327

Biochimica et Biophysiea Acta, 441 (1976) 327-333 @ Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam - Printed in The Netherlands

BBA 56830

CARACTERISATION DE L’ACIDE D(-)GLYCERIQUE GLYCOLIPIDE DE NOCARDZA CA VZAE

MARIE-TH~R~SE

DANS UN

POMMIER et GEORGES MICHEL

Laborutoire de Biochimie Microbienne, Uniuersite’ Claude Bernard, Lyon I, 43, Boulevard du I I Nouembre I91 8, 69621 Vitleurbanne (France) (Requ le 16 fbvrier, 1976)

Summary C~ar~cterisutio~

of D (-)glyceric

acid from Nocardiu

caviue

A glycolipid was found in a strain of ~oc~rdiu caviue. It consists of glucose, my~stic, palmitic and stearic acids and a polyhydroxylated acid. The structure of this hydroxyacid was demonstrated by the identification of the product glycerol after LiAlK, reduction of the glycolipid methyl ester and subsequent hydrolysis, by comparison of the infrared spectra of the hydroxyacid and glyceric acid, by gas chromatography of acetylated methyl and ethyl esters of the polyhydroxylated acid and of standard glyceric acid and by mass spectrometry of the diacetylated methyl ester. The hydroxyacid from the glycolipid is D(-)glyceric acid, a compound rarely found amongst natural products.

Introduction L’etude des phospholipides des Nocardiae a mis en evidence la presence de glycolipides; toutes les souches etudiees renferment des phosphatidylinositol monomannosides [ 11. De plus, dans une souche de Nocardia cauiae, un glycolipide non phosphoryle a 6th isole; il renferme du glucose, des acides gras en C-14, C-16 et C-18 et un acide polyhydroxyle [2]. Nous decrivons ici la caractkrisation et l’identification de cet acide polyhydroxyle. Methodes Zso~e~e~t et purification du gZycolipide. ~ocardi~ caviae IM-1381 est cultive 3 semaines sur milieu de Sauton. Puis les bactkries sont extraites par le

pendent

Abbrhiations:

ECNSS-M.

eopolym’ere de nitrile silicone polyester.

328

melange chloroforme/methanol (2 : I), les extraits lipidiques sont laves selon la methode de Folch et al. [ 31. ~~t~ade~ ~~romat~~ap~i~ues. Les composes liposolubles sont chromatograph& sur colonne d’acide silicique Unisil selon la mkthode de Vorbeck et Marinetti [ 41. Les fractions correspondant au glycolipide sont etudikes par chromatographie sur couches minces de gel de silice H dans les solvants: chloroforme/methanol (9 : l), chloroforme/methanol/eau (65 : 25 : 4) et chloroformel m~thanol/ammoniaque 14 M (65 : 25 : 4). Les composes hydrosolubles r&ultant de l’hydrolyse du glycolipide sont etudiks par chromato~aphie sur papier Whatman No. 1 dans les solvants: butanol/pyridine/eau (60 : 40 : 30), isopropanol/pyridine/acide acetique/eau (80 : 80 : 10 : 40), acetone/eau (90 : lo), butanol/acide ac&ique/eau (65 : 10 : 25). La revelation des chromatogrammes est effect&e par le reactif periodate/benzidine [ 51. Les chromato~aphies en phase vapeur sont effect&es sur un appareil Intersmat IGC 120 FB avec une colonne de ECNSS-M a 3% sur Gas Chrom Q 100120 mesh a 110” C ou avec une colonne de silicone SE 30 a 10% sur Chromosorb w a 130°C. Re’duction du glycolipide. Le glycolipide est dissous dans le chlorure de methylene puis esterifie par le diazomethane gazeux. L’ester methylique (20 mg) est mis en solution dans le t~trahydrofurane anhydre (3 ml) en presence de LiAlH4 (40 mg) puis chauffe pendant 4 h sous reflux. L’exces de LiAlH4 est ensuite dktruit par addition de 5 ml d’acetate d’ethyle, le prkipite est &pare par centrifugation apres extraction par un melange eau/Bther (1 : l), et la phase aqueuse est lyophilisee. Prkparation des de’rizxk Les esters methyliques et ethyliques sont obtenus par action du methanol ou de l’ethanol chlorhydrique 0.12 M, 1 h a 100°C. Les derives 0-acetyles sont prepares par chauffage du compose en solution dans le melange anhydride ac&ique/pyridine (1 : 1) pendant 15 min a 100°C. Le derive colore de l’acide glycerique avec le carbazole est prepare selon la methode de Dische [6], les derives color& avec le 2,7-dihydroxynaphtalene et le naphtoresoreinol sont prbpares selon la methode de Bartlett f7]. Le se1 de calcium est obtenu par action de l’acide glycerique sur une solution aqueuse d’hydroxyde de calcium. Me’thodes analytiques. Le dosage des sucres a l’anthrone est effect& selon la methode de Radin et al, [8]. L’oxydation par le periodate de sodium est effect&e sur 1 pmol d’acide polyhydroxyle dans un tampon acetate 0.02 M, pH 5, selon la mkthode de Tipper et Strominger 191. Le dosage du periodate est effect& par spectrometrie a 224 nm [lo]. Resultats Prkpara tion du glycolipide Les lipides totaux repr~sentent 53% du poids set de ~ocardia cauiae. La chromatographie sur .acide silicique Unisil avec elution par les solvants chloroforme, chloroforme/ac&one, acetone, chloroforme/methanol donne plusieurs fractions (Fig. 1). L’homogeneite de chaque fraction est recherchee par chromatographie sur couches minces de gel de sihce H. La fraction I eIu6e au chloroforme (71%

329

0

IO

Chlorolorme

20

I

30

‘OI AcLo”e I ~hlorofQrm8, L On Fraccmlr

Chloroforme/Acltone

Fig. 1. SCparation SW colonne d’acide silicique Wnisil(15 g) des lipides de Nocurdia caviae (2 g). LWution OS~@ffectu& par fractionsde 50 ml avec le chbroforme (750 ml); des m6langes chloroforme/ac&one renfermant I%, 3%. 5% d’ac6tone (250 ml de chaque solvant), chloroformelac&one 10% (500 ml), chlorofonne/acacftane 50% (250 mff, x&one (500 ml) et des m&fanges chloroforme/m+5thannl renfermant 5%. 10%. 50% de m%thanot (250 ml de ehaque sokant) , o-o, courhe dWution exprimbe =e.npoids de ebque 6luat;rA, cow&e de dosage des suctes.

des lipides totaux) represente les lipides neutres. La fraction II (7% des lipides totaux) renferme un glycolipide (3% des lipides totaux) en melange avec le diphosphatidylglycerol. La fraction III, (1% des lipides totaux) est egalement constituee de glycolipides non phosphoryles. La fraction IV (21% des lipides totaux) est un melange de phospholipides, la reaction positive au reactif 1 l’anthrone est due h la presence de phospbatidylinositol mannosides. Le glycolipide constituant la fraction II est skpare du d~phos~hatidylgly~~rol par ~r~~ip~tat~ons rGpCtees dans le melange ~hlorofo~e~m~th~ol (1 : 4). 11 donne une seule tache par ~hromato~aphie sur couches minces de gel de sifice H : RF = 0.60 dans le solvant ~hloroforme~m~th~ol~e~u (65 : 25 : 4), RF = 0.36 dans le solvant ~hloroforme/m~thanol/ammon~aque 14 M (65 : 25 : 4). Le glycolipide est un compose acide. Lorsqu’il est trait& par le diazomhthane le camportement de l’ester methylique est different de celui du compose initial (Tableau I). Constituants du giycolipide L”hydrolyse totale du glycolipide par HCl 2 M pendant 2 h i 110°C donne une fraction iiposoluble constit&e par un mGlange d’acides myristique, palmitique et stearique [2]_ La fraction hydrosoluble renferme deux constituants dpar& par ~hromato~~h~e sur papier. L”un de ces constltuants est le glucose identifie par ~hromato~a~hie sur papier dans divers solvants et par chromatographie en phase gazeuse sur colonne de ECNSS-M apres tr~sfo~ation en a&tat@ d’alditol.

330

TABLEAU

I

RF DU GLYCOLIPIDE

ET

DE

SON

ESTER

METHYLIQUE

Chloroforme/methanol/ ammoniaque Glycolipide Ester

m&hylique

glycolipide

(65

DANS

DIVERS

Chloroforme/mCthanol/

: 25 : 4)

eau

(65

:

25

: 4)

SOLVANTS

Chloroforme/methanol (9

0.36

0.60

0.08

0.80

0.88

0.55

: 1)

du

L’autre constituant, X, soluble dans l’eau et l’ethanol, est un compose polyhydroxyle, il donne une reaction positive au reactif periodate/benzidine [ 51. D’autre part, il possede une fonction acide: il est rev&? par le reactif de Schweppe, caracteristique des acides [ 111, il est retenu sur colonne de Dowex 1 et lorsqu’il est trait6 par le diazomethane, l’ester methylique a un RF superieur a celui du compose initial par chromatographie sur papier: RF = 0.28 dans le solvant butanol/pyridine/eau (3 : 1 : 1) au lieu de 0.04 pour le compose initial dans le meme solvant. Le compose X est done un acide polyhydroxyle. De’termination de la structure du compose’ X Le glycolipide esterifie par le diazomethane est trait6 par LiAlH4 en solution dans le tetrahydrofurane selon le pro&de de Bergelson et al. [ 121. La fraction hydrosoluble est ensuite hydrolysee par HCl 2 M a 110°C pendant 3 h. La chromatographie sur papier indique la presence de glucose, la disparition du compose X et l’apparition d’un compose ayant le RF du glycerol. L’identification du glycerol est confirmee par chromatographie gazeuse de la fraction hydrosoluble apres acetylation. Les temps de retention sur colonne de ECNSS-M et de silicone SE 30 sont identiques a ceux du triacetylglycerol temoin. Le compose X ayant donne le glycerol par reduction est vraisemblablement l’acide glycerique. L’identification du compose X a ete effectuee par comparaison avec l’acide glycerique authentique. Les spectres infrarouges sont voisins et presentent, entre autres, les bandes OH h 3400 cm-’ et C = 0 a 1725 cm-’ (Fig. 2). Les faibles differences observkes peuvent stre dues a des variations dans l’etat d’hydratation ou dans l’ionisation des groupements carboxyles des deux composes. La chromatographie sur papier en presence de glucose temoin montre que le compose X a un RF identique a celui de l’acide glycerique dans plusieurs solvants: RG~~ = 2.5 dans butanol/acide ac&ique/eau (65 : 10 : 25), RG~~ = 0.45 dans butanol/pyridine/eau (60 : 40 : 30), R ~1~ = 0.75 dans isopropanol/pyridine/acide ac&ique/eau (80 : 80 : 10 : 40), RG~~ = 0.73 dans acetone/eau (90 : 10). Les esters methyliques du compose X et de l’acide glycerique temoin polyacetyles sont etudiks par chromatographie gazeuse en presence de tri-O-acetylglycerol; les temps de retention des esters acetyles sont identiques sur colonne de silicone SE 30 et de ECNSS-M. Des d&ives color& sont obtenus avec le carbazole, l’acide chromotropique, le 2,7-dihydroxynaphtalene et le naphtorksorcinol, les spectres de ces derives

331

Fig. 2. Spectres d’absorption infra-rouge: 1, acide bydroxyle risue t6moin; les acides sont inclus dam des pastilles de KBr.

provenant

du glycolipide;

2. acide glycd-

prepares 6 partir du compose X et de l’acide glycerique authentique sont identiques. D’autre part, l’etude quantitative de l’action du periodate de sodium indique que 2 mol d’oxydant reagissent sur 1 mol du compose X. La structure a et6 confirmee par spectrometrie de masse de l’ester methylique diacetyle. Le compose X et l’acide glyckrique sont methyl& par le methanol chlorhydrique puis acetyles par l’anhydride acetique dans la pyridine. Les produits sont ensuite analyses par chromatographie gazeuse sur colonne de silicone SE 30 couplee avec un spectrographe de masse. Les spectres provenant des derives du compose X et de l’acide glycerique sont identiques. Fig. 3 donne le spectre de masse du derive du compose X. Le pit rnoldculaire M’ 6 m/e = 204 n’apparait pas mais on observe le pit a m/e = 173 [M-(OCH,)]‘. Le pit de base est 1 m/e = 145 [M-(COOCH,)]‘. On observe encore les pits a m/e = 132 [CH,-COO~H=C(OH)-OCH,]‘, a m/e =

Fig. 3.

Spectre

de masse

de l’ester

m6thylique

ac6tyl8

de l’hydroxyacide

constituant

du glycolipide.

332

103 et m/e = 90 provenant vraisemblablement du depart du cetene (CH, = CO) h partir des fragments a m/e = 145 et m/e = 132. Configuration optique de 1‘a&de glyce’rique L’acide D -glyc&ique prepare a partir de l’acide phospho-3-D-glycerique est %VOgyre [a]~ = -3.0” 1131. P ar contre, les sels metalliques et les esters sont dextrogyres. Le pouvoir rotatoire de l’acide glycerique est difficile a determiner &ant donne sa faible valeur et le caractere hautement hygroscopique de l’acide glyeerique. Nous avons prepare l’ester rithylique diacetyle et le se1 de calcium. Les pouvoirs rotatoires sont dextrogyres pour ces deux derives: diacetyl ethyl ester [a]D = +23” (c = 0.115 g/100 ml dans le chloroforme), [cy]Dtheorique = +16.31” 1141, se1 de calcium: [&ID = +13” (c = 0.116 g/100 ml dans l’eau) [&‘]Dtheorique = +12.9’ [ 14) OU +15.5” [ 151. 11 s’agit done de I’acide D(-)glycerique. Conclusions L’acide D (-)glyc&ique est un compose extremement rare dans les composes naturels contrairement aux esters phosphoriques, interm~diaires du metabolisme glucidique. Seuls, Colin et Augier [ 161 ont signal& sa presence dans un mannoside isole d’une algue rouge Polysiphonia fastigiata et Ballou [ 171 dans un lipopolysaccharide de Mycobacterium phlei. 11est assez curieux de retrouver I’acide D(-)glyc&ique constituant d’ester d’un glucoside dans les lipides de Nocardia curiae. 11 est vraisemblable que les acides phospho-D -glyc&iques sont les precurseurs biog~n~tiques de l’acide D -glyc&ique. Remerciements Nous remercions le Dr. Champy, Rhone-Progil (Decines, Rhone) pour les essais de spectrometrie de masse. Ce travail a beneficie de l’aide matkrielle du Centre National de la Recherche Scientifique. Resume’ Un glycolipide a 4th isolk d’une souche de ~ocard~a cauiae. 11 est constitue de glucose, des acides myristique, palmitique, stearique et d’un acide polyhydroxyli!. La structure de cet acide hydroxylk a 6th demontree par identification du glycerol apres reduction par LiAlH* de l’ester methylique du glycolipide et hydrolyse, par comparaison des spectres infrarouges de l’acide hydroxylk et de l’acide glyeerique, par chromatographie gazeuse des esters methyliques et kthyliques acetyles de l’acide hydroxyle et de l’acide glycerique temoin et par spectrometrie de masse du diacetyl ester methylique. L’acide hydroxyle constituant le glycolipide est l’acide D(-)glycerique qui est un compose extrBmement rare dans les composes naturels.

333

References 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Pommier, M.T. et Michel. G. (19’73) Biochem. Syst. 1.3-12 Pommier, M.T. et Michel, G. (19’72) C.R. Acad. Sci. Ser. C. 275.1323-1326 Folch, J., Lees, M. et Stanley, G.H.S. (1957) J. Biol. Chem. 226,496-509 Vorbeck. M.L. et Marinetti. G.V. (1965) J. Lipid Res. 6,3-6 Gordon, H.T., Thornburg, W. et Verum. L.N. (1956) Anal. Chem. 28.849-855 Dische, Z. (1927) Biochem. Z. 189.77-80 Bartlett, G.R. (1959) J. Biol. Chem. 234.469-471 Radin. N.S., Lavin. F.B. et Brown. J.R. (1955) J. Biol. Chem. 217,789-796 Tipper, D.J. et Strominger, J.L. (1966) Biochem. Biophys. Res. Commun. 22,48-56 Dixon, J.S. et Lipkin, D. (1954) Anal. Chem. 26,1092-1093 Dyeing reagents for Thin Layer and paper chromatography (1971) (E. Merck, ed.), P. 47, Darmstadt. Allemagne Bergelson, L.D., Batrakov, S.G. et Pilipenko, T.V. (1970) Chem. Phys. Lipids 4. 181-190 Embden, G.. Deuticke. H.J. et Kraft, G. (1934) Z. Physiol. Chem. 230,12-28 Dictionary of Organic Compounds (1965) (Pollock, J.R.A. et Stevens, R., eds.). Vol. 3, p. 1534. The Chanter Press Ltd., Bungay Jackson, E.L. et Hudson, C.S. (1940) J. Amer. Chem. Sot. 62,958-961 Colin, H. et Augier, J. (1939) C.R. Acad. Sci. 208,1450-1453 Ballou, C.E. (1968) Act. Chem. Res. 1.366-373