15.7. 1976

Speeialia

865

Number of nuclei.per cyst in various populations of Artemis salina (L.) Locality

Ploidy

Mode of reproduction ~

Year of collection

No. of cysts

Mean number of nuclei

Standard deviation

San Francisco (USA)

2N

B

Great Salt Lake (USA)

2N

B

Inagua (Bahamas) Aio-maehi (Japan) Jamnagar (India) Comacchio (Italy) Sete (France)

2N

B P P P P

1938 1951 1961 1965 (not known) 1951 1967 1969 1968 1968 1960 1962

10 10 10 22 60 10 10 3 9 5 20 15

3164 3462 3086 2959 4004 3543 3900 3534 3769 3221 3468 3415

239 182 356 469 192 192 150 134 171 156 209 243

? 3N 4N 2N

B, bisexual; P, parthenogenetic.

a n d n o t t e t r a p l o i d as p r e v i o u s l y r e p o r t e d 2. The diploid n u m b e r for Artemia is a c c e p t e d as 42 3. T h e r e s u l t s of n u c l e a r c o u n t s in v a r i o u s c y s t s p o p u l a t i o n s are s h o w n in t h e Table. T h e d a t a on NAKANISHI et al.'5 h a v e b e e n r e c a l c u l a t e d f r o m t h e i r original findings a n d are t h o s e listed in t h e last h e a d i n g u n d e r ' S a n F r a n cisco'. On t h e one h a n d t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t , w i t h i n a given p o p u l a t i o n , d o r m a n c y is i n i t i a t e d a t essentially t h e s a m e d e v e l o p m e n t a l s t a g e w i t h r e s p e c t t o t h e n u m b e r of nuclei p r e s e n t . F u r t h e r m o r e , t h e n u m b e r of nuclei p e r c y s t a p p e a r s to be q u i t e similar in p o p u l a t i o n s s e p a r a t e d b y m a n y t h o u s a n d s of miles, t h e i m p l i c a t i o n being t h a t t h e o n s e t of d o r m a n c y is r a t h e r rigidly p r o g r a m m e d i n t o t h e d e v e l o p m e n t of t h i s organism. F u r t h e r m o r e , signif i c a n t gene flow b e t w e e n t h e b i s e x u a l p o p u l a t i o n s seems unlikely w i t h t h e possible e x c e p t i o n of t h e G r e a t Salt

L a k e a n d California p o p u l a t i o n s . Of course, no genetic e x c h a n g e t a k e s place b e t w e e n t h e p a r t h e n o g e n e t i c ones. Thus, t h e relative c o n s t a n c y of nuclei a t t h e t i m e of emb r y o n i c d o r m a n c y is an e v e n t t h a t a p p e a r s t o be a c q u i r e d and m a i n t a i n e d in e a c h p o p u l a t i o n i n d e p e n d e n t l y of geog r a p h i c a n d e n v i r o n m e n t a l conditions. On t h e o t h e r h a n d t h e i e are s t a t i s t i c a l l y significant differences b e t w e e n some of t h e s e p o p u l a t i o n s . The applic a t i o n of S t u d e n t ' s t-test t o t h e d a t a s h o w s t h a t t h e p o p u l a t i o n s can b e s e p a r a t e d a t t h e 95% level of confidence into t h e following s e q u e n c e : S F ~ = SL 67 > A i o - m a c h i > SL 51 = I n a u g u a = Comacchio = S F 51 = Sete > J a m n a g a r ~ S F 38 = S F 61 - - S F 65. H o w e v e r , t h e g r o u p i n g in t h i s s e q u e n c e s h o w s no overall correlation w i t h t h e geographical origin, t h e m o d e of r e p r o d u c t i o n , or t h e p l o i d y of t h e p o p u l a t i o n s .

Charakterisierung der Geisseln und des Flagellins von Listeria monocytogenes. I. I m m u n o l o g i s c h e Untersuchungen Characterization of Flagella and Flagellin of Listeria monocytogenes. I. I m m u n o l o g i c a l Investigations I. BRKVE~Y a n d H . LOTT~R

Inslitut If& Hygiene und Medizinische Mihrobiologie der Technischen Universitiit, Ismaninger Strasse 22, D-8 Miinchen 80 (Deutschland, B R D ) ; und Max-Planck-Institul [i~r Biochemie, D-8033 Marlinsried bei Mi~nchen (Deutschland, BRD), 15. Dezember 1975. Summary. I t is possible t o s h o w o n l y H - a n t i b o d i e s in a l a t e x t e s t w i t h a purified flagella s u s p e n s i o n of Listeria monocytogenes. An a n t i g e n c o m m u n i t y b e t w e e n Staphylococcus aureus a n d flagella of Listeria could be excluded. B a k t e r i e n g e i s s e l n b e s t e h e n aus einheitlichen globul~tren U n t e r e i n h e i t e n , die als Flagellin b e z e i c h n e t w e r d e n u n d in regelm~ssiger A n o r d n u n g z u m z y l i n d r i s c h e n Filam e n t a g g r e g i e r t sind (ScH~ITT1). Diese A g g r e g a t e k6nh e n d u r c h v e r s c h i e d e n e M e t h o d e n (IiNo ~) aufgelCst w e r d e n . E s ist b i s h e r n i c h t b e k a n n t , w i e w e i t Geisseln y o n Listeria monocytogenes u n d ihr G e i s s e l m o n o m e r - das Flagellin - i m m u n o l o g i s c h i d e n t i s c h sind. Das Flagetlin l~tsst sich besser reinigen als i n t a k t e Geisseln. Mit d e m g e r e i n i g t e n Flagellin kCnnen - bei b e s t e h e n d e r serologischer A q u i v a l e n z - h o c h s p e z i f i s c h e G e i s s e l - ( H ) - H y p e r -

i m m u n s e r e n h e r g e s t e l l t w e r d e n . Solche Seren sind zur K l ~ u n g d e r A n t i g e n g e m e i n s c h a f t y o n L~steria-Geisseln m i t a n d e r e n E r r e g e r n erforderlich. Serologische N r e u z r e a k t i o n e n der s o m a t i s c h e n (O)-Antigene yon L. ~nonocytoge~es m i t S t a p h y l o k o k k e l t o d e r E n t e r o k o k k e n sind h i n r e i c h e n d b e k a n n t (SE~LIGER 8, SACHS~ u n d

x R. SCHMITT, Biologie in unserer Zeit 7/2, 83 (1972). T. IINo, Bact. Rev. 33, 454 (1969). a H. P. R. SEELIGER,Z. Hyg. 1411,15 (1955).

866

Specialia

POTEL a, NETER e t al.S). Sie e r s c h w e r e n die A n t i k 6 r p e r b e s t i m m u n g in S e r e n y o n P a t i e n t e n m i t ListerioseVerdacht. Dem Nachweis von H-Antik6rpern wurde d e s h a l b m e h r B e d e u t u n g b e i g e m e s s e n als d e m y o n OA n t i k 6 r p e r n (SEELIGER6). Fiir die H - A g g l u t i n a t i o n w u r d e n b i s h e r S u s p e n s i o n e n y o n begeisselten B a k t e r i e n v e r w e n d e t . E i n e reine H - A g g l u t i n a t i o n ist a b e r n u r d a n n zu e r w a r t e n , w e n n als A n t i g e n e isolierte Geisseln verw e n d e t werden. D a m i t eine solche R e a k t i o n s i c h t b a r wird, ist es erforderlich, die Geisseln a n P o l y s t y r o l k i i g e l c h e n zu a d s o r b i e r e n . BADER 7 b e s c h r i e b eine L a t e x G e i s s e l - A g g l u t i n a t i o n bei Salmonellen. Mit e i n e m /~hnlic h e n T e s t w u r d e n die f o l g e n d e n U n t e r s u c h u n g e n d u r c h gefiihrt. D a b e i w u r d e n o p t i m a l e M e t h o d e n zur G e w i n n u n g u n d R e i n i g u n g d e r G e i s s e l s u s p e n s i o n e n u n d y o n Flagellin beschrieben. M a t e r i a l u n d Methoden. V e r w e n d e t e BakterienstS~mme. Listeria monocytogenes, S e r o t y p 4b (1071/53), Staphylococcus aureus (b 3), Proteus vulgaris (D 10), P s e u d o m o n a s aeruginosa (A 2), Bacillus subtilis (ATCC 6633). Geisselgewinnung. Die A n z i i c h t u n g d e r K e i m e erfolgte z u n ~ c h s t a u f B l u t a g a r bei 37~ Einzelne glatte K o l o n i e n w u r d e n a u f grosse P l a t t e n m i t T r y p t o s e a g a r i i b e r i m p f t u n d m i t 5 m l T r y p t o s e b o u i l l o n (Difco) fibers c h i c h t e t . N a c h 48 h B e b r t i t u n g bei 28 ~ w u r d e m i t gep u f f e r t e r K o c h s a l z l 6 s u n g ( P B S - p H 7,2) a b g e s c h w e m m t u n d die S u s p e n s i o n 30 rain bei 3 000/U z e n t r i f u g i e r t . D a s A u s g a n g s v o l u m e n w u r d e u m d e n F a k t o r 10 v e r r i n g e r t .

Tabelle I. Serumtiter vor und nach der Imlnunisierung mit ListeriaGeisseln und Flagellin.

O-Agglutination G 1 (Geissel) G 2 (GeisseI) F i (Flagellin) F 2 (Flagellin) Latex-Geissel-Test G1 G2 F1 F2

1280C 640C 3200 1600

Vor der Immunisierung

Nach der Immunisierung

1 : 20 1 : 20

1 : 80 t : 80

--

1 : 20

1 : 20

-----

1 : 12800 1 : 6400 1 : 3200 1:3200

~ ~ G1 G

800

I~XPERIENTIA32/7

Die Geisseln w u r d e n d u r c h B e h a n d l u n g m i t d e m H o m o g e n i s a t o r n a c h P o t t e r - E l v e h j e m (Fa. B r a u n , Melsungen) 3 m i n bei 1500 U / m i n a b g e t r e n n t . Die B a k t e r i e n z e l l e n w u r d e n d a n n d u r c h Z e n t r i f u g a t i o n bei 10000 g 20 m i n l a n g e n t f e r n t . D e r f J b e r s t a n d w u r d e 1 h bei 100000 g ( B e c k m a n n - Z e n t r i f u g e Spinco L 50) z e n t r i f u g i e r t . Das S e d i m e n t w u r d e in 20 m l P B S a u f g e n o m m e n u n d e r n e u t bei 10000 g 20 m i n z e n t r i f u g i e r t , m n e v e n t u e l l n o c h vorh a n d e n e B a k t e r i e n k 6 r p e r zu e n t f e r n e n . Die Geisselsuspension (fJberstand) wurde mit Formalin (Endkonzent r a t i o n 0,3%) k o n s e r v i e r t . H e r s t e l l u n g des Flagellins. D a s Flagellin w u r d e d u r c b B e h a n d l u n g m i t v e r d i i n n t e r HC1 bei p H 2 g e w o n n e n ( K O F F L E R 8). Herstellung y o n I m m u n s e r e n

gegen Geisseln u n d Fla-

gellin. Z u c h t k a n i n c h e n w u r d e n in 5-t/~gigem A b s t a n d m i t s t e i g e n d e r M e n g e (25-400 Fg P r o t e i n / m l ) Geisseln bzw. Flagellin in 0,5 m l P B S i.v. i m m u n i s i e r t . L a t e x - G e i s s e l - T e s t . V o n der g e r e i n i g t e n Geisselsusp e n s i o n w u r d e eine g e o m e t r i s c h e V e r d i i n n u n g s r e i h e m i t P B S hergestellt, w o b e i jedes iR6hrchen 0,25 m l e n t h i e l t . E i n T r o p f e n L a t e x - R e a g e n z (0,8 y. Fa. H y l a n d ) w u r d e m i t 5 m l P B S ve~diinnt. V o n diesem L a t e x - R e a g e n z w u r d e n 0,25 m l d e n G e i s s e l s u s p e n s i o n e n zugegeben. D a z u w u r d e n je 0,5 m l e i n e r p o s i t i v e n V e r d i i n n u n g des I m m u n s e r u m s gegeben. Dieses G e m i s c h w u r d e 4 h i m YVasserbad bei 37 ~ i n k u b i e r t u n d n a c h einer w e i t e r e n 1/2 h I n k u b a t i o n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r abgelesen. B e i p o s i t i v e r IReaktion e n t s t a n d e n weisse Flocken, die sich in d e r iKuppe des R e a g e n z g l a s e s a b s e t z t e n . Die l e t z t e G e i s s e l v e r d i i n n u n g , die n o c h eine s t a r k e IReaktion gezeigt h a t t e , w u r d e fiir d e n H a u p t v e r s u c h v e r w e n d e t . V o n d e m zu p r i i f e n d e n S e r u m w u r d e eine g e o m e t r i s c h e V e r d i i n n u n g s r e i h e hergestellt, w o b e i jedes l ~ 6 h r c h e n 0,5 m l e n t h i e l t . D a z u w u r d e die gleiche Menge des G e i s s e l - L a t e x G e m i s c h e s gegeben. D a n n w u r d e wie o b e n i n k u b i e r t u n d abgelesen. O- u n d H - A g g l u t i n a t i o n e n w u r d e n m i t L i s t e r i a - A u f s c h w e m m u n g e n (Behringwerke) n a c h A n g a b e n y o n SEELIGER 6 durchgefiihrt. A b s g t t i g u n g . V o n Geisseln u n d Flagellin w u r d e n m i t P B S S u s p e n s i o n e n hergestellt, die 1 m g / m l P r o t e i n enthielten. Es wurden weiterhin Listeria-O- und Staphyl o k o k k e n - A n t i g e n v e r w e n d e t . D u r c h f i i h r u n g n a c h CASTELLANI

9.

Fiir die S t a p h y l o k o k k e n - A g g l u t i n a t i o n w u r d e n zwei v e r s c h i e d e n e A n t i g e n e h e r g e s t e l l t : eine formalinisierte, u n d eine i m D a m p f t o p f e r h i t z t e B a k t e r i e n - S u s p e n s i o n (ScHIt~t~Z u n d BURGER10). Ergebnisse. Die Seren w u r d e n v o r u n d n a c h d e r I m m u n i s i e r u n g m i t d e m L a t e x - T e s t in d e r O- u n d H - A g g l u t i n a t i o n gepriift (Tabelle I). E i n T i t e r a n s t i e g in d e r O - A g g l u t i n a t i o n zeigte sich lediglich bei d e n m i t Geisseln i m m u n i s i e r t e n Tieren. E s fSJlt auf, dass alle Tiere v o r der Immunisierung im Latex-Geissel-Test negativ reagierten. V e r g l e i c h d e r a n t i g e n e n E i g e n s c h a f t e n y o n Geisseln u n d Flagellin. D e r A n s t i e g des H - T i t e r s i m L a t e x - T e s t bei d e n m i t Geisseln u n d Flagellin i m m u n i s i e r t e n T i e r e n ist a u s d e r F i g u r ersichtlich. A n t i k 6 r p e r w e r d e n v e r z 6 g e r t geb i l d e t ; e r s t n a c h d e r 4. W o c h e k o m m t es zn e i n e m steilen

400

._E 200 ioo o

/

/

i

2 3 4 5 6 7 8 9 Wochen

Anstieg des H-Titers im Latex-Test bei Kaninchen, die mit ListeriaGeisseln (G1 und G2) und Listeria-Flagellin (F1 und F2) immunisiert wurden.

4 H. SACHSEund J. POTEL, 114, 472 (1957). 5 ]~. NETER, H. ANZAI und E. A. GORZYNISKI, Proc. Soc. exp. Biol. IVied. 105, 131 (I960). 6 H. P. R. S E E L I G E R , Listeriosis (S. Karger, Basel, New York 1961). 7 R . E . B A D E R , Z . Hyg. 150, 199 (1964). 8 H. KOFFLER und T. KOBAYASHI,Arch. Biochem. Biophys. 67, 246 (1957). 9 A . CASTELLANI, Z . Hyg. dO, 1 (1902). 10 G. SeHIRRZ und A. BURGER, Z. reed. Mikrobiol. Immun. 152, 300 (1966).

15.7. 1976

Specialia

Tabelle II. S e r u m t i t e r g e g e n Listeria-Geisseln u n d Flagellin (6 W o ehen nach Beginn der hnmunisierung) v o r u n d n a c h der Abs~itti-

gung mit Staphylococcus aureus b 3. Listeria-Latex- Nach der Staphylokokken- Nach der Geissel-Test Absattigung Agglutination Absattigung G1 G2 FI

F2

1:6400 1:6400 1:400 1:200

1:3840 1:3840 1:480 1:240

1:40 1:40 1:20 1:20

--

-

---

Tabelle I I I . S e r u m t i t e r der m i t v e r s c h i e d e n e n B a k t e r i e n - G e i s s e l n i m l n u n i s i e r ten K a n i n c h e n .

hnlnunserum gegen

Serumttter ira Latex-Geissel-Test Homologes Antigen Listeria-Antigen

Geisseln yon Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis

1 : 9600 1 : 25000 1 : 9600

1 : 80 1:40 1 : 80

T i t e r a n s t i e g . D a b e i w u r d e n grunds~ttzlich a u c h y o n d e n m i t F l a g e l l i n i m m u n i s i e r t e n T i e r e n A n t i k 6 r p e r gegen Geisseln g e b i l d e t ; - die W e r t e liegen ] e d o c h n a c h 8 W o c h e n u m 2 T i t e r s t u f e n n i e d r i g e r als bei d e n m i t Geisseln i m m u n i s i e r t e n Tieren. E l e k t r o n e n m i k r o s k o p i s c h k o n n t e n i m