Exp. Anim. 41(4), 537-540,
1992
Note
Cryopreservation
of Spermatozoa
of a Transgenic
Mouse
Naomi NAKAGATA***, Kazuya MATSUMOTO*, Masayuki ANZAI*, Akio TAKAHASHI*, Yumi TAKAHASHI *, Yuichi MATSUZAKI*, and Kenji MIYATA* *NT Science Co., Ltd., 2221-1Shinmachi, Ome-shi, Tokyo 198 and **Nippon Institute for Biological Science, 2221-1Shinmachi, Ome-shi, Tokyo 198, Japan (Received 5 February
Spermatozoa gene One
was
of
fourth
of
Thirty-six were
lucif
the
of 65 transferred
23/36)
were erase
transgenic
a homozygous
expressed
under frozen
to born. gene
tranasgenic the
control
sperm
oocytes
was
(55.4%) the All
of
young
expression.-KEY
later
4 June 1992)
mouse,
of ƒÀ-actin
to
in
and the
WORDS:
the were
used
2-cell
pseudopregnant analyzed
which
promoter,
thawed
developed
oviducts of
1992/Accepted
for
stage.
in All
recipients carried
the
and
firefly
vitro the
fertilization. embryos
young and
of
at-196•Ž.
2-cell
23
transgene
cryopreservation
luciferase
frozen
(63.9%, showed
mouse
the sperm,
mouse
中 潟 直 己*,**・
松 本 和 也*・ 安 斉 政 幸*・ 高 橋 明 男*
高 橋 由 美*・ 松 崎 雄 一*・ 宮 田 堅 司* *株 式 会 社 エ ヌテ ィ ーサ イ エ ンス **財 団 法 人 日本生 物 科 学 研 究所
近 年,マ
ウ ス精 子 の凍 結 保 存 が 可 能 とな り,人 工 授精
モ個 体 一匹(15週
齢)を 用 いた 。 即 ち,C57B:L/6N雌
と
あ る いは 体 外 受 精 ・胚 移 植 に よ り,そ れ ら 凍 結 精 子 を
Jcl:ICR系
用 い て の産 児 の作 出 が 相 次 い で 報 告 され て い る[2,5,7,
受 精 卵 に遺 伝 子 を注 入 した後,偽 妊 娠 第1日
10]。 私 た ち も精 子 の 融 解 後 の 処 理 法 な どの 改 良 に よ り,
に移 植 す る こ とに よ り,雄 の ヘ テ ロ トラ ンス ジ ェニ ック
実 用 性 の高 い マ ウ ス精 子 の凍 結 保 存 法 を 確 立 しつ つ あ り
マ ウス を作 製 した。 続 い て,こ の ヘ テ ロマ ウ ス と正 常 な
[4,8,11],当
C57BL/6N雌
研 究 室 で 作 成 して い る トラ ン ス ジ ェ ニ ック
雄 を交 配 し,得 られ た 体 内受 精 由来 前 核 期 目の 受 容 雌
マ ウス を交 配 して得 られ た 雌 雄 の ヘ テ ロ
マ ウス につ い て も既 に,精 子 の 凍 結 保 存 を 開 始 して い
マ ウス 同士 を さ ら に 兄妹 交 配 し,ホ
る。 そ こで,本 実 験 で は,一 例 で は あ るが,凍 結 した ト
[3]。 な お,導 入 した遺 伝 子 は,プ
ラ ンス ジ ェニ ック マ ウ ス精 子 の 一 部 を 融 解 し,そ の 生存
ワ トリの β-ア クチ ン遺 伝 子 の5’上 流 領 域 約1.5kbを
性 につ い て検 討 した 結 果,若 干 の 知 見 を 得 た の で報 告 す
い,そ の 下流 にホ タル ・ル シ フェ ラーゼ[1,6]のcDNA
る。
お よびSV40の
供 試 動 物:凍 結 実 験 に は,β-ア
クチ ン/ル シ フ ェ ラ ー
ゼ融 合 遺 伝 子 を 導 入 した トラ ン ス ジ ェ ニ ックマ ウ ス雄 ホ
モ雄 マ ウスを得 た ロモ ー タ ー と し て ニ 用
ス プ ライ シ ング領 域 と ポ リAシ グ ナ ルを
付 け た全 長 約4.3Kbの
断 片 で あ る(Fig.1)。
凍 結 融 解 操 作:凍 結 融 解操 作 は,ほ ぼ前 法に従 った[4,
中 潟 直 己 ・松 本 和 也 ・安 斉政 幸
538 8,11]。
即 ち,organ
3037)内
の0.4mlの
tissue
ム ミル ク を そ れ ぞ れ18%お に 加 え,60℃
culture
保 存 液(ラ
dish(FALCON,
フィノー スお よび スキ
よ び3%と
な る よ うに蒸 留 水
の 温 水 中 で 溶 解 後,10,000gの
ゼ イ ン ミセ ル を 除 去 し た 上 清)に の 精 巣 上 体 尾 部2個
を 入 れ,保
一 に 懸 濁 後 ,約0.1m1ず
存 液 中 で 細 切,精
つ0.25mlの
解 は,凍
ス 中 に 約10分
っ た(融
静 置
に 浸漬 した。 ま
結 し た サ ン プ ル の うち,一 体
り取 り出 し,3∼5分,室
子を均
牛精子凍結保存用
却 速 度:30∼40℃/min),LN2中
た,融
遠心 にて カ
上 述 した ホ モ雄 マ ウ ス
プ ラ ス チ ッ ク ス ト ロ ー に 詰 め,LN2ガ 後(冷
他
をLN2よ
温 に 放 置 す る こ と に よ り行 な
解 速 度:50∼80℃/min)。
融 解 後 の精 子 浮 遊 液 の希 釈 ・洗 浄:融 解 した 精 子 浮 遊 液 をorgantissueculturedish内
の0.4m1の
Fig. 1. Structure of transgene used for microinjection. Fusion genes contain 1.5 kbp of the chicken 9-actin 5' franking region fused to 1.8 kbp of the firefly luciferase c DNA 0.8 kbp of SV 40 splicing region and SV 40 polyadenylationsite.
培 養液 下
部 に静 か に 挿 入 し,培 養 器 内で30分 静 置 す る こ とに よ り 緩 徐 に精 子 浮 遊 液 の希 釈 を 行 な った 後,0.45uの フ ィル タ ー(ミ リポ アSLHAO250S)を 用 い て 精子 浮 遊液 を 濾 過 し,完 全 に 保 存 液 を 除 去 した 。 体 外 受 精:体 外 受 精 は 豊 田 らの 方 法 に 従 った[9]。 なわち,5iu
PMsGと5iuHcGを48時
間 間 隔 で腹腔
内投 与 し,過 排 卵 処 理 を施 したICR系 齢)の 卵 管 膨 大 部 よ りHCG注
す
雌 マ ウ ス(10週
射 後16∼17時 間 に採 取 し
た卵 子 を1.5時 間 前 培 養 した 凍 結精 子 懸濁 液 内 に 導 入 す るこ とに より授 精 を行 な った(精 子 濃 度:2000精
子/μl)。
卵 子 は 授 精後6時
体 の放 出
間 に 倒 立顕 微鏡 下 で,第2極
と雌 雄 前 核形 成 を 指 標 と して受 精 の 有無 を 検査 し,そ の 後,更 に18時 間 培 養 し,2細
胞期 へ の発 生 につ い て観 察
した 。 胚 の 移 植:2細
胞期 へ 発生 した胚 は偽 妊 娠 第 一 日 目の
受 容雌(Jcl:MCH)の
卵 管 へ移 植 し,新 生 児 へ の 発 生
に つ い て 検討 した。 導 入 遺 伝 子 の 検 定 お よび 発 現 の 解 析:得
られ た産 児 に
つ い て は 尾 部 の 細 胞 よ り抽 出 ・精 製 し た 高 分 子DNA を 試 料 と し,以
下 に示 す サ ザ ン プ ロ ッテ ィン グお よび フ
ィ ル タ ー ハ イ ブ リダ イ ゼ イ シ ョ ン法 に よ っ て,導
入 した
遺 伝子 断 片 の マ ウス の染 色 体 上 へ の 組 込 み を 検 索 した 。 す な わ ち,制
限 酵 素BamHIで
の 高 分 子DNAを1%ア
完 全 に 消 化 させ た10μg
ガ ロ ー ス 中 で 電 気 泳 動 し た 後,
ナ イ ロ ン フ ィ ル タ ー にDNAを プ ロ ー ブ を 用 い,ECL (RPN2101,ア
固 定 さ せ,Fig.1に
GENE
マ シ ャ ム)に
DETECTION
よ って フ ィル タ ーハ イ ブ リ
ダ イ ゼ イ シ ョ ン を 行 な っ た 。 ま た,ル に つ い て は,尾 KH2PO4,1mM
示す
SYSTEM
シ フ ェ ラ ーゼ活 性
部 組 織 よ り抽 出 用 バ ッ フ ァ ー(100mM DDT,pH7.5)で
ホ モ ジナ イ ズ して
Fig.
2.
試 験 管 内 の350μ1の
反応 液
blot
mouse.
Tail and
ed
analysis
cryopreserved
BamHI, with
that kbp)
bands
integration
of are
(10ƒÊg)
15 young
above
of was
fragments
probe
hybridizing
numbers
DNA
(1.9
of
sperm
the
a
fragment
the
得 ら れ た 細 胞 抽 出 液20μ1を
Southern
from
were was
from (1.9
kbp
injected the
a the
a
digested blot
with
hybridiz-
BamHI-BamHI transgene.
; arrow) fragments.
line.
derived transgenic
The indicate Mouse
トラ ン ス ジ ェ ニ ックマ ウス精 子 の 凍結 保 存
Table
Table
(25mM
TD4000)に 100μ1を
1. Fertility of the cryopreserved luciferase transgenic mouse sperm assessed by in vitro fertilization
2. Development to live young of 2-cell embryos produced by in vitro fertilization with the cryopreserved lucif erase transgenic mouse sperm
glycylglycine,5mM
に 加 え て 混 和 し,ル
ATP,15mMMgSO4)
ミ ノ メ ー タ ー(ラ
セ ッ ト し た 後,1mMル
約
シ フ ェ リ ン溶 液
注 入 す る こ と に よ り反 応 さ せ,そ
よびTable2に
要
ボ サ イ エ ン ス,
の 発光 量 を 測
β-ア クチ ン/ホ タ ル ・ル シ フ ェラーゼ融 合遺伝 子を導 入 した トラ ンス ジ ェニ ッ ク雄 マ ウ ス(1匹)の
定 し て ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 を 検 出 し た[1]。
Table1:お
539
遺 伝 子 導 入 凍 結 マ ウ ス精
精 巣 上 体尾
部 か ら得 られ た精 子 を凍 結 保 存 後,そ の1/4を
融 解 し,
子 の 体 外 受 精 お よび 得 られ た 胚 の 移 植 成 績 を 示 す 。 供
そ の生 存 性 につ い て検 討 した 。 凍 結 融 解 した精 子 を 用 い
試 卵65個 中,そ の55.4%に
て体 外 受 精 を行 な っ た結 果,検 査 卵65個 中36個 が 受 精
当 た る36個 が 受精 し,培 養
に よ りす べ ての 受 精 卵 が2細
胞 期 へ 発 生 した(Table
(55.4%)し,2細
胞 期 へ 発 生 した 。 さ ら に こ れ ら胚 を
1)。 さ らに,こ れ らす べ て の 胚 を2匹 の 受 容 雌 に 移 植
偽 妊 娠 第 一 日の 受 容 雌 の卵 管 に移 植 した とこ ろ,23匹
した とこ ろ,23匹(63.9%,23/36)の
(63.9%,23/36)の
た(Table2)。
また,得
新生児が得 られ
られ た 新 生 児 の内,無
作為に
新 生 児 が 得 られ た 。 また,得
新 生 児 の 一 部(15匹)に
られ た
つ い て,サ ザ ンプ ロ ッ ト法 にて
選 ん だ15匹 を サザ ン プ ロ ッ トに よ り解 析 した 結 果,全 例
DNAの
に導 入 遺 伝 子 の伝 達 が 確 認 され た(Fig2)。
伝 子 が 伝達 され て い る こ とが確 認 され た。 また,得
得 られ た新 生 児 す べ て にお いて,そ
さ らに,
の細 胞 抽 出 液 に ル シ
フ ェ ラー ゼ の活 性 が 認 め られ た 。 以上,本 実 験 結 果 か ら,ト
られ
た新 生 児 す べ て に お い て ル シ フ ェ ラー ゼ遺 伝 子 の発 現 が 確 認 され た 。
ラ ンス ジ ェニ ック マ ウ ス精
子 の凍 結 保 存 は可 能 で あ り,融 解 後,そ 体外 受 精 を行 な い,得
解析 を行 な った結 果,す べ て の新 生 児 に 導 入 遺
文
の精 子 を 用 い て
られ た胚 を 受 容 雌 へ 移 植 す る こ と
[1]
に よ り,導 入 遺 伝 子 が伝 達 され た新 生 児 へ 発 生 す る こ と が 知 られ た。
[2]
現 在,い ろ い ろ な 目的 で,種 々 の外 来 遺 伝 子 を導 入 し た トラ ン ス ジ ェ ニ ッ クマ ウス が次 々 と作 出 され てお り, 今後 そ の 数 は急 速 に増 加 し,膨 大 な数 に な る もの と思 わ
[3]
れ る。 した が って,精 子 の凍 結 保 存 は,胚 の凍 結 保 存 と と もに,こ れ らマ ウス の系 統維 持 ・保 存 に きわ め て有 効
[4]
な 手 段 に な り得 る もの と考 え られ る。
[5]
献
DeWet, J.R., Wood, K.V., DeLuca, M.D., Herinski, D.R., and Subramani, S. (1987). Mol Cell Biol, 7, 725-737. Graham, E.F., Schmehl, M.L.K., Evensen, B.K., and Nelson, D.S. (1978). Semen preservation in non-domestic mammals. Symp zool Soc. Lond, 43, 153-173. Matsumoto, N., Takahashi, A., Nakagata, N., Takahashi, Y., Matsuzaki, U., and Miyata, K. (1991). Cell structure and f unction, 16, 608. Nakagata, N. and Takeshima, T. (1992). Theriogenology. 37, 1283-1291. 奥 山 学 ・磯 貝 滋 樹 ・佐 賀 正 彦 ・浜 田 宏 ・尾 川 昭 三 (1990).日 本 受 精 着 床 学 会 雑誌,7,116-119.
540
[6]
[7] [8]
中 潟 直 己 ・松 本 和 也 ・安 斉 政幸
Ow, D.W., Wood, K.V., DeLuca, M.D., DeWet, J. R., Herinski, D.R., and Howell, S.H. (1986). Science, 234, 856-859. Tada, N., Sato, N., Yamanoi, Y., Mizorogi, T., Kasai, K., and Ogawa, S. (1990). J Reprod Fert., 89, 511516. 竹島
勉 ・中潟 直 己 ・尾 川 昭 三(1991).実
験 動 物,40,
他
493-497. [9] [10] [11]
豊 田 裕 ・横 山 峯 介 ・星 冬 四 郎(1972).家 畜 繁 殖 誌, 16,147-151. 横 山 峯 介 ・秋 葉 久 弥 ・勝 木 元 也 ・野 村 達 次(1990).実 験 動 物,39,125-128. 横 山 峯 介 ・中 潟 直 己(1991).臨 床 科 学,27,359-366.
1992
Note
Cryopreservation
of Spermatozoa
of a Transgenic
Mouse
Naomi NAKAGATA***, Kazuya MATSUMOTO*, Masayuki ANZAI*, Akio TAKAHASHI*, Yumi TAKAHASHI *, Yuichi MATSUZAKI*, and Kenji MIYATA* *NT Science Co., Ltd., 2221-1Shinmachi, Ome-shi, Tokyo 198 and **Nippon Institute for Biological Science, 2221-1Shinmachi, Ome-shi, Tokyo 198, Japan (Received 5 February
Spermatozoa gene One
was
of
fourth
of
Thirty-six were
lucif
the
of 65 transferred
23/36)
were erase
transgenic
a homozygous
expressed
under frozen
to born. gene
tranasgenic the
control
sperm
oocytes
was
(55.4%) the All
of
young
expression.-KEY
later
4 June 1992)
mouse,
of ƒÀ-actin
to
in
and the
WORDS:
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used
2-cell
pseudopregnant analyzed
which
promoter,
thawed
developed
oviducts of
1992/Accepted
for
stage.
in All
recipients carried
the
and
firefly
vitro the
fertilization. embryos
young and
of
at-196•Ž.
2-cell
23
transgene
cryopreservation
luciferase
frozen
(63.9%, showed
mouse
the sperm,
mouse
中 潟 直 己*,**・
松 本 和 也*・ 安 斉 政 幸*・ 高 橋 明 男*
高 橋 由 美*・ 松 崎 雄 一*・ 宮 田 堅 司* *株 式 会 社 エ ヌテ ィ ーサ イ エ ンス **財 団 法 人 日本生 物 科 学 研 究所
近 年,マ
ウ ス精 子 の凍 結 保 存 が 可 能 とな り,人 工 授精
モ個 体 一匹(15週
齢)を 用 いた 。 即 ち,C57B:L/6N雌
と
あ る いは 体 外 受 精 ・胚 移 植 に よ り,そ れ ら 凍 結 精 子 を
Jcl:ICR系
用 い て の産 児 の作 出 が 相 次 い で 報 告 され て い る[2,5,7,
受 精 卵 に遺 伝 子 を注 入 した後,偽 妊 娠 第1日
10]。 私 た ち も精 子 の 融 解 後 の 処 理 法 な どの 改 良 に よ り,
に移 植 す る こ とに よ り,雄 の ヘ テ ロ トラ ンス ジ ェニ ック
実 用 性 の高 い マ ウ ス精 子 の凍 結 保 存 法 を 確 立 しつ つ あ り
マ ウス を作 製 した。 続 い て,こ の ヘ テ ロマ ウ ス と正 常 な
[4,8,11],当
C57BL/6N雌
研 究 室 で 作 成 して い る トラ ン ス ジ ェ ニ ック
雄 を交 配 し,得 られ た 体 内受 精 由来 前 核 期 目の 受 容 雌
マ ウス を交 配 して得 られ た 雌 雄 の ヘ テ ロ
マ ウス につ い て も既 に,精 子 の 凍 結 保 存 を 開 始 して い
マ ウス 同士 を さ ら に 兄妹 交 配 し,ホ
る。 そ こで,本 実 験 で は,一 例 で は あ るが,凍 結 した ト
[3]。 な お,導 入 した遺 伝 子 は,プ
ラ ンス ジ ェニ ック マ ウ ス精 子 の 一 部 を 融 解 し,そ の 生存
ワ トリの β-ア クチ ン遺 伝 子 の5’上 流 領 域 約1.5kbを
性 につ い て検 討 した 結 果,若 干 の 知 見 を 得 た の で報 告 す
い,そ の 下流 にホ タル ・ル シ フェ ラーゼ[1,6]のcDNA
る。
お よびSV40の
供 試 動 物:凍 結 実 験 に は,β-ア
クチ ン/ル シ フ ェ ラ ー
ゼ融 合 遺 伝 子 を 導 入 した トラ ン ス ジ ェ ニ ックマ ウ ス雄 ホ
モ雄 マ ウスを得 た ロモ ー タ ー と し て ニ 用
ス プ ライ シ ング領 域 と ポ リAシ グ ナ ルを
付 け た全 長 約4.3Kbの
断 片 で あ る(Fig.1)。
凍 結 融 解 操 作:凍 結 融 解操 作 は,ほ ぼ前 法に従 った[4,
中 潟 直 己 ・松 本 和 也 ・安 斉政 幸
538 8,11]。
即 ち,organ
3037)内
の0.4mlの
tissue
ム ミル ク を そ れ ぞ れ18%お に 加 え,60℃
culture
保 存 液(ラ
dish(FALCON,
フィノー スお よび スキ
よ び3%と
な る よ うに蒸 留 水
の 温 水 中 で 溶 解 後,10,000gの
ゼ イ ン ミセ ル を 除 去 し た 上 清)に の 精 巣 上 体 尾 部2個
を 入 れ,保
一 に 懸 濁 後 ,約0.1m1ず
存 液 中 で 細 切,精
つ0.25mlの
解 は,凍
ス 中 に 約10分
っ た(融
静 置
に 浸漬 した。 ま
結 し た サ ン プ ル の うち,一 体
り取 り出 し,3∼5分,室
子を均
牛精子凍結保存用
却 速 度:30∼40℃/min),LN2中
た,融
遠心 にて カ
上 述 した ホ モ雄 マ ウ ス
プ ラ ス チ ッ ク ス ト ロ ー に 詰 め,LN2ガ 後(冷
他
をLN2よ
温 に 放 置 す る こ と に よ り行 な
解 速 度:50∼80℃/min)。
融 解 後 の精 子 浮 遊 液 の希 釈 ・洗 浄:融 解 した 精 子 浮 遊 液 をorgantissueculturedish内
の0.4m1の
Fig. 1. Structure of transgene used for microinjection. Fusion genes contain 1.5 kbp of the chicken 9-actin 5' franking region fused to 1.8 kbp of the firefly luciferase c DNA 0.8 kbp of SV 40 splicing region and SV 40 polyadenylationsite.
培 養液 下
部 に静 か に 挿 入 し,培 養 器 内で30分 静 置 す る こ とに よ り 緩 徐 に精 子 浮 遊 液 の希 釈 を 行 な った 後,0.45uの フ ィル タ ー(ミ リポ アSLHAO250S)を 用 い て 精子 浮 遊液 を 濾 過 し,完 全 に 保 存 液 を 除 去 した 。 体 外 受 精:体 外 受 精 は 豊 田 らの 方 法 に 従 った[9]。 なわち,5iu
PMsGと5iuHcGを48時
間 間 隔 で腹腔
内投 与 し,過 排 卵 処 理 を施 したICR系 齢)の 卵 管 膨 大 部 よ りHCG注
す
雌 マ ウ ス(10週
射 後16∼17時 間 に採 取 し
た卵 子 を1.5時 間 前 培 養 した 凍 結精 子 懸濁 液 内 に 導 入 す るこ とに より授 精 を行 な った(精 子 濃 度:2000精
子/μl)。
卵 子 は 授 精後6時
体 の放 出
間 に 倒 立顕 微鏡 下 で,第2極
と雌 雄 前 核形 成 を 指 標 と して受 精 の 有無 を 検査 し,そ の 後,更 に18時 間 培 養 し,2細
胞期 へ の発 生 につ い て観 察
した 。 胚 の 移 植:2細
胞期 へ 発生 した胚 は偽 妊 娠 第 一 日 目の
受 容雌(Jcl:MCH)の
卵 管 へ移 植 し,新 生 児 へ の 発 生
に つ い て 検討 した。 導 入 遺 伝 子 の 検 定 お よび 発 現 の 解 析:得
られ た産 児 に
つ い て は 尾 部 の 細 胞 よ り抽 出 ・精 製 し た 高 分 子DNA を 試 料 と し,以
下 に示 す サ ザ ン プ ロ ッテ ィン グお よび フ
ィ ル タ ー ハ イ ブ リダ イ ゼ イ シ ョ ン法 に よ っ て,導
入 した
遺 伝子 断 片 の マ ウス の染 色 体 上 へ の 組 込 み を 検 索 した 。 す な わ ち,制
限 酵 素BamHIで
の 高 分 子DNAを1%ア
完 全 に 消 化 させ た10μg
ガ ロ ー ス 中 で 電 気 泳 動 し た 後,
ナ イ ロ ン フ ィ ル タ ー にDNAを プ ロ ー ブ を 用 い,ECL (RPN2101,ア
固 定 さ せ,Fig.1に
GENE
マ シ ャ ム)に
DETECTION
よ って フ ィル タ ーハ イ ブ リ
ダ イ ゼ イ シ ョ ン を 行 な っ た 。 ま た,ル に つ い て は,尾 KH2PO4,1mM
示す
SYSTEM
シ フ ェ ラ ーゼ活 性
部 組 織 よ り抽 出 用 バ ッ フ ァ ー(100mM DDT,pH7.5)で
ホ モ ジナ イ ズ して
Fig.
2.
試 験 管 内 の350μ1の
反応 液
blot
mouse.
Tail and
ed
analysis
cryopreserved
BamHI, with
that kbp)
bands
integration
of are
(10ƒÊg)
15 young
above
of was
fragments
probe
hybridizing
numbers
DNA
(1.9
of
sperm
the
a
fragment
the
得 ら れ た 細 胞 抽 出 液20μ1を
Southern
from
were was
from (1.9
kbp
injected the
a the
a
digested blot
with
hybridiz-
BamHI-BamHI transgene.
; arrow) fragments.
line.
derived transgenic
The indicate Mouse
トラ ン ス ジ ェ ニ ックマ ウス精 子 の 凍結 保 存
Table
Table
(25mM
TD4000)に 100μ1を
1. Fertility of the cryopreserved luciferase transgenic mouse sperm assessed by in vitro fertilization
2. Development to live young of 2-cell embryos produced by in vitro fertilization with the cryopreserved lucif erase transgenic mouse sperm
glycylglycine,5mM
に 加 え て 混 和 し,ル
ATP,15mMMgSO4)
ミ ノ メ ー タ ー(ラ
セ ッ ト し た 後,1mMル
約
シ フ ェ リ ン溶 液
注 入 す る こ と に よ り反 応 さ せ,そ
よびTable2に
要
ボ サ イ エ ン ス,
の 発光 量 を 測
β-ア クチ ン/ホ タ ル ・ル シ フ ェラーゼ融 合遺伝 子を導 入 した トラ ンス ジ ェニ ッ ク雄 マ ウ ス(1匹)の
定 し て ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 を 検 出 し た[1]。
Table1:お
539
遺 伝 子 導 入 凍 結 マ ウ ス精
精 巣 上 体尾
部 か ら得 られ た精 子 を凍 結 保 存 後,そ の1/4を
融 解 し,
子 の 体 外 受 精 お よび 得 られ た 胚 の 移 植 成 績 を 示 す 。 供
そ の生 存 性 につ い て検 討 した 。 凍 結 融 解 した精 子 を 用 い
試 卵65個 中,そ の55.4%に
て体 外 受 精 を行 な っ た結 果,検 査 卵65個 中36個 が 受 精
当 た る36個 が 受精 し,培 養
に よ りす べ ての 受 精 卵 が2細
胞 期 へ 発 生 した(Table
(55.4%)し,2細
胞 期 へ 発 生 した 。 さ ら に こ れ ら胚 を
1)。 さ らに,こ れ らす べ て の 胚 を2匹 の 受 容 雌 に 移 植
偽 妊 娠 第 一 日の 受 容 雌 の卵 管 に移 植 した とこ ろ,23匹
した とこ ろ,23匹(63.9%,23/36)の
(63.9%,23/36)の
た(Table2)。
また,得
新生児が得 られ
られ た 新 生 児 の内,無
作為に
新 生 児 が 得 られ た 。 また,得
新 生 児 の 一 部(15匹)に
られ た
つ い て,サ ザ ンプ ロ ッ ト法 にて
選 ん だ15匹 を サザ ン プ ロ ッ トに よ り解 析 した 結 果,全 例
DNAの
に導 入 遺 伝 子 の伝 達 が 確 認 され た(Fig2)。
伝 子 が 伝達 され て い る こ とが確 認 され た。 また,得
得 られ た新 生 児 す べ て にお いて,そ
さ らに,
の細 胞 抽 出 液 に ル シ
フ ェ ラー ゼ の活 性 が 認 め られ た 。 以上,本 実 験 結 果 か ら,ト
られ
た新 生 児 す べ て に お い て ル シ フ ェ ラー ゼ遺 伝 子 の発 現 が 確 認 され た 。
ラ ンス ジ ェニ ック マ ウ ス精
子 の凍 結 保 存 は可 能 で あ り,融 解 後,そ 体外 受 精 を行 な い,得
解析 を行 な った結 果,す べ て の新 生 児 に 導 入 遺
文
の精 子 を 用 い て
られ た胚 を 受 容 雌 へ 移 植 す る こ と
[1]
に よ り,導 入 遺 伝 子 が伝 達 され た新 生 児 へ 発 生 す る こ と が 知 られ た。
[2]
現 在,い ろ い ろ な 目的 で,種 々 の外 来 遺 伝 子 を導 入 し た トラ ン ス ジ ェ ニ ッ クマ ウス が次 々 と作 出 され てお り, 今後 そ の 数 は急 速 に増 加 し,膨 大 な数 に な る もの と思 わ
[3]
れ る。 した が って,精 子 の凍 結 保 存 は,胚 の凍 結 保 存 と と もに,こ れ らマ ウス の系 統維 持 ・保 存 に きわ め て有 効
[4]
な 手 段 に な り得 る もの と考 え られ る。
[5]
献
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