Korrektt chritte bei der Aktivienmg der Aminos/iuren zur Protein-Biosynthese F. yon der Haar Max-Planck-Institut fiir experimentelle Medizin, Abteilung Chemie, GSttingen

Activation of aminoacids for proteinbiosynthesis is not absolutely specific. With tRNA modified at the 3' end we were able to show, that valine misactivated by isoleucyl-tRNA synthetase is transferred to tRNA II~. Val-tRNA ne is then hydrolyzed by the enzyme prior to release of the wrong product. For this hydroIysis the nonaccepting 3' OH of the 3'-terminal ribose is essential. The role of the 3' OH is to activate a water molecule which, in the case of valine, is inserted into the place normally occupied by the methyl group of isoleucine. Hence hydrolysis is specific for misactivated valine while the correct substrate, isoleucine, is protected by its additional methyl group.

Genauigkeit erfolgen. Wiirde niimlich eine falsche Aminosfiure, z.B. Valin, an die tRNA ne gebunden und in das ribosomale System eingebracht, so wtirde jetzt anstelle des Isoleucins, der richtigen Aminosiiure, das Valin, die falsche Aminos~iure, in die wachsende Proteinkette eingebaut. Ein einziger solcher Fehleinbau in einer Kette yon mehreren hundert Aminosiiuren wiirde dazu ftihren, dab dieses Protein nur unvollkommen oder gar nicht mehr arbeitet. Ein solcher Fehleinbau bei vielen Proteinmolekiilen w~ire ftir die Zelle tSdlich.

Mangelnde Spezifitiit der Aminosiiureaktivierang Das Problem der spezifischen Verkniipfung einer Aminos/iure mit der dazugehSrigen tRNA 15st die Zelle auf folgende Weise: Sie besitzt ftir jede Aminosiiure ein spezifisches Enzym, eine sog. AminoacyltRNA-Synthetase. Wir wollen sie im folgenden als Exxx bezeichnen. Die hochgestellten Buchstaben geben dabei nach den 3-Buchstaben-Abktirzungen die Aminos/iure an, ftir die dieses Enzym spezifisch ist, also z.B. E ~e ftir die Isoleucyl-tRNA-Synthetase. Eine spezifische Aminoacyl-tRNA-Synthetase bindet eine ganz bestimmte Aminos/iure sowie ein ATP und bildet daraus unter Abspaltung von Pyrophosphat ein enzymgebundenes Aminoacyl-AMP (G1. (1)).

Aktivierung der Aminosiiuren zur Proteinbiosynthese Die genetische Information, der Bauplan far jede Zelle, ist in ihrer Desoxyribonukleins/iure gespeichert. Zur Entwicklung und ftir den Fortbestand einer Zelle mug dieser Bauplan in funktionelle Einheiten, die Proteine, iibersetzt werden. In den Proteinen sind Aminos~iuren zu Ketten verkniipft, die sich entsprechend den Eigenschaften der Kettenglieder falten: Die Verkniipfung der Aminos/iuren zu den Proteinen findet in der Zelle in einer molekularen Maschinerie den Ribosomen - statt [1]. Eine wichtige Vorstufe der ribosomalen Proteinbiosynthese ist die Aufbereitung der in der Zelle vorhandenen Aminos~iuren in eine Form, die die ribosomale Maschinerie benutzen kann. Dazu wird eine Aminos~iure an ein ~0bertr/igermolektil, eine Transfer-Ribonukleins/iure (tRNA), gebunden. Diese bringt dann die mit ihr verbundene Aminosiiure in das ribosomale System ein und iibertr/igt sie auf die wachsende Peptidkette [1]. Die Position ftir eine Aminos~iure in der Kette wird am Ribosom nicht mehr durch die Aminos~iure selbst, sondern nur noch durch das l~bertr~igermolektil tRNA bestimmt [2]. Daher existieren in jeder Zelle mindestens 20 tRNAs, die jeweils fiir eine und nur eine Aminos/iure als Obertr/igermolekiil dienen. Die Verbindung zwischen einer bestimmten Aminosiiure und ihrer zugehSrigen tRNA, z.B. Isoleucin und isoleucinspezifischer tRNA (tRNAn~), mug mit/iuBerster N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 63, 5 1 9 - 5 2 2

(1976)

9

AsXxx + ATP + EXxx

~

[EXXX'AsXXX-AMP] + PP

(I)

Die so aktivierte Aminos~iure wird in einem zweiten Teilschritt auf eine tRNA iibertragen. Spezifitiit wird auch hier dadurch erreicht, dab das Enzym ExXx nur mit der tRNA xxx reagiert (G1. (2)) [3]. [EXXX'AsXXX-AMP] -~ tRNAx x x ~

AsXXX-tRNAXxx + Exxx + AMP

(2)

Die in Gleichung (1) und (2) beschriebenen Vorg~inge lassen sich experimentell auf folgende Weise verfolgen: Gibt man zu dem durch Gleichung (1) beschriebenen Teil-System radioaktives Pyrophosphat, so erfolgt wegen der Reversibilit~it jeder enzymatischen Reaktion ein Einbau yon Pyrophosphat in ATP. Der Einbau yon markiertem PP in ATP ist dabei abh~ingig yon der Anwesenheit der Aminosiiure. Mit Hilfe dieser Reaktion stellte man nun tiberraschenderweise fest,

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dab die Spezifit~it fiir die Aminos~iure nicht absolut ist. Zum Beispiel ist die Isoleucyl-tRNA-Synthetase in der Lage, neben Isoleucin auch Valin entsprechend Gleichung (1) zu aktivieren. Die Valyl-tRNA-Synthetase kann neben Valin auch Threonin aktivieren. Die Fehlerrate bei diesen TeilReaktionen ist so hoch, dab eigentlich eine geordnete Proteinbiosynthese nicht zu erwarten sein sollte [4].

Korrekturmiiglichkeit bei der Aminoacylierung von tRNA Wegen der mangelnden Spezifit~it bei der AminoacylAMP-Bildung untersuchte man, was mit den nach Gleichung (1) fehlaktivierten Aminos~iuren im zweiten Teilschritt der Reaktion geschieht. Diesen Schritt kann man verfolgen, indem man in das System eine radioaktiv markierte Aminosiiure gibt. Um eine klarere Reaktion zu bekommen, stellte man zun~ichst folgende Komplexe her: E TM +

Ile

+

ATP

~

[EIle 9 Ile-AMP]

+

PP

(A)

E Ile +

Val +

ATP

~

[EIIe -VaI-AMP]

+

PP

(B)

Ist der Korrekturschritt kinetisch oder chemisch kontrolliert ?

Aus dem ffir die Proteinbiosynthese richtigen Komplex A wird Isoleucin korrekt an tRNA ne gebunden und kann fiir die Proteinbiosynthese verwandt werden (G1. (3)). Aus dem falschen Komplex B wird diese Aminos~iure nicht auf tRNA n~ iibertragen; es findet vielmehr nach Zugabe yon tRNA n~ eine Hydrolyse zu Valin, tRNA und AMP statt (G1. (4)) [5]. [E! le" Ile-AMP] + tRNATM ~ [EIIe.vaI-AMP] + tRNATM

Ile-tRNATM ~

+ E Ile + AMP

(3)

tRNAIle + Val + E IIe + AMP

(4)

Man kann sich nun gut vorstellen, dab die Valyl-tRNASynthetase eine Bindungsstelle fiir Valin besitzt, die an diese Aminos~iure ideal angepaBt ist. Aus iliumlichen Griinden kann in diese Bindungsstelle das gr6gere Isoleucin nicht eintreten. Die Isoleucyl-tRNASynthetase hat es dagegen schwerer. Valin besitzt alle Elemente des Isoleucins, mit Ausnahme einer Methylgruppe. Alle bei Valin und Isoleucin identischen Gruppen k6nnen daher bei der Bindung von Valin an die Isoleucyl-tRNA-Synthetase wirksam werden. Die einzige Chance ffir die Isoleucyl-tRNA-Synthetase, zwischen Valin und Isoleucin zu unterscheiden, besteht darin, bei der Bindung grogen Wert auf die zus~itzliche Methylgruppe zu legen. Und das ist in der Tat der Fall. Die Bindung zwischen Valin und der Isoleucyl-tRNA-Synthetase ist 10fach schw~icher als die Bindung zwischen Isoleucin und diesem Enzym. Dieser Faktor aber reicht fiir die Proteinbiosynthese nicht aus; er miigte etwa 10r betragen.

Die Bedeutung dieser Befunde ist offenbar: Wegen der grogen )~hnlichkeit beider Aminos~iuren k6nnen sie bei der Aktivierung durch E n~ nicht mehr eindeutig unterschieden werdeni Damit die Aminoacylierung der tRNA trotzdem spezifisch verliiuft, muB ein Korrekturschritt eingeschaltet werden. Dieser wird erst dann wirksam, wenn die tRNA ne mit dem Enzym in Wechselwirkung tritt. Die hier beschriebenen Befunde wurden im Wesentlichen yon Paul Berg u. Mitarb. [4, 5] erarbeitet. Es blieb jedoch die Frage, wie dieser Korrekturmechanismus auf der molekularen Ebene verl~iuft.

Kommen wir nun zu der Frage, wie die IsoleucyltRNA-Synthetase in der zweiten Reaktionsstufe (G1. (2)) den in der ersten Stufe gemachten Fehler, die Fehlaktivierung .yon Valin, korrigieren kann. J.J. Hopfield [6] hat in einer interessanten theoretischen Betrachtung dargelegt, wie Spezifit~it durch die Kinetik der Reaktion erreicht werden k6nnte. Seine These ist: Wenn in einer Reaktionsstufe keine Spezifit~it erreicht werden kann, mug man ein System fiber mehrere Reaktionsstufen laufen lassen. Die Gesamtfehlerrate ist dann das Produkt der Fehlerraten aus allen Einzelstufen. Nehmen wir an, wir haben 2200 Molekiile Isoleucyl-tRNA-Synthetase und bieten gleiche Mengen an Valin und Isoleucin an, so werden sich wegen der 10fach st/irkeren Bindung von Isoleucin 2000 [E he. Ile] und 200 [E ne" Val]-Komplexe bilden. Diese werden mit ATP in die jeweiligen Aminoacyl-AMP umgesetzt. Findet auf dieser Stufe wieder eine Diskriminierung um den Faktor 10 statt, so verbleiben 1800 Molekiile [E he- Ile-AMP] gegentiber 20 [E Ile. Val-AMP]. Der Fehler yon 0,1 auf der ersten Stufe reduziert sich nach der zweiten Stufe auf 0,01. 2200 E Ile 200 [EIle. Val] +

2200 Val

+

2200 Ile

Ursaehen fiir die mangelnde Spezififiit

/COOH

HC--CH / \ CHs NH2 Valin

520

no\

/COOH

tIC--CH / \ CHa NH2 Threonin

H~C--CH2 /COOH HC--CH / \ CH3 NH2 Isoleucin

)

20 [EIle. Val-AMP]

~

1800 [EIle 9 IIe-AMP]

ATP 2000 [EIle 9Ile]

Warum wird durch die Isoleucyl-tRNA-Synthetase gerade Valin und durch die Valyl-tRNA-Synthetase gerade Threonin fehlaktiviert und nicht umgekehrt? Isoleucin unterscheidet sich yon Valin nur durch eine zus~itzliche Methylgruppe. CH?

F

--~

Stellt man jetzt noch in Rechnung, dab die Obertragung des Valins um den Faktor 15 langsamer verl~iuft als die Ubertragung des Isoleucins auf die tRNA ne [7] (s. unten), so wiirde in diesem weiteren Schritt eine Reduzierung der Fehlerrate auf ~0,007 erfolgen, was in etwa den Erfordernissen der Proteinbiosynthese entspr~iche. Diese Hypothese hat jedoch Schw~ichen. Die Aminoacyl-AMP werden durch den Bindungsanteil des AMP

Naturwissenschaften

63, 5 1 9 - 5 2 2

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um etwa den Faktor 100 bis 1000 besser gebunden als die Aminos~iuren. Der Bindungsanteil des AMP aber ist fiir Ile-AMP und Val-AMP identisch und deshalb sollte man in dieser zweiten Reaktionsstufe keine groBe Diskriminierung fiir beide erwarten. Diese Ansicht wird dutch den Befund unterstiitzt, dab man den [E he. ValrAMP]-Komplex leicht isolieren kann und zur Spaltung dieses Komplexes die Anwesenheit der tRNA ne ben6tigt [5]. Dieser Befund legt den Gedanken nahe, dab es sich bei der Korrektur der Fehlaktivierung um eine chemische und nicht um eine kinetische Kontrolle handelt. Wir entschlossen uns daher, das Problem mit chemischen Methoden zu untersuchen.

Einige der so eingebauten Adenosinanalogen sind: NH2

HO

OH

HO

Adenosin

[EXxx 9AsXXX-AMP] + tRNA X X X ~ A d e .

HO

OH

tRNAXXX~o

Ade + EXXX + AMP

"V---( 0 NH2 I I II I xxx HO O - - C - - C - - R

H

Um n~iheren Einblick in den Chemismus dieser Reaktion zu bekommen, haben wir viele tRNA-Derivate mit modifiziertem 3'-Ende hergestellt. Dazu stehen im Wesentlichen zwei Wege zur Verfiigung: Chemisch kann man das besondere Verhalten der freien Ribose am Y-Ende ausnutzen [8]; tRNA~Ade

tRNA H ~ O ~ d e Oxydation mit NaJO4 >

H

OH

0

0

Dialdehyd tRNA~

O

Ade

Reduktion mit NaBH4 HO OH

tRNA-NukleotidyitRNAXXX-c--c + NTP - * tRNAXXX-c--C--N + PP transferase

(NTP=Analoges des Adenosintriphosphat; tRN&Xxx - C - - C - - A = t R N A TM mit Angabe der drei Y-endstiindigen Nukleotide) Naturwissenschaften 63, 5 1 9 - 5 2 2 (1976)

HO

3'-Desoxyadenosin (Cordycepin)

2'-Desoxyadenosin

Um zu erfahren, welche Gruppen am Y-terminalen Ende ffir die Aminoacylierung der tRNA von Bedeutung sind, untersuchten wir das Verhalten der so modifizierten tRNAs bei der Reaktion mit den Enzymen im Vergleich zum Ausgangsmaterial. Mit dieser Methodik konnten wir die seit 15 Jahren offene Detailfrage 16sen, an welches der beiden Hydroxyle der 3'-terminalen Ribose das Enzym die Aminos~iure iibertfiigt [12]. Wit konnten ferner zeigen, dab das Y-terminale Adenosin nicht nur ein passiver Akzeptor for die Aminosiiure ist, sondern dab diese reaktive Stelle Verlauf und Spezifit~it der Aminoacylierung entscheidend steuert [13]. Der molekulare Mechanismus des Korrekturschrittes

Mit den so modifizierten tRNAs kl~irten wir auch, wie die l~lbertragung des fehlaktivierten Valins auf die tRNA lie verhindert wird: Die tRNAne-C--C--A wird yon der Isoleucyl-tRNA-Synthetase an der 2'-Hydroxylgruppe des terminalen Adenosins mit Isoleucin verestert. Liil3t man tRNA~le-C--C--YdA, eine tRNA he, der das 3'-Hydroxyl am terminalen Adenosin fehlt, mit [g lie- Val-AMP] reagieren, so findet ganz glatt eine ~bertragung des fehlaktivierten Valins auf die tRNA n~ statt [14]. Es bildet sich also Val-tRNA n~C--C--3'dA. Val + ATP + ElIe + tRNAIle-c~--A~

ringoffenes Diol

enzymatisch kann man sich die Tatsache zunutze machen, dab sich mit dem Enzym tRNA-Nukleotidyltransferase Adenosinanaloge in das Y-Ende einbauen lassen, nachdem das 3'-terminale Adenosin entfernt worden ist [9 - 11].

OH

NH z

OH

Bei der Aminoacylierung der tRNA wird die Aminos~iure Ester-artig an ein Hydroxyl des Y-terminalen Endes der tRNA gebunden. Dieses 3'-Ende besteht bei allen tRNAs aus einem Adenosin.

NH2

Formycin NH2

Zur Methodik

HO

H

~

tRNA Ile-C---C - - A e - + VaI + AMP + E Ile

[Erle.Val-AMP] ~.x.~

+ PP + tRNAlle'c-~-C--YdA

Val-tRNA IIe- C - - - C 1 3 ' d A + AMP + E Ile

Dagegen nimmt die nattirliche tRNAn"-C--C--A, die die 3'-Hydroxylgruppe besitzt, niemals das fehlaktivierte Valin an. Da der einzige Unterschied zwischen diesen beiden tRNAne-Spezies die An- bzw. Abwesenheit der Hydroxylgruppe ist, miissen wir dieser eine ganz wesentliche Funktion bei der Korrektur der Fehlaktivierung zuschreiben. Es war schon friiher bekannt, dab die IsoleucyltRNA-Synthetase, wie auch viele andere Aminoacyl-

9 by Springer-Verlag 1976

521

tRNA-Synthetasen [15], eine hydrolytische Kapazit~it besitzt und Ile-tRNAn~ spalten kann. Um zu sehen, inwieweit diese hydrolytische Kapazitiit fiir die Korrektur des fehlaktivierten Valins benutzt wird, stellten wir Val-tRNAne-c--C--A, Val-tRNA ~j~C - - C - - F und Val-tRNAn~-C--C--YdA her, was im Reagenzglas unter ganz bestimmten Bedingungen m6glich ist [14, 15]. Ebenso priiparierten wir IletRNAn~-C--C--A, Ile-tRNAne-C--C--F und IletRNAne-c--c--3'dA und untersuchten, was das Isoleucyl-Enzym mit diesen tRNA-Spezies macht. Es zeigte sich, dab das Enzym die Esterbindung von Val-tRNAne-c--C--A, Val-tRNAne-c--C--F und Ite-tRNAn~-C--C--A spaltet, abet nicht die von IletRNAn~-C--C--F, Ile-tRNAU*-C--C--YdA und ValtRNAn~-C--C--3'dA. ETM + Val-tRNAIIe-c--C--A

Val + tRNAIIe-c--C--A

EIle + IIe-tRNAIle-c--C--A

Ile

ETM + Val-tRNAIIe-c--C--F

Val + tRNAIle-c--C--F

EIle + Ile-tRNAIIe-c--C--F

keine Reaktion

ETM + Val-tRNAIIe-c--c--3'dA EIle + Ile-tRNAIle-c--C--3'dA

9

§ tRNAIle-c--(2--A

tRNA~f

keine Reaktion keine Reaktion

Es wird also auch die falsch beladene Val-tRNA nr C - - C - - A gespalten, und zwar deutlich schneller als die Ile-tRNAne-c--C--A. Bei Ile-tRNAne-C--C~A, die die Aminos~iure auf dem 2'-Hydroxyl akzeptiert, kann Hydrolyse nur dann erfolgen, wenn das Isoteucin an das Y-Hydroxyl gebunden ist [7]. In der normalen Ile-tRNAn~-c--C--A wandert die. Aminos~iure nach der .Beladung sehr schnell zwischen den beiden Hydroxylen der Y-terminalen Ribose hin und her, und folglich unterliegt der Anteil der beladenen tRNA ll~, a n dem sich die Aminos~iure auf dem Y-Hydroxyl befindet, der Hydrolyse. Da sowohl ValtRNAIle-C--C--A wie auch Ile-tRNAne-c--C--A hydrolysiert werden, ergab sich die Frage: Wird Valin yon der tRNA ne dutch E n~ genau wie Isoleucin yore nicht-akzeptierenden Y-Hydroxyl oder, anders als Isoleucin, vom akzeptierenden 2'-Hydroxyl abgespalten? Dies lieB sich durch Vergleich der Hydrolyse von Ile-tRNAII~-C--C--F und Val-tRNAn~-C--C--F, die anstelle des Adenosin ein Formycin am 3'-Ende tragen, kl~iren. Die tRNAne-C--C--F unterscheidet sich v o n d e r tRNAIle-C--C--A dadurch, dab die Y-Hydroxylgruppe fiir die Hydrolyse yon Ile-tRNA n~C - - C - - F nicht zugiinglich ist [7]. Infolgedessen ist die Ile-tRNAne-c--C--F v/511igstabil. Demgegeniiber wird Val-tRNAne-c--C--F sehr leicht gespalten, daher mul3 die Korrektur der Fehlaktivierung des Vatins erfolgen, wenn das Valin an das akzeptierende T-Hydroxyl gebunden ist. Das bedeutet auch, dab sich das Valin am Enzym in der Isoleucin-Bindungsstelle befindet und vor der Korrektur auf tRNA n~ i.ibertragen wird. Ein Vorschlag fiir den chemischen Verlauf der Korrektur mul3 folgende experimentetlen Befunde beriicksichtigen: a) Das fehlaktivierte Valin wird auf die 522

tRNA Ile iibertragen, b) Die gebildete Val-tRNA n~ wird jedoch nicht aus ihrer Bindungsstelle am Enzym entlassen, sondern es findet Hydrolyse der Esterbindung statt, c) Zur Hydrolyse der Esterbindung wird das Y-terminale Hydroxyl der terminalen Ribose ben6tigt, d) Da Ile-tRNA ne nicht korrigiert wird, sondern nut die fehlbeladene Val-tRNA he, muB sich das Enzym den Unterschied zwischen Valin und Isoleucin - die Abwesenheit einer Methylgruppe - zunutze machen, nach unserer Meinung dadurch, dab sich in die entstehende Tasche ein Wassermolekiil schiebt. Isoleucin und (Valin+Wasser) bilden dann isostere Molekiilgruppen. Das so eingeschobene Wassermolekiil kann jetzt zur Hydrolyse der Esterbindung benutzt werden. Es ist aber offensichtlich allein nicht nukleophil genug, sondern mug mit Hilfe der benachbarten Y-Hydroxylgruppe negative Ladung vom Enzym iibernehmen. Die Elemente dieses Mechanismus sind wie folgt zusammengefal3t: A

~ _~ H--OIJ O, --C--OV .O C'~-~O H " / ]/H 2 H3C\- /C'--NH C /\ H CH3

tRNA~A

- - ~- - o~ -

HOJ OI

C=O H2C\ / Ic/H "~NH2 C /\ H CH~

Abschliegend k6nnen wir also feststellen: Zwei mit sehr hoher Spezififiit umzusetzende Molekiile sind so ~ihnlich, dab ein Enzym nicht genau genug zwischen ihnen unterscheiden kann. Anstatt nun seine eigentliche Funktion - die spezifische Erkennung der Aminos/iure - bis zur bentitigten Perfektion weiter zu entwickeln, ist es fiir das Enzym leichter, einen zusiitzlichen Korrekturschritt aufzubauen. Dieser Korrekturschritt ist chemisch gesehen eine Hydrolyse. Sein Mechanismus erinnert stark an den Mechanismus der Proteinspaltung durch die Serin-Proteasen [16]. 1. Matthaei, H., et al.: Naturwissenschaften 55, 281 (1968) 2. Chapeville, F., et al.: Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 48, 1086 (1962) 3. Loftfield, R.B., in: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol. 12, p. 87 (Eds. Davidson, J.P., Cohn, W.E.). New York-London: Academic Press 1972 4. Bergmann, F.H., Berg, P., Dieckmann, M.: J. Biol. Chem. 236, 1735 (1961) 5. Baldwin, A.N., Berg, P.: ibid. 241,839 (1966) 6. Hopfield, J.J.: Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 71, 4135 (1974) 7. yon der Haar, F., Cramer, F.: Biochemistry (in press) 8. Cramer, F., yon der Haar, F., Schlimme, E.: FEBS Letters 2, 136 (1968) 9. Schlimme, E., et al.: Enr. J. Biochem. 14, 351 (1970) 10. Sprinzl, M., et al.: Biochem. Biophys. Res. C o m m u n . 51, 881 (1973) 11. Maelicke, A., et al.: Eur. J. Biochem. 43, 617 (1974) 12. Cramer, F., et al.: FEBS Letters 56, 212 (1975) 13. yon der Haar, F., Gaertner, E.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 1378 (1975) 14. yon der Haar, F., Cramer, F.: FEBS Letters 56, 215 (1975) 15. Ebel, J. P., et al.: Biochimie 55, 547 (1973) 16. Dickerson, R., Geis, I.: Struktur und Funktion der Proteine, S. 82. Weinheim: Verlag Chemie 1971 Eingegangen am 28. Mai 1976

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