Aus dem Institut fur Biochemie der Pflanzen, Halle (Saale) des Forschungszentrrrms fur Molekrrlarbiologie und Medizin der Akademie der Wissenschaften der DDR
BIOSYNTHESE DES PEPTIDTEILS DER MUTTERKORNALKALOIDE V O M CYCLOL-TYP
Biosynthes'is of the Peptide Portion o f Cyclol-type Ergot Alkaloids
Abstract A review is given on the biosynthesis o f the peptide moiety in ergot alkaloids. Feeding experiments with labeled amino acids have revealed that phenylalanine, proline, valine and leucine are specifically incorporated into the appropriate constituents of the peptides of ergotamine, ergocornine and ergokryptine, respectively. The a-hydroxy-&-aminoacid residue of the ergotoxine alkaloids is derived from valine. In the case of ergotamine alanine or a close relative is the immediate precursor of the hydroxyamino acid fragment. The exact mechanism of cyclol formation in ergot alkaloid biosynthesis is not yet clarified. Abe's group in Japan has found the intact incorporation of lysergylalanine and lysergylvaline in peptide alkaloids of various ergot strains. Furthermore they demonstrated the incorporation of L-lezrcyl-L-proline lactam and Lphenylalanyl-l-proline-lactam in ergokryptine and ergotamine, respectively. Other authors (Floss, Groger) did not confirm these results. They have tested the possible involvement o f free simple lysergic acid derivatives, various di- and tripeptides as well as the corresponding diketopiperazines. In these experiments the added precursors were split by the fulzgus into the correspo~zdingcompounds (lysergic acid and amino acids) prior to incorporation into the peptide moitety o f ergot alkaloids. Based on these results and on inhibitor experiments one may speculate that the synthesis o f the peptide portion is a nonribosomal process. Apparently like in the biosynthesis of peptide antibiotics the peptide chain formation takes place on a multienzyme complex. Einfiihrung Bislang sind etwa 50 Mutterkornalkaloide bekannt. Die iiberwiegende Zahl dieser Indolalkaloide wurde aus verschiedenen Claviceps-Arten isoliert. Lange Zeit war man der Ansicht, dat3 nur Vertreter dieser Ascomyceten-Gattung in der
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Von D. GROCER
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Groger
/CH
(2) R l r R Z = ~ ; R ~ CHTCH =
(3)
n,, RZ= C H ~ ;R3=
'CH3 / CH3
-cH
'CH~
: ~rgosin
: Ergocornin
0CH3 : a-Ergokryptin (4) Rq,R2=CH3; R3= -CH2-CH 'CH~
Abb. 1. Strukrurformeln einiger Cyclolalkaloide des Mutterkorns
Die Peptidalkaloide (Abb. 1)des Mutterkorns und die entsprechenden Dihydro'Derivate sind von augerordentlicher Bedeutung fiir die Therapie. Offensichtlich ist dieser Alkaloid-Typ bisher nicht in Pilzen auRerhalb der Gattung Claviceps nachgewiesen worden. Kiirzlich konnte jedoch ein Vertreter, namlich das Ergosin (2), aus Samen vort Ipomoea argyrophylla VATKE(STAUFFACHER et al., 196.5) isoliert werden. Die Chemie und Biochemie der Mutterkornalkaloide ist ausfiihrlich von HOFMANN (1964), GROCER(1972) und THOMAS u. BASSETT(1973) dargestellt worden. Neben der Gewinnung der Peptidalkaloide aus Sklerotien besteht die Moglichkeit der Isolation aus saprophytischen Kulturen, nachdem es vor allem italieni1966; AMICIet al., schen Autoren gelang, geeignete Stamme zu isolieren (TONOLO, 1966; 1969). Derartige Stamme eignen sich gut zur Untersuchung der Biosynthese des Peptidteiles der Ergolinalkaloide. Die Kenntnis der Bildungsmechanismen der
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Lage sind, Ergolin-Derivate zu bilden. Heute weiR man, dai3 Ergoline, insbesondere Clavin-Alkaloide auch von anderen Pilzen (Aspergillus, Penicillittm, Rhimpus) synthetisiert werden und sogar in bestimmten Gattungen der Convolvulaceen vorkommen.
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cyclischen Peptide sowie deren Verknupfung mit dem Lysergsaure-Rest ist eine Vorausseaung um Regulationsvorgange zu studieren. Der Peptidteil der Ergoline enthalt zwei ungewohnliche Strukturelemente: ~ eine a-Hydroxy-a-aminosaure-Gruppierung und eine C y c l o l - G n ~ p p i e r u n(Alkaloide vom Cyclol-Typ). Der Begriff ,Cyclol" wurde erstmals von WRINCH(1936) zwecks Charakterisierung hypothetischer Peptidstrukturen gepragt. Bei der Cyclolisierung in Proteinen sol1 durch Protonenwanderung von einer NH-Gruppe zu einem Carbonyl ein Ringschluf3 erfolgen. Dabei wird eine neue N-C-Bindung geknupft unter gleichzeitiger Ausbildung eines neuen Asymmetriezentrums mit einer tertiaren OH-Gruppe. Offensichtlich sind die Peptidalkaloide des Mutterkorns bislang die einzigen Naturstoffe, bei denen Cyclolstrukturen sicher nachgewiesen sind. Die Totalsynthese von Cyclolstrukturen verdanken wir vor allem den Arbeitskreisen um Hofmann und Shemyakin (HOFMANN et al., 1961; 1963; ANTONOVet al., 1963; SHEMYAKIN et al., 1962). Bei der alkalischen Hydrolyse der Alkaloide erhalt man stets L-Prolin und eine zweite variable L-Aminosaure sowie eine a-Ketosaure, die aus dem a-Hydroxy-a-aminosaure-Teil stammt. Biosynthetisch betrachtet lassen sich fur die Cyclolalkaloide folgende Strukturen formulieren: = Lysergyl-alanyl-phenylalanyl-prolin Ergotamin Ergosin = Lysergyl-alanyl-leucyl-prolin Ergostin = Lysergyl-a-Amino-butyryl-phenylalanyl-prolin Ergocristin = Lysergyl-valyl-phenylalanyl-prolin Ergocornin = Lysergyl-valyl-valyl-prolin a-Ergokryptin = Lysergyl-valyl-leucyl-prolin 6-Ergokryptin = Lysergyl-valyl-isoleucyl-prolin. Fur die Biosynthese der Cyclole ergeben sich nun eine Reihe von Moglichkeiten. Der Kettenstart konnte bei der Lysergsaure oder beim Prolin erfolgen. Damit ergeben sich verschiedene Varianten der Kettenverlangerung. So konnen die einzelnen Aminosauren an die Lysergsaure sukzessive angefugt werden, oder es werden Teilstucke, d. h. Di- oder Tripeptide an den ,,Starteru angehangt. Meiterhin ist zu klaren, auf welcher Stufe die Hydroxylierung der direkt mit der Lysergsaure verbundenen Aminosaure erfolgt und o b intermediar Diketopiperazinstrukturen durchlaufen werden. Zu untersuchen ist ferner, o b die Cyclolbildung in vivo ein spontan ablaufender ProzeB ist oder o b dieser Schritt enzymkatalysiert wird. In diesem Zusammenhang ist es von Interesse zu priifen, o b durch eine ,,Aktivierung'' der Carboxylgruppe des Prolins durch Glycin bzw. Alanin die Cyclol(1968) begunstigt wird. bildung im Sinne von RAMSTAD Die bisher vorliegeriden Ergebnisse zu diesem Problemkreis werden nachstehend diskutiert.
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Biosynthese des Peptidteils der Mutterkornalkaloide
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(1963) Erste Versuche mit saprophytischen Kulturen sind von VININCu. TABER durchgefuhrt worden. Sie verwendeten einen C. purpzrrea-Stamm, der in Oberflachenkulturen etwa 5 mgl5O ml Gesamtalkaloide bildete. Nach Applikation von Phenylalanin-U-14C (Fiitterungsdauer 35 Tage) wurden radioaktives Ergotamin sowie Ergocristin erhalten. Nach Hydrolyse und PC-Trennung liei3 sich radioaktives Phenylalanin nachweisen. Unter Verwendung von Submerskulturen eines Ergotoxinbildners (Stamm Pepty 695) konnte ein Einbau von L-l?r~lin-U-'~C in den Peptid-Teil eines Ergocornin/Ergokryptin-Gemisches nachgewiesen werden (GROGERU. Erge, 1970). Trotz verschiedener Inkubationszeiten (24h, 4Sh, 7 Tage) wurden etwa die gleichen spez. Einbauraten (2,6-2,995) gefunden. Der ' ~ b b a udes Ergotoxingemisches aus den verschiedenen Futterungsexperimenten ergab, daB 50%-60% der Radioaktivitat in dem durch Hydrolyse erhaltenen Prolin lokalisiert war. Oberraschend hoch war die Markierung in der Lysergsaure (14-35%). Offensichtlich wird ein gewisser Teil des applizierten L-Prolins schnell metabolisiert und unspezifisch eingebaut. Prinzipiell ahnliche Ergebnisse erhielten BASSETTet al. (1973) bei der Applikation (24h, 4Sh) von L - P r ~ l i n - u - ~an ~ Ceinen Erigotaminbildner (Hochleistungsstamm). Auch hier waren etwa 75% der im isolierten Ergotamin gefundenen Radioaktivitat in dem durch Hydrolyse erhaltenen Prolin lokalisiert. In der Lysergsaure wurden 14-21% der Radioaktivitat wiedergefunden. Der gleiche Arbeitskreis untersuchte den Einbau von L-Phenylalanin-U-lJC unter Submersbedingungen. Hier waren 95% der Radioaktivitat des Ergotamins im Phenylalanin-Teil des Molekiils und nur 2% in der Lysergsaure nachweisbar. Nach Prolingabe waren zahlreiche andere Aminosauren im Mycel markiert, wahrend nach Fiitterung von L-Phenylalanin-U-14C nur radioaktives Phenylalanin und Tyrosin gefunden wurden (BASSETTet al., 1971). Prolin wird bei diesem Stamm .starker metabolisiert und weniger spezifisch als die aron~atischeAminosaure in das Peptidalkaloid inkorporiert. Intensiv ist die Herkunft des u-Hydroxy-a-Aminosaure-Teils von Ergotamin und einigen Ergotoxin-Alkaloiden untersucht worden. MAJERet al. (1967) fannur 12% der im marden bei ihren Versuchen nach L-Alanin-U-14C-Applikation kierten Ergotamin vorhandenen Radioaktivitat im ,,Hydroxyalanin-Teil". Futterungsbedingungen und Ausbeuten sind leider -nicht angegeben. MINCHETTIu. ARCAMONE(1969) fanden einen besseren Einbau von L-Alaninol-U-I4C, verglichen mit L-Alanin-U-14C in den Hydroxyaminosaure-Teil bei ihrem Ergotaminstamm. Einen iibersichtlichen Abbau des markierten Ergotamins nach Futterung von L-Alanin-U-14C sowie D,L-Alanin-l-'4C (Applikationsdauer jeweils 6,511; 24h) fiihrten BASSETTe t al. (1973) durch. Die Einbauraten waren relativ
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Inkorporation uon Aminosauren
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gering und lagen zwischen 0,07-0,3%. Zum Vergleich sei angefiihrt, daf3 unter gleichen Versuchsbedingungen L-Prolin und L-Phenylalanin etwa zehnmal besser inkorporiert werden. Bei den L-Alanin-Versuchen verteilt sich die Radioaktivitat wie folgt: a-Hydroxyalanin-Teil (52-54%); Prolin (25-26%); Lysergyl-Rest (20-23%), Phenylalanin (6%). Bei Applikation des im C-1 markierten Alanins sind dagegen 90-94% im a-Hydroxyalanin-Teil nachweisbar. Die Autoren schluBfolgern daraus, daR alle drei C-Atome des Alanin eingebaut werden. Die schnelle Randomisierung bei Verwendung des L-Alanin-U-14C erklart sich durch die Decarboxylierung der Aminosaure und die Einschleusung der entstandenen CzEinheit in den allgemeinen Stoffwechsel. VerhaltnismaRig niedrige Einbauraten trotz langer Fiitterungsdauer (13 Tage, Submerskultur) nach Gabe von L-AlaninolU-14C und L-Alanin-U-14C erzielten FLOSSet al. (1971a). In beiden Fallen wurde eine erhebliche Verschmierung der Radioaktivitat im Ergotamin gefunden. Das aus dem Hydroxyaminosaure-Teil stammende pyruvat war nach Alaningabe weniger radioaktiv als nach L-Alaninolfiitterung. Vom Alanin wurde bei diesem Experiment allerdings eine wesentlich geringere Menge mit sehr holler spez. Radioaktivitat appliziert als beim Alaninol-Versuch. Bei Fiitterung einer groReren Menge Alanin mit geringerer spezifischer Radioaktivitat (Erhohung des Alaninpools der Zelle) stieg der Anteil der Markierung im Hydroxyalanin-Teil des Ergotamin. Zusammenfassend kann man feststellen, daf3 auf Grund der Resultate mehrerer Laboratorien Alanin oder eine nahe verwandte Verbindung als Vorstufe des a-Hydroxyalanin-Teils von Ergotamin angesehen werden konnen. Offen bleibt.die Bedeutung des Alaninols. Hier miiRte geklart werden, ob ein C2- oder C3-Fragment dieser Verbindung inkorporiert wird. Als Vorlaufer fur den a-Hydroxy-a-aminosaure-Teil der Ergotoxinalkaloide Ergocornin und Ergokryptin kann Valin angesehen werden. Nach Applikation von markierten Valinpraparaten wurde ein erheblicher Teil der Radioaktivitat < 50% im Dimethylpyruvat (aus dem a-Hydroxyvalin-Teil) wiedergefunden (FLOSSet al., 1971b; MAIERet al., 1971). Offenbar wird das gesamte C-Gexust dieser Aminosaure intakt inkorporiert. Dies geht insbesondere aus Versuchen mit D,L-Valin-l-'4C bzw. D,L-Alanin-l-14C hervor. Alanin-l-14C kann in der Zelle biosynthetisch zu Valin-l-I4C umgesetzt werden. Beim Abbau des nach der Futterung der beiden im C-1 markierten Aminosauren nach alkalischer Hydrolyse der Ergotoxine anfallenden Dimethylpyruvats waren -- 90% der Radioaktivitat in der Carboxylgruppe der a-Ketosaure lokalisiert. Als zweite ,,variableu Aminosaure ist im Ergocornin (3) Valin und im Ergokryptin (4) Leucin vorhanden. Da bei den ersten von uns durchgefiihrten Versuchen (FLOSS et al., 1971b) ein Ergotoxingemisch analysiert wurde, war es von Tnteresse, den Einbau der verzweigtkettigen Aminosauren in die einzelnen Ergotoxinalkaloide getrennt zu untersuchen (MAIERet al., 1971). Valin wird wie zu erwarten stets besser in Ergocornin als Ergokryptin eingebaut. Im Ergokryptin finden sich nach Valin-
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Futterung etwa 65-75% der Radioaktivitat im a-Hydroxyvalin-Teil, wahrend etwa K der Markierung im Leucin lokalisiert ist. Auffallig war die Konstanz der Radioaktivitatsverteilung unabhangig von der Applikationsdauer (2h-3 d). Die Markierung des Leucins nach Valin-Futterung ist erklarlich, da Valin durch Transaminierung in a-Ketoisovaleriansaure ubergehen kann, welches nach Kondensation rnit Acetyl-CoA und Durchlaufen mehrerer Zwischenstufen Leucin ergibt. Auch bei Kurzzeit-Experimenten war die spezifische Radioaktivitat beim Ergocornin im Dimethylpyruvat stets hoher als im Valin-Teil. Diese Ergebnisse lassen sich so deuten (FLOSSet al., 1971b), daf3 offenbar die Peptidkette vom Prolin her aufgebaut wird: Valin, welches im Tripeptid Valin bleibt, wird fruher inkorporiert als das Valin, welches als Vorstufe des a-Hydroxyvalins dient. Die Radioaktivitat des Valins wird im ersten Fall starker verdunnt durch ein grogeres Angebot an nicht-markierten pools (Valin enthaltende Peptide) als das Valin, welches schlieRlich zum sHydroxvalin" umgesetzt wird. Der endgiiltige Beweis, dat3 Prolin die ,,Startu-Aminosaure ist, muR jedoch noch erbracht werden. Versuche mit Valin-14C,'W sollten zeigen, o b der Stickstoff des Valins zur Peptidbildung mit der Lysergsaure genutzt wird (MAIERet al., 1971). In verschiedenen Versuchen wurden sehr unterschiedliche 'W/14C-Raten im u-Hydroxyvalin-Teil gefunden: 0,33, 0,12, 0,029. Das 15N/14C-Verhaltnisim a-Hydroxyvalin war im Ergocornin und Ergokryptin praktisch gleich. Diese Ergebnisse zeigen, daf3 offenbar ein starker 'W-Ausbau stattgefunden hat. Vom Clavine bildenden Stamm SD 58 ist bekannt (TEUSCHER, 1970), daR bei Transaminierungsreaktionen L-Valin als besonders guter Aminogruppen-Donator fungiert, wenn a-Ketoglutarat als NH2-Akzeptor eingesetzt wird. Wenn hohe Transaminierungsaktivitaten auch beim Peptidalkaloide bildenden Stamm vorhanden sind, wiirde sich leicht der starke I5N-Ausbau .erkliren. Man darf annehmen, daB die unmittelbar' mit Lysergsaure die Peptidbindung eingehende NH2-Gruppe vom Valin geliefert wird, obgleich der endgultige Beweis auf Grund der starken metabolischen Aktivitat dieser Aminosaure schwer zu erbringen sein diirfte. Nach Applikation von D,L-Leucin-l-14C und L-Leucin-U-14C war die spezifische Einbaurate im Ergokryptin etwa 10mal hoher als im Ergocornin. Leucin-14C wird erwartungsgemag bevorzugt in den Leucin-Teil von Ergokryptin inkorporiert. Crberraschend war die verhaltnismaf3ig starke Markierung des a-HydroxyvalinTeils dieses Alkaloids. Offenbar wird Leucin metabolisiert und die Bruchstucke via Valin eingebaut. Im Zuge des Leucinabbaues entsteht Acetyl-CoA, welches iiber mehrere Zwischenstufen, u. a. Brenztraubensaure, in Valin ubergehen kann. Diese Reaktionsfolge wiirde die Valin-Markierung nach L-Leucin-U-14C-Fiitterung erklaren. Ein unspezifischer Einbau ist nach D,L-Valin-l-I4C-Gabe zu diskutieren. Hier wird kein markiertes Acetyl-CoA erhalten, da beim ersten Abbauschritt C 0 2 Freigesetzt wird, das die gesarnte Radioaktivitat enthalt. Lysergsaure wird spezifisch in Ergotoxin inkorporiert, dagegen wird Lyserg-
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saureamid nicht als Zwischenstufe bei der Peptidalkaloidbildung durchlaufen (MAIER et al., 1971). Einbau von potentiellen Zwischenstufen
Ober den moglichen Mechanismus der Cyclolbildung bei Mutterkornalkaloiden liegen von verschiedenen Autoren (AGURELL, 1966; RAMSTAD, 1968; ABE, 1969)
-Hypothese von Agurell: 7'43
+ C HII - N H , COOH
.\
- &;? .
H
(5) Lysergsaure (6)A la nin
Hypothese von Abe: '43% ,c'43 I
I
+
COO,,
I
I
H
L~-.C~-NH-CY
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&
CH3
N-CH3
7 "N.
'H
I ,C=O
C
-
/CH3 'cH~-c~
(71 Lysergylalanin
(11 Ergotamin
Lyserg.co-NH -c/ I OC-
l
l
N H ~ C CH2-CH 3 0/CH3 \
CH3
(I 0) Lysergylvalin
(11) Leu-Pro-Lactam
CH3
( 4 ) Ergokryptin
Abb. 2. Mechanismus der Peptidalkaloidbildung nach AGURELL und ABE. Lyserg. CO
=
Lysergyl
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Hypothesen vor, die gewisse Gemeinsamkeiten erkennen lassen. Nach AGURELL (1966) wird als eine der ersten Vorstufen bei der Ergotaminbildung (Abb. 2) Lysergylalanin (7) durchlaufen. Reduktion der Carbonylgruppe von (7) fiihrt zum Ergometrin; andererseits kann ausgehend von Lysergylalanin uber mehrere Diketopiperazin-Strukturen enthaltende Zwischenstufen (8) (9) Ergotamin (1) entstehen. Xhnliche Vorstellungen sind von ABE (1969) fiir Ergotoxinalkaloide entwickelt worden. In Analogie zu (7) ubernimmt hier Lysergylvalin (8) die ,,Starterfunktionu, welches sich mit dem entsprechenden freien Diketopiperazin kondensiert. Beim Ergokryptin (4) ist dies L-Leucyl-L-prolin-lactam(11). RAMSTAD (1968) vermutet, daB sich Lysergsaure mit einem Tetrapeptid zu einem Lysergyltetrapeptid- (12) umsetzt. Durch die terminale Aminosaure (Alanin, Glycin) sol1 das Prolincarboxyl ,,aktiviertU werden. Durch Abspaltung von Alanin bzw. Glycin kijnnte spontan Diketopiperazinbildung (13) eintreten. Bekanntlich neigen aktivierte Prolin enthaltende Peptide in bisonderem Maf3e zur Ringbildung. Die mit dem Lysergyl-Rest verbundene Aminosaure wird unter Bildung von (14) durch ein spezifisches Enzym hydroxyliert. Spontan tritt nun Cyclolisierung ein, wobei ein neues Asymmetriezentrum aufgebaut wird und das Molekul sich stabilisiert (15). Die Postulierung von einfachen Lysergylderivaten als Voret al. stufen fur Peptidalkaloide ist sicherlich durch die Befunde von SCHLIENTZ (1963) stimuliert worden. Diese Autoren konnten den Methylester von d-LysergylL-valin (10) aus Alkaloidmutterlaugen von Zuchtmutterkorn isolieren und in vielen Mutterkorndrogen als Spurenalkaloid nachweisen. Ahnliche Ergebnisse u. ROCHELMEYER (1966) mitgeteilt worden. sind von HOHMANN Die Beteiligung von Lysergyl-Derivaten sowie Oligopeptiden und Diketopiper-
Lyserg.
Hydroxylase --C
7
y\?,>m -
Ly%rg.co-NU-c-0 c
I
1
OC-N,
l
sDontmn
l
I
1
Lyserg CO-NH-
C , =O
&..
R2
Abb. 3. Mechanismus der Cyclolalkaloidsynthese n. RAMSTAD. Lyserg. CO einer weiteren Aminosaure (Glycin, Alanin)
,CEO
OC-N,
H,c...
=
Lysergyl. X
R2
=
Rest
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azinen an der Cyclolalkaloidbildung ist in verschiedenen Laboratorien experimentell gepruft worden. Die Verbindungen wurden an intaktes Mycel verschiedener Mutterkornstamme appliziert und dienten ferner als Substrat fur Rohenzymextrakte. OHASHIe t al. (1972) inkubierten [d-Lysergyl-L-valinmethylester-U-TI lfih bei 2 8 O mit einem-zellfreien Extrakt des Cfaviceps-Stammes HA-6 vom Elyrnz~s-Typ und konnten mittels Radioscanner radioaktives Ergokryptin/Ergokryptininnachweisen. Bei der Inkubation von Elymoclavin-U-14C zusammen mit nichtmarkiertem Lysergylvalinmethylester war das Ergotoxinalkaloid wesentlich weniger radioaktiv als nach Inkubation von Elymoclavin-U-I4C allein. Ein definierter Abbau der Alkaloide wurde nicht durchgefiihrt. Die Autoren leiten aus diesen Ergebnissen eine direkte Beteiligung des Lysergylvalins an der Ergokryptinbildung das entsprechende ab. FLOSSet al. (1971a) verfiitterten d-Lysergyl-L-alanin-U-14C, Isolysergsaure-Derivat sowie d-Lysergyl-L-alanin-l-14Can Submerskul,turen eines Ergotaminbildners. Neben geringen Einbauraten in das Alkaloid war eine erhebliche Verschmierung der Radioaktivitat in den einzelnen Fragmenten beim Abbau zu beobachten. Dies deutet auf eine Hydrolyse und nachfolgenden Einbau des Alanins hin. Die gleichen Resultate wurden von FLOSSet al. (1971b) bei Verfiitterung von d-Lysergyl-L-valin-l-'4Cbzw. dem entsprechenden IsolysergsaureDerivat an einen Ergocornin-Ergokryptinbildner erhalten. Bei intaktem Einbau sollte die gesamte Radioaktivitat im a-Hydroxyvalin-Teil lokalisiert sein. Dies war jedoch bei keinem Versuch der Fall. Stets waren die anderen Spaltprodukte ebenfalls radioaktiv, insbesondere das aus dem Ergocornin stammende Valin. Das Verteilungsmuster der Markierung im Ergotoxingemisch entsprach praktisch einer Valinfiitterung und schliegt somit L~sergylvalinals unmittelbare Vorstufe fiir Ergotoxinalkaloide weitgehend aus. Um nahere Einblicke in den Stoffwechsel von L~sergyl-Derivatenzu erhalten, wurden d-Lysergyl-L-alanin-U-'4C-methylester und d-Lysergyl-L-valin-U-l4Cmethylester an einen saprophytischen Ergotoxinbildner und einen saprophytisch et al., 1974). Gearbeitet wurde ergolinfreien Mutterkornstamm verfuttert (MAIER . mit der Replacement-Technik (Sh, 24") sowie mit ~ o h e n z ~ m e x t r a k t e nBeide Stamme spalten im Replacement d-Lysergylalanin-OMe. Als Hauptprodukt entsteht Lysergylalanin (7). Daneben lassen sich freies Alanin sowie Lysergsaure nachweisen. Ahnliche Verhaltnisse finden sich beim d-Lysergyl-L-valin-U-'4Cmethylester. Eine wesentlich starkere Spaltung und nachfofgend starke Markierung der Proteinfraktion ist hier beim Ergotoxinbildner, verglichen tnit dem Nichtproduzenten, erfolgt. Eine Spaltung der Ersterbindung sowie der Peptidbindung von Lysergyl-aminosaureestern wird auch durch Rohenzymextrakte beider Stamme katalysiert. Beim Lysergylalanin-OMe-Versuch sind Alanin und Lysergylalanin etwa gleich stark markiert. Auch hier 1aGt sich eindeutig freie Lysergsaure nachweisen. Beim d-Lysergyl-valin-methylesterwird offenbar die Peptidbindung we,
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sentlich schneller gespalten, da bei beiden Stammen Valin starker markiert ist als Lysergylvalin. Zusammenfassend 1ai3t sich feststellen, daR bei den von uns untersuchten C. purpurea-Stammen offenbar Enzymsysteme enthalten sind, die einfache Lysergyl-Derivate spalten. Diese Versuche schlieRen eine mogliche Kompartimentierung nicht aus, d. h. von auRen applizierte Lysergyl-Derivate werden zwar rasch hydrolysiert, intrazellular lauft aber dennoch die Peptidalkaloidsynthese iiber d ~ e s eVerbindungen. Um dies zu priifen, wurden Trapping-Versuche durchgefiihrt. Es liei3en sich aber in keinem Fall nach Applikation iron radioaktivem Alanin bzw. Valin markierte Lysergylaminosaure-Derivate fassen. Der Einbau von Diketopiperazinen, z. B. ( l l ) , in den Peptidteil der Ergolinalkaloide ist erstmals von Abe's Arbeitskreis untersucht worden. Zusammen mit inaktivem Elymoclavin (als Lysergsaure-Vorstufe) wurden an zellfreie Extrakte sowie [Lverschiedener Mutterkornstamme [L-Leucyl-D-prolin-lactam-U-TI Phenylalanyl-D-prolin-lactam-U-TIals Substrate appliziert. Im ersten Fall lieR sich radioaktives ErgokryptinIErgokryptinin und nach Gabe von Phe-Pro-lactam ErgotaminIErgotaminin nachweisen (ABE, 1969). Ahnliche Versuche wurden mit der Replacement-Technik unter Verwendung der Mycelien verschiedener Stamme durchgefiihrt. Die Lactame wurden in Phosphatpuffer gelost und das G a m e 18'' geschiittelt. Als Substrate hat man hier neben den D-Prolin enthaltenden Diketopiperazinen auch L-Leucyl-L-Prolin-lactam und [L-Phenylalanyl-L-Prolin-lactamU-TI eingesetzt. Die gebildeten Alkaloide wurden mit nichtmarkiertem Alkaloid verdiinnt und bis zur konst. Radioaktivitat umkristallisiert. Die L- bzw. D-Prolin enthaltenden Lactame ergaben. die gleichen Einbauraten. Das bedeutet, bei den D-Prolin enthaltenden Lactamen mui3te vor der Inkorporation Konfigurationsumkehr stattgefunden haben (ABEet al., 1971). In einer weiteren Arbeit (OHASHI et a]., 1972) wird nochmals berichtet, daR [L-Leucyl-L-prolin-U-TI in einem zellfreien System in Ergokryptin/Ergokryptinin inkorporiert wird. Verwendet man unter gleichen Bedingungen, D,L-Leucin-1-I4C, L-Prolin-U-'C und D,L-Valin1-14C als Substrate, so konnte nur nach Valingabe markiertes Alkaloid gefunden werden. Das Resultat wird als Beweis interpretiert, daR L-Valin uber d-LysergylL-valin in Peptidalkaloide inkorporiert wird. Uberraschend ist der Nicht-Einbau der beiden anderen Aminosauren in den Peptidteil des Ergokryptins. Interessant sind die Befunde uber das Vorkommen von Prolin enthaltenden Diketopiperazinen in verschiedenen Ergot-Stammen (ABEet al., 1970). So konnten L-Leucyl-D-prolinlactam und ein unbekanntes Pr~l~ldiketopiperazin in Sklerotien und Oberflachenkulturen eines Ergokryptin-Stammes und Phe-Pro-lactam sowie Phe-D-Pro-lactam in Sklerotien eines Ergotamin-Stammes nachgewiesen werden. Der Gehalt an Prolyldiketopiperazinen stieg im Verlauf der Oberflachenkultur eines ErgokryptinStammes standig a n und erreichte gleichzeitig mit dem maximalen Alkaloidgehalt am 40. Tag den hochsten Wert (0,4 pMo1/40 ml).
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Der Einbau verschiedener Oligopeptide und Diketopiperazine unter Verwenu. JOHNE (1972) dung eines ErgocorninlErgokryptin-Statnmes wurde von GROCER und GROCER et al. (1974) untersucht. Die Vorstufen wurden wahrend der Idiophase an 5 Tage alte Submerskulturen appliziert. Die Inkubationsdauer betrug 17h-441'.Gefuttert wurden u. a. L-Valyl-L-leucin-U-'4C, L-Valyl-L-leucyl-L-prolinU-I4C, L-Leucyl-L-prolin-U-'4C-lactam und L-Valyl-L-prolin-U-14C-lactam. Das Alkaloidgemisch wurde aufgetrennt, mit inaktivem Material verdunnt und die einzelnen Alkaloide einem definierten Alkaloidabbau unterworfen. Val-Leu, ValLeu-Pro und Leu-Pro-lactam sind mogliche Teilsequenzen von Ergokryptin. Falls eln spezifischer Einbau erfolgt, sollte nur Ergokryptin markiert sein. Bei einem spezifischen Einbau von L-Valyl-L-prolin-lactam diirfte nur radioaktives Ergocornin gebildet werden. Es zeigt sich jedoch bei allen Fiitterungen, da& jeweils beide Alkaloide markiert waren. Nach Verfutterung der Prolyllactame war stets der uberwiegende Teil der Radioaktivitat im aus Ergocornin und Ergokryptin isolierten Prolin (72-90%) lokalisiert. Nach L-Valyl-L-Leucyl-L-prolin-U-14C-Fiitterung lie& sich markiertes Ergocornin und Ergokryptin isolieren. In beiden Alkaloiden war die Radioaktivitat praktisch vollstandig im Prolin (95%) lokalisiert. Analoge Versuche mit einem anderen Tripeptid, namlich L-Valyl-l-14C-L-valy1L-prolin sind von FLOSSet al. (1974) beschrieben worden. Bei einem intakten Einbau ist nur radioaktives Ergocornin zu erwarten, welches spezifisch im aHydroxyvalin-Teil markiert sein sollte. Der Abbau ergab eine Gleichverteilung der Radioaktivitat im a-Hydroxyaminsaure-Teil und im Valin von Ergocornin sow,ie eine erhebliche Markierung des ,,a-Hydroxyvalins" des Ergokryptins. Fiitterungsversuche von L-Prolyl-U-14C-alanin und L-Prolyl-U-14C-glycin ergaben, daR auch diese Dipeptide vom Pilz gespalten werden und das Prolin zur Markierung des Ergotoxingemisches herangezogen wird. Weiterhin wurde gefunden, daf3 nach Verfutterung der Oligopeptide und Diketopiperazine die Proteinfraktion stark radioaktiv war und sich die entsprechenden radioaktiven Aminoet al., 1974). sauren im Pool der freien Aminosauren nachweisen lieBen (GROCER In. diesem Zusammenhang war auch das Vorkommen und der Stoffwechsel der Diketopiperazine in Claviceps-Arten von Interesse. Wir konnten in frisch geernteten Sklerotien verschiedener Mutterkornstamme keine cyclischen Dipeptide finden. Eingehe~id wurden Submerskulturen des Ergocornin/Ergokryptin-Scammes Pepty 695 im Verlauf der Kulturentwicklung untersucht. In Spuren lieBen sich einmal wahrend der Idiophase Val-Pro-lactum und in einern zweiten Versuch Val-Pro-lactam und Leu-Pro-lactam jeweils an einern Kulturtag nachweisen. Eine Korrelation zwischen Alkaloidbildung und dem Vorkommen von Lactamen bestand nicht. Oberraschend waren die Ergebnisse von Replacementversuchen unter Venvendung verschiedener Claviceps-Stamme. Bei einer Versuchsdauer von 24" unter Verwendung eines Vollmediums wurde eine erhebliche Spaltung von LLeucyl-L-prolyl-lactam durch Claviceps purpurea-Stamme gefunden. Mycel eines
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Vergleicht man die Untersuchungen verschiedener Arbeitskreise, so ergibt sich ein unterschiedliches Bild. Nach ABE'S Vorstellungen sind Lysergylvalin und Diketopiperazine obligatorische freie Zwischenstufen, die bei der Peptidalkaloidbildung durchlaufen werden. Die Laboratorien von FLOSSund GROCER konnten durch Versuche mit intaktem Mycel von Claviceps nachweisen, daR Lysergylvalin, Di- und Tripeptide sowie Diketopiperazine gespalten werden und die freien Aminosauren zur Alkaloidsynthese Verwendung finden. Moglicherweise sind die Diskrepanzen auf unterschiedliche Kulturbedingungen sowie verschiedenes Pilzmaterial zuruckzufiihren. Fur mechanistische Betrachtungen von groRer Bedeutung sind die Befunde von ST~~T et Zal. (1973).Bei der schonenden Aufarbeitung des Mycels eines ErgocristinStammes gelang ihnen die Isolation eines neuen Alkaloids: N-[N-(d-Lysergy1)L-valyll-L-phenylalanyl-D-prolin-lactam (16). Diese Verbindung ist augerordentlich labil und zerfallt leicht in Lysergylvalin-methylester und Phe-D-Pro-lactam. Die Autoren sind der Meinung, daR es sich bei der friiher beschriebenen Isolierung des Methylesters von (10) urn ein Artefakt handelt, welches erst bei der Aufet al., 1963). Somit entfallt ein wichtiges arbeitung entstanden sei (SCHLIENTZ Argument fur die Hypothese, daiS die Cyclolalkaloidbildung via LysergylaIaninbzw. -valin verlauft. Ober die Verbreitung von (16) sowie analoger Verbindung ist noch nichts bekannt. Das unterschiedliche Auftreten von Alkaloiden dieses
'I
HN
Abb. 4. (16) N-[N-(d-Lysergyl)-valyl]-L-phenylalanyl-D-prolin-Lactam
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Clavinbildners (SD 58) und Claviceps paspali war dagegen nicht 'in der Lage, Lactame zu spalten. Da Leu-Pro-U-14C-lactam im Mycel nach Inkubation nicht nachweisbar war, kann man vermuten, daR bei den letztgenannten Stammen Diketopiperazin-spezifische Transportsysteme fehlen.
Biosynthese des Peptidteils der Mutterkornalkaloide
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neuen Struktur-Typs in verschiedenen Claviceps-Stammen und deren Spaltung in die beiden Komponenten bei der Aufarbeitung wurde zwanglos die verschiedenen Befunde beirn Diketopiperazin-Nachweis in Claviceps-Arten erklaren. Wir bevorzugen die Hypothese, daB es sich bei der Peptidteilbildung der Cyclolalkaloide u m einen RNS-unabhangigen nichtribosomalen ProzeR handelt. Darauf deuten Hemmversuche mit Cycloheximid hin (ERGEet al., 1972). Offenbar Iaufl die Bildung an einem Multienzymkomplex ab, etwa vergleichbar mit der Biosynthese bestimmter Peptidantibiotica (Gramicidin, Tyrocidin). An einen ,,Starter" werden die einzelnen Aminosauren bzw. Lysergsaure sukzessive angefugt. Bei der Verknupfung der einzelnen Bausteine der Peptidalkaloide Lysergsaure Aminosauren handelt es sich um einen stark endergonischen ProzeB. Die einzelnen Verbindungen sollten daher im Pilz intermediar in ,,aktivierterU Form vorliegen. Aktivierungsreaktionen bei Claviceps sind von uns untersucht worden (MAIERet al., 1972). Interessant sind die Befunde iiber die Prolin-Aktivierung in jungen Kulturen eines Ergotoxinbildners. Bei der Messung der ,,Gesamtaktivierung" (Prolin zur Proteinsynthese sowie zur Alkaloidbildung) wurden hier 2040-fach hohere Werte gefunden als bei entsprechenden Kulturen der NichtPeptidalkaloide produzierenden Stamme. Dieser Befund unterstutzt die Annahme, daB der Kettenstart vom Prolin her beginnt. FLOSS e t al. (1974) haben kiirzlich ein entsprechendes Schema (Abb. 5) fiir ~ r ~ o t o x i nformuliert. e Die ersten Schritte bis zur Ausbildung eines Lysergyltripeptides laufen demnach enzymgebunden ab. Die Ablosung vom Enzym konnte
2 Enz -SH
H3%cf+ l-4
1%
JJ
L~S-N,,MCH C
o=,-I, I
" C-0
I Uydroxylierunq .
2.Cyclolisierung
Abb. 5. Biosynthese von Ergocornin
11.
FLOSS et al. (1974'). Lys
=
d-Lysergsaure
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+
Crijger
Planta medica Vol. 28 1975
durch einen. intramolekularen Angriff des Stickstoffs von der dem Prolin benachbarten Aminosaure unter gleichzeitiger Lactamisierung erfolgen. Dies konnte das erste freie Zwischenprodukt sein. Im Normalfall erfolgt nun die Bildung der a-Hydroxy-a-Aminosaure-Gruppierung und Cyclolisierung. Offen bleibt, wieviel Enzyme die letzten Biosyntheseschritte katalysieren und ob sie mit dem Multienzymkom~lexassoziiert sind. Tritt auf der Stufe von (21) eine nichtenzymatische Epimerisierung ein, so kommt es zur Bildung von (22), einer Verbindung, in der Prolin in der D-Konfiguration vorliegt und die offensichtlich nicht weiter urngesetzt werden kann. Der erste Vertreter dieses neuen Alkaloid-Typs ist von ST~JTZ et al. (1973) isoliert worden (16). Die endgiiltige Klarung dieses Problems ist abhangig von der Isolation der entsprechenden Enzymsysteme. Dies wiirde nicht nur einen entscheidenden Fortschritt auf dem Mutterkorngebiet darstellen sondern auch von grogem allgemeinem biochemischem Interesse sein. Als Modellsysteme zur Untersuchung der Mechanismen der nichttribosomalen Peptids~nthesebei Eucaryonten, die bislang kaum untersucht ist, scheinen sich Mutterkornstamme in besonderer Weise zu eignen.
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Biosynthese des Peptidteils der Mutterkornalkaloide
BIOSYNTHESE DES PEPTIDTEILS DER MUTTERKORNALKALOIDE V O M CYCLOL-TYP
Biosynthes'is of the Peptide Portion o f Cyclol-type Ergot Alkaloids
Abstract A review is given on the biosynthesis o f the peptide moiety in ergot alkaloids. Feeding experiments with labeled amino acids have revealed that phenylalanine, proline, valine and leucine are specifically incorporated into the appropriate constituents of the peptides of ergotamine, ergocornine and ergokryptine, respectively. The a-hydroxy-&-aminoacid residue of the ergotoxine alkaloids is derived from valine. In the case of ergotamine alanine or a close relative is the immediate precursor of the hydroxyamino acid fragment. The exact mechanism of cyclol formation in ergot alkaloid biosynthesis is not yet clarified. Abe's group in Japan has found the intact incorporation of lysergylalanine and lysergylvaline in peptide alkaloids of various ergot strains. Furthermore they demonstrated the incorporation of L-lezrcyl-L-proline lactam and Lphenylalanyl-l-proline-lactam in ergokryptine and ergotamine, respectively. Other authors (Floss, Groger) did not confirm these results. They have tested the possible involvement o f free simple lysergic acid derivatives, various di- and tripeptides as well as the corresponding diketopiperazines. In these experiments the added precursors were split by the fulzgus into the correspo~zdingcompounds (lysergic acid and amino acids) prior to incorporation into the peptide moitety o f ergot alkaloids. Based on these results and on inhibitor experiments one may speculate that the synthesis o f the peptide portion is a nonribosomal process. Apparently like in the biosynthesis of peptide antibiotics the peptide chain formation takes place on a multienzyme complex. Einfiihrung Bislang sind etwa 50 Mutterkornalkaloide bekannt. Die iiberwiegende Zahl dieser Indolalkaloide wurde aus verschiedenen Claviceps-Arten isoliert. Lange Zeit war man der Ansicht, dat3 nur Vertreter dieser Ascomyceten-Gattung in der
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Von D. GROCER
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Planta medica Vol. 28 1975
Groger
/CH
(2) R l r R Z = ~ ; R ~ CHTCH =
(3)
n,, RZ= C H ~ ;R3=
'CH3 / CH3
-cH
'CH~
: ~rgosin
: Ergocornin
0CH3 : a-Ergokryptin (4) Rq,R2=CH3; R3= -CH2-CH 'CH~
Abb. 1. Strukrurformeln einiger Cyclolalkaloide des Mutterkorns
Die Peptidalkaloide (Abb. 1)des Mutterkorns und die entsprechenden Dihydro'Derivate sind von augerordentlicher Bedeutung fiir die Therapie. Offensichtlich ist dieser Alkaloid-Typ bisher nicht in Pilzen auRerhalb der Gattung Claviceps nachgewiesen worden. Kiirzlich konnte jedoch ein Vertreter, namlich das Ergosin (2), aus Samen vort Ipomoea argyrophylla VATKE(STAUFFACHER et al., 196.5) isoliert werden. Die Chemie und Biochemie der Mutterkornalkaloide ist ausfiihrlich von HOFMANN (1964), GROCER(1972) und THOMAS u. BASSETT(1973) dargestellt worden. Neben der Gewinnung der Peptidalkaloide aus Sklerotien besteht die Moglichkeit der Isolation aus saprophytischen Kulturen, nachdem es vor allem italieni1966; AMICIet al., schen Autoren gelang, geeignete Stamme zu isolieren (TONOLO, 1966; 1969). Derartige Stamme eignen sich gut zur Untersuchung der Biosynthese des Peptidteiles der Ergolinalkaloide. Die Kenntnis der Bildungsmechanismen der
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Lage sind, Ergolin-Derivate zu bilden. Heute weiR man, dai3 Ergoline, insbesondere Clavin-Alkaloide auch von anderen Pilzen (Aspergillus, Penicillittm, Rhimpus) synthetisiert werden und sogar in bestimmten Gattungen der Convolvulaceen vorkommen.
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cyclischen Peptide sowie deren Verknupfung mit dem Lysergsaure-Rest ist eine Vorausseaung um Regulationsvorgange zu studieren. Der Peptidteil der Ergoline enthalt zwei ungewohnliche Strukturelemente: ~ eine a-Hydroxy-a-aminosaure-Gruppierung und eine C y c l o l - G n ~ p p i e r u n(Alkaloide vom Cyclol-Typ). Der Begriff ,Cyclol" wurde erstmals von WRINCH(1936) zwecks Charakterisierung hypothetischer Peptidstrukturen gepragt. Bei der Cyclolisierung in Proteinen sol1 durch Protonenwanderung von einer NH-Gruppe zu einem Carbonyl ein Ringschluf3 erfolgen. Dabei wird eine neue N-C-Bindung geknupft unter gleichzeitiger Ausbildung eines neuen Asymmetriezentrums mit einer tertiaren OH-Gruppe. Offensichtlich sind die Peptidalkaloide des Mutterkorns bislang die einzigen Naturstoffe, bei denen Cyclolstrukturen sicher nachgewiesen sind. Die Totalsynthese von Cyclolstrukturen verdanken wir vor allem den Arbeitskreisen um Hofmann und Shemyakin (HOFMANN et al., 1961; 1963; ANTONOVet al., 1963; SHEMYAKIN et al., 1962). Bei der alkalischen Hydrolyse der Alkaloide erhalt man stets L-Prolin und eine zweite variable L-Aminosaure sowie eine a-Ketosaure, die aus dem a-Hydroxy-a-aminosaure-Teil stammt. Biosynthetisch betrachtet lassen sich fur die Cyclolalkaloide folgende Strukturen formulieren: = Lysergyl-alanyl-phenylalanyl-prolin Ergotamin Ergosin = Lysergyl-alanyl-leucyl-prolin Ergostin = Lysergyl-a-Amino-butyryl-phenylalanyl-prolin Ergocristin = Lysergyl-valyl-phenylalanyl-prolin Ergocornin = Lysergyl-valyl-valyl-prolin a-Ergokryptin = Lysergyl-valyl-leucyl-prolin 6-Ergokryptin = Lysergyl-valyl-isoleucyl-prolin. Fur die Biosynthese der Cyclole ergeben sich nun eine Reihe von Moglichkeiten. Der Kettenstart konnte bei der Lysergsaure oder beim Prolin erfolgen. Damit ergeben sich verschiedene Varianten der Kettenverlangerung. So konnen die einzelnen Aminosauren an die Lysergsaure sukzessive angefugt werden, oder es werden Teilstucke, d. h. Di- oder Tripeptide an den ,,Starteru angehangt. Meiterhin ist zu klaren, auf welcher Stufe die Hydroxylierung der direkt mit der Lysergsaure verbundenen Aminosaure erfolgt und o b intermediar Diketopiperazinstrukturen durchlaufen werden. Zu untersuchen ist ferner, o b die Cyclolbildung in vivo ein spontan ablaufender ProzeB ist oder o b dieser Schritt enzymkatalysiert wird. In diesem Zusammenhang ist es von Interesse zu priifen, o b durch eine ,,Aktivierung'' der Carboxylgruppe des Prolins durch Glycin bzw. Alanin die Cyclol(1968) begunstigt wird. bildung im Sinne von RAMSTAD Die bisher vorliegeriden Ergebnisse zu diesem Problemkreis werden nachstehend diskutiert.
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Biosynthese des Peptidteils der Mutterkornalkaloide
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Planta rnedica Vol. 28 1975
Groger
(1963) Erste Versuche mit saprophytischen Kulturen sind von VININCu. TABER durchgefuhrt worden. Sie verwendeten einen C. purpzrrea-Stamm, der in Oberflachenkulturen etwa 5 mgl5O ml Gesamtalkaloide bildete. Nach Applikation von Phenylalanin-U-14C (Fiitterungsdauer 35 Tage) wurden radioaktives Ergotamin sowie Ergocristin erhalten. Nach Hydrolyse und PC-Trennung liei3 sich radioaktives Phenylalanin nachweisen. Unter Verwendung von Submerskulturen eines Ergotoxinbildners (Stamm Pepty 695) konnte ein Einbau von L-l?r~lin-U-'~C in den Peptid-Teil eines Ergocornin/Ergokryptin-Gemisches nachgewiesen werden (GROGERU. Erge, 1970). Trotz verschiedener Inkubationszeiten (24h, 4Sh, 7 Tage) wurden etwa die gleichen spez. Einbauraten (2,6-2,995) gefunden. Der ' ~ b b a udes Ergotoxingemisches aus den verschiedenen Futterungsexperimenten ergab, daB 50%-60% der Radioaktivitat in dem durch Hydrolyse erhaltenen Prolin lokalisiert war. Oberraschend hoch war die Markierung in der Lysergsaure (14-35%). Offensichtlich wird ein gewisser Teil des applizierten L-Prolins schnell metabolisiert und unspezifisch eingebaut. Prinzipiell ahnliche Ergebnisse erhielten BASSETTet al. (1973) bei der Applikation (24h, 4Sh) von L - P r ~ l i n - u - ~an ~ Ceinen Erigotaminbildner (Hochleistungsstamm). Auch hier waren etwa 75% der im isolierten Ergotamin gefundenen Radioaktivitat in dem durch Hydrolyse erhaltenen Prolin lokalisiert. In der Lysergsaure wurden 14-21% der Radioaktivitat wiedergefunden. Der gleiche Arbeitskreis untersuchte den Einbau von L-Phenylalanin-U-lJC unter Submersbedingungen. Hier waren 95% der Radioaktivitat des Ergotamins im Phenylalanin-Teil des Molekiils und nur 2% in der Lysergsaure nachweisbar. Nach Prolingabe waren zahlreiche andere Aminosauren im Mycel markiert, wahrend nach Fiitterung von L-Phenylalanin-U-14C nur radioaktives Phenylalanin und Tyrosin gefunden wurden (BASSETTet al., 1971). Prolin wird bei diesem Stamm .starker metabolisiert und weniger spezifisch als die aron~atischeAminosaure in das Peptidalkaloid inkorporiert. Intensiv ist die Herkunft des u-Hydroxy-a-Aminosaure-Teils von Ergotamin und einigen Ergotoxin-Alkaloiden untersucht worden. MAJERet al. (1967) fannur 12% der im marden bei ihren Versuchen nach L-Alanin-U-14C-Applikation kierten Ergotamin vorhandenen Radioaktivitat im ,,Hydroxyalanin-Teil". Futterungsbedingungen und Ausbeuten sind leider -nicht angegeben. MINCHETTIu. ARCAMONE(1969) fanden einen besseren Einbau von L-Alaninol-U-I4C, verglichen mit L-Alanin-U-14C in den Hydroxyaminosaure-Teil bei ihrem Ergotaminstamm. Einen iibersichtlichen Abbau des markierten Ergotamins nach Futterung von L-Alanin-U-14C sowie D,L-Alanin-l-'4C (Applikationsdauer jeweils 6,511; 24h) fiihrten BASSETTe t al. (1973) durch. Die Einbauraten waren relativ
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Inkorporation uon Aminosauren
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gering und lagen zwischen 0,07-0,3%. Zum Vergleich sei angefiihrt, daf3 unter gleichen Versuchsbedingungen L-Prolin und L-Phenylalanin etwa zehnmal besser inkorporiert werden. Bei den L-Alanin-Versuchen verteilt sich die Radioaktivitat wie folgt: a-Hydroxyalanin-Teil (52-54%); Prolin (25-26%); Lysergyl-Rest (20-23%), Phenylalanin (6%). Bei Applikation des im C-1 markierten Alanins sind dagegen 90-94% im a-Hydroxyalanin-Teil nachweisbar. Die Autoren schluBfolgern daraus, daR alle drei C-Atome des Alanin eingebaut werden. Die schnelle Randomisierung bei Verwendung des L-Alanin-U-14C erklart sich durch die Decarboxylierung der Aminosaure und die Einschleusung der entstandenen CzEinheit in den allgemeinen Stoffwechsel. VerhaltnismaRig niedrige Einbauraten trotz langer Fiitterungsdauer (13 Tage, Submerskultur) nach Gabe von L-AlaninolU-14C und L-Alanin-U-14C erzielten FLOSSet al. (1971a). In beiden Fallen wurde eine erhebliche Verschmierung der Radioaktivitat im Ergotamin gefunden. Das aus dem Hydroxyaminosaure-Teil stammende pyruvat war nach Alaningabe weniger radioaktiv als nach L-Alaninolfiitterung. Vom Alanin wurde bei diesem Experiment allerdings eine wesentlich geringere Menge mit sehr holler spez. Radioaktivitat appliziert als beim Alaninol-Versuch. Bei Fiitterung einer groReren Menge Alanin mit geringerer spezifischer Radioaktivitat (Erhohung des Alaninpools der Zelle) stieg der Anteil der Markierung im Hydroxyalanin-Teil des Ergotamin. Zusammenfassend kann man feststellen, daf3 auf Grund der Resultate mehrerer Laboratorien Alanin oder eine nahe verwandte Verbindung als Vorstufe des a-Hydroxyalanin-Teils von Ergotamin angesehen werden konnen. Offen bleibt.die Bedeutung des Alaninols. Hier miiRte geklart werden, ob ein C2- oder C3-Fragment dieser Verbindung inkorporiert wird. Als Vorlaufer fur den a-Hydroxy-a-aminosaure-Teil der Ergotoxinalkaloide Ergocornin und Ergokryptin kann Valin angesehen werden. Nach Applikation von markierten Valinpraparaten wurde ein erheblicher Teil der Radioaktivitat < 50% im Dimethylpyruvat (aus dem a-Hydroxyvalin-Teil) wiedergefunden (FLOSSet al., 1971b; MAIERet al., 1971). Offenbar wird das gesamte C-Gexust dieser Aminosaure intakt inkorporiert. Dies geht insbesondere aus Versuchen mit D,L-Valin-l-'4C bzw. D,L-Alanin-l-14C hervor. Alanin-l-14C kann in der Zelle biosynthetisch zu Valin-l-I4C umgesetzt werden. Beim Abbau des nach der Futterung der beiden im C-1 markierten Aminosauren nach alkalischer Hydrolyse der Ergotoxine anfallenden Dimethylpyruvats waren -- 90% der Radioaktivitat in der Carboxylgruppe der a-Ketosaure lokalisiert. Als zweite ,,variableu Aminosaure ist im Ergocornin (3) Valin und im Ergokryptin (4) Leucin vorhanden. Da bei den ersten von uns durchgefiihrten Versuchen (FLOSS et al., 1971b) ein Ergotoxingemisch analysiert wurde, war es von Tnteresse, den Einbau der verzweigtkettigen Aminosauren in die einzelnen Ergotoxinalkaloide getrennt zu untersuchen (MAIERet al., 1971). Valin wird wie zu erwarten stets besser in Ergocornin als Ergokryptin eingebaut. Im Ergokryptin finden sich nach Valin-
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Biosynthese des Peptidteils der Mutterkornalkaloide
Groger
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Futterung etwa 65-75% der Radioaktivitat im a-Hydroxyvalin-Teil, wahrend etwa K der Markierung im Leucin lokalisiert ist. Auffallig war die Konstanz der Radioaktivitatsverteilung unabhangig von der Applikationsdauer (2h-3 d). Die Markierung des Leucins nach Valin-Futterung ist erklarlich, da Valin durch Transaminierung in a-Ketoisovaleriansaure ubergehen kann, welches nach Kondensation rnit Acetyl-CoA und Durchlaufen mehrerer Zwischenstufen Leucin ergibt. Auch bei Kurzzeit-Experimenten war die spezifische Radioaktivitat beim Ergocornin im Dimethylpyruvat stets hoher als im Valin-Teil. Diese Ergebnisse lassen sich so deuten (FLOSSet al., 1971b), daf3 offenbar die Peptidkette vom Prolin her aufgebaut wird: Valin, welches im Tripeptid Valin bleibt, wird fruher inkorporiert als das Valin, welches als Vorstufe des a-Hydroxyvalins dient. Die Radioaktivitat des Valins wird im ersten Fall starker verdunnt durch ein grogeres Angebot an nicht-markierten pools (Valin enthaltende Peptide) als das Valin, welches schlieRlich zum sHydroxvalin" umgesetzt wird. Der endgiiltige Beweis, dat3 Prolin die ,,Startu-Aminosaure ist, muR jedoch noch erbracht werden. Versuche mit Valin-14C,'W sollten zeigen, o b der Stickstoff des Valins zur Peptidbildung mit der Lysergsaure genutzt wird (MAIERet al., 1971). In verschiedenen Versuchen wurden sehr unterschiedliche 'W/14C-Raten im u-Hydroxyvalin-Teil gefunden: 0,33, 0,12, 0,029. Das 15N/14C-Verhaltnisim a-Hydroxyvalin war im Ergocornin und Ergokryptin praktisch gleich. Diese Ergebnisse zeigen, daf3 offenbar ein starker 'W-Ausbau stattgefunden hat. Vom Clavine bildenden Stamm SD 58 ist bekannt (TEUSCHER, 1970), daR bei Transaminierungsreaktionen L-Valin als besonders guter Aminogruppen-Donator fungiert, wenn a-Ketoglutarat als NH2-Akzeptor eingesetzt wird. Wenn hohe Transaminierungsaktivitaten auch beim Peptidalkaloide bildenden Stamm vorhanden sind, wiirde sich leicht der starke I5N-Ausbau .erkliren. Man darf annehmen, daB die unmittelbar' mit Lysergsaure die Peptidbindung eingehende NH2-Gruppe vom Valin geliefert wird, obgleich der endgultige Beweis auf Grund der starken metabolischen Aktivitat dieser Aminosaure schwer zu erbringen sein diirfte. Nach Applikation von D,L-Leucin-l-14C und L-Leucin-U-14C war die spezifische Einbaurate im Ergokryptin etwa 10mal hoher als im Ergocornin. Leucin-14C wird erwartungsgemag bevorzugt in den Leucin-Teil von Ergokryptin inkorporiert. Crberraschend war die verhaltnismaf3ig starke Markierung des a-HydroxyvalinTeils dieses Alkaloids. Offenbar wird Leucin metabolisiert und die Bruchstucke via Valin eingebaut. Im Zuge des Leucinabbaues entsteht Acetyl-CoA, welches iiber mehrere Zwischenstufen, u. a. Brenztraubensaure, in Valin ubergehen kann. Diese Reaktionsfolge wiirde die Valin-Markierung nach L-Leucin-U-14C-Fiitterung erklaren. Ein unspezifischer Einbau ist nach D,L-Valin-l-I4C-Gabe zu diskutieren. Hier wird kein markiertes Acetyl-CoA erhalten, da beim ersten Abbauschritt C 0 2 Freigesetzt wird, das die gesarnte Radioaktivitat enthalt. Lysergsaure wird spezifisch in Ergotoxin inkorporiert, dagegen wird Lyserg-
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Biosynthese des Peptidteils der Mutterkornalkaloide
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saureamid nicht als Zwischenstufe bei der Peptidalkaloidbildung durchlaufen (MAIER et al., 1971). Einbau von potentiellen Zwischenstufen
Ober den moglichen Mechanismus der Cyclolbildung bei Mutterkornalkaloiden liegen von verschiedenen Autoren (AGURELL, 1966; RAMSTAD, 1968; ABE, 1969)
-Hypothese von Agurell: 7'43
+ C HII - N H , COOH
.\
- &;? .
H
(5) Lysergsaure (6)A la nin
Hypothese von Abe: '43% ,c'43 I
I
+
COO,,
I
I
H
L~-.C~-NH-CY
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&
CH3
N-CH3
7 "N.
'H
I ,C=O
C
-
/CH3 'cH~-c~
(71 Lysergylalanin
(11 Ergotamin
Lyserg.co-NH -c/ I OC-
l
l
N H ~ C CH2-CH 3 0/CH3 \
CH3
(I 0) Lysergylvalin
(11) Leu-Pro-Lactam
CH3
( 4 ) Ergokryptin
Abb. 2. Mechanismus der Peptidalkaloidbildung nach AGURELL und ABE. Lyserg. CO
=
Lysergyl
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Hypothesen vor, die gewisse Gemeinsamkeiten erkennen lassen. Nach AGURELL (1966) wird als eine der ersten Vorstufen bei der Ergotaminbildung (Abb. 2) Lysergylalanin (7) durchlaufen. Reduktion der Carbonylgruppe von (7) fiihrt zum Ergometrin; andererseits kann ausgehend von Lysergylalanin uber mehrere Diketopiperazin-Strukturen enthaltende Zwischenstufen (8) (9) Ergotamin (1) entstehen. Xhnliche Vorstellungen sind von ABE (1969) fiir Ergotoxinalkaloide entwickelt worden. In Analogie zu (7) ubernimmt hier Lysergylvalin (8) die ,,Starterfunktionu, welches sich mit dem entsprechenden freien Diketopiperazin kondensiert. Beim Ergokryptin (4) ist dies L-Leucyl-L-prolin-lactam(11). RAMSTAD (1968) vermutet, daB sich Lysergsaure mit einem Tetrapeptid zu einem Lysergyltetrapeptid- (12) umsetzt. Durch die terminale Aminosaure (Alanin, Glycin) sol1 das Prolincarboxyl ,,aktiviertU werden. Durch Abspaltung von Alanin bzw. Glycin kijnnte spontan Diketopiperazinbildung (13) eintreten. Bekanntlich neigen aktivierte Prolin enthaltende Peptide in bisonderem Maf3e zur Ringbildung. Die mit dem Lysergyl-Rest verbundene Aminosaure wird unter Bildung von (14) durch ein spezifisches Enzym hydroxyliert. Spontan tritt nun Cyclolisierung ein, wobei ein neues Asymmetriezentrum aufgebaut wird und das Molekul sich stabilisiert (15). Die Postulierung von einfachen Lysergylderivaten als Voret al. stufen fur Peptidalkaloide ist sicherlich durch die Befunde von SCHLIENTZ (1963) stimuliert worden. Diese Autoren konnten den Methylester von d-LysergylL-valin (10) aus Alkaloidmutterlaugen von Zuchtmutterkorn isolieren und in vielen Mutterkorndrogen als Spurenalkaloid nachweisen. Ahnliche Ergebnisse u. ROCHELMEYER (1966) mitgeteilt worden. sind von HOHMANN Die Beteiligung von Lysergyl-Derivaten sowie Oligopeptiden und Diketopiper-
Lyserg.
Hydroxylase --C
7
y\?,>m -
Ly%rg.co-NU-c-0 c
I
1
OC-N,
l
sDontmn
l
I
1
Lyserg CO-NH-
C , =O
&..
R2
Abb. 3. Mechanismus der Cyclolalkaloidsynthese n. RAMSTAD. Lyserg. CO einer weiteren Aminosaure (Glycin, Alanin)
,CEO
OC-N,
H,c...
=
Lysergyl. X
R2
=
Rest
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azinen an der Cyclolalkaloidbildung ist in verschiedenen Laboratorien experimentell gepruft worden. Die Verbindungen wurden an intaktes Mycel verschiedener Mutterkornstamme appliziert und dienten ferner als Substrat fur Rohenzymextrakte. OHASHIe t al. (1972) inkubierten [d-Lysergyl-L-valinmethylester-U-TI lfih bei 2 8 O mit einem-zellfreien Extrakt des Cfaviceps-Stammes HA-6 vom Elyrnz~s-Typ und konnten mittels Radioscanner radioaktives Ergokryptin/Ergokryptininnachweisen. Bei der Inkubation von Elymoclavin-U-14C zusammen mit nichtmarkiertem Lysergylvalinmethylester war das Ergotoxinalkaloid wesentlich weniger radioaktiv als nach Inkubation von Elymoclavin-U-I4C allein. Ein definierter Abbau der Alkaloide wurde nicht durchgefiihrt. Die Autoren leiten aus diesen Ergebnissen eine direkte Beteiligung des Lysergylvalins an der Ergokryptinbildung das entsprechende ab. FLOSSet al. (1971a) verfiitterten d-Lysergyl-L-alanin-U-14C, Isolysergsaure-Derivat sowie d-Lysergyl-L-alanin-l-14Can Submerskul,turen eines Ergotaminbildners. Neben geringen Einbauraten in das Alkaloid war eine erhebliche Verschmierung der Radioaktivitat in den einzelnen Fragmenten beim Abbau zu beobachten. Dies deutet auf eine Hydrolyse und nachfolgenden Einbau des Alanins hin. Die gleichen Resultate wurden von FLOSSet al. (1971b) bei Verfiitterung von d-Lysergyl-L-valin-l-'4Cbzw. dem entsprechenden IsolysergsaureDerivat an einen Ergocornin-Ergokryptinbildner erhalten. Bei intaktem Einbau sollte die gesamte Radioaktivitat im a-Hydroxyvalin-Teil lokalisiert sein. Dies war jedoch bei keinem Versuch der Fall. Stets waren die anderen Spaltprodukte ebenfalls radioaktiv, insbesondere das aus dem Ergocornin stammende Valin. Das Verteilungsmuster der Markierung im Ergotoxingemisch entsprach praktisch einer Valinfiitterung und schliegt somit L~sergylvalinals unmittelbare Vorstufe fiir Ergotoxinalkaloide weitgehend aus. Um nahere Einblicke in den Stoffwechsel von L~sergyl-Derivatenzu erhalten, wurden d-Lysergyl-L-alanin-U-'4C-methylester und d-Lysergyl-L-valin-U-l4Cmethylester an einen saprophytischen Ergotoxinbildner und einen saprophytisch et al., 1974). Gearbeitet wurde ergolinfreien Mutterkornstamm verfuttert (MAIER . mit der Replacement-Technik (Sh, 24") sowie mit ~ o h e n z ~ m e x t r a k t e nBeide Stamme spalten im Replacement d-Lysergylalanin-OMe. Als Hauptprodukt entsteht Lysergylalanin (7). Daneben lassen sich freies Alanin sowie Lysergsaure nachweisen. Ahnliche Verhaltnisse finden sich beim d-Lysergyl-L-valin-U-'4Cmethylester. Eine wesentlich starkere Spaltung und nachfofgend starke Markierung der Proteinfraktion ist hier beim Ergotoxinbildner, verglichen tnit dem Nichtproduzenten, erfolgt. Eine Spaltung der Ersterbindung sowie der Peptidbindung von Lysergyl-aminosaureestern wird auch durch Rohenzymextrakte beider Stamme katalysiert. Beim Lysergylalanin-OMe-Versuch sind Alanin und Lysergylalanin etwa gleich stark markiert. Auch hier 1aGt sich eindeutig freie Lysergsaure nachweisen. Beim d-Lysergyl-valin-methylesterwird offenbar die Peptidbindung we,
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Biosynthese des Peptidteils der Mutterkor~~alkaloide
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sentlich schneller gespalten, da bei beiden Stammen Valin starker markiert ist als Lysergylvalin. Zusammenfassend 1ai3t sich feststellen, daR bei den von uns untersuchten C. purpurea-Stammen offenbar Enzymsysteme enthalten sind, die einfache Lysergyl-Derivate spalten. Diese Versuche schlieRen eine mogliche Kompartimentierung nicht aus, d. h. von auRen applizierte Lysergyl-Derivate werden zwar rasch hydrolysiert, intrazellular lauft aber dennoch die Peptidalkaloidsynthese iiber d ~ e s eVerbindungen. Um dies zu priifen, wurden Trapping-Versuche durchgefiihrt. Es liei3en sich aber in keinem Fall nach Applikation iron radioaktivem Alanin bzw. Valin markierte Lysergylaminosaure-Derivate fassen. Der Einbau von Diketopiperazinen, z. B. ( l l ) , in den Peptidteil der Ergolinalkaloide ist erstmals von Abe's Arbeitskreis untersucht worden. Zusammen mit inaktivem Elymoclavin (als Lysergsaure-Vorstufe) wurden an zellfreie Extrakte sowie [Lverschiedener Mutterkornstamme [L-Leucyl-D-prolin-lactam-U-TI Phenylalanyl-D-prolin-lactam-U-TIals Substrate appliziert. Im ersten Fall lieR sich radioaktives ErgokryptinIErgokryptinin und nach Gabe von Phe-Pro-lactam ErgotaminIErgotaminin nachweisen (ABE, 1969). Ahnliche Versuche wurden mit der Replacement-Technik unter Verwendung der Mycelien verschiedener Stamme durchgefiihrt. Die Lactame wurden in Phosphatpuffer gelost und das G a m e 18'' geschiittelt. Als Substrate hat man hier neben den D-Prolin enthaltenden Diketopiperazinen auch L-Leucyl-L-Prolin-lactam und [L-Phenylalanyl-L-Prolin-lactamU-TI eingesetzt. Die gebildeten Alkaloide wurden mit nichtmarkiertem Alkaloid verdiinnt und bis zur konst. Radioaktivitat umkristallisiert. Die L- bzw. D-Prolin enthaltenden Lactame ergaben. die gleichen Einbauraten. Das bedeutet, bei den D-Prolin enthaltenden Lactamen mui3te vor der Inkorporation Konfigurationsumkehr stattgefunden haben (ABEet al., 1971). In einer weiteren Arbeit (OHASHI et a]., 1972) wird nochmals berichtet, daR [L-Leucyl-L-prolin-U-TI in einem zellfreien System in Ergokryptin/Ergokryptinin inkorporiert wird. Verwendet man unter gleichen Bedingungen, D,L-Leucin-1-I4C, L-Prolin-U-'C und D,L-Valin1-14C als Substrate, so konnte nur nach Valingabe markiertes Alkaloid gefunden werden. Das Resultat wird als Beweis interpretiert, daR L-Valin uber d-LysergylL-valin in Peptidalkaloide inkorporiert wird. Uberraschend ist der Nicht-Einbau der beiden anderen Aminosauren in den Peptidteil des Ergokryptins. Interessant sind die Befunde uber das Vorkommen von Prolin enthaltenden Diketopiperazinen in verschiedenen Ergot-Stammen (ABEet al., 1970). So konnten L-Leucyl-D-prolinlactam und ein unbekanntes Pr~l~ldiketopiperazin in Sklerotien und Oberflachenkulturen eines Ergokryptin-Stammes und Phe-Pro-lactam sowie Phe-D-Pro-lactam in Sklerotien eines Ergotamin-Stammes nachgewiesen werden. Der Gehalt an Prolyldiketopiperazinen stieg im Verlauf der Oberflachenkultur eines ErgokryptinStammes standig a n und erreichte gleichzeitig mit dem maximalen Alkaloidgehalt am 40. Tag den hochsten Wert (0,4 pMo1/40 ml).
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Biosynthese des Peptidteils der Mutterkornalkaloide
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Der Einbau verschiedener Oligopeptide und Diketopiperazine unter Verwenu. JOHNE (1972) dung eines ErgocorninlErgokryptin-Statnmes wurde von GROCER und GROCER et al. (1974) untersucht. Die Vorstufen wurden wahrend der Idiophase an 5 Tage alte Submerskulturen appliziert. Die Inkubationsdauer betrug 17h-441'.Gefuttert wurden u. a. L-Valyl-L-leucin-U-'4C, L-Valyl-L-leucyl-L-prolinU-I4C, L-Leucyl-L-prolin-U-'4C-lactam und L-Valyl-L-prolin-U-14C-lactam. Das Alkaloidgemisch wurde aufgetrennt, mit inaktivem Material verdunnt und die einzelnen Alkaloide einem definierten Alkaloidabbau unterworfen. Val-Leu, ValLeu-Pro und Leu-Pro-lactam sind mogliche Teilsequenzen von Ergokryptin. Falls eln spezifischer Einbau erfolgt, sollte nur Ergokryptin markiert sein. Bei einem spezifischen Einbau von L-Valyl-L-prolin-lactam diirfte nur radioaktives Ergocornin gebildet werden. Es zeigt sich jedoch bei allen Fiitterungen, da& jeweils beide Alkaloide markiert waren. Nach Verfutterung der Prolyllactame war stets der uberwiegende Teil der Radioaktivitat im aus Ergocornin und Ergokryptin isolierten Prolin (72-90%) lokalisiert. Nach L-Valyl-L-Leucyl-L-prolin-U-14C-Fiitterung lie& sich markiertes Ergocornin und Ergokryptin isolieren. In beiden Alkaloiden war die Radioaktivitat praktisch vollstandig im Prolin (95%) lokalisiert. Analoge Versuche mit einem anderen Tripeptid, namlich L-Valyl-l-14C-L-valy1L-prolin sind von FLOSSet al. (1974) beschrieben worden. Bei einem intakten Einbau ist nur radioaktives Ergocornin zu erwarten, welches spezifisch im aHydroxyvalin-Teil markiert sein sollte. Der Abbau ergab eine Gleichverteilung der Radioaktivitat im a-Hydroxyaminsaure-Teil und im Valin von Ergocornin sow,ie eine erhebliche Markierung des ,,a-Hydroxyvalins" des Ergokryptins. Fiitterungsversuche von L-Prolyl-U-14C-alanin und L-Prolyl-U-14C-glycin ergaben, daR auch diese Dipeptide vom Pilz gespalten werden und das Prolin zur Markierung des Ergotoxingemisches herangezogen wird. Weiterhin wurde gefunden, daf3 nach Verfutterung der Oligopeptide und Diketopiperazine die Proteinfraktion stark radioaktiv war und sich die entsprechenden radioaktiven Aminoet al., 1974). sauren im Pool der freien Aminosauren nachweisen lieBen (GROCER In. diesem Zusammenhang war auch das Vorkommen und der Stoffwechsel der Diketopiperazine in Claviceps-Arten von Interesse. Wir konnten in frisch geernteten Sklerotien verschiedener Mutterkornstamme keine cyclischen Dipeptide finden. Eingehe~id wurden Submerskulturen des Ergocornin/Ergokryptin-Scammes Pepty 695 im Verlauf der Kulturentwicklung untersucht. In Spuren lieBen sich einmal wahrend der Idiophase Val-Pro-lactum und in einern zweiten Versuch Val-Pro-lactam und Leu-Pro-lactam jeweils an einern Kulturtag nachweisen. Eine Korrelation zwischen Alkaloidbildung und dem Vorkommen von Lactamen bestand nicht. Oberraschend waren die Ergebnisse von Replacementversuchen unter Venvendung verschiedener Claviceps-Stamme. Bei einer Versuchsdauer von 24" unter Verwendung eines Vollmediums wurde eine erhebliche Spaltung von LLeucyl-L-prolyl-lactam durch Claviceps purpurea-Stamme gefunden. Mycel eines
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Vergleicht man die Untersuchungen verschiedener Arbeitskreise, so ergibt sich ein unterschiedliches Bild. Nach ABE'S Vorstellungen sind Lysergylvalin und Diketopiperazine obligatorische freie Zwischenstufen, die bei der Peptidalkaloidbildung durchlaufen werden. Die Laboratorien von FLOSSund GROCER konnten durch Versuche mit intaktem Mycel von Claviceps nachweisen, daR Lysergylvalin, Di- und Tripeptide sowie Diketopiperazine gespalten werden und die freien Aminosauren zur Alkaloidsynthese Verwendung finden. Moglicherweise sind die Diskrepanzen auf unterschiedliche Kulturbedingungen sowie verschiedenes Pilzmaterial zuruckzufiihren. Fur mechanistische Betrachtungen von groRer Bedeutung sind die Befunde von ST~~T et Zal. (1973).Bei der schonenden Aufarbeitung des Mycels eines ErgocristinStammes gelang ihnen die Isolation eines neuen Alkaloids: N-[N-(d-Lysergy1)L-valyll-L-phenylalanyl-D-prolin-lactam (16). Diese Verbindung ist augerordentlich labil und zerfallt leicht in Lysergylvalin-methylester und Phe-D-Pro-lactam. Die Autoren sind der Meinung, daR es sich bei der friiher beschriebenen Isolierung des Methylesters von (10) urn ein Artefakt handelt, welches erst bei der Aufet al., 1963). Somit entfallt ein wichtiges arbeitung entstanden sei (SCHLIENTZ Argument fur die Hypothese, daiS die Cyclolalkaloidbildung via LysergylaIaninbzw. -valin verlauft. Ober die Verbreitung von (16) sowie analoger Verbindung ist noch nichts bekannt. Das unterschiedliche Auftreten von Alkaloiden dieses
'I
HN
Abb. 4. (16) N-[N-(d-Lysergyl)-valyl]-L-phenylalanyl-D-prolin-Lactam
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Clavinbildners (SD 58) und Claviceps paspali war dagegen nicht 'in der Lage, Lactame zu spalten. Da Leu-Pro-U-14C-lactam im Mycel nach Inkubation nicht nachweisbar war, kann man vermuten, daR bei den letztgenannten Stammen Diketopiperazin-spezifische Transportsysteme fehlen.
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neuen Struktur-Typs in verschiedenen Claviceps-Stammen und deren Spaltung in die beiden Komponenten bei der Aufarbeitung wurde zwanglos die verschiedenen Befunde beirn Diketopiperazin-Nachweis in Claviceps-Arten erklaren. Wir bevorzugen die Hypothese, daB es sich bei der Peptidteilbildung der Cyclolalkaloide u m einen RNS-unabhangigen nichtribosomalen ProzeR handelt. Darauf deuten Hemmversuche mit Cycloheximid hin (ERGEet al., 1972). Offenbar Iaufl die Bildung an einem Multienzymkomplex ab, etwa vergleichbar mit der Biosynthese bestimmter Peptidantibiotica (Gramicidin, Tyrocidin). An einen ,,Starter" werden die einzelnen Aminosauren bzw. Lysergsaure sukzessive angefugt. Bei der Verknupfung der einzelnen Bausteine der Peptidalkaloide Lysergsaure Aminosauren handelt es sich um einen stark endergonischen ProzeB. Die einzelnen Verbindungen sollten daher im Pilz intermediar in ,,aktivierterU Form vorliegen. Aktivierungsreaktionen bei Claviceps sind von uns untersucht worden (MAIERet al., 1972). Interessant sind die Befunde iiber die Prolin-Aktivierung in jungen Kulturen eines Ergotoxinbildners. Bei der Messung der ,,Gesamtaktivierung" (Prolin zur Proteinsynthese sowie zur Alkaloidbildung) wurden hier 2040-fach hohere Werte gefunden als bei entsprechenden Kulturen der NichtPeptidalkaloide produzierenden Stamme. Dieser Befund unterstutzt die Annahme, daB der Kettenstart vom Prolin her beginnt. FLOSS e t al. (1974) haben kiirzlich ein entsprechendes Schema (Abb. 5) fiir ~ r ~ o t o x i nformuliert. e Die ersten Schritte bis zur Ausbildung eines Lysergyltripeptides laufen demnach enzymgebunden ab. Die Ablosung vom Enzym konnte
2 Enz -SH
H3%cf+ l-4
1%
JJ
L~S-N,,MCH C
o=,-I, I
" C-0
I Uydroxylierunq .
2.Cyclolisierung
Abb. 5. Biosynthese von Ergocornin
11.
FLOSS et al. (1974'). Lys
=
d-Lysergsaure
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+
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durch einen. intramolekularen Angriff des Stickstoffs von der dem Prolin benachbarten Aminosaure unter gleichzeitiger Lactamisierung erfolgen. Dies konnte das erste freie Zwischenprodukt sein. Im Normalfall erfolgt nun die Bildung der a-Hydroxy-a-Aminosaure-Gruppierung und Cyclolisierung. Offen bleibt, wieviel Enzyme die letzten Biosyntheseschritte katalysieren und ob sie mit dem Multienzymkom~lexassoziiert sind. Tritt auf der Stufe von (21) eine nichtenzymatische Epimerisierung ein, so kommt es zur Bildung von (22), einer Verbindung, in der Prolin in der D-Konfiguration vorliegt und die offensichtlich nicht weiter urngesetzt werden kann. Der erste Vertreter dieses neuen Alkaloid-Typs ist von ST~JTZ et al. (1973) isoliert worden (16). Die endgiiltige Klarung dieses Problems ist abhangig von der Isolation der entsprechenden Enzymsysteme. Dies wiirde nicht nur einen entscheidenden Fortschritt auf dem Mutterkorngebiet darstellen sondern auch von grogem allgemeinem biochemischem Interesse sein. Als Modellsysteme zur Untersuchung der Mechanismen der nichttribosomalen Peptids~nthesebei Eucaryonten, die bislang kaum untersucht ist, scheinen sich Mutterkornstamme in besonderer Weise zu eignen.
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