Planta (BEE.) 79, 162--180 (1968)

Zur Frage eines anaeroben Wachstums von einzelligen Griinalgen* B. NOI~v, NBm~O, D. L ~ S ~ M A ~ u n d A. PIRSO~ Pfianzenphysiologisches Institut der Universit~t G6ttingen Eingegangen am 10. November 1967

Concerning the Question o/Anaerobic Growth in Unicellular Green Algae Summary. 1. With a strain of Chlorella the conditions have been established for a photoreduction to run for at least 3 days after activation of hydrogenase. These conditions are: 500 Lux, manganese deficiency in cultures with ammonia, or addition of DCM-U (10-5 tool) to normally grown algae (nitrate or ammonia). In the absence of DCM~ nitrate accelerates the inactivation of hydrogenase. 2. During a period of pure photoreduction storage of carbohydrates is abundant; however, further syntheses leading to growth are cut off. 3. Another Chlorella strain is unable to grow anaerobically in dark or in light in a glucose medium free from CO2. After elimination of photosynthetic oxygen production (DCMU) cells stop growing even in the presence of C02. Growth in light requires a minimum amount of CO2 or 02 to be available at least inside the cells. 4. Aerobic cultures in glucose media grow well in dark and light in the presence of DCMU. In this case illumination increases cell growth if the external oxygen concentration exceeds 0,4 Vol.- %. At very low levels of oxygen nitrate as compared with ammonia improves cell growth in light. 5. Both strains of Chlorella can start growing from anaerobiosis only if photosynthesis is active as an auxiliary source of oxygen. Specific biochemical pathways for syntheses which would allow anaerobic growth are not available in these algae. Mit d e r k o n s e q u e n t e n A n w e n d u n g des P r i n z i p s d e r vergleichenden Physiologic auf p h o t o s y n t h e t i s c h a k t i v e M i k r o o r g a n i s m e n h a t vA~ NI~L (1932, 1941) einen w i c h t i g e n A b s c h n i t t in d e r U n t e r s u c h u n g des P h o t o s y n t h e s e v o r g a n g s eingeleitet. S e i t d e m g e h 6 r t die Gegen/iberstellung d e r P h o t o s y n t h e s e grfiner P f l a n z e n m i t 0 2 - E n t w i c k l u n g , die sich n a c h heutiger Auffassung zweier P h o t o r e a k t i o n e n bedient, u n d d e r a n a e r o b e n P h o t o s y n t h e s e ohne 0 2 - A b g a b e bei P u r p u r b a k t e r i e n u n d photoreduzier e n d e n Algen, ihrerseits n u r a n eine P h o t o r e a k t i o n (I) gebunden, zu d e n ergiebigen T h e m e n d e r vergleiehenden P h o t o s y n t h e s e f o r s e h u n g . Die einseht~gigen A r b e i t e n beschri~nken sich in ihrer m e i s t kurzfristigen Versuehsanstellung fast a u s n a h m s l o s attf d e n eigentliehen P h o t o s y n t h e s e v o r g a n g u n d d e h n e n d a h e r die vergleiehende B e t r a e h t u n g n i e h t weiter aus bis zu d e n F o l g e r e a k t i o n e n , die W a e h s t u m u n d V e r m e h r u n g der Zellen bedingen. Von den P u r p u r b a k t e r i e n ist zwar b e k a r m t , d a b sic * Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Dr. h.c. RIC~a~D HARDERin Verehrung zum 80. Geburtstag gewidmet.

Anaerobes Wachstum einzelliger Grfinalgen

163

im Licht anaerob waehsen, wenn dies aueh ffir den Fall der H~-Verwertung unter Bedingungen strikter Autotrophie bisher nur in einem Fall sichergestellt ist (THI]~LE, 1966). Wieweit eine Photoreduktion den Grfinalgen anaerobes Wachstum gestattet, ist jedoch bisher nicht eindeutig gekli~rt. Diese Frage hat gewisse Bedeutung fiir die 0kologie der Algen und ist auBerdem yon Interesse im Zusammenhang mit der gern angestellten l~berlegung, ob der Zellstoffwechsel der Algen nach der Aktivierung der I-Iydrogenase hn Sinne eines physio]ogischen Atavismus auf die Stufe der Photobakterien umgeschaltet wird. Ein anderer dem Mechanismus nach anaerober Vorgang ist die an das Photosystem I anschlieBende Phoslohorylierung organischer Substrate, wie sie z.B. an der lichtabh/~ngigen Glucoseaufnahme dutch Chlorella nachgewiesen worden ist (TA~x~g, D:4cHs~L und K~XDLEg, 1965). Auch hier stellt sich die Frage, ob Algen mit Hflfe des Photosyntheseapparats eine anaerobe Photoheterotrophie erlangen k6nnen, die ebenfalls yon Photobakterien bekannt ist (GEST, 1963). Ffir diese M6glichkeit spreehen einige frfihere Befunde an Chlorellen (NEISH, 1951; BEI~GMA~I~, 1955), dagegen jedoch neuere Effahrungen an Chlamydobotrys (WIEsSNV~ U. GAFFgO~, 1964). Die vorliegende Arbeit behandelt die Rolle dcr Photoreduktion einerseits und der Photoassimilation yon Glucose andererseits im Gesamtstoffwechscl der Chlorellazelle. Einige besondere methodische Probleme, die im R a h m e n der anaeroben Kalturversuche auftraten, sind ebenso wie verschiedene einsehliigige Detailergebnisse an anderer Stelle wiedergegeben (N(~ra~BE~G, 1967, LESEMAN~, 1966).

Methodik Versuchsobjekte waren zwei Chlorella-Stiimme der Sammlung Pringsheim des GSttinger Pflanzenphysiologisehen Instituts: flit Photoreduktionsversuche Chlorellapyrenoidosct C~c~, 211/8e; f/~r Glueosekulturen Chlorella vulgaris B~IJEmINCE, 211/llh. Diese Auswahl wurde wegen der relativ hohen Photoreduktionsleistung nach 20 Std Dunkelaktivierung der Itydrogenase in H 2 mit 4 Vol.- % COs bzw. wegen der vergleiehsweise starken Tendenz zur Glucoseverwertung getroffen. Das mineralische Kulturmedium fiir beide Algen ist bei Kvn~ (1962) angegeben. Sollte der l~itratstiekstoff durch Ammonsalz ersetzt werden, so wurde die /~quivalente Menge von (NH4)2HP04 gegeben und das Kaliumnitrat durch Kaliumehlorid ersetzt. Zur sterilen Anzucht im Lichtthermostaten im 02-freien Gasstrom wurde ein geschlossenes System verwendet. Bei Kultur bzw. Inkubation im tt2/C02-Gemisch (fertig hergestellt) wurde ein groSes Vorratsgef&$ (70 l) in den Kreislauf eingeschaltet; eine Membranpumpe sorgte fiir den Umlauf mit x/10atm Uberdruek. Im Kreislauf befand sieh auBerdem ein Troekenturm (CaC12),fiber den das Gas einen DeoxoGasreiniger zur Entfernung evtl. vorhandenen Sauerstoffs passierte; hinter demselben wurde es erneut mit Wasserdampf angereichert. Der herrschende lJ-berdruek ermSgliehte einerseits eine einfache anaerobe und sterile Entnahme der Algenproben fiber einen Dreiwegehahn, ffihrte aber andrerseits gelegentlich zu gr68eren 12a

P l a n t a (Berl.), Bd. 79

164

B. ~OHR:EI~BERG,D. LES:EMANlqund A. PI~SO~:

lokalen DruekerhShungen, so daft Sicherheitsh~hne verwendet werden mul~ten. Einzelheiten bei N(im~EN]~ERG(1967). - - Die Anzuchten mit Glucose wurden in dem yon WIESSN]~R (1960) besehriebenen Lichtthermostaten vorgenommen. Das Gasgemisch (80% N2~-20% H2) wurde mit CapillarstrSmungsmessem in einem ~ischgefi~B hergestellt und passierte yon dort aus, angetrieben durch eine Membranpumpe, nach Trocknen ebenfalls einen Deoxoreiniger und danach zur Beseitigung yon etwa vorhandenem C02 eine KOH-GaswasehrShre oder ein Natronasbestrohr. Aus den KulturrShren kehrte das Gas in das Mischgef~B zuriick. Auch hier konnten die Algenproben anaerob und steril entnommen werden (Detailangabeu bei LESEMANN, 1966). Zur Thermostatenbeleuchtung diente Misehlicht Philips ,,Warmton" ~ Phflips ,,Tageslicht" entsprechend den Angaben bei KOWALLIK(1962). Begrenzend ffir den Sauerstoffgehalt der Gasmischungen war die Leistungsf~higkeit des Deoxo-Reinigers. Der Restgehalt (nach Firmcnangaben 1 ppm) war mit einer elektro-chemischen Methode (T6DT, 1958) nicht mehr meBbar. Leuchtbakterien sprachen im Gaskreislauf ohne Algen noch eben schwaeh an. Es war also nach HA~VE~:und M o p , soN (1924) mit einer Restkonzentration zwischen 1 und 10 ppm 02 (10-4--10-a Vol.-% ) zu rechnen. Bei Wachstumsversuchen in Abh~ngigkeit yore 02-Gehalt wurde ein offenes System verwendet; hierbei wurden die 02Konzentrationen elektrochemiseh gemessen. Als MaB fiir d~s Algenwachstum diente meist die Zunahme des Zellstickstoffs pro Milliliter Kultursuspension. Diese GrSBe war der Zellzahl vorzuziehen, well sie unabh~ngig yon StSrungen der Teilungsvorgiinge ist. Anwendung yon DCMU. Da es in der vorliegenden Arbeit mehrfach auf die spezifische Ausschaltung der photosynthetischen Sauerstoffentwicklung (Photosystem II) mit Hilfe des Herbizids DCMU (3-(3',4'-Dichlorphenyl)-l,l-dimethylharnstoff) fiber einen l~ngeren Zeitraum hinweg ankara, wurde in einleitenden Versuchen die in diesem Sinne selektiv wirkende Hemmstoffdosis ermittelt. Es ergab sich dabei, dab sich die verwendeten Sti~mme yon Chlorella bei 10-Stool/1 DCMU in heterotropher Dunkelkultur mit Glucose praktiseh ungehemmt vermehrten: die Zunahme des Algenstickstoffs in der Kultur innerhalb yon 3 Tagen war ebenso wie die Kohlenhydratzunahme unbeeinfluBt; lediglich der Chlorophy]lgeh~lt hatte in der Dunkelkultur zur gleichen Zeit um etwa 15 % weniger zugenommen Ms ohne den ttemmstoff. Das photoautotrophe Wachstum war bei der gleichen DCMUDosis vollkommen gehemmt. Die Photoreaktion II ist somit dureh die angegebene Hemmstoffkonzentration komplett ausgesch~ltet; es muff ffeilich - - wie im folgenden gezeigt - - in Kauf genommen werden, daB bei dieser Dosis auch die Aktivit~t des Photosystems I geringfiigig vermindert ist. Analytische Bestimmungen. Gesamtstickstoff nach der Mikro-Kjeldahl-Methode; Kohlenhydrate modifiziert nach RoE (1955); Chlorophyll nach den Angaben yon B6OE~ (1964). Versuchsteil

I. Photoredulction und Wachstum 1. B e d i n g u n g e n stabiler P h o t o r e d u k t i o n Die Hauptschwierigkeit ffir eine B e a r b e i t u n g der P h o t o r e d u k t i o n i n lang]ristigen U n t e r s u c h u n g e n b e s t e h t darin, dal~ die Aktiviti~t der H y d r o g e n a s e e r h a l t e n bleiben mul~, also kein Umschlag zur photosynthetischen Sauerstoffentwicklung effolgt. Diese sog. D e a d a p t a t i o n t r i t t

Anaerobes Wachstum einzelliger Griinalgen

165

bei hSheren Beleuchtungsst/irken ein. So haben GAFFI~ON (1940) und K~SSLn~ (1957a) im kurzffistigen Experiment einen Anstieg der Photoreduktion H2-adaptierter Algen nur bis 600 Lux messen kSnnen. Unsere Vorversuche zeigten auBerdem, dag der Photosyntheseapparat yon adaptierten Chlorellen auch bei niedrigeren Beleuehtungsst/irken (z.B. 500 Lux) innerhalb weniger S t u n d e n zur apparenten Sauerstoffentwieklung zurfickkehrt. Offenbar ist das Reaktionssystem der Wasserspaltung auch wghrend der PhotorednktiorL nicht v611ig eliminiert und setzt sich daher im Laufe einer l~ngeren Reaktionszeit der Hydrogenase gegenfiber durch; hierffir spreehen schon die massenspektrometrisehen Untersuchungen von l~'Ra~c~: u.Mitarb. (1945) und yon HO~WITZ u. A L L ~ (1957a, b), in denen w/ihrend der Photoreduktion eine verdeckte 02Entwicklung naehgewiesen worden war. Nach diesen Ert'ahrungen war es ffir unsere Versuehe notwendig, die Tendenz zur Sauerstoffentwicldung zus/~tzlieh zu vermindern. Dies wurde durch Verwendung yon Algen, deren F/ihigkeit zur 02-Entwieklung durch vorherigen Manganentzug (KEssL~.R, 1955, 1957b) abgeschw/~cht war, zum Teil erreicht; vollst&ndig wurde die Sauerstoffabgabe dureh DCMU geeigneter Konzentration (10-6Mol/Liter) unterbunden. Gasau]nahme (--H~; -- C02) H2-adaptierter Algen yon Chlorella pyrenoidosa 211/8 e in Gegenwart yon CrCl e i m Seitenarm. Gasatmosphiire: H e ~ 4 % COe,

T a b e l l e 1.

Beleuchtungsstiir~,e: 500 Lux. Ansatz pro Ge/ii[3: 230 #g Chlorophyll~3 ml Algensuspension

Druek~nderung in 60 min (ram Brodie) Normal-Algen

Mn-Mangel-Algen Normal-Algen + 10-5 m DCMU

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~: CrC12 --CrC1 e

--99 --92

Die verdeekte Sauerstoffentwicklung wghrend der Photoreduktion kann bereits im kurzfristigen manometrisehen Experiment (1 Std) demonstriert werden. In Tabelle 1 ist die Gasaufnahme bei Photoreduktion in Gegenwart nnd Abwesenheit yon Chrom(II)-Chlorid als wirksamem Absorbens ffir Sauerstoff wiedergegeben. Normalalgen nehmen in Gegenwart von CrC12 mehr als doppelt soviel Gas (It2, C02) auf als ohne das Absorbens, weil im letzteren Fall eine st/~rkere gegenlgufige Sauerstoffentwieklung stattfinden kann. Unter sonst gleiehen Bedingungen ist die Druekabnahme bei photoreduzierenden Algen unabhgngig yon der Gegenwart yon CrC12, wenn Mn-Mangel vorliegt oder DCMU zugesetzt ist. Die hSehste Gasaufnahme wird hier bei 12b

Planta (Berl.), Bd. 79

166

B. Ntim~NB~ae, D. L~,s~A~x und A. Pmso~:

Tabelle 2. Ein]lufl der Anzuchtbedingungen au/ die Photoreduktion H2-adaptierter ChloreUa pyrenoidosa 211/8 e bei Kultur unter H2 + d % CO~ (500 Lux ). Messung 3 Tage nach er]olgter A~ivierung der Hydro~enase. Aus[iihrlichere Daten bei Ni)HR~N~nRO(1966) Anzucht

N- Quelle

Photoreduktion nach 3 Tagen

Normal-Kultur

--

Mn-Mangel-Kultur

NO~ NH~ NO~

Normal-Kultur + 10-5 m DCMU

NO~ NH~

+ +

--

Manganmangelalgen beobachtet; im DCMU-Versuch ist die Photoreduktion etwas geringer; wahrseheinlich wirkt der Hemmstoff nicht v611ig selektiv auf die 0e-Entwicklung, sondern beeintr/ichtigt auch etwas die Gesamtleistung des Photosyntheseapparats. Bei den Normalalgen ist auch in Gegenwart yon CrC12 die manometrisch megbare Gasaufnahme suboptimal, weft das Absorbens die Deadaptation der Hydrogenase durch den in der Zelle freigesetzten Sauer"~: - 6 O t ~ - - ~ . . o stoff (oder dessen Vorstufe im Photosynthesemechanismus) offenbar nicht vSllig auszuschalten vermag. Es zeigte sieh Ierner, dag die Stabilit/it der Photoreduktion von der Art der Sticksto//quelle mitbestimmt ~4_rd. Nitrat fSrdert gegen0 1 2 3 Tage fiber Ammonsalz die Deadaptation. Abb. 1. Anaerobe G~saufnahme (--H 2; Nach dreit~giger Belichtung bei --CO~) bei der Photoreduktion yon 500 Lux und Begasung mit H 2 und H2-ad~ptierten Manganmangelalgenin CO 2 erwies sieh die Hydrogenase Ammonkultur (e) und yon Normal- adaptierter Algen im manometrialgen mit DCMU (10-stool/L) aus schen Test noch aktiv, sofern die 03Nitratkultur ([]) und Ammonkultur (9 500 Lux. Ans~tze ]proManometer- Entwicklung durch DCMU blockiert gefgl]: 55, 82 bzw. 70 ~g Chlorophyll. oder bei Manganmangel der StickChlorella pyrenoidosa 211/8e. 25~ stoff als Ammonsalz geboten war. Nach gleicher Expositionszeit hatten Manganmangelalgen in Nitrat ihre F/~higkeit zur Photoreduktion eingebfiBt, was bei Normalalgen unabh~ngig yon der N-Quelle eingetreten war (Tabelle 2).

t \o. o

Anaerobes Wachstum einzelliger Grtinalgen

167

Abb. 1 gibt die liehtabh~ngige Gasaufn~hme bei der Photoreduktion tt2-adaptierter Algen wieder, und zwar bei dreitagiger Kultur unter H~ mit 4% CO 2 (500 Lux). Die MeBpunkte zeigen die manometrisch erf~Bte Photoreduktion nach anaerober Uberfiihrung aus den Kulturen in die Manometergef~Be. Dargestellt sind die t~aten der Photoreduktion yon Manganmangelalgen in Ammonkul~ur und von DCMU-gehemmten Normal~lgen aus Ammon- und Nitratkultur. Trotz gleicher Beleuchtungsst/~rke kann bei diesem Verfahren der Lichtgenu{~ der Algen im Kulturthermostaten und im Manometergef~8 nicht exakt auf gleiche Betr&ge eingestellt werden. Die Unterschiede in den Absolutwerten der Gasaufnahme rtihren yon den etwas unterschiedlichen Algenmengen her, die sich zuvor in den verschiedenen AnzuchtrShren ergeben hatten. Als Anhaltspunkt fiir die Menge der Algen kann der Chlorophyllgehalt der jeweiligen Versuchsproben dienen. Das im vorliegenden Zusammenhang wesentliche Ergebnis der Versuchsreihe ist der Nachweis einer mehrere Tage anhaltenden Photoreduktion. Bei den Manganmangelalgen sind bei Versuchsende die Druckabnahmen ann/thernd unver/~ndert; bei Normalalgen mit DCMU ist im Versuchsverlauf ein m/~l]iger Abfall zu verzeichnen. 2. Kennzeichen der Photoreduktion a ) StSchiometrie. Es wurde nunmehr gepriift, ob der zun~chst nur

durch Druckgbnahme im Manometer gemessene Gasverbrauch bei stabilisierter Photoreduktion (DCMU) tatsachlich den Forderungen der StSchiometrie entspricht. Hierzu wurde nach dem yon GAFF~O~ (1940) angegebenen Verfahren das Verh<nis der H2-Aufnahme zum CO~-Verbrauch bestimmt. Dabei wird eine bekannte Menge yon CO 2 (in Form yon NaHCOs) zugegeben und anschlie~end die H2-Aufnahme gemessen. Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, verbrauchen adaptierte Normalalgen in Tabelle 3. Stgchiometrie der Photoreduktion. Bestimmung des Verhiiltnisses von au/genommenem H 2 zu au]genommensm CO2 bei Normal-Algen yon Chlorella pyrenoidosa 211/8 e in Gegenwart yon D C M U (10 -5 Mol/Liter). Beleuchtungsstg@e 500 Lux. Ansatz pro Ge]~i[3:190 ttg Chlorophyll~3 ml Algensuspension Zugegebene C02-~enge (~) - -

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Aufgenommene H2-Menge (~M) 1,28

4,55 2,06 8,40 8,20

H2-Menge Blindwert (~M) - -

3,27 -6,34 6,14

Verhgl~nis H2/CO~

- -

2,03 -1,97 1,90

168

B. Ni~m~NB~RO, D. LES~MA~ und A. Pn~so~:

Gegenwart yon DCMU bei 500 Lux mit fast theoretischer Genauigkeit die der Bruttogleiehung 2H~ -? CO 2 = 1/6C6H1~0~-~ H20 entspreehenden Gasmengen. b) Lichts~ittigung. Nach Bishop (1958)/~uBert sieh die Stabilisierung der Photoreduktion dutch DCM-U bei Ankistrodesmus und Scenedesmus darin, dab die Gasaufnahme auch im Bereieh hSherer Beleuehtungsst/~rken (fiber 2000 Lux hinaus) beobachtet werden kann, also der Reak.c E oCo

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Abb. 2A u. B. Abh~ngigkeit der Photoreduktion von der Beleuchtungsst~rke bei Chlorella pyrenoidosa 211/8 e. A Gasaufnahme H2-adaptierter Algen (--It 2; --C02). Ansatz pro Gef~l]: 200 ~g Chlorophyll pro 3 ml Algensuspension. Gasatmosphgre: H~ + 4% CO.2. B Kohlenhydratzunahme in % des Ausgangswertes H~-adaptierter Algen nach 48 Std Kultur unter H 2+ 4% CO2 tion von Manganmangelalgen (KEssLER, 1957a) entspricht. Kurzfristige Versuehe (60') ergaben bei unserem Stature, da6 die mit DCMU stabilisierte Photoreduktion oberhalb yon 500 Lux nieht mehr wesentlich ansteigt (Abb. 2A). Zwischen 500 und 2000 Lux ist nur noch eine Zunahme von etwa 10% festzustellen. Auch im langfristigen Kulturexperiment (48 Std) bei verschiedenen Beleuchtungsst/irken ergab sich eine markante Kohlenhydratzunahme infolge Photoreduktion ebenfalls bis zu 500 Lux, darfiber hinaus war der Anstieg wesentlieh geringer (Abb. 2 B). Der gegeniiber der Photosynthese niedrige Lichts/~ttigungswert der

Anaerobes Wachstum einzelliger Griinalgen

169

Photoreduktion diirfte damit zusammenhs dab hier nur das Photosystem I eingesetzt ist. Aueh in anderen Fallen, wo der Photosyntheseapparat nur mit diesem System arbeitet (KA~DLER, 1954, 1955; U~BAe~ u. SIMOn,S, 1964; MeLAeHLANU. POR~R, 1959; FO~TI u. PA~ISI, 1963; P R I ~ G S ~ u. WI~ss~w~, 1960; WI~SS~E~, 1965), liegt die Liehts~ttigung vergleiehsweise niedrig ( T A ~ u.Mitarb., 1965). Es ist allerdings damit zu rechnen, dab der zur Aussehaltung des Photosystems II dienende DCMU-Zusatz im vor]iegenden Fall eine Verminderung der Photoreduktionsrate bedingt; denn DCMU (10-~Mol/Liter) l~i~t aueh die eyelisehe Phosphorylierung im Photosystem I nieht ganz unbeeinflut]t ( T ~ a u.Mitarb., 1965, 1966; WIESS~E~, 1966). 3. Zusammensetzung der adaptierten Algen naeh Kultur im Wasserstoffstrom In Vorversuchen war festgestellt worden, dab sieh in allen Wasserstoffkulturen, bei denen eine Photoreduktion fiber 1/~ngere Zeit nieht aufreehterhalten werden konnte (Nitrat- und Ammonkultur von Normalalgen, Nitratkultur yon Manganmangelalgen), Waehstum und Zusammensetzung nieht wesentlieh von Kulturen in Luft-CO2-Gemiseh untersehieden. Die Substanzvermehrung war Mso aueh in Wasserstoffatmosph/~re (4 % C02) wohlbalaneiert, d.h., es kam nieht zu einer Speieherung von Kohlenhydrat (Detaflangaben bei N t ~ m ~ N B ~ , 1967). Durehaus versehieden hiervon verhielten sieh die Kulturen mit langfristig stabilisierter Photoreduktion (Abb. 3 und 4). In Ammonkulturen yon Manganmangelalgen (Abb. 3) nimmt der Gesamtstiekstoff nooh etwas zu, jedoeh weniger als in Luft; die absolute Menge des Chlorophylls bleibt vSllig unver~ndert. Ausgesproehen kr/~ftig ist dagegen die Zunahme der Kohlenhydrate, so dal3 das Verh/~ltnis Kohlenhydrat : Stickstoff stark ansteigt. Diese Anh/~ufung ist bemerkenswert aueh deshalb, weil Manganmangelzellen in der aeroben Kultur selbst bei hohen Be]euehtungsst/~rken dureh einen niedrigen Kohlenhydratspiegel gekennzeiehnet sind; denn bei ihnen ist die Photosynthese herabgesetzt, die Kohlenhydratverarbeitung dagegen nieht oder nut wenig behindert (PI~so~ und BADO~7~,1961), also die Voraussetzung fiir eine Speieherung nieht gegeben. Erw/~hnt sei aul3erdem, dal~ die Chlorophyllproduktion v611ig stillgelegt ist, w/~hrend gleiehzeitig noeh eine geringe Zunahme des Stickstoffs eintritt. Im Bereieh niedrigster 02-Konzentrationen kommt es also offenbar zu einer Konkurrenz zwisehen den O2-abh/~ngigen Zellsynthesen. Die Versuehe mit Normalalgen in Anwesenheit yon DCMU, bei denen im Unterschied zu Manganmangelalgen ohne DCMU aueh der letzte

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Abb. 3A---C. Wachstum und Zusammensetzung yon Munganmangel-Kulturen yon Chlorellapyrenoidosa 211/8 e bei Begasung mit H2+4% CO2 (9 und Luf$ 4-2% CO~ ([]). AmmonnghrlSsnng, 500 Lux. A Gesam~stiekstoff der Algen/ml Suspension. B Gesamtkohlenhydrat der Algen/ml Suspension. C Chlorophyll/ml Suspension

Rest yon photosynthetischer O~-Entwicklung beseitigt is~, lieferten in gleichem Sinne ein noeh eindeutigeres Bild (Abb. 4): weder in Nitrat, noeh in Ammonsalz t r a t innerhalb yon 3 Tagen eine Stiekstoff- oder Chlorophyllzunahme ein; dagegen stieg der Kohlenhydratspiegel auf ein Mehffaehes des Anfangswertes an. Regelm~Big wurde in solchen Versuehen festges~ellt, dab die Kohlenhydratspeicherung in Nitra~kulturen gr6Ber war als in Ammonkulturen, Auf welehe Weise das Nitrat, sofern es - - wie in diesem FMle durch DCMU - - an seiner deadap$ationsfSrdernden Wirkung gehinder$ ist, die Speicherung yon Kohlenhydrat in den wachstumsgehemmten Zellen begiinstigt, bedarf n~herer Untersuchung. _&us den vorliegenden Daten 1/~B~ sich insgesam~ schlieBen, dab ein Zellwachstum H~-adaptierter Algen nur dann erfolgt, wenn die Sauerstoffentwieklung wieder ins Spiel kommt. Hierbei braucht die Re~ktivierung des Photosystems I I wahrseheinlich nicht vollst/~ndig zu sein. So kSnnte die ]eichte Stickstoffzunahme der H2-adaptierten Manganmangelalgen in Ammonkultttr (Abb. 3) mi~ einer neben der Photoreduktion

Anaerobes Wachstum einzelliger Gr/inalgen

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Abb. 4A--C. Wachstum und Zusammensetzung yon Normalku]turen yon Chlorella pyrenoidosa 211/8e bei Begasung mit H 2 + 4 % C02 nach Zugabe yon DCMU (10-Stool/l). 500 Lux. [] Nitratkultur; o Ammonkultur. A Gesamtstickstoff der Algen/ml Suspension. B Gesamtkohlenhydrat der Algen/ml Suspension. C Chlorophyll/ml Suspension

noch ablaufenden geringen intracellul/~ren s a m m e n h a n g stehcn.

Sauerstoffabgabe in Zu-

I I . Glucosekulturen B ~ G ~ A N ~ (1955) berichtet y o n W a c h s t u m s v e r s u e h e n an Chlorella im CO~-frcien Stickstoffstrom mit Glucose als organischer Kohleustoffquelle. Vcrsuche, die hier vorliegenden Anzeichen fiir eine anaerobe

172

B. NiJltRE~TBERG,D. LESEI~IANNund A. PIRSON:

Photoheterotrophie sicherzustellen, fiihrten zu der Beobachtung, dal3 sich solehe Kulturen nur entwickeln kormten, wenn 1. eine Mindestmenge yon Zellen eingeimpft und 2. das Volumen des in der Zeiteinhei~ durehstrSmenden Stickstoffs nicht zu gTO~ gew/~hlt war. I n bestimmten Grenzen konnte das Waehstum bei grSBerer Impfdichte dureh hohe DurchstrSmungsgeschwindigkeit oder bei schw/~cherem Gasstrom durch

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Abb. 5A u. B. Glueosekulturen ,/on Chlorell~ wlgaris 211/llh bei l1000Lux. Impfdiehten 5, 6,5 und 8 ~xgN/ml. Nitratn~hrl6sung. Begasung 25 l/h. A Begasung mit =

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12

14Tage

Abb. 6. Glucosekulturen yon Chlorella vulgaris 211/llh bei 500 Lux und Entzug yon 02 und C02. Starke Begasung (50 l/h). Zugabe von C02 (5 Vol.- % ) zum Gasstrom nach dem 8. Versuchstag. Nitratn~hrlSsung, 5000Lux, im Gasstrom 10 ppm 02 Normalansatz (.). Ansatz mi~ 10-SmoI DCMU (9 in diesem Versuch eine Kultur mit 10-sin DCMU; sie sprach auf den Zusatz yon CO~ nieh~ an. I n Abb. 7 ist zusammenfassend das Ergebnis einer grSI3eren Versuchsserie dargestellt, die den Wachstumsverlauf in Abh~ngigkeit yon der O~-Konzentration im Gasraum unter verschiedenen Versuchsbedingungen verfotgte. Die Waehstumsgeschwindigkeit ist dargestellt durch die Differenz des Logarithmus der Zunahme des Zellstickstoffs pro Volumeneinheit der Algensuspension innerhalb yon 24 Std. Die Voraussetzung ffir diese Darste]lung ist logarithmisches Waehstum innerhalb der Versuehszeit. Wie in Vorversuehen festgestellt war, befinden sich bei 5000 Lux die Kulturen unabhiingig yon der Zuwaehsrate w~hrend der 24 Std in der exponentiellen Wachstumsphase. Selbst naeh 30 Std war unter optimalen Wachstumsbedingungen bei Einsaaten yon 10 ~g N pro ml eine Abnahme der Zuwachsrate infolge des verminderten durchschnittliehen Lichtgenusses der Einzelzelle noeh nieht eingetreten (L]~sEMA~, 1966). Dichte und DurchstrSmungsgeschwindigkeit (offenes System) waren bei diesen Versuchen so gew/~hlt, dab das Waehstum der Kulturen in der fiblichen N/ihrl6sung (N-Quelle Nitrat) selbst bei der niedrigsten

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B. Nt~m~EN~G, D. L]~S]~A~Nund A. Pmso~:

O2-Konzentration ( ~ 10 ppm) ebenso glatt in Gang k a m wie bei DurchstrSmung mit Luft. I m Dunkeln k o m m t es bei diesem niedrigen 02Druck nicht zur Substanzvermebrung. Ein Ansatz mit Ammonsalz als N-Quelle ergibt gegenfiber der NRratkontrolle stark verlangsamtes Wachstum. Erst im Bereich yon 1 Vol.-% 0~ erreicht die Ammonkultur die Nitratkultur bzw. fibertrifft dann dieselbe etwas (ein ffir den verwendeten Chlorellastamm unter Normalbedingungen typisches Verhalten). Dies Ergebnis zeigt, dal~ in belichteten Glueosekulturen ohne

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0,05 0~ 0# ID 3,0 21 Vol.-~ Oz

Abb. 7. G]ucosekulturen yon Chlorella vulgaris 211/llh. Wachstumsrate (A log N/24 h) in Abh~ngigkeit vonder Sauerstoffkonzentration. Begasung im offenen System. 5000 Lux. [] Norm~Ikultur, belichtet (Nitratn~lu'16sung); 9 Normalkultur, dunkel (Nitratn~hrlSsung); O Kultur mit DCMU (10-Stool/l), belichtet (Nitratn~hrl6sung); A Normalkultur, belichtet (Ammonn~hrl6sung). Jeder Kurvenpunkt kennzeiehnet die Waehstumsleistung einer unter den angegebenen Bedingungen angezogenen Kultur (s. Text) Zufuhr yon CO 2 und 02 - - ebenso wie bei Kultur unter Photoreduktionsbedingungen (s. S. 166) - - Nitrat das Wachstum fSrdert. Dunkelkulturen mit Glucose erreiehen ihr Zuwachsoptimum erst zwischen 3 und 21 Vol.-% Sauerstoff (die Diskontinuit~t im Anstieg der Waehstumsleistung zwischen 0,2 und 0,4 Vol.-% wurde nur in der vorliegenden Versuchsreihe beobaehtet). Kulturen in Gegenwart yon DCMU (5000 Lux) verhielten sich bei niedrigen 02-Gehalten (bis hinauf in den Bereieh zwischen 0,05 und 0,4 Vol.- % ) ann~hernd wie Dunkelkulturen. Zwischen 0,4 und 21 Vol.-% 02 war eine m~Bige, aber in vielen Versuchen best~tigte F6rderung dureh das Licht festzustellen. I n diesem Bereich fibt also die Beleuchtung auch ohne Mitwirkung des Photosystems I I einen fSrdernden Einflu~ auf die Glueoseverwertung aus, und zwar offenbar mit Hilfe der Photophosphorylierung, wobei in Erw~gung zu ziehen ist, ob die Bindung des Effekts an die etwas h6heren 02-Konzentration einen ,,pseudocyclisehen" Vorgang anzeigt. Dal3 unter diesen Bedingun-

Anaerobes Wachstum einzelliger Griinalgen

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gen die fSrdernde Wirkung des Liehts nieht genfigt, um die volle Leistung tier Normalanzuehten zu erreichen, dfirfte damit zusammenhgngen, dag DCMU nicht vSllig selektiv auf das Photosystem I I wirkt, sondern in seiner Gif~wirkung auch andere Schritte der Photosynthese etwas beeintrgchtigt. Bei der Beurteilung des Liehteinflusses auf die Glucoseverarbeitung mug man iibrigens beachten, dab das Licht auch fiber andere als photosynthetische Mechanismen in das synthetisehe Zellgesehehen einzugreffen vermag (z.B. KOWaLLIK, 1966). 1,o 0,8 2D

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Abb. 8. Glucosekultur yon Chlorella vulgaris 211/11h. Wachstumsrate in Abhgngigkeit vonder Beleuchtungsst~rke. Nitratn~hrlSsung. 9 Normalkultur in Luft-~ 2 % C02; o Normalkultur bei 02- und C02-freier Begasung. Art der Darstellung wie in Abb. 7 Eine weitere Versuchsserie (Abb. 8) diente der Ermittlung der Produktionsleistung yon gul3erlieh anaerob geha]tenen Glucosekulturen in ihrer Abh/~ngigkeit yon der Beleuchtungsst&rke. Die Kontrollkurve (Luft ~- CO2) zeigt den zu erwartenden Anstieg bis 11000 Lux ; die Liehts~ttigung ist auch dann noch nicht erreicht; bei diesen h6heren LuxWerten ist allerdings exponentielles Wachstum innerhalb 24 Std nieht mehr gesiehert. Beim Fehlen yon O2 und CO 2 im Gasstrom steigen die Waehstumsleistungen yore Dunkelwert 0 bis zu etwa 2000 Lux steil an, fallen dann zwisehen 2000 und 5000 Lux annahernd mit den Normalkontrollen zusammen, steigen jedoch bei noch hSheren Beleuehtungsst/~rken lfieht welter an, sondern werden im Starklicht sogar etwas herabgemindert. Die in Abb. 5--8 niedergelegten Ergebnisse lassen insgesam~ eine Deutung des Wachstums ,,anaerober und CO~-freier" Glueosekulturen zu. V611ige Anaerobiose, verbunden mit komplettem CO~-Entzug, gestattet bei dem vorliegenden Chlorella-Stamm weder im Dunkeln noeh im Lieht eine Vermehrung der Zellsubstanz. Ein kleinerer Betrag von

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B. NtYm~NB~gG,D. LES~Ale~und A. Pmso~r

COs, der aus der Zelle nieht ausgetrieben wurde oder auch durch G~rungsvorg/~nge neugebfldet sein kann, bringt jedoeh die Photosynthese in Gang; der nun entwiekelte Sauerstoff ffihr~, sofern aueh er nicht vSllig aus der Zelle entfernt wird, zur Freisetzung von Atmungskohlens/~ure. Die Atmung wiederum liefert bei gleichzeitigem Einsetzen assimilatorischer Prozesse einen kleinen C02-~bersehuB, der seinerseits weiteres Ansteigen der photosynthetisehen O~-Entwieklung bewirkt. So kommt es dazu, dab sieh Atmung und Photosynthese gegenseitig bis zu einem Weft aufschaukeln, der dutch die volle Inanspruchnahme des respiratorischen Enzymsystems (Glucoseatmung) der Algen bestimmt ist. Darfiber hinaus ist eine Steigerung des synthetischen Stoffwechsels nur dutch zus~tzliehe C02-Zufuhr yon auBen mSglieh. Erfolgt diese nicht, dann kann es im Starklicht in dem nicht roll besch~ftigten Photosyntheseapparat zu einer Leistungsdepression kommen. Nach dieser Vorstellung k/~me man mit der Annahme aus, dab das Anwachsen der Algen aus der Anaerobiose heraus allein yon den dureh das Photosystem II in der Zelle erzeugten aeroben Bedingungen abh/~ngt und daher die beginnende Glueoseverarbeitung in ihrem Ablauf mit den synthetischen Vorg/~ngen in aeroben Dunkelkulturen identisch ist. Die Versuehe mit DCMU (Abb. 7) spreehen jedoch daffir, dab oberhalb eines bestimmten 02-Gehalts in Gasraum bzw. Zelle das Photosystem I einen zus~tzliehen und spezifischen Beitrag zur Glucoseverwertung leistet. Diskussion Naeh den hier niedergelegten Ergebnissen sind die untersuchten Chlorellast/~mme weder im Dunkeln noeh im Licht zu anaerober Vermehrung bef~higt. Zwar besteht unter strenger Anaerobiose fiber das Photosystem I die M6gliehkeit einer Kohlenhydratsynthese dureh Photoreduktion und einer F6rderung der Aufnahme bzw. Phosphorylierung yon Glucose (vgl. T A ~ I ~ u.Mitarb., 1965, 1966). Eine weiterffihrende Verarbeitung des bei der Photoreduktion angelieferten Kohlenhydrats oder der im Medium gebotenen Glucose ist jedoeh ausgeschlossen, solange die Abgabe yon Sauerstoff durch das Photosystem II stfllgelegt ist. Es sei hier erw/~hnt, dab aueh die yon Bishop (1962) isotierte Scenedesmus-Mutante Nr. 11, die kein Photosystem II besitzt, aber Hydrogenase aktivieren kann, auf Grund ihrer Photoreduktion allein nieht zu wachsen vermag (N~gE~B~gO, 1967). Unter anaeroben Ausgangsbedingungen wird somit die Photosynthese als Sauerstofflieferant zur obligatorischen Hilfsreaktion des Zellstoffweehsels; sic siehert auf dicse Weise den vollst/~ndigen Ablauf der Zellentwieklung. Eine derartige Sonderfunktion des Photosyntheseapparats haben bereits WI~SS~g und GArr~o~ (1964) bei der zun~ehst anaerob erseheinenden Photo-

Anaerobes Wgchstum einzelliger Grfinalgen

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assimilation von Acetat in Chlamydobotrysaufgefunden. W~hrend es sich in diesem Fall um einen Sauerstoffbedarf bei der Kohlenhydratbildung ans Acetat handelt, betrifft bei unseren Objekten die Rolle des Sauerstoffs eine Rcihe yon synthetischen Vorg~ngen, die v o m Kohlenhydrat ihren Ausgang nehmen und zweifellos nieht auf den Chloroplasten besehr~nkt sind. Wozu nun im einzelnen der Sauerstoff im Zellstoffweehsel der Chlorellen benStigt wird, l ~ t sich auf Grund unserer Ergebnisse nieht angeben. I m m e r h i n kann man aussehliel3en, dal~ es dabei nur durum geht, eine im Gefolge der Anaerobiose eintretende Uberreduktion von Cofermenten des Zellstoffwechsels, z.B. der Pyridinnueleotide, zu beseitigen. Denn naeh neueren Erfahrungen der Biochemie gibt es im aerob wachsenden Organismus eine Anzahl yon Synthesen, die an spezifisehe Oxygenasen gebunden sind und daher molekularen Sauerstoff benStigen. Hier k o m m t z.B. die Bildung yon unges~ttigten Fetts~uren, Chinonen, Carotinoiden und Porphyrinen in Betraeht (s. BLOCK, 1962; ERWIN u. BLOCH, 1964; SAGO, 1966). Fiir die Chlorophyllsynthese besteht naeh unseren physiologischen Daten in Chlorella sogar ein gegeniiber anderen synthetisehen Reaktionen erh5hter Sauerstoffbedarf. Nitrat kann im Bereieh wachstumsbegrenzender Sauerstoffdrueke einen speziell fSrdernden Einflul~ auf die Entwicklung behehteter Zellen ~usiiben. Die n~ehstliegende Erkl~rung hJel~ttr ergibt sich aus der Annahme, dub Nitrat als Elektronenaeceptor neben oder anstelle yon Kohlendioxyd die Bet~tigung des Photosystems I I begtinstigt, d.h. dem Chloroplasten in vivo als ehae Art ttill-Reagens dient. Es sei jedoeh betont, dalt das Nitrat bei vSlliger Anaerobiose die Wachstumsvorg~nge in beliehteten Glueosekulturen nicht starter, sondern nur zus~tzlich zu einer geringen Anfangsdosis yon O 2 wirkt. Den Gesichtspunkt der bioehemischen Evolution kann man mit der Annahme ins Spiel bringen, dalt in den photosynthetiseh aktiven Zellen naeh einem sekund~ren Erwerb des sauerstoffentwiekelnden Photosystems (II) die besonderen Meehanismen entbehrlieh und r~ickgebildet wurden, die den Anaerobiern gewisse beim Zellwaehstum mal~gebende Synthesen gestatten. Damit mug sich eine strenge Bindung des Gesamtsfoffweehsels an die ~eroben Bedingungen entwickelt haben. Soweit griine Algen iiberhaupt zu einer G~rung in nennenswertem Ausmal] befahigt shad -- dies tri~ft bei Chlorellen in Gegenwart yon Zuokern jedenfalls zu (SYR~TT U. W O ~ G , 1963) -- ist diese naeh bisherigen Erfahrungen nieht waohstnmswirksam, mag aber dureh geringe Produktion yon CO 2 dem anaeroben Start der photosynthetisehen O~-Entwieklung dienlieh sein. Es ist bemerkenswert, dab die Ausbildnng yon Miteehondrien in den Eukaryonten ffir sich allein keine obligatorische Bindung des Zellstoffwechsels an den Sauerstoff anzeigt. Denn manehe

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B. Ni~:KR:ENBERG,:D. LESE~IANNund A. PIRsoN:

Helen besitzen sauerstoffunabh/ingige Synthesesysteme, die sie wie die anaeroben Bakterien bei SauerstoffausschluB in den Dienst einer dann freflich relativ geringeren Zellvermehrung stellen; dabei werden die Mitochondrien weitgehend riickgebildet (W~J~LACn u. LINNAN~, 1964). Die Frage dr/~ngt sich auf, ob es unter den photosynthetiseh aktiven Eukaryonten iiberhaupt Typen gibt, die fakultativ anaerob wachsen kSnnen. Jedenfalls stehen sieh Photobaktexffen und Grfinalgen fiber die augenf~lhgen Unterschiede ihrer Feinstruktur hinaus so fern, alas weitere vergleichend-zellphysiologische Untersuchungen mehr Abweichungen als fibereinstimmende Ziige aufzeigen diirften.

Zusammenfassung 1. Ffir Chlorella pyrenoidosa, Stature 211/8e, wurden die Bedingungen ermittelt, unter denen nach Aktivierung der Hydrogenase eine Photoreduktion auf l~ngere Zeit hinaus (3 Tage) aufrechterhalten bleibt. Dies wurde bei 500 Lux dutch Manganentzug in Ammonkultur oder nach Normalanzucht durch Zusatz yon DCMU (10-Stool) in Nitrat- oder Ammonkultur erreicht. Nitrat f6rdert in Abwesenheit yon DCMU die Inaktivierung der Hydrogenase. 2. Beim Vorliegen reiner Photoreduktion erfolgt zwar eine Speicherung yon Kohlenhydrat; weiterffihrende Synthesen (Zunahme des Zellstickstoffs, Chlorophyllbildung) und Wachstum sind jedoch nicht m6glich. 3. Chlorella vulgaris, Stamm 211/11 h, vermag mit Glucose bei strenger Anaerobiose weder im Dunkeln noch bei Belichtung in Abwesenheit yon C02 zu wachsen. Ausschaltung der photosynthetischen 02-Produktion durch 10-Smol DCM-U untcrbindet in Anaerobiose die Wachstumsvorgi~nge. Wachstum mit Glucose im Licht ist stets gebunden an eine Mindestmenge yon 02 oder CO~, die wenigstens intracellular vorliegen muB. 4. Aerobe Glucosekulturen k6nnen sich in Gegenwart yon DCMU im Dunkeln und im Licht entwickeln. I m Lich~ ist die Produktion etwas erh6ht, jedoch nur oberhalb einer Mindestmenge freien Sauerstoffs (0,4 Vol.- % ). In Gegenwart yon sehr wenig Sauerstoff f6rdert im Licht Nitrat gegenfiber Ammonsalz die Entwicklung der Glucosekulturen. 5. Fiir die untersuchten Algenstiimme wird bei anaeroben Ausgangsbedingungen die Photosynthese in ihrer Funktion als Sauerstofflieferant zum unen~behrHehen HilfsprozeB des Zellstoffwechsels. Spezifische Synthesewege ffir ein anaerobes Wachstum stehen diesen Stiimmen nieht zur Verffigung. Die vorliegende Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaf~ sowie dutch eine Beihilfe tier GSttinger Akademie der Wissenschaften gef6rdert; hierffir sei an dieser Ste]le bestens gedankt. Zu danken haben wir aueh Professor A. T~BST und Dr. W. WIESS~g fiir wertvolle Hinweise und Diskussionen.

Anaerobes Wachstum einzelliger Grfinalgen

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Prof. Dr. A. Pn~soN Pflanzenphysiolog. Inst. d. Univ. 34 GSttingen, Untere Karspiile 2