1978, Vol. 34, pp. 97-108, @ Hippokrates Verlag GmbH
Joumdat k ? t a Medicinal med~ca~ b nResearch t
Contribution to the Pharmacology and Toxicology of different Extracts as well as the Harpagosid from Harpagophytum procumbens DC A. Erdos, R. Fontaine, H. Friehe, R. Durand und Th. Poppinghaus Aus den Forschungslaboratorien der Firma A. Nattermann & Cie. GmbH, Koln.
Key Word Index: Harpagophytum procumbens; Harpagosid; Pharmacology; HPLC-Analysis; Isolation.
Abstract
Eight dry extracts of the roots of
Harpagophytum procumbens DC were prepared and tested for analgesic and antiphlogistic effects in five animal models after oral respectively oral and intravenous application in two dose groups. Some analgesic and antiphlogistic actions could be observed with the methanolic basic extract, the butanolic part of the methanolic extract and the fluid extract. The pharmacological tests of pure .Harpagosid3' showed no'better effects than the other extracts. Semichronic animal models showed better results than acute animal experiments when Harpagopytum extracts were tested for antiphlogistic activity.
With the exception of the high purified Harpagosid-glycoside, which acted slightly toxic after intravenous application all the other extracts tested could be classified as non toxic. Einleitung
Harpagophytum
procumbens
DC
(Teufelskralle) aus der Familie der Pedaliaceae wird in der Volksmedizin bei unterschiedlichsten Indikationen, z. B. Verdauungsstorungen verschiedener Art, rheumatischen Erkrankungen, Geburrshilfe, Wundheilung, Arterienverkalkung, allergischen Erkrankungen, Nikotinvergiftung etc. verwendet [I31Ober die Pflanze [2, 3, 4, 51, die Inhaltsstoffe und deren chemische Struktur [I, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 121 wurde aus-
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Beitrag zur Pharmakologie und Toxikologie verschiedener Extra kte, sowie des Harpagosids aus Harpagophytum procumbens DC.
Erdos et al.
akuten und chronischen Tierversuchen nachgewiesen werden konnen.
Material und Methoden Prufproben und Analytik
Gewinnung von Extraktfraktionen und Harpagosid Zur Extraktherstellung standen getrocknete Knollen der sekundaren Speicherwurzel von Harpagophytum procumbens DC zur Verfiigung, deren Identitat pharmakognostisch eindeutig ermittelt worden war. Fur erste pharmakologische Untersuchungen wurde die Droge einer wai3rigen Extraktion unterworfen. Das daraus resultierende Trockenkonzentrat ( H 25 B,) wies einen Herpagosidgehalt von 2,7O/o auf. Parallel dazu wurde ein methanolischer Grundextrakt (H 25 A,) gewonnen. Nach Trodtnung unter Vakuum wurde dieser Extrakt (3,7O/o Harpagosid) in Wasser aufgenommen und mit Butanol erschopfend ausgeschiittelt. Die nach Phasentrennung und Trocknung resultierende wai3rige Teilfraktion (H 25 A4) wies einen Harpagosidgehalt von 0,2 010 auf, wohingegen in der Butanolphase (H 25 A,) eine Anreicherung auf 19,5 010 erzielt werden konnte. Zur ~ e r e i n f a c h u ndes ~ oben beschriebenen Aufarbeitungsverfahrens und zur Gewinnung einer groseren Extraktmenge mit einem Harpagosidgehalt von ca. 20 ('10 wurde Tubera Harpagophyti (2,0°/o Harpagosid) unmittelbar einer Extraktion mit wassergesattigtem Butan01 unterworfen.
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fuhrlich berichtet, hingegen sind pharmakologisch-toxikologische Arbeiten iiber diese ,Wunderdrogeu nur sehr sparlich. Wahrend ZORN [13] eine Teeabkochung der Speicherwurzeln von Harpagophytum procumbens nach oraler und subkutaner Applikation bei der Ratte im Formaldehyd-Arthritis-Testmodell mit Erfolg priifte, verwendeten EICHLER und KOCH [14] einen Gesamtextrakt sowie das reine Glykosid ,,Harpagosid" bzw. mit Emulsin-behandeltes Harpagosid bei der Suche nach antiphlogistischer, analgetischer und spasmolytischer Wirksamkeit in verschiedenen pharmakologischen Tierversu&en. So konnten die beiden letztgenannten Autoren nach intravenoser und intraperitonealer Verabreichung an Maus und Ratte teils positive, teils negative Resultate erzielen. Orientierende Toxizitats-Werte liegen lediglich von Albus [15] fur einen Fluidextrakt vor; sie wurden an der Maus n a h oraler und parenteraler Verabreichung enielt. Die vorliegende Arbeit sol1 einen Beitrag zur toxikologischen Beurteilung und zum pharmakodynamischen Wirkungsprofil von Harpagophytum procumbens D C leisten. Insbesondere sollen die Eigenschaften von H a r p a g o p h y t ~ m procumbens in Modellversuchen zur Indikation ,Rheumatische Erkrankungen" (analgetische und . entziindungshemmende Wirkungen) naher untersucht werden. Hierbei stellt sich die Frage, ob der Wirkstoff durch verschiedene Extraktionsverfahren aus der Wurzeldroge so anzureichern ist, dai3 bei oraler bzw. intravenoser Verabreichung die pharmakodynamisch erwarteten Effekte bei
Aus 2,5 kg Droge resultierten 235 g Trockenextrakt mit einem Harpagosidgehalt von 17,7O/o. Zur weiteren Anreicherung wurde diese Extraktfraktion uber Kieselgel60 Merck (0,063-0,l mm) saulenchromatographisch gereinigt. Die Elution wurde mit einem Gemisch aus Toluol und Methanol vorgenommen, wobei die Anfangskonzentration an Methanol 10O/o und Endkonzentration 30°/o betrug. Das durch Vereinigung verschiedener Saulenablaufe gewonnene Harpagosid-Konzentrat wies einen Gehalt von 67O/o auf, die Ausbeute, bezogen auf die Droge, betrug 60 O/o. Nach Wiederholung der beschriebenen saulenchromatographischen Auftrennung wurde ein Produkt mit einem Gehalt von 85O/o ( H 25 C,) isoliert, das sich auch unter Hinzuziehung verschiedener Methoden nicht weiter anreichern liei3. Die Analytik des bei der Saulentrennung anfallenden Vorlaufes (H 25 C,) erbrachte einen Harpagosidgehalt von 0,10/0, der Nachlauf (H 25 C,) enthielt 1,5 "/o. Das Penta-O-Acetyl-Harpagosid ( H 25 C,) wurde entsprechend der von LICHTIund WARTBURG [9]beschriebenen Methode gewonnen. Weiterhin wurden drei Handelspraparate als Vergleich herangezogen: Handelspraparat I als Tonicum (mit 20°/oigem Harpagophytum-Extrakt); Handelspraparat I1 als Tonicum (mit 20°/oigem Harpogophytum-Extrakt); Handelspraparat I11 als Tinktur (mit 10°/oigem Harpagophytum-Extrakt). Analytik Etwa 1 g der gemahlenen Droge, genau gewogen, wird mit 100 ml wassergesattigtem Butanol [15] 1 Stunde ge-
99
schuttelt. Man saugt auf einer kleinen Nutsche scharf ab, wascht den Ruckstand mit 10 rnl wassergesattigtern Butan01 nach und extrahiert noch zweimal je 30 Minuten rnit je 30 ml wassergesattigtem Butanol auf der Schuttelmaschine. Die Extrakte werden in einem 200 ml-Meakolben vereinigt, den man rnit wassergesattigtem Butanol auffullt. Zur Analyse von Extrakten wird ein aliquoter Teil im Wasser gelost. HPLC-Bedingungen: Gerat: HP-1010 B Saule: Lange 2 m, Durchmesser 2 mm, Fiillung: Perisorb RP-2 (Merck)
o 4 3 ,EI~ I i 8 R+I~ Abb. 1 HPLC-Analyse von Harpagophytum
Trodtenextrakt A: Externer Standard, 1 pg/5 pl Harpagosid B: Trockenextrakt, 0,6 g1100 rnl(5,uleingespritzt)
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Harpagophytum procumbens. Pharmacology and Toxicology
Erdos et al.
100
Versuchsbedingungen
Versuchstiere - NMRI-Mause und - Wistar-Ratten (beides SPF-Zucht, Fa. HagernannlBiisingfeld) - Pirbright-white-Meerschweinchen (konventionelle Zucht, Fa. Baumlerl Wolfratshausen). Versuchstierhaltung Vor und wahrend der Versuche wurden die Tiere unter konstanten Bedingungen gehalten, d. h. Raumtemperatur 22 f l o C (Ratten und Mause) bzw. 20 1' C (Meerschweinchen), relative Luftfeuchtigkeit 55 rt 5010, Luftwechsel 15fach/Stunde, Hell-Dunkel-Rhythmus 12 Stunden. Pelletiertes Standardfutter der Fa. Eggersmann1Rinteln stand, ebenso wie Trinkwasser, ad libitum zur Verfugung.
*
Losungsmittel Die Extrakte wurden entweder in 1°/oiger Tylose (CMC) suspendiert oder in Aqua dest. gelost, wobei die Ansatze fur die Versuche stets frisch zubereitet wurden.
Applikationsvolumen Fiir die pharmakodynamischen Prufungen wurden, ebenso wie fur die toxikologischen Priifungen bei intravenijser Applikation, 10 mllkg KGW, dagegen fur die toxikologischen Prufungen bei peroraler Applikation 50 mllkg KGW als Applikationsvolumen verwendet. Dosierung und Applikation In den pharrnakologischen Studien wurden von den Extrakten oral die Dosen 20 und 200 mg/kg KGW, dagegen intravenijs.0,5 und 5 mglkg KGW eingesetzt. Die Handelspraparate wurden ausschliei3lich oral gepriift, und zwar I und I1 in den Dosierungen 1 und 10 ml/kg KGW - mit Ausnahme des - Pfotenodem-Tests, wo ausschliefllich 2ml/kg KGW verwendet wurden -, dagegen I11 mit 0,2 und 2 ml/kg KGW. Fur samtliche Versuche wurde den Tieren 16 Stunden vor Versuchsbeginn das Futter entzogen. Berechnung der Ergebnisse Die Angabe der Resultate erfolgte prozentual. Zwecks Prufung der Unterschiede zur unbehandelten Kontrollgruppe wurde der t-Test nach Student (p 0,05) herangezogen.
Versuchsmethoden
Brennstrahl-Test nach Gross Je Dosis kornmen 10 mannliche und 10 weibliche Mause im Gewicht von ca. 18 g in den Versuch. Mittels einer Halogenlampe wird auf die Schwanze der Tiere ein Warmereiz dergestalt gegeben, dafl die Schmerzreaktion deutlich beobachtet und registriert werden kann.
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Elutionsmittel: A: Wasser, B: 50°/oiges waflriges Acetonitril Ofentemperatur: 35' Detektor: Durchfluflphotometer, Wellenlange: 276 nm Integrator: System I (Spectraphysics) Gradient: 12,5 O/o Acetonitril 2 min isokratisch, in 5 min linear auf 17,5O/o Acetonitril.
Die Auswertung erfolgt durch Angabe der Zeitverlangerung in Prozent gegeniiber den anfangs an den unbehandelten Tieren erhaltenen Ausgangswerten. I
Writhing-Syndrom-Test nach Siegmund et al. [I71 Zur Feststellung der analgetischen Wirkung durch Antagonismus zu Phenyl-p-benzochinon kommen pro Dosis 10 Mause je Geschlecht im Gewicht von 18-25 g in den Versuch. Die Applikation von Phenyl-p-benzochinon, und zwar 2 mg/kg KGW, erfolgt intraperitoneal 30 Minuten nach Verabreichung der Testsubstanz. Die Auswertung erfolgt prozentual durch die Angabe der geschutzten Tiere, die innerhalb von 30 Minuten keine charakteristischen Symptome gezeigt haben. Rattenpfotenodem-Test nach Hillebrecht [I 81 In den Versuch kommen 6 WistarRatten pro Dosis und Geschlecht in einem Gewicht von 150-200 g. Bei je einer Hinterpfote wird durch sublantare Gabe von O,S0/oigem Carragenin in einem Volumen von 0,l ml/Pfote ein Udem erzeugt. Nach Verabreichung der Testsubstanz in einem Volumen von 2 mllkg KGW wird das Pfotenvolumen mit einem automatischen Volumenmefigerat (Fa. Bundschuh) ermittelt. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung des Udems gegenuber der Kontrollgruppe angegeben. UV-Erythem-Test ndch Schikorr [19] Es werden weifie Pirbright-Meerschweinchen im Gewicht von 250-350 g
101
verwendet. Je Dosis werden 3 mannliche und 3 weibliche Tiere eingesetzt. Am Vortage werden die Tiere an den Flanken enthaart, sorgfaltig abgewaschen und getrocknet. Die Testsubstanz wird 30 Minuten vor der UV-Bestrahlung appliziert. Die Bestrahlungsdauer betragt 120 Sekunden. Bei der semiquantitativen Auswertung, die 11/2 Stunden nach der UV-Bestrahlung erfolgt, wird die Veranderung der Kontroll- zur Substanzgruppe prozentual errechnet. Granuloma-Pouch-Test nach Selye [20] In den Versuch kommen pro Dosis 6 mannliche und 6 weibliche Wistar-Ratten im Gewicht von 150-250 g. Nachdem die Riickenhaare der Tiere entfernt worden sind, wird unter leichtem Atherrausch auf dem Riicken subcutan ein Luftbeutel von 25 ml gesetzt, in den anschliei3end 0,5 ml Crotonol injiziert wird. Die Testsubstanz wird an 11 Tagen verabreicht, zum ersten Ma1 112 Stunde vor Setzen des Luftbeutels. Am 11. Versuchstag werden die Tiere getotet und sowohl das Volumen des Exsudates als auch die -Feu&- bzw. Trockengewichte der Granulationsgewebe bestirnmt. Die Auswertung erfolgt durch prozentuale Angabe der Anderungen in Relation zu den Kontrollwerten. Akute Toxizitatspriifung Je Dosis und Geschlecht erhalten 5 Mause im Gewicht von 18-25 g die Testsubstanz oral bzw. intravenos. In Einzelkafigen untergebracht werden iiber 7 Tage Vergiftungssymptome und Letalitatsrate registriert.
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Harpagophytum procumbens, Pharmacology and Toxicology
Erdos et al.
102
Ergebnisse
Tabelle I
20 mglkg
Substanz
Applikationsart
Wirkung in O/o
+ 29,40 + 19,OO + 2,80 + 2,90 + 19,60 + 11,64 + 1,34
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o.
-
0,78
+
0,44
-
+
+
p zu Kontr. 0,Ol-0,001 0,02-0,Ol 0,5 0,5 0,02-0,Ol 0,05-0,02 0,5 0,5
> > > >
0,5 mglkg 0,5 1 mllkg 6,lO 0,5 1,30 0,5 0,2 mllkg 3,36 0,s
>
> >
>
200 mglkg
Wirkung in O/o
p zu Kontr.
+ 32,50 + 32,OO 1,70
< 0,001 < 0,001 > 0,s
2,80 18,28
0,02-0,Ol 0,001 0,05-0,02 0,5-0,4 0,02-0,Ol
4-
+ 12,lO + 32,60 + 11,97 + +
n
0,5 10 mllkg + 11,40 0,02-0,Ol f
+
4,00
0,4-0,3
2 mllkg 4,90
> 0,5
Tabelle I I Writhing-Syndrom-Test Alle gepriiften Testsubstanzen zeigen in diesem Versuch entweder keine oder nur eine unbcdeutend schwache analgetische Wirkung. H 25 A, allein gab 2/20 Tieren vor der typischen Benzochinon-Wirkung einen Schutz. Die analgetische Wirkung entspricht jedoch bei diesem Extrakt nicht derjenigen von Acctylsalicy~saure. Referenzsubstanzen Acetylsalicylsaure oral EDso = 116,90 mglkg KGW. oral ED,, = 100,30 mglkg KGW. Tilidin HCI Substanz
Applikationsarc
20 mglkg 200 mglkg Wirkung in 010 Wirkung in
O/o
n
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Brennstrahl-Test Die Extrakce H 25 A,, H 25 A, und H 25 C, zeigen in diesem Testmodell und in den gepriiften Dosen eine mittelstarke analgetische Wirkung. Dieser analgetische Effekt ist schwacher als derjenige von Acetylsalicjrlsaure. Alle anderen Testsubscanzen lassen keinen nennenswerten, analgetischen Effekt erkennen. Referenzsubstanzen Acetylsalicylsaure oral ED,, = 200,16 mglkg KGW. Tilidin H C I oral ED,, = 76,86 mglkg KGW.
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Harpagophyturn procurnbens, Pharmacology and Toxicology Applikationsart
20 rnglkg Wirkung in
010
0 0 0 0 0,5 rnglkg 0 1 mllkg 0 0 0,2 mllkg 0
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o. Handelsprap. I11 p. 0.
Wirkung in Ole 200 mglkg
n
0 0 0 0 5 mglkg 0 10 ml/kg 5 5 2 mllkg 0
Tabelle III Pfotenodem-Test Bei dem mit Carragenin induzierten Pfotenodem ist bei oraler Gabe der Extrakte kein signitikanter, odemhemmender Effekt feststellbar. Die hochste abschwellende Wirkung wird mit dem Extrakt H 25 C , nach intravenijser Applikation erreicht, jedoch auch hier nur rnit schwacher Signifikanz. Keiner der gepriiften Extrakte erreicht - nicht einmal annahernd - die Wirkung der Referenzsubstanzen. Referenzsubstanzen ED,, = 76,66 mglkg KGW. Pheny lbutazon oral Flufenarninsaure oral ED, = 70,54 rng/kgKGW.
Substanz
Applikationsart
Wirkung in Ola
+ + -
Handelsprap. I11 p. o.
> 0,s > 0,s > 0,5 > 055 > 0,5
0,3-0,2 0,s 0,s 0,5 rnglkg - 12,87 0,05-0,02 1 ml/kg 0,66 0,5 2,61 0,5 0,2 mllkg - 12,83 0,2-0,l
-
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o.
4,35 9,38 5,10 2,11 3970 7,68 9,74 2,11
20 mg/kg p zu Kontr.
+ +
> >
> >
Wirkung in Olo
200 rng/kg p zu Kontr.
n
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Substanz
Erdos et al.
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Tabelle ZV
Substanz
Applikationsart
20 mglkg Wirkung in
010
200 mglkg n Wirkung in 010
- 11,82 - 11,52 - 11,90
+
5,82 7,33 3,78 12,36 5,99 0,5 mglkg - 6,60 1 mllkg 7,85 - 6,OO 0,2 mllkg - 7,64
-
+ +
+
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o. Handelsprap. I11 p. o.
(Tabelle Va siehe Seite 105; Tabelle Vb siehe Seite 106).
Tabelle VI Akute Toxizitatsprufung
- 7-Tagewerte
in mglkg KGW -
Substanz
DLo Maus oral
DL0 Maus i. v.
DL50 Maus i. v.
Vergiftungssymptome
H H H H H
> 4640 > 4640 > 4640 > 4640 > 4640
> 1000 > 1000 > 1000 > 1000
-
keine keine keine keine Innerhalb der ersten Minuten p. a. Bauchbzw. Seitenlage sowie tonisch-klonische Krampfe, Passivitat, herabgesetzte Spontanaktivitat, verminderter Muskeltonus, abgeschwachte Reflexauslosbarkeit, verengte Lidspalten
25 25 25 25 25
A, A, A, Bl
C,
395
-
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UV-Erythem-Test Alle gepriiften Extrakte, mit Ausnahme von H 25 C3 und H 25 C,,weisen in der hohen Dosis nach oraler Gabe eine schwache Verringerung des Hauterythems auf. Die entziindungshemmende Wirkung liegt aber weit unter derjenigen der Referenzsubstanzen. H 25 C, nach intravenoser Verabreichung zeigt keinen Einflui3 auf die nach UV-Behandlung entstandene akute Entziindung. Die gepruften Handelspraparate erweisen sich in diesem Testmodell praktisch als unwirksam. Referenzsubstanzen Phenylbutazon oral ED,, = 15,OO mglkg KGW. Flufenaminsaure oral EDEo = 63,95 mglkg KGW.
Tabelle V a
Substanz
Applikationsart
Anderung d. Feuchtgew. in "10
- 14,89 keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung 3,07 - 5,74 keine Hemmung keine Hemmung
-
keine Hemmung Handelsprap. I p. o. Handelsprap. 11 p. o. Handelsprap. 111 p. o.
keine Hemmung
p zu Kontr.
-
20 mg1kgyKGW -
Anderung d. Trockengew. in "lo
keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hernmung - 24,50 keine Hernmung keine Hemmung 0,5 mglkg keine Hemmung 1 mllkg keine Hemmung - 9,89 0,2 mllkg 2,42
-
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Granuloma-Pouch-Test
p zu Kontr. Pinderung d. Exsudates in
p zu Kontr. n O/o
- 32,14 keine Hemmung - 1,43 - 14,29 keine Hemmung keine Hemmung keine Hernmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung ke.ine Hemmung keine Hemmung
Tabelle V b Substanz
Applikationsart
Anderung d. Feuchtgew. in O/o keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hernmung - 10,78 - 13,59 keine Hemmung keine Hemrnung
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o. Handelsprap. 111 p.
0.
p zu Kontr.
-
200 rng1kgyKGW-
Anderung d. Trodcengew. in O/o keine Hemmung keine Hemmung - 30,20 - 35,44 - 26,95 - 44,22 keine Hemmung keine Hemmung 5 mdkg keine Hemmung 10 mllkg keine Hemmung - 22.49 2 mllkg - 23,61
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Granuloma-Pouch-Test
p zu Kontr. Anderung d. Exsudates in ' l o
p zu Kontr.
n
- 73,81
keine Hernmung
- 14,29
- 69,05 keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung
keine Hemmung - 13,88 keine Hemmung
Eine Hemmung des GewiQtes der Granulationsgewebe zeigen nur in der hohen Dosis die Extrakte H 25 A, und H 25 B, nach oraler Verabreichung. sich in beiden gepriiften ~ o s e neine schwach signifikante, entziindungshemmende Wirkung nachweisen. Fiir H 25 C, Eine recfit starke Exsudathemmung wird bei den Extrakten H 25 A, und H 25 B, festgestellt. Die intravenose Gabe von H 25 CS erbringt nur in der hohen Dosis von 200 mg/kg Korpergewicht eine mictelstarke Wirkung in der exsudativen, nicht aber in der proliferativen Phase des Entziindungsprozesses. Mir den Handelspraparaten I1 und 111 kann im hohen Dosisbereich eine schwach signifikante Hernmung des Granulationsgewebes nachgewiesen werden. Das Handelspraparat I erweist sich in diesem Testmodell als unwirksam. Referenzsubstanzen Phenylbutazon oral ED,, = 74,OO mg/kg KGW (exsudative Hemrnung). Flufenaminsaure oral ED,, = 83,18 mglkg KGW (exsudarive Hemmung). Flufenarninsaure oral ED,, = 114,OO mglkg KGW (proliferative Hernrnung).
Harpagophytum procumbens, Pharmacolo!~yand Toxicology
107
Ein wesentlich gunstigeres Resultat brachten die semichronischen Prufungen Bei der Oberprufung der analgeti- am Granuloma-Pouch-Modell, wo soschen und antiphlogistischen Wirkung wohl die exsudative als auch die prolider Extrakte aus der Harpagophytum ferative Phase des Entzundungsprozesprocumbens DC Wurzeldroge.kann eine ses erfai3t werden konnte. Hierbei lief3 sich wiederum mit dern gewisse Wirkungsabhangigkeit vom niethanolischen Grundextrakt (H 25 Al) Tiermodell einerseits bzw. von den Extrakten andererseits beobachtet werden. und auch mit d m waflrigen GrundexWahrend der methanolische Grund- trakt ( H 25 B,) eine starke Exsudatextrakt ( H 25 A,) und der butanollos- hemmung feststellen. Die Wirkung ist liche Anteil des methanolischen Grund- mit derjenigen der Referenzsubstanzen extraktes (H 25 A,) bzw. das reine Har- vergleichbar. Eine schwach bis mittelstarke Hemmpagosid ( H 25 C,) nach oraler Gabe im wirkung der proliferativen Phase zeigBrennstrahl-Test eine mittelstarke signiH 25 A,, H 25 B,, H ten die Extrakte fikante analgetische Wirkung zeigte, erwiesen sich alle anderen gepruften Ex- 25 C, und H 25 C4 nach oraler Gabe, trakte in diesem Versuchsmodell als aber nur in der hohen Dosisgruppe. Die festgestellten Wirkungen liegen praktisch unwirksam. Der festgestellte analgetische Effekt war schwacher als aber weit unter denjenigen der herangezogenen Bezugssubstanzen (Phenylbytderjenige von AcetylsalicylsLure. Keine antagonistische Wirkung konn- azon bzw. Flufenaminsaure). Es kann festgestellt werden, daf3 die ten hingegen die Extrakte gegenuber dern Phenyl-p-benzochinon im Wri- Wirkung einzelner Extrakte sowohl von thing-Syndrom-Test aufweisen. Ledig- dern benutzten Tiermodell als auch von lich H 25 At gab bei zwei Tieren in der der Extraktionsart der Wurzeldroge Dosisgruppe 200 mglkg KGW eine abhangig ist. Das Glykosid ,HarpagoSchutzwirkung. sidu ist wahrscheinlich nicht allein fur Obwohl in dern Pfotenodem-Test die hier erreichte analgetische und antinach i.v.-Gabe von H 25 C, und in dern phlogistische Wirkung verantwortlich. UV-Erythem-Test bei der p.0.-Gabe Dies beweist die Wirkung von dern von 2 0 0 mglkg KGW fast alle Extrakte hochgereinigten Extrakt H 25 C,,der (mit Ausnahme von H 25 C3 und H 25 85010 Harpagosid enthalt, aber in keiC,) eine schwache antiphlogistische Wir- nem der Versuchsmodelle einen bedeukung andeuten, kann bei beiden Ver- tend besseren Effekt zeigt als die iibrisuchsmodellen keine mit den Referenz- gen Extrakte. Auch die intravenose Apsubstanzen (Phenylbutazon und Flufen- plikation bringt nicht die erhoffte besaminsaure) vergleichbare Hemmwir- sere Wirkung. Damit kann angenomkung registriert werden. men werden, dai3 die relativ gut wasserDie entzundungshemmende Wirkung loslichen Extrakte auch nach oraler Gader gepriiften Harpagophytum Extrak- be gut resorbiert werden. te in akuten Tiermodellen ist also sehr Akute Versuchsmodelle sind fur die schwach. Beurteilung der pharmak~d~namischen
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Diskussion
Erdos et al.
Danksagung Wir danken Herrn Prof. TUNMANN fur die Uberlassung von Harpagosid-Vergleichsbustanz fur analytische Zwecke. Unser spezieller Dank gilt Frau Dr. STAESCHE von der Hauptabteilung Phytoforschung unseres Hauses fur die pharmakognostische Identifizierung des Drogenrnaterials.
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theker-Zeitung 102, 1274 (1962). 2. Dittrich, C.:Usterreichische Apotheker-Zeitung 28, 53 (1974). 3. Kampf, R.: Schweiz. Apoth. Ztg. 114, 337 (1976). 4. Volk, 0. H.: Deutsche Apotheker-Zeitung 104, 573 (1964). 5. Becker, H, und Richter, S.: Pharm. Ztg. 120, 441 (1975). 6. Tunmann, P.und R. Lux: Pharrnazeutische Zeitung 106, 1357 (1961). 7. Tunmann, P. und N. Stierstorfer: Deutsche Apotheker-Zeitung 103, 395 (1963). 8. Tunmann, P. und N. Stierstorfer: Tetrahedron Letter 25, 1697 (1964). 9. Lichti, H.und A. von Wartburg: Helvetica chimica Acta 49, 1552 (1966). 10. Tunrnann, P. und H. E. Hammer: Liebigs Ann. Chem. 712,138 (1968). 11. Koch, J. H. H.: Dissertation, Wurzburg (1970). 12. Bauersfeld, H. J.: Dissertation, Wurzburg (1974). 13. Zorn, B.: Zeitschrift fiir Rheurnaforschung 17, 134 (1958). 14. Eihler, 0.und Ch. Koch: Arzneim.-Forsch. 20, 107 (1970). 15. Albus, G.:zitiert bei Tunmann und Lux [I]. 16. Gross, F.: Helv. Physiol. Acta 5, C, 31 (1947). 17. Siegmund, E. et al.: Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 95, 729 (1957). 18. Hillebrecht, J.: Arzneirn.-Forsch. 4, 607 (1954). 19. Schikorr, R.: Arch. exp. Path. 168, 190 (1929). 20. Selye, H.:Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 82, 328 (1953). Adresse: Dr. A. Erdos, A . Nattermann u. Cie, G m b H , Nattermann-Allee I 5000 Koln 30 (Bocklemiind)
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Wirkung von Harpagophytum-Extrakten weniger geeignet als semichronische Tiermodelle. und KOCH[14] fanden Auch EICHLER bei der Priifung von ,HarpagosidU im Rattenpfo-tenodem-Test keine, dagegen im semichronischen Crotonolgranulombeutel-Test bzw. chronischen Formaldehyd-Arthritis-Test interessante pharmakodynamische Wirkungen. Des letztgenannten Tiermodells bediente sich auch ZORN[I31 mit Erfolg. Die toxikologisch gepriiften Harpagophytum-Extrakte H 25 A,, H 25 A,, H 25 A4 und H 25 Bi konnen nach oraler und intravenoser Verabreichung an der Maus als praktisch untoxisch eingestuft werden. Hingegen ist das reine ,,Hargaposid" ( H 25 C,) - oral ebenfalls untoxisch nach intravenoser Verabreichung an der Maus als leicht toxisch zu bezeichnen. Die zur Kontrolle gepruften Handelspraparate haben fast ausnahmslos eine schwachere oder keine Wirkung im Vergleich zu den von uns untersuchten Extrakten gezeigt.
Joumdat k ? t a Medicinal med~ca~ b nResearch t
Contribution to the Pharmacology and Toxicology of different Extracts as well as the Harpagosid from Harpagophytum procumbens DC A. Erdos, R. Fontaine, H. Friehe, R. Durand und Th. Poppinghaus Aus den Forschungslaboratorien der Firma A. Nattermann & Cie. GmbH, Koln.
Key Word Index: Harpagophytum procumbens; Harpagosid; Pharmacology; HPLC-Analysis; Isolation.
Abstract
Eight dry extracts of the roots of
Harpagophytum procumbens DC were prepared and tested for analgesic and antiphlogistic effects in five animal models after oral respectively oral and intravenous application in two dose groups. Some analgesic and antiphlogistic actions could be observed with the methanolic basic extract, the butanolic part of the methanolic extract and the fluid extract. The pharmacological tests of pure .Harpagosid3' showed no'better effects than the other extracts. Semichronic animal models showed better results than acute animal experiments when Harpagopytum extracts were tested for antiphlogistic activity.
With the exception of the high purified Harpagosid-glycoside, which acted slightly toxic after intravenous application all the other extracts tested could be classified as non toxic. Einleitung
Harpagophytum
procumbens
DC
(Teufelskralle) aus der Familie der Pedaliaceae wird in der Volksmedizin bei unterschiedlichsten Indikationen, z. B. Verdauungsstorungen verschiedener Art, rheumatischen Erkrankungen, Geburrshilfe, Wundheilung, Arterienverkalkung, allergischen Erkrankungen, Nikotinvergiftung etc. verwendet [I31Ober die Pflanze [2, 3, 4, 51, die Inhaltsstoffe und deren chemische Struktur [I, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 121 wurde aus-
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Beitrag zur Pharmakologie und Toxikologie verschiedener Extra kte, sowie des Harpagosids aus Harpagophytum procumbens DC.
Erdos et al.
akuten und chronischen Tierversuchen nachgewiesen werden konnen.
Material und Methoden Prufproben und Analytik
Gewinnung von Extraktfraktionen und Harpagosid Zur Extraktherstellung standen getrocknete Knollen der sekundaren Speicherwurzel von Harpagophytum procumbens DC zur Verfiigung, deren Identitat pharmakognostisch eindeutig ermittelt worden war. Fur erste pharmakologische Untersuchungen wurde die Droge einer wai3rigen Extraktion unterworfen. Das daraus resultierende Trockenkonzentrat ( H 25 B,) wies einen Herpagosidgehalt von 2,7O/o auf. Parallel dazu wurde ein methanolischer Grundextrakt (H 25 A,) gewonnen. Nach Trodtnung unter Vakuum wurde dieser Extrakt (3,7O/o Harpagosid) in Wasser aufgenommen und mit Butanol erschopfend ausgeschiittelt. Die nach Phasentrennung und Trocknung resultierende wai3rige Teilfraktion (H 25 A4) wies einen Harpagosidgehalt von 0,2 010 auf, wohingegen in der Butanolphase (H 25 A,) eine Anreicherung auf 19,5 010 erzielt werden konnte. Zur ~ e r e i n f a c h u ndes ~ oben beschriebenen Aufarbeitungsverfahrens und zur Gewinnung einer groseren Extraktmenge mit einem Harpagosidgehalt von ca. 20 ('10 wurde Tubera Harpagophyti (2,0°/o Harpagosid) unmittelbar einer Extraktion mit wassergesattigtem Butan01 unterworfen.
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fuhrlich berichtet, hingegen sind pharmakologisch-toxikologische Arbeiten iiber diese ,Wunderdrogeu nur sehr sparlich. Wahrend ZORN [13] eine Teeabkochung der Speicherwurzeln von Harpagophytum procumbens nach oraler und subkutaner Applikation bei der Ratte im Formaldehyd-Arthritis-Testmodell mit Erfolg priifte, verwendeten EICHLER und KOCH [14] einen Gesamtextrakt sowie das reine Glykosid ,,Harpagosid" bzw. mit Emulsin-behandeltes Harpagosid bei der Suche nach antiphlogistischer, analgetischer und spasmolytischer Wirksamkeit in verschiedenen pharmakologischen Tierversu&en. So konnten die beiden letztgenannten Autoren nach intravenoser und intraperitonealer Verabreichung an Maus und Ratte teils positive, teils negative Resultate erzielen. Orientierende Toxizitats-Werte liegen lediglich von Albus [15] fur einen Fluidextrakt vor; sie wurden an der Maus n a h oraler und parenteraler Verabreichung enielt. Die vorliegende Arbeit sol1 einen Beitrag zur toxikologischen Beurteilung und zum pharmakodynamischen Wirkungsprofil von Harpagophytum procumbens D C leisten. Insbesondere sollen die Eigenschaften von H a r p a g o p h y t ~ m procumbens in Modellversuchen zur Indikation ,Rheumatische Erkrankungen" (analgetische und . entziindungshemmende Wirkungen) naher untersucht werden. Hierbei stellt sich die Frage, ob der Wirkstoff durch verschiedene Extraktionsverfahren aus der Wurzeldroge so anzureichern ist, dai3 bei oraler bzw. intravenoser Verabreichung die pharmakodynamisch erwarteten Effekte bei
Aus 2,5 kg Droge resultierten 235 g Trockenextrakt mit einem Harpagosidgehalt von 17,7O/o. Zur weiteren Anreicherung wurde diese Extraktfraktion uber Kieselgel60 Merck (0,063-0,l mm) saulenchromatographisch gereinigt. Die Elution wurde mit einem Gemisch aus Toluol und Methanol vorgenommen, wobei die Anfangskonzentration an Methanol 10O/o und Endkonzentration 30°/o betrug. Das durch Vereinigung verschiedener Saulenablaufe gewonnene Harpagosid-Konzentrat wies einen Gehalt von 67O/o auf, die Ausbeute, bezogen auf die Droge, betrug 60 O/o. Nach Wiederholung der beschriebenen saulenchromatographischen Auftrennung wurde ein Produkt mit einem Gehalt von 85O/o ( H 25 C,) isoliert, das sich auch unter Hinzuziehung verschiedener Methoden nicht weiter anreichern liei3. Die Analytik des bei der Saulentrennung anfallenden Vorlaufes (H 25 C,) erbrachte einen Harpagosidgehalt von 0,10/0, der Nachlauf (H 25 C,) enthielt 1,5 "/o. Das Penta-O-Acetyl-Harpagosid ( H 25 C,) wurde entsprechend der von LICHTIund WARTBURG [9]beschriebenen Methode gewonnen. Weiterhin wurden drei Handelspraparate als Vergleich herangezogen: Handelspraparat I als Tonicum (mit 20°/oigem Harpagophytum-Extrakt); Handelspraparat I1 als Tonicum (mit 20°/oigem Harpogophytum-Extrakt); Handelspraparat I11 als Tinktur (mit 10°/oigem Harpagophytum-Extrakt). Analytik Etwa 1 g der gemahlenen Droge, genau gewogen, wird mit 100 ml wassergesattigtem Butanol [15] 1 Stunde ge-
99
schuttelt. Man saugt auf einer kleinen Nutsche scharf ab, wascht den Ruckstand mit 10 rnl wassergesattigtern Butan01 nach und extrahiert noch zweimal je 30 Minuten rnit je 30 ml wassergesattigtem Butanol auf der Schuttelmaschine. Die Extrakte werden in einem 200 ml-Meakolben vereinigt, den man rnit wassergesattigtem Butanol auffullt. Zur Analyse von Extrakten wird ein aliquoter Teil im Wasser gelost. HPLC-Bedingungen: Gerat: HP-1010 B Saule: Lange 2 m, Durchmesser 2 mm, Fiillung: Perisorb RP-2 (Merck)
o 4 3 ,EI~ I i 8 R+I~ Abb. 1 HPLC-Analyse von Harpagophytum
Trodtenextrakt A: Externer Standard, 1 pg/5 pl Harpagosid B: Trockenextrakt, 0,6 g1100 rnl(5,uleingespritzt)
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Harpagophytum procumbens. Pharmacology and Toxicology
Erdos et al.
100
Versuchsbedingungen
Versuchstiere - NMRI-Mause und - Wistar-Ratten (beides SPF-Zucht, Fa. HagernannlBiisingfeld) - Pirbright-white-Meerschweinchen (konventionelle Zucht, Fa. Baumlerl Wolfratshausen). Versuchstierhaltung Vor und wahrend der Versuche wurden die Tiere unter konstanten Bedingungen gehalten, d. h. Raumtemperatur 22 f l o C (Ratten und Mause) bzw. 20 1' C (Meerschweinchen), relative Luftfeuchtigkeit 55 rt 5010, Luftwechsel 15fach/Stunde, Hell-Dunkel-Rhythmus 12 Stunden. Pelletiertes Standardfutter der Fa. Eggersmann1Rinteln stand, ebenso wie Trinkwasser, ad libitum zur Verfugung.
*
Losungsmittel Die Extrakte wurden entweder in 1°/oiger Tylose (CMC) suspendiert oder in Aqua dest. gelost, wobei die Ansatze fur die Versuche stets frisch zubereitet wurden.
Applikationsvolumen Fiir die pharmakodynamischen Prufungen wurden, ebenso wie fur die toxikologischen Priifungen bei intravenijser Applikation, 10 mllkg KGW, dagegen fur die toxikologischen Prufungen bei peroraler Applikation 50 mllkg KGW als Applikationsvolumen verwendet. Dosierung und Applikation In den pharrnakologischen Studien wurden von den Extrakten oral die Dosen 20 und 200 mg/kg KGW, dagegen intravenijs.0,5 und 5 mglkg KGW eingesetzt. Die Handelspraparate wurden ausschliei3lich oral gepriift, und zwar I und I1 in den Dosierungen 1 und 10 ml/kg KGW - mit Ausnahme des - Pfotenodem-Tests, wo ausschliefllich 2ml/kg KGW verwendet wurden -, dagegen I11 mit 0,2 und 2 ml/kg KGW. Fur samtliche Versuche wurde den Tieren 16 Stunden vor Versuchsbeginn das Futter entzogen. Berechnung der Ergebnisse Die Angabe der Resultate erfolgte prozentual. Zwecks Prufung der Unterschiede zur unbehandelten Kontrollgruppe wurde der t-Test nach Student (p 0,05) herangezogen.
Versuchsmethoden
Brennstrahl-Test nach Gross Je Dosis kornmen 10 mannliche und 10 weibliche Mause im Gewicht von ca. 18 g in den Versuch. Mittels einer Halogenlampe wird auf die Schwanze der Tiere ein Warmereiz dergestalt gegeben, dafl die Schmerzreaktion deutlich beobachtet und registriert werden kann.
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Elutionsmittel: A: Wasser, B: 50°/oiges waflriges Acetonitril Ofentemperatur: 35' Detektor: Durchfluflphotometer, Wellenlange: 276 nm Integrator: System I (Spectraphysics) Gradient: 12,5 O/o Acetonitril 2 min isokratisch, in 5 min linear auf 17,5O/o Acetonitril.
Die Auswertung erfolgt durch Angabe der Zeitverlangerung in Prozent gegeniiber den anfangs an den unbehandelten Tieren erhaltenen Ausgangswerten. I
Writhing-Syndrom-Test nach Siegmund et al. [I71 Zur Feststellung der analgetischen Wirkung durch Antagonismus zu Phenyl-p-benzochinon kommen pro Dosis 10 Mause je Geschlecht im Gewicht von 18-25 g in den Versuch. Die Applikation von Phenyl-p-benzochinon, und zwar 2 mg/kg KGW, erfolgt intraperitoneal 30 Minuten nach Verabreichung der Testsubstanz. Die Auswertung erfolgt prozentual durch die Angabe der geschutzten Tiere, die innerhalb von 30 Minuten keine charakteristischen Symptome gezeigt haben. Rattenpfotenodem-Test nach Hillebrecht [I 81 In den Versuch kommen 6 WistarRatten pro Dosis und Geschlecht in einem Gewicht von 150-200 g. Bei je einer Hinterpfote wird durch sublantare Gabe von O,S0/oigem Carragenin in einem Volumen von 0,l ml/Pfote ein Udem erzeugt. Nach Verabreichung der Testsubstanz in einem Volumen von 2 mllkg KGW wird das Pfotenvolumen mit einem automatischen Volumenmefigerat (Fa. Bundschuh) ermittelt. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung des Udems gegenuber der Kontrollgruppe angegeben. UV-Erythem-Test ndch Schikorr [19] Es werden weifie Pirbright-Meerschweinchen im Gewicht von 250-350 g
101
verwendet. Je Dosis werden 3 mannliche und 3 weibliche Tiere eingesetzt. Am Vortage werden die Tiere an den Flanken enthaart, sorgfaltig abgewaschen und getrocknet. Die Testsubstanz wird 30 Minuten vor der UV-Bestrahlung appliziert. Die Bestrahlungsdauer betragt 120 Sekunden. Bei der semiquantitativen Auswertung, die 11/2 Stunden nach der UV-Bestrahlung erfolgt, wird die Veranderung der Kontroll- zur Substanzgruppe prozentual errechnet. Granuloma-Pouch-Test nach Selye [20] In den Versuch kommen pro Dosis 6 mannliche und 6 weibliche Wistar-Ratten im Gewicht von 150-250 g. Nachdem die Riickenhaare der Tiere entfernt worden sind, wird unter leichtem Atherrausch auf dem Riicken subcutan ein Luftbeutel von 25 ml gesetzt, in den anschliei3end 0,5 ml Crotonol injiziert wird. Die Testsubstanz wird an 11 Tagen verabreicht, zum ersten Ma1 112 Stunde vor Setzen des Luftbeutels. Am 11. Versuchstag werden die Tiere getotet und sowohl das Volumen des Exsudates als auch die -Feu&- bzw. Trockengewichte der Granulationsgewebe bestirnmt. Die Auswertung erfolgt durch prozentuale Angabe der Anderungen in Relation zu den Kontrollwerten. Akute Toxizitatspriifung Je Dosis und Geschlecht erhalten 5 Mause im Gewicht von 18-25 g die Testsubstanz oral bzw. intravenos. In Einzelkafigen untergebracht werden iiber 7 Tage Vergiftungssymptome und Letalitatsrate registriert.
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Harpagophytum procumbens, Pharmacology and Toxicology
Erdos et al.
102
Ergebnisse
Tabelle I
20 mglkg
Substanz
Applikationsart
Wirkung in O/o
+ 29,40 + 19,OO + 2,80 + 2,90 + 19,60 + 11,64 + 1,34
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o.
-
0,78
+
0,44
-
+
+
p zu Kontr. 0,Ol-0,001 0,02-0,Ol 0,5 0,5 0,02-0,Ol 0,05-0,02 0,5 0,5
> > > >
0,5 mglkg 0,5 1 mllkg 6,lO 0,5 1,30 0,5 0,2 mllkg 3,36 0,s
>
> >
>
200 mglkg
Wirkung in O/o
p zu Kontr.
+ 32,50 + 32,OO 1,70
< 0,001 < 0,001 > 0,s
2,80 18,28
0,02-0,Ol 0,001 0,05-0,02 0,5-0,4 0,02-0,Ol
4-
+ 12,lO + 32,60 + 11,97 + +
n
0,5 10 mllkg + 11,40 0,02-0,Ol f
+
4,00
0,4-0,3
2 mllkg 4,90
> 0,5
Tabelle I I Writhing-Syndrom-Test Alle gepriiften Testsubstanzen zeigen in diesem Versuch entweder keine oder nur eine unbcdeutend schwache analgetische Wirkung. H 25 A, allein gab 2/20 Tieren vor der typischen Benzochinon-Wirkung einen Schutz. Die analgetische Wirkung entspricht jedoch bei diesem Extrakt nicht derjenigen von Acctylsalicy~saure. Referenzsubstanzen Acetylsalicylsaure oral EDso = 116,90 mglkg KGW. oral ED,, = 100,30 mglkg KGW. Tilidin HCI Substanz
Applikationsarc
20 mglkg 200 mglkg Wirkung in 010 Wirkung in
O/o
n
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Brennstrahl-Test Die Extrakce H 25 A,, H 25 A, und H 25 C, zeigen in diesem Testmodell und in den gepriiften Dosen eine mittelstarke analgetische Wirkung. Dieser analgetische Effekt ist schwacher als derjenige von Acetylsalicjrlsaure. Alle anderen Testsubscanzen lassen keinen nennenswerten, analgetischen Effekt erkennen. Referenzsubstanzen Acetylsalicylsaure oral ED,, = 200,16 mglkg KGW. Tilidin H C I oral ED,, = 76,86 mglkg KGW.
103
Harpagophyturn procurnbens, Pharmacology and Toxicology Applikationsart
20 rnglkg Wirkung in
010
0 0 0 0 0,5 rnglkg 0 1 mllkg 0 0 0,2 mllkg 0
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o. Handelsprap. I11 p. 0.
Wirkung in Ole 200 mglkg
n
0 0 0 0 5 mglkg 0 10 ml/kg 5 5 2 mllkg 0
Tabelle III Pfotenodem-Test Bei dem mit Carragenin induzierten Pfotenodem ist bei oraler Gabe der Extrakte kein signitikanter, odemhemmender Effekt feststellbar. Die hochste abschwellende Wirkung wird mit dem Extrakt H 25 C , nach intravenijser Applikation erreicht, jedoch auch hier nur rnit schwacher Signifikanz. Keiner der gepriiften Extrakte erreicht - nicht einmal annahernd - die Wirkung der Referenzsubstanzen. Referenzsubstanzen ED,, = 76,66 mglkg KGW. Pheny lbutazon oral Flufenarninsaure oral ED, = 70,54 rng/kgKGW.
Substanz
Applikationsart
Wirkung in Ola
+ + -
Handelsprap. I11 p. o.
> 0,s > 0,s > 0,5 > 055 > 0,5
0,3-0,2 0,s 0,s 0,5 rnglkg - 12,87 0,05-0,02 1 ml/kg 0,66 0,5 2,61 0,5 0,2 mllkg - 12,83 0,2-0,l
-
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o.
4,35 9,38 5,10 2,11 3970 7,68 9,74 2,11
20 mg/kg p zu Kontr.
+ +
> >
> >
Wirkung in Olo
200 rng/kg p zu Kontr.
n
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Substanz
Erdos et al.
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Tabelle ZV
Substanz
Applikationsart
20 mglkg Wirkung in
010
200 mglkg n Wirkung in 010
- 11,82 - 11,52 - 11,90
+
5,82 7,33 3,78 12,36 5,99 0,5 mglkg - 6,60 1 mllkg 7,85 - 6,OO 0,2 mllkg - 7,64
-
+ +
+
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o. Handelsprap. I11 p. o.
(Tabelle Va siehe Seite 105; Tabelle Vb siehe Seite 106).
Tabelle VI Akute Toxizitatsprufung
- 7-Tagewerte
in mglkg KGW -
Substanz
DLo Maus oral
DL0 Maus i. v.
DL50 Maus i. v.
Vergiftungssymptome
H H H H H
> 4640 > 4640 > 4640 > 4640 > 4640
> 1000 > 1000 > 1000 > 1000
-
keine keine keine keine Innerhalb der ersten Minuten p. a. Bauchbzw. Seitenlage sowie tonisch-klonische Krampfe, Passivitat, herabgesetzte Spontanaktivitat, verminderter Muskeltonus, abgeschwachte Reflexauslosbarkeit, verengte Lidspalten
25 25 25 25 25
A, A, A, Bl
C,
395
-
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UV-Erythem-Test Alle gepriiften Extrakte, mit Ausnahme von H 25 C3 und H 25 C,,weisen in der hohen Dosis nach oraler Gabe eine schwache Verringerung des Hauterythems auf. Die entziindungshemmende Wirkung liegt aber weit unter derjenigen der Referenzsubstanzen. H 25 C, nach intravenoser Verabreichung zeigt keinen Einflui3 auf die nach UV-Behandlung entstandene akute Entziindung. Die gepruften Handelspraparate erweisen sich in diesem Testmodell praktisch als unwirksam. Referenzsubstanzen Phenylbutazon oral ED,, = 15,OO mglkg KGW. Flufenaminsaure oral EDEo = 63,95 mglkg KGW.
Tabelle V a
Substanz
Applikationsart
Anderung d. Feuchtgew. in "10
- 14,89 keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung 3,07 - 5,74 keine Hemmung keine Hemmung
-
keine Hemmung Handelsprap. I p. o. Handelsprap. 11 p. o. Handelsprap. 111 p. o.
keine Hemmung
p zu Kontr.
-
20 mg1kgyKGW -
Anderung d. Trockengew. in "lo
keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hernmung - 24,50 keine Hernmung keine Hemmung 0,5 mglkg keine Hemmung 1 mllkg keine Hemmung - 9,89 0,2 mllkg 2,42
-
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Granuloma-Pouch-Test
p zu Kontr. Pinderung d. Exsudates in
p zu Kontr. n O/o
- 32,14 keine Hemmung - 1,43 - 14,29 keine Hemmung keine Hemmung keine Hernmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung ke.ine Hemmung keine Hemmung
Tabelle V b Substanz
Applikationsart
Anderung d. Feuchtgew. in O/o keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hernmung - 10,78 - 13,59 keine Hemmung keine Hemrnung
Handelsprap. I p. o. Handelsprap. I1 p. o. Handelsprap. 111 p.
0.
p zu Kontr.
-
200 rng1kgyKGW-
Anderung d. Trodcengew. in O/o keine Hemmung keine Hemmung - 30,20 - 35,44 - 26,95 - 44,22 keine Hemmung keine Hemmung 5 mdkg keine Hemmung 10 mllkg keine Hemmung - 22.49 2 mllkg - 23,61
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Granuloma-Pouch-Test
p zu Kontr. Anderung d. Exsudates in ' l o
p zu Kontr.
n
- 73,81
keine Hernmung
- 14,29
- 69,05 keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung keine Hemmung
keine Hemmung - 13,88 keine Hemmung
Eine Hemmung des GewiQtes der Granulationsgewebe zeigen nur in der hohen Dosis die Extrakte H 25 A, und H 25 B, nach oraler Verabreichung. sich in beiden gepriiften ~ o s e neine schwach signifikante, entziindungshemmende Wirkung nachweisen. Fiir H 25 C, Eine recfit starke Exsudathemmung wird bei den Extrakten H 25 A, und H 25 B, festgestellt. Die intravenose Gabe von H 25 CS erbringt nur in der hohen Dosis von 200 mg/kg Korpergewicht eine mictelstarke Wirkung in der exsudativen, nicht aber in der proliferativen Phase des Entziindungsprozesses. Mir den Handelspraparaten I1 und 111 kann im hohen Dosisbereich eine schwach signifikante Hernmung des Granulationsgewebes nachgewiesen werden. Das Handelspraparat I erweist sich in diesem Testmodell als unwirksam. Referenzsubstanzen Phenylbutazon oral ED,, = 74,OO mg/kg KGW (exsudative Hemrnung). Flufenaminsaure oral ED,, = 83,18 mglkg KGW (exsudarive Hemmung). Flufenarninsaure oral ED,, = 114,OO mglkg KGW (proliferative Hernrnung).
Harpagophytum procumbens, Pharmacolo!~yand Toxicology
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Ein wesentlich gunstigeres Resultat brachten die semichronischen Prufungen Bei der Oberprufung der analgeti- am Granuloma-Pouch-Modell, wo soschen und antiphlogistischen Wirkung wohl die exsudative als auch die prolider Extrakte aus der Harpagophytum ferative Phase des Entzundungsprozesprocumbens DC Wurzeldroge.kann eine ses erfai3t werden konnte. Hierbei lief3 sich wiederum mit dern gewisse Wirkungsabhangigkeit vom niethanolischen Grundextrakt (H 25 Al) Tiermodell einerseits bzw. von den Extrakten andererseits beobachtet werden. und auch mit d m waflrigen GrundexWahrend der methanolische Grund- trakt ( H 25 B,) eine starke Exsudatextrakt ( H 25 A,) und der butanollos- hemmung feststellen. Die Wirkung ist liche Anteil des methanolischen Grund- mit derjenigen der Referenzsubstanzen extraktes (H 25 A,) bzw. das reine Har- vergleichbar. Eine schwach bis mittelstarke Hemmpagosid ( H 25 C,) nach oraler Gabe im wirkung der proliferativen Phase zeigBrennstrahl-Test eine mittelstarke signiH 25 A,, H 25 B,, H ten die Extrakte fikante analgetische Wirkung zeigte, erwiesen sich alle anderen gepruften Ex- 25 C, und H 25 C4 nach oraler Gabe, trakte in diesem Versuchsmodell als aber nur in der hohen Dosisgruppe. Die festgestellten Wirkungen liegen praktisch unwirksam. Der festgestellte analgetische Effekt war schwacher als aber weit unter denjenigen der herangezogenen Bezugssubstanzen (Phenylbytderjenige von AcetylsalicylsLure. Keine antagonistische Wirkung konn- azon bzw. Flufenaminsaure). Es kann festgestellt werden, daf3 die ten hingegen die Extrakte gegenuber dern Phenyl-p-benzochinon im Wri- Wirkung einzelner Extrakte sowohl von thing-Syndrom-Test aufweisen. Ledig- dern benutzten Tiermodell als auch von lich H 25 At gab bei zwei Tieren in der der Extraktionsart der Wurzeldroge Dosisgruppe 200 mglkg KGW eine abhangig ist. Das Glykosid ,HarpagoSchutzwirkung. sidu ist wahrscheinlich nicht allein fur Obwohl in dern Pfotenodem-Test die hier erreichte analgetische und antinach i.v.-Gabe von H 25 C, und in dern phlogistische Wirkung verantwortlich. UV-Erythem-Test bei der p.0.-Gabe Dies beweist die Wirkung von dern von 2 0 0 mglkg KGW fast alle Extrakte hochgereinigten Extrakt H 25 C,,der (mit Ausnahme von H 25 C3 und H 25 85010 Harpagosid enthalt, aber in keiC,) eine schwache antiphlogistische Wir- nem der Versuchsmodelle einen bedeukung andeuten, kann bei beiden Ver- tend besseren Effekt zeigt als die iibrisuchsmodellen keine mit den Referenz- gen Extrakte. Auch die intravenose Apsubstanzen (Phenylbutazon und Flufen- plikation bringt nicht die erhoffte besaminsaure) vergleichbare Hemmwir- sere Wirkung. Damit kann angenomkung registriert werden. men werden, dai3 die relativ gut wasserDie entzundungshemmende Wirkung loslichen Extrakte auch nach oraler Gader gepriiften Harpagophytum Extrak- be gut resorbiert werden. te in akuten Tiermodellen ist also sehr Akute Versuchsmodelle sind fur die schwach. Beurteilung der pharmak~d~namischen
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Diskussion
Erdos et al.
Danksagung Wir danken Herrn Prof. TUNMANN fur die Uberlassung von Harpagosid-Vergleichsbustanz fur analytische Zwecke. Unser spezieller Dank gilt Frau Dr. STAESCHE von der Hauptabteilung Phytoforschung unseres Hauses fur die pharmakognostische Identifizierung des Drogenrnaterials.
Literatur 1. Tunmann, P. und R. Lux: Deutsche Apo-
theker-Zeitung 102, 1274 (1962). 2. Dittrich, C.:Usterreichische Apotheker-Zeitung 28, 53 (1974). 3. Kampf, R.: Schweiz. Apoth. Ztg. 114, 337 (1976). 4. Volk, 0. H.: Deutsche Apotheker-Zeitung 104, 573 (1964). 5. Becker, H, und Richter, S.: Pharm. Ztg. 120, 441 (1975). 6. Tunmann, P.und R. Lux: Pharrnazeutische Zeitung 106, 1357 (1961). 7. Tunmann, P. und N. Stierstorfer: Deutsche Apotheker-Zeitung 103, 395 (1963). 8. Tunmann, P. und N. Stierstorfer: Tetrahedron Letter 25, 1697 (1964). 9. Lichti, H.und A. von Wartburg: Helvetica chimica Acta 49, 1552 (1966). 10. Tunrnann, P. und H. E. Hammer: Liebigs Ann. Chem. 712,138 (1968). 11. Koch, J. H. H.: Dissertation, Wurzburg (1970). 12. Bauersfeld, H. J.: Dissertation, Wurzburg (1974). 13. Zorn, B.: Zeitschrift fiir Rheurnaforschung 17, 134 (1958). 14. Eihler, 0.und Ch. Koch: Arzneim.-Forsch. 20, 107 (1970). 15. Albus, G.:zitiert bei Tunmann und Lux [I]. 16. Gross, F.: Helv. Physiol. Acta 5, C, 31 (1947). 17. Siegmund, E. et al.: Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 95, 729 (1957). 18. Hillebrecht, J.: Arzneirn.-Forsch. 4, 607 (1954). 19. Schikorr, R.: Arch. exp. Path. 168, 190 (1929). 20. Selye, H.:Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 82, 328 (1953). Adresse: Dr. A. Erdos, A . Nattermann u. Cie, G m b H , Nattermann-Allee I 5000 Koln 30 (Bocklemiind)
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Wirkung von Harpagophytum-Extrakten weniger geeignet als semichronische Tiermodelle. und KOCH[14] fanden Auch EICHLER bei der Priifung von ,HarpagosidU im Rattenpfo-tenodem-Test keine, dagegen im semichronischen Crotonolgranulombeutel-Test bzw. chronischen Formaldehyd-Arthritis-Test interessante pharmakodynamische Wirkungen. Des letztgenannten Tiermodells bediente sich auch ZORN[I31 mit Erfolg. Die toxikologisch gepriiften Harpagophytum-Extrakte H 25 A,, H 25 A,, H 25 A4 und H 25 Bi konnen nach oraler und intravenoser Verabreichung an der Maus als praktisch untoxisch eingestuft werden. Hingegen ist das reine ,,Hargaposid" ( H 25 C,) - oral ebenfalls untoxisch nach intravenoser Verabreichung an der Maus als leicht toxisch zu bezeichnen. Die zur Kontrolle gepruften Handelspraparate haben fast ausnahmslos eine schwachere oder keine Wirkung im Vergleich zu den von uns untersuchten Extrakten gezeigt.
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