem 4. und 8. Lebenstag (LT). Haltung der Tiere unter konstanten Bedingungen (12stfindiger kfinstlicher Licht-Dunkel-Wechsel, Stalltemperatur 22 +_1~C) in Macrolon| mit Holzsp/ineeinstreu. Die Miitter erhielten Altromin| und Leitungswasser ad libitum. T6tung dutch Dekapitation in Athemarkose.

Gewebevorbehandlung. Einfrieren des nativen Jejunums in N2-gekfihltern Propan (Winckler, 1970) oder nach Stfickfixation in 4% Formaldehyd rnit 1% wasserfreiem CaCI2 (pH 7 , 2 - 7,4, Einstellung mit NaOH) oder 2,5% Glutaraldehyd (Reinigung fiber Tierkohle; phosphat-gepuffert, 0,1 M, pH 7,2-7,4) und anschlieBendern Spfilen in Holtscher L6sung (Holt, 1959) ffir jeweils 24 h bei 4 ~C. Herstellung yon Kryostatschnitten (System Ditttes-Duspiva, 10~rn, - 25 bis - 30~C), Aufziehen auf unbehandelte oder albuminisierte und geflarnrnte zirnrnerwarrne Objekttr~iger und Aufbewahrung in verschlossenen Kiivetten oder sofort Weiterverarbeitung nach Lufttrocknung ( 2 - 5 rnin). [nkubationsmedien. 5 mg 5-Br-4-C1-3-Indolyl-fi-D-fucosid, -glucosid oder galactosid (Cyclo Chemicals; gel6st in 0,5 rnl N,N-Dimethylformamid, Merck) und 0,8-0,005 ml hexazotiertes p-Rosanilin (Lojda etal., 1964; Chrorna) oder 5 - 1 0 rng Fast Blue B reinst, BB und RR (Serva) oder Fast Red TR (Dajac) in 10 rnl 0,I M Citronensfiure-Phosphat-Puffer, pH 6 -6,5; pH-Kontrolle und gegebenenfalls Einstellung rnit NaOH. Zum Vergleich Nachweis der Lactase nach Lojda und Krarnl (1971) mit Indolyl-fl-fucosid, -glucosid und -galactosid (vgt. Lojda et at., 1973) sowie nach Gossrau (1973a) rnit l-Naphthy1-fl-Dglucosid und -galactosid (vgk Lojda, 1972, 1975).

Azoindoxylverfahren zum Lactase-Nachweis

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Inkubation in feuchter Kammer (37~ 1 5 - 6 0 rain) oder unter F/irbemikroskop mit elektrischer Beleuchtung im Labor bei 35facher Vergr61?erung bis zum ersten Auftreten yon sichtbarem Farbstoff (vgl. Lojda, 1975; Gossrau, 1976a; Minimalinkubation mit Stoppuhrkontrolle). Hierzu wurden um die schnitttragenden Objekttrfiger Plexiglasringe gelegt, mit Vaseline befestigt und 1 ml zimmerwarmes Medium eingeffitlt. Die angegebenen Zeiten sind die Mittelwerte aus 6 - 8 Einzelmessungen bei verschiedenen Tieren. - Eindecken in Glycerin-Gelatine (Merck).

Befunde

Kryostatschnitte von ff!schem Jejunum liefern stets die gr613te Menge Reaktionsprodukt, das fast ausschliel31ich im Bfirstensaum der Zotten abgelagert ist (Abb. 1). Nach Stiickfixation in Aldehyden und anschlieBendem Spfilen in Holtscher Zuckerl6sung f'fillt der Nachweis schw/icher als in nativem Material aus, erlaubt aber eine pr/izisere Lokalisation der Azoindoxyle (Abb. 2). Verglichen miteinander hemmt Glutaraldehyd die Lactase st/irker als Formaldehyd. Bei Minimalinkubation vergehen bis zum ersten Auftreten lichtmikroskopisch sichtbaren Farbstoffs nach Fixation mit Formaldehyd durchschnittlich 90, nach Vorbehandlung in Glutaraldehyd dagegen 150 s; im Bfirstensaum nativer Kryostatschnitte ist Reaktionsprodukt schon nach 30 s auszumachen. Bei pH 6 oder 6,5 wird mit Hexazonium-p-rosanilin, Fast Blue B, BB und RR als Simultankuppler 5-Br-4-C1-3-Indolyl-fi-fucosid am schnellsten umgesetzt gefolgt yon 5-Br-4-C1-3-Indolyl-fl-glucosid; mit dem entsprechenden Galactosid kommt es erst bei 1/ingerer Inkubation zur Ablagerung yon Azoindoxyl im Bfirstensaum (Tabelle 1). Der Reaktionsausfall h/ingt in hohem MaBe vom Typ und yon der Konzentration des verwendeten Kupplers ab. In frischen Schnitten liefert nut Hexazonium-p-rosanilin einen fiberwiegend, in fixiertem Material einen rein amorphen Farbstoff, der sich auf den Bfirstensaum beschr/inkt (Abb. 1, 2). Mit Fast Blue B erscheint das dunkelblaue Azoindoxyl in nativen Schnitten feingranulfir, in solchen von fixiertem Jejunum teilweise amorph und konzentriert sich weitgehend auf die Mikrovillizone (Abb. 3). Mit Fast Blue BB und RR ist der Farbstoff grobgranul/ir, wobei das ebenfalls dunkelblaue Reaktionsprodukt aus Fast Blue BB und Indoxyl meistens im Gebiet des Bfirstensaums, das aus Fast Blue RR und Indoxyl zusfitzlich im Cytoplasma der Enterozyten und im Darmlumen anzutreffen ist (Abb. 4). Mit beiden Echtblausalzen sind die Resultate in fixiertem und nativem Jejunum nahezu identisch. Dient Fast Red TR als

Tabelle 1. Minimalinkubation, Rattensgugling, 5. LT, native Kryostatscbnitte, 0,002 ml Hexazonium-p-rosanitin/ml Substrat

Zeit in Minuten bis zum ersten Auftreten yon Azoindoxyl

Indolyl-fi-fucosid Indolyl-fl-glucosid Indolyl-fl-galactosid

0,5 3,5 14,0

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Abb. 1. Rattens~ugling, 4. LT, unfixierter KryostatschnitL 0,01 ml Hexazonium-p-rosanilin/ml, tnkubationszeit 60 rain. Positive Reaktion des Biirstensaums und wenige unspezifische Niederschl~ige auBerhalb davon. Objektiv 25 x

Azoindoxytverfahren zum Lactase-Nachweis

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Kupplungssalz, ffillt der Nachweis immer negativ aus. Gleiches gilt ffir Fast Garnet GBC, das zus~tzlich Ablagerungen von Indigo in den Zellen der Lamina propria erm6glicht. Der Einflul3 der Konzentration des Kupplers auf das Reaktionsergebnis wurde wegen seiner iiberlegenen Eigenschaften (Davis und Ornstein, 1959; Lojda, 1962; Beneg et al., 1961; Pearse, 1968) vor allem ffir hexazotiertes pRosanilin untersucht. Mit Mengen yon 0,08- 0,06 ml Hexazonium-p-rosanilin/ ml Inkubationsmedium f~illt der Nachweis fast negativ aus. Im Medium selbst machen sich Trtibungen und auf den Schnitten ohne Filtration massive Niederschl/ige bemerkbar. Mit 0,025 ml/ml ist nach 1 heine schwach positive Reaktion im Bfirstensaum zu beobachten; ferner trfibt sich das Inkubationsmedium bei Zugabe des Kupplers zum Substrat-Puffer-Gemisch weniger stark und langsamer als mit den h6heren Hexazonium-p-rosanilin-Konzentrationen. Mit 0,015, 0,01 und 0,005 ml/ml l~il3tsich die Menge Azoindoxyi in der angegebenen Reihenfolge weiter steigern, wfihrend Trfibungen im Medium und Niederschlfige auf den Schnitten abnehmen (Abb. 1). Optimale Ergebnisse erlauben 0,002 ml/ml. Dann bildet sich Azoindoxyl unter den getesteten Konzentrationen am schnellsten und wird exakt im Bfirstensaum ausgeffillt (Abb. 2). Das Inkubationsmedium bleibt bei 37~ l~inger als 45 min klar, so dab Niederschl/ige auf den Schnitten fehlen; pH-Korrektur erfibrigt sich. Mit 0,001 ml/ml entsteht stellenweise Indigo in der Lamina propria; im Bfirstensaum lagert sich nur z.T. Azoindoxyl ab. 0,0005 ml/ml f/irben die Mikrovillizone nicht mehr an bei gleichzeitiger Zunahme der Indigomenge in der Lamina propria (Abb. 5). Bis zu 0,01 ml/ml hat das Reaktionsprodukt dauernd braune Farbe; ab 0,005 ml/ml kann sie unabh/ingig von der Gewebevorbehandlung einige Zeit nach der Inkubation nach schwarzbraun bis schwarz umschlagen. - Unter den stabilen Diazoniumsalzen Fast Blue B, BB und RR sowie Fast Red TR und Fast Garnet GBC erhfilt man mit 0,5 und 1 mg/ml gleiche Resultate; vorteilhaft ist, daf3 die Medien mitunter stabiler als die mit Hexazonium-p-rosanilin sind. Das Inkubationsmedium der Wahl besteht aus 5 mg 5-Br-4-C1-3-Indolyl-fi-Dfucosid und 0,02 ml Hexazonium-p-rosanilin in 10 ml 0,1 M CitronensfiurePhosphat-Puffer, pH 6 - 6,5. Verglichen mit der Indigogen- (Abb. 6) und Azokupplungsmethode zum histochemischen Lactase-Nachweis lfiuft die Azoindoxylreaktion am schneIlsten

Abb. 2. Rattens/iugling, 6. LT, Stfickfixierung in Glutaraldehyd, 0,002 ml Hexazonium-p-rosanilin/ ml, Inkubationszeit 30 min. Azoindoxyl im Biirstensaum der Enterozyten. Objektiv 60 x Abb. 3. Rattens~iugling, 8. LT, unfixierter Kryostatschnitt, 1 mg Fast Blue B reinst/ml. Feingranulfires Reaktionsprodukt fiberwiegend im Bfirstensaum. Objektiv 25 x Abb. 4. Siehe Abb. 3, 0,5 mg Fast Blue RR/ml. Grobgranul~tres Azoindoxyl in Bfirstensaum, Darmlumen und Enterozytencytoplasma. Objektiv 25 x Abb. 5. Siehe Abb. 3, 0,0005 ml Hexazonium-p-rosanilin/ml. Falschnegative Reakfion im Bfirsten-

saum und Ablagerungen von Indigo in der Lamina propria. Objektiv 25 • Abb. 6. Siehe Abb. 2, Indigogenverfahren mit Indolyl-fi-fucosid. Verglichen mit Abb. 2 schw~ichere Reaktion im Biirstensaum. Objektiv 40 x

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116 Tabelle2. Minimalinkubation, Rattens~iugling6. LT, native Kryostatschnitte Methode

Zeit in Minuten bis zum ersten Auftreten von Farbstoff im Bfirstensaum

Azoindoxyl (Indolyl-fl-fucosid/Hexazonium-p-rosanilin) Indigogen (Indolyl-fl-fucosid/Fes +) Azokupplung (1-Naphthyl-fl-glucosid/Hexazonium-p-rosanilin)

0,5 1,0 5,0

ab, d.h. bei Minimalinkubation tritt sichtbares Reaktionsprodukt zuerst mit dem Azoindoxylverfahren auf (Tabelle 2), und lokalisiert in nativem und fixiertern Material h/iufig pr~iziser.

Diskussion

Unsere Untersuchung zeigt, dab die Lactase (Lojda et al., 1973) und m6glicherweise auch der fl-Glucosidase-Anteil des Lactase-fl-glucosidase-Komplexes (Lojda, 1975) erfolgreich mit der Azoindoxylmethode nachgewiesen werden kann. Die relativ hohe Spezifit~it des Verfahrens haben Studien yon Lojda (1973) mit isolierter Rattenlactase bewiesen, die bevorzugt Indolyl-fi-D-fucosid in Anwesenheit yon Diazoniumsalzen im intestinalen Bfirstensaum angreift. Eine Mitreaktion der Hetero-fi-glucosidase(galactosidase) und sauren fl-Galactosidase, die in geringem Ausmaf3 ebenfalls Indolyl-fi-fucosid umsetzen (Lojda et al., 1973), stellt kein Problem dar. Beide Enzyme sind im Gegensatz zur festgebundenen Lactase hochdiffusibel (Lojda et al., 1974) und verlassen bei dem yon uns u.a. verwendeten nativem Material und w/iBrigen Medien den Schnitt. Ursache ffir die reproduzierbar guten Resultate ist offenbar die augerordentlich schnelle Kupplungsreaktion zwischen Indoxyl und dem Diazoniumsalz Hexazonium-p-rosanilin (Pearse, 1972), so dab kleine Mengen Kuppler im Gegensatz zu den simultanen Azokupplungsreaktionen mit Naphthol-AS- und Naphthylderivaten als Substraten (Lojda et al., 1964; Pearse, 1968, 1972) ausreichen. Damit bietet das Azoindoxylverfahren zur Lactase-Darstellung die M6glichkeit, 5-Br-4-C1-3-Indolyl-fl-fucosid als Substrat der Wahl (Lojda und Kraml, 1971; Lojda et al., 1973) mit einer Kupplerkonzentration zu kombinieren, die das Enzym relativ wenig hemmen dfirfte. Untersuchungen yon Lojda et al. (1964) haben die Abh/ingigkeit der Enzymhemmung yon der Menge Hexazonium-prosanilin sichergestellt. Die fibrigen geprfiften Diazoniumsalze sind hexazotiertern p-Rosanilin in der Regel unterlegen, da sie entweder keinen ffir Aussagen fiber die intrazellul~ire Lokalisation notwendigen amorphen Azofarbstoff, Diffusionsartefakte oder Negativbefunde liefern. Eine Ausnahme macht Fast Blue B, das sich gut zum Nachweis der alkalischen Phosphatase mit Indoxylphosphat eignet (Gossrau, unver6ff.).

Azoindoxylverfahrenzum Lactase-Nachweis

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Verglichen mit der Indigogenmethode nach Lojda und Kraml (1971; vgl. Lojda, 1970a), bei der 3-wertiges Eisen in Form yon Kaliumhexacyano-(III)ferrat (Holt, 1956; Holt und Withers, 1958) als Oxidationsmittel dient und Indigo entsteht, hat unser Verfahren 2 Vorteile: 1. lfiuft die Reaktion schneller ab bzw. die Methode ist empfindlicher, da die Inhibition der Lactase durch die Eisenkationen (Shnitka und Seligman, 1961; Pearson et al., 1962; Lojda 1970a, b; Lojda und Kraml, 1971; Lojda und Havrfinkovfi, 1975) vermutlich gr6Ber ist als die dutch Hexazonium-p-rosanilin; denn seine Konzentration liegt 1 5 75real niedriger als in den Azokupplungsans/itzen (Lojda et al., 1964; Pearse, 1968, 1972). Allerdings diirfen bestimmte Mindestmengen an hexazotiertem pRosanilin nicht unterschritten werden. Dies belegt die Bildung von Indigo in den Zellen der Lamina propria ab 0,001 ml Kuppler/ml Inkubationsmedium. In derartigen Ansfitzen kann das im Bfirstensaum gebildete Indoxyl wie im Fall der Indigogenverfahren (Holt, 1952, 1956; Lojda 1970a, b, 1971; Lojda und Kraml, 1971) nicht mehr effektiv gekuppelt werden, verl/iBt seinen Entstehungsort und wird im subepithelialen Bindegewebe an Stellen mit Peroxidaseaktivit/it artefiziell zu Indigo oxidiert (Lojda, 1972). 2. k6nnen bei Verwendung der Indigogenmethoden auch in Gegenwart von Eisenionen aus Indoxyl schwach farbige oder farblose Verbindungen entstehen (Ahlquist, 1963; Pearse, 1972; Lojda und Havrfinkovfi, 1975) und/oder die Bildung von Indigo kann sogar gehemmt werden (Tsou und Su, 1963). Daher existiert bei den Enzymnachweisen mit Indigogenmethoden und Kaliumhexacyanoferrat als Metallkatalysator nicht unbedingt eine eindeutige Relation zwischen Enzymaktivit/it und Farbstoffmenge. Fiir die Azoindoxylverfahren sind derartige potentielle Fehlerquellen bislang unbekannt. Nachteilig macht sich bei der Azoindoxylmethode zum Lactase-Nachweis lediglich bemerkbar, dab das Inkubationsmedium relativ instabil ist und sich deshalb im Gegensatz zum Indigogen-Ansatz nicht wiederholt (Lojda, 1975) verwenden lfiBt. Die simultanen Azokupplungsverfahren (Lojda, 1972, 1975; Gossrau 1973 a, b) zur Darstellung der Lactase sind weniger sensitiv als die Indigogen- und vor allem die Azoindoxylmethode; sie sollten jedoch dann eingesetzt werden, wenn Indolylderivate nicht zur Verf/igung stehen. Ob Azoindoxylmethoden auch bei anderen histochemischen Hydrolasennachweisen im Vergleich zu den Azokupplungs- und Indigogenreaktionen Vorztige haben, mtissen weitere Untersuchungen sichern. Die bisherigen Befunde zur Darstellbarkeit der sauren fl-Galactosidase, fl-N-Acetylglucosaminidase, flGlucuronidase, Sulfatase, alkalischen und sauren Phosphatase sowie der Petidasen mit Azoindoxylverfahren deuten darauf hin (Gossrau, unver6ff.).

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Azoindoxylverfahren zum Lactase-Nachweis

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Eingegangen am 26. Februar 1976