Z. Lebensm. Unters.-Forseh. 159, 43--46 (1975) © by J. F. Bergmann, Miinchen 1975

Coffeinbestimmung durch Gelchromatographie S v a t o p l u k Pokorn:~ u n d Ji~i Coupek *Institut f~ir makromolekulare Chemie der Tsehechoslowakisehen Akademie der Wissenschaften, Prag (~SSR) P h a n - t r o n g T$i u n d J a n P o k o r n ~ **Institut for Lebensmitteluntersuehung, Teehnische Hochschule fiir Chemie, Prag (~SSR) Eingegangen am 14. Fehruar 1975 Caffeine D e t e r m i n a t i o n b y Gelchroma~ography

Summary. Caffeine in beverages was determined by gel chromatography after extraction with chloroform from an alkalized sample. For extract from coffee, tea and mat6 a very good agreement was observed between the chromatographic method used and the method of Navellier et al. Major departures were observed for decaffeinized coffee and some beverages of the cola type, where gel chromatography was more selective and caffeine separated from impurities stripped into the extract. The reproducibility of determination corresponded to the standard method (standard deviation 4.2%). Zusammen]assung. Der Coffeingehalt in Getriinken wurde naeh Extraktien des Coffeins aus der alkalisierten Probe mit Chloroform durch Gelchromatographie bestimmt. Bei Kaffee-, Teeund Mat6-Extrakten bestand eine sehr gute ~2~bereinstimmungzwischen der ehromatographisehen Methode und dem Verfahren nach ~avellier u. Mitarb. GrSl3ere Abweichungen wurden bei decoffeiniertem Kaffee und bei einigen Getri~nken veto Cola-Typus beobachtet, well die Gelchromatographic selektiver ist und Coffein yon den in den Extrakt mitgerissenen Verunreinigungen getrennt wurde. Die l~eproduzierbarkeit der Bestimmung entspraeh der Standardmethode (Streuung 4,2%).

Einleitung

Coffein wird gewShnlich in alkalischem Medium aus den Proben durch Extraktion mR Chloroform oder anderen organischen LSsungsmitteln isoliert [1] and die Verunreinigungen aus dem Extrakt werden dureh Saulenadsorptionschromatographie [2] oder durch Behandlung mit Kaliumpermanganat [3] beseitigt. Coffein kaml hierauf spektrophotometriseh bei 272 nm [4] oder gravimetrisch, gegebenenfalls durch Stickstoffbestimmung naeh Kjeldahl [5] bestimmt werden. Weniger fiblieh ist die jodometrische Bestimmung [6]. Die Coffeinbestimmung nach dem genannten Verfahren wird jedoeh dureh verschiedene Stoffe gestSrt, die bei der Extraktion nicht vollstKndig aus der Probe entfernt werden und deren Eliminierung langwierig und oft sehr schwierig ist [7]. :Bei der Coffeinbestimmung nach Kjeldahl wirken auch die stickstoffhaltigen, schwer beseitigbaren Verunreinigungen stSrend [8]. In der vorliegenden Arbeit haben wir deshalb die MSglichkeit gepriift, Coffein auf direktem Wege dutch Gelchromatographie zu bestimmen.

Experimenteller Teil .Bezugsmethode: yon ~avellier u. ~itarb. [9] mit gravimetrischer oder spektrophotometrischer :Bestimmung. Ffir die gelchromatographische Analyse die Probe dutch Chloroform-Extraktion aus ammoniakalischer L6sung [8] naeh einem vereinfachten Vorgang isolieren: Zu 100--200 ml der in Wasser aufgel6sten Probe einige Tropfen einer 25°/oigen wSi3rigen AmmoniumhydroxidlSsung zugeben, danaeh Coffein dureh zweimaliges Ausschiitteln mit jeweils 30 ml Chloroform extrahieren und aus der Chloroformphase der vereinigten Extrakte das LSsungsmittel im Vakuum abdampfen. Den Riickstand in einer kleinen Wassermenge aufl5sen, nochmals mit 50 ml Chloroform extrahieren und das L5sungsmittel wiederum im Vakuum verdampfen. Den Riiekstand wiigen, in 1 ml Tetrahych'ofuran aufnehmen und ffir die gelchromatographische Analyse verwenden. Die Bestimmung an einem System yon 5 S/~ulen aus Edelstahl yon 5 × 1200 mm durchffihren, die mit dem homogenen Styrol-Divinylbenzol-CopolymerenS-Gel-832 (Institut fiir makromolekulare Chemie der Tschechoslowakischen Akademie der Wissensehaften, Prag) gefiillt waren, dessen Ausschlul3grenze einem Molekulargewicht yon ca. 1000 entsprieht. Elutionsmittel: Tetrahydrofuran, DurehfluBgeschwindigkeit 0,5 ml/min. Detektion mit einem System yon zwei in Serie geschalteten Detektoren, und zwar Differentialrefraktometer Wafters Ass. Modell R-3 und UV-DurchfluBspektrometer (Entwicklungswerkst~tten der Tschechoslowakischen Akademie der Wissensehaften, Prag), das bei der WellenIKnge yon 254 nm arbeitete. Den Coffeinextrakt mit Tetrahydrofuran anni~hernd anf die Xonzentration yon 5 mg/ml verdfinnen und die LSsung in einer Menge yon 0,3--0,4 ml in die erste Si~ule des Chromatographen einspritzen. Nach durchgeffihrter Elation auf dem Chromatogramm die I-I6he des

44 Tabelle 1. Coffeinbestimmung in Extrakten yon Getr~nken Art des Getr~nkes

Gefundener Coffeingehalt nach ~avellier u. Mitarb. [9]

mg GPC

Fermentierter Tee indischer ceylonesischer 1 ceylonesischer 2 assamesischer 1 azsamesischer 2 grusinischer chinesischer 1 chinesischer 2 chinesischer 3 Griiner chinesischer Tee •at6 1 Mat6 2 GerSsteter Kaffee Columbia Kaffee-Extrakt 1 Kaffee-Extrakt 2

61,2 29,0 20,9 68,3 78,7 28,0 108,0 77,1 107,5 57,1 39,5 31,5 27,5 19,0 20,5

58,2 22,0 20,6 69,1 75,4 28,0 106,2 75,7 107,5 60,7 41,5 29,3 29,3 18,7 18,2

7,0 5,0 24,0 5,0 7,0 4,3 4,4 4,4 4,5 6,4 6,0 7,5

3,4 1,7 3,3 3,0 2,4 4,1 4,0 4,7 3,8 6,2 4,1 7,4

16,5 15,1 12,9 12,0 15,7 17,4

14,4 12,7 10,7 6,1 9,5 11,7

Gerbsteter koffeinfreier Kaffee 1 GerSsteter koffeinfreier Kaffee 2 Ger5steter koffeinfreier Kaffee 3 Coffeinfreier Kaffee-Extrakt Coffeinfreier griiner Kaffee Getr~nke yore Cola-Typus 1 Getranke yore Cola-Typus 2 Getri£nke veto Cola-Typus 3 GetrKnke yore Cola-Typus 4 Getranke veto Cola-Typus 5 Getr~nke yore Cola-Typus 6 Getr~nke yore Cola-Typus 7 Getri~nke yore Cola-Typus mit Obstsirupgehalt 1 mit Obstsirupgehalt 2 mit Obstsirupgehalt 3 mit Obstsirupgehalt 4 mit Obstsirupgehalt 5 mit Obstsirupgehalt 6

Ausgangssignals dos Differentialrefraktometers messen, aus der Eichkurve fiir reines Coffein den Coffeingehalt in der eingespritzten Probenmenge ablesen und auf den Gesamtgehalt im Extrakt umrechnen. Streuung der Ergebnisse bei der Priifung der l~eproduzierbarkeit des Verfahrens ~ 4,20/o.

Ergebnisse und Diskussion Coffein pro anal. liefert unter den Bedingungen der gelchromatographischen Elution einen scharfen symmetrisehen P e a k (Elutionsvolumen 91,8 count, 1 count = 2,72 ml), tier deutlich yore P e a k des Theobromins getrennt ist (Elutionsvolumen 86,3 count). Trigonellin geht unter den Extraktionsbedingungen nicht in die ChloroformlSsung fiber, die Chlorogens/~uren bleiben ebenfalls in der w/i6rigen Phase zurfick. Wie aus d e m E i c h d i a g r a m m (Abb. 1) hervorgeht, besteht zwischen tier GrSSe des v o m Differentialrefraktometer aufgezeichneten Peaks u n d tier Coffeinkonzentration eine lineare Abhi~ngigkeit his zu einem Gehalt y o n 4 mg in tier eingespritzten Probe. Der relative mittlere Fehler der Bestimmung betrug 4,2%. Der U V - D e t e k t o r ist ffir die Messung der Coffeinkonzentration etwas empfindhcher, sein Nachtefl liegt jedoch im nichtlinearen Verlauf tier Eichkurve. Bei den angewandten experimentel-

45 len Bedingungen betrug die mit der angeftihrten Genauigkeit bestimmbare kleinste Coffeinmenge 0,1 mg mit Verwendung des Refraktometers als Detektor und 0,02 mg mi~ Verwendung des UV-Spektrophotometers.

100 - -

8G--

60--

40--

20

]

I

I

I

1

2

3

4

g .1~3

Abb. 1. Eiehkurve ftir die Coffeinbestimmung.- Abhangigkeit des Detektorsignals h (HShe des ehromatographischen Peaks bei Verwendung der differentialrefraktometrisehen Detektion) yon der Menge des eingespritzten Coffeins

Die gelchromatographischen Bestimmungen und die Analysen mit Hilfe der Bezugsmethode [9] warden an 16 verschiedenen Proben yon Teeaufgfissen nnd 6 verschiedenen Proben yon Kaffeeaufgiissen verglichen (Tab. 1). Die Proben unterschieden sich in der Qu~litat, Provenienz und Konzentration, um die Anwendbs~r-

UV

RI

I

I

I

1

40

50

80

100 Vo ~ count

Abb. 2. Gelehromatogramm des Extraktes aus einem Getr~nk vom Cola-Typus.- RI-Aufzeichnung des Differentialrefraktometers, UV-Aufzeichnung des UV-DurehfluBdetektors (254 rim); das Signal vom Elutionsvolumen 91,8 count entsprieht dem Coffein, die tibrigen Peaks entspreehen den Beimengungen, die bei Verwendung yon Chloroform in den Extrakt mitgerissen wurden

46 keit der l~ethode an einem m6glichst breiten Sortiment zu priifen. Der Vergleieh ergab eine sehr gute l~lbereinstimmung zwischen den Ergebnissen beider Verfahren (Korrelationskoeffizient r---0,960, r~i t ---0,652 f/Jr das Wahrseheinlichkeitsniveau = 0,001 und die Zahl der Freiheitsgrade [ = 20). Im Dm-ehsehnitt lagen die Ergebnisse der gelehromatographisehen Bestimmung um 0,2% niech-iger als bei der gravimetrisehen Methode, was dutch die Anwesenheit geringer Mengen an Begleitstoffen bei der gravimetrisehen Bestimmung erkl~rt werden kann. Bei der Analyse yon Getr~nken vom Cola-Typus (Coea Cola, Citrocola, Aroeola, Kofola) lagen die Resultate der gelehromatographischen Methode im Durchsehnitt um 22% niedriger als die Ergebnisse der Referenzmethode. Die Ursache dafiir ist die Gegenwart versehiedener h6hermolekularer Anteile, die im ultravioletten Gebiet absorbieren, wie das typische Chromatogramm in Abb. 2 beweist. Noch grSBere 15ntersehiede wurden bei der Analyse von deeoffeiniertem Kaffee und seiner Extrakte beobaehtet. Der Vorgang bei der Analyse dieses Materials wird den Gegenstand einer weiteren Mitteilung bflden. In Anbetraeht der Selektivit~t der Coffeinbestimmung konnte bei der gelehromatographischen Methode der im experimentellen Tell beschriebene vereinfachte Vorgang benutzt werden. Die gelchromatographische Bestimmung ist dank der groBen Wirksamkeit, mit der das Coffein yon den Lrt der Probe anwesenden Verunreinigungen abgetrennt wird, und dank der MSgliehkeit seiner direkten quantitativen Bestimmung aus dem Chromatogramm frei von den Fehlern, mit denen die bisher benutzten Methoden behaftet sind. Literatur

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