Archives of

Microbiology

Arch. Microbiol. 111, 271-282 (1977)

9 by Springer-Verlag 1977

Cyclodextrin-Glucanotransferase von Klebsiella pneumoniae 1. Synthese, Reinigung und Eigenschaften des Enzyms von K. pneumoniae M 5 al HANS BENDER Chemisches Laboratorium der Universitfit, Albertstr. 21, D-7800 Freiburg i. Br., Bundesrepublik Deutschland

Cyclodextrin Glucanotransferase from Klebsiella pneumoniae

characterization the enzyme is compared to the amylase of Bacillus macerans.

1. Formation, Purification and Properties of the Enzyme from Klebsiella pneumoniae M 5 al

Key words: Klebsiella pneumoniae -

Abstract. 1. The strain M 5 al of Klebsiellapneumoniae

grows excellently with starches. We were able to show that besides the pullulanase associated with the external membrane of the cells the bacterium produces an inducible, extracellular cyclodextrin glucanotransferase [l,4-~-D-glucan-4-~-(l,4-c~-glucano)-transferase (cyclising) (EC 2.4.1.19)]. Potato starch and cyclohexaamylose or cycloheptaamylose were found to be the best "inducing" carbon sources for the synthesis of the enzyme. When the bacteria are grown batchwise, maltose is a poorly "inducing" carbon source; larger quantities of the enzyme are synthesized by continuous cultivation with maltose as growth limiting factor. 2. For the determination of the cyclodextrin glucanotransferase-activity an assay method was worked out. 3. The enzyme could be separated from the culture filtrate and purified to more than 90 ~o in few steps. At a total yield of 61.2~ related to the activity of the culture filtrate employed we received an enzyme solution with the specific activity of 26.6 units/rag protein. Some properties of the enzyme are described. 4. The products formed from amylopectin by the enzyme were analyzed. Somewhat more than half the amylopectin was found as cyclodextrins. 29.3 ~ of the cyclodextrin fraction were cycloheptaamylose, 47.2 ~o cyclohexaamylose and 10.7 ~o exo-branched cyclohexaamylose. 12.8 ~ of cyclohexaamylose were obtained from a cyclodextrin glucanotransferase-limit dextrin after debranching by pullulanase and exposing the product to the action of the glucanotransferase again. 5. The importance of the cyclodextrin glucanotransferase for the utilization of starches by this strain of Klebsiella pneumoniae is discussed. After a first

1,4-e-Glucan utilization - Pullulanase - a-Amylase - Cyclodextrin glucanotransferase - Cyclodextrins - Bacillus macerans amylase.

Zusammenfassung. 1. Der Stamm M 5 al von Klebsiellapneumoniae w/ichst ausgezeichnet mit St/irken.

Wir konnten zeigen, dab das Bacterium neben der mit der externen Membran der Zellen assoziierten Pullulanase eine induzierbare, extracellul/ire Cyclodextrin-Glucanotransferase [1,4-c~-D-Glucan-4-c~-(l,4~-glucano)-transferase (cyclising) (EC 2.4.1.19)] produziert. Als beste ,,induzierende" Kohlenstoffquellen erwiesen sich Kartoffelst/irke und Cyclohexaamylose bzw. Cycloheptaamylose. Bei statischer Kultivierung ist Maltose eine nur schlecht ,,induzierende" Kohlenstoffquelle, gr6gere Mengen des Enzyms werden bei kontinuierlicher Ztichtung mit diesem Zucker als wachstumslimitierendem Faktor synthetisiert. 2. Ffir die Bestimmung der Cyclodextrin-Glucanotransferase-Aktivitfit wurde eine Testmethode ausgearbeitet. 3. Das Enzym konnte in wenigen Schritten aus dem Kulturfiltrat abgetrennt und in guten Ausbeuten zu fiber 90 ~ rein erhalten werden. Bei einer Gesamtausbeute von 61,2 ~, bezogen auf die mit dem Kulturfiltrat eingesetzte Aktivitfit, erhielten wir eine Enzym16sung mit der spezifischen Aktivit/it von 26,6 E/rag Protein. Einige Eigenschaften des Enzyms werden beschrieben. 4. Die durch das Enzyme aus Amylopectin gebildeten Produkte wurden analysiert. Etwas mehr als die Hfilfte des Amylopectins fand sich als Cyclodextrine. 29,3 ~ der Cyclodextrinfraktion waren Cycloheptaamylose, 47,2~ Cyclohexaamylose und 10,7~o exo-verzweigte Cyclohexaamylose. 12 8 ~ Cyclohexa-

272 amylose konnten aus einem Cyclodextrin-Glucanotransferase-Grenzdextrin nach Entzweigung durch Pullulanase und erneuter Einwirkung der Glucanotransferase erhalten werden. 5. Die Bedeutung der Cyclodextrin-Glucanotransferase ffir die Verwertung von St/irken dutch diesen Stature von Klebsiellapneumoniae wird diskutiert. Nach einer ersten Charakterisierung wird das Enzym mit der Amylase von Bacillus macerans verglichen.

Untersuchungen an drei Species der Pseudomonadaceae und an zwei Species der Enterobacteriaceae sollen zur K1/irung der Frage beitragen, ob ffir Organismen, deren 6kologische Nische durch die Kohlenstoffquelle ,,St/irke" charakterisiert ist, ein allgemein gfiltiges Schema ffir die Verwertung verzweigter und unverzweigter 1,4-e-Glucane zu erstellen ist (Hope u. Dean, 1974; Norrman u. W6ber, 1975; Palmer et al., 1973; W6ber, 1973). Das vollst/indige, induzierbare System ffir die Einschleusung der 1,4-e-Glucane in die intermedi/iren metabolen Wege besteht im wesentlichen aus ffinf Enzymen, die aufgrund ihrer Lokalisation in drei Gruppen eingeteilt werden k6nnen: Die auBerhalb der cytoplasmatischen Membran lokalisierten Amylasen und ,,entzweigende" Enzyme Pullulanase oder Isoamylase, das ffir den Transport der augerhalb der Membran gebildeten Spaltprodukte in die Zelle verantwortliche membrangebundene System (Maltodextrinpermease) und die intracellul/iren Enzyme Amylomaltase (4-e-Glucanotransferase) und Maltodextrinphosphorylase. Wit sind in erster Linie an der Verwertung von 1,4-e-Glucanen. durch den zu den Enterobakterien geh6renden Genus Klebsiella interessiert. Die F/ihigkeit zur Synthese von Pullulanase ist innerhalb dieses Genus, insbesondere innerhalb der Species Klebsiella pneumoniae, weit verbreitet (Hope u. Dean, 1974; Wallenfels et al., 1974). Einige der Klebsiella-Pullulanasen wurden eingehend untersucht (u. a. Drummond et al., 1969; Eisele et al., 1972; Yokobayashi et al., 1973). Auch die intracellul/iren Enzyme Maltodextrinphosphorylase und Amylomaltase des von uns im Jahr 1960 isolierten Stammes yon K.pneumoniae (Bender, 1970; Bender u. Wallenfels, 1961)wurden gereinigt und charakterisiert (Essig, 1976; Linder et al., 1976). Dagegen stehen bis heute sowohl die Charakterisierung der induzierbaren Maltodextrinpermease (Norrman u. W6ber, 1975; Palmer u. W6ber, 1975; Palmer et al., 1973) wie auch der exakte Nachweis einer extracellul/iren e-Amylase aus. Wohl konnte bei einigen St/immen von K. pneumoniae eine

Arch. Microbiol., Vol. 111 (1977) spezielle Amylase nachgewiesen und aus einem Stature des Bacteriums isoliert und gereinigt werden, welche vom nicht reduzierenden Ende der 1,4-e-Glucane Maltohexaose abspaltet (Kainuma et al., 1972, 1975), jedoch 1/igt sich weder bei unserem Stamm von K. pneumoniae 1009/III noch bei einem anderen untersuchten Stamm des Bacteriums NCIB 8017 extracellul/ire Amylaseaktivit/it nachweisen. Beide St/imme besitzen aber, wie sich bei Versuchen mit Rohextrakten der Zellen zeigt, intracellul/ir lokalisierte amylolytische Aktivit/it (Bender, 1975; Hernandez u. Pirt, 1975). Unter den in unserem Laboratorium untersuchten, Pullulanase produzierenden Klebsiellen fanden wir einen molekularen Stickstoff fixierenden Stamm von K. pneumoniae, der im Gegensatz zu dem Stamm 1009/ III mit St/irken oder Glykogenen ausgezeichnet w/ichst. In den Kulturfiltraten des mit 1,4-e-Glucanen gewachsenen Bacteriums 1/igt sich amylolytische Aktivit/it nachweisen. In dieser Arbeit soll fiber die Bedingungen ffir die Synthese, fiber die Anreicherung und Reinigung sowie fiber eine erste Untersuchung der Eigenschaften des extracellul/iren amylolytischen Enzyms, welches sich als eine Cyclodextrin-Glucanotransferase erweisen sollte, berichtet werden.

MATERIAL UND METHODEN 1. Mikroorganismus und Ziichtungsbedingungen Alle hier zu beschreibenden Versuche wurden mit dem Stamm M 5 al von Klebsiellapneumoniae1 durchgeffihrt. Eine Nachbestimmung ergab die Zugeh6rigkeit zu der Species Klebsiella oxytoea (Vari-Kutka u. Bender, 1974).Da die Unterschiedezwischendieser Species und der SpeciesK. pneumoniae unbedeutend sind (Richard, 1973) und eine Beibehaltung der Untertrennung kaum rechtfertigen (Buchanan u. Gibbons, 1974), sprechen wir weiterhin von K. pneumoniae. LyophilisierteStammkulturen des Klebsiella-Stammes wurden mit sterilem Wasser rehydratisiert und auf Glucose-HefeextraktPeptonagar plattiert [g/1 Hefeextrakt (Merck) 1,7; Caseinpepton (Merck) 1,7; NaC1 0,7; KgHPO4 0,7; Glucose 6,0; Agar 20; pH 7,2]. Von 12 h alten Plattenkulturen wurden Schtittelkolben mit Minimalmedium beimpft (g/1 K2HPO4 1,0; NI-hC1 3,0; MgSO4 97 H20 0,5; KC1 0,5; Natriumcitrat 0,5; FeSO4.7 H20 0,025; CaCO3 1,5; Kohlenstoffquelle5-16; pH 6,5). Fiir eine Reihe yon Ziichtungen wurde das Minimalmedium mit 0,6 g/1 Caseinhydrolysat und 0,6 g/1 Hefeextrakt supplementiert.Die Kulturen (200 ml Medium/11 Erlenmeyerkolben)wurden bei 28~ 12-24 h lang auf einem Reziprokschtittler geschiittelt. Die Fermenterans/itze wurden mit dem gleichen Medium durchgefiihrt. 600 ml Zellsuspension einer 16 h alten Vorkultur dienten als Inoculum f/ir 101 Medium (Fermenterbedingungen: Fermenter WKF 10/20 der Fa. Wehrle AG, Emmendingen, Temperatur 28~C, Riihrgeschwindigkeit 360 rpm, BeRiftung 6001 Luft/h). Zur Schaumbek~impfung wurde SLE Silikonemulsionder Fa. Wacker, Mtinchen, verwendet. Der pH-Wert wurde mit KOH automatisch auf 6,5 gehalten. Ich danke Herrn Dr. D. Kleiner fiir die Uberlassung des Stammes von Klebsiellapneumoniae

H. Bender: Cyclodextrin-Glucanotransferasevon K.pneumoniae Die Kohlenstoffquelle Kartoffelst~irkewurde als 10 ~ige L6sung (w/v) in der Hitze gelatinisiert und heil3 durch hochtouriges Rfihren in einem Waring Blender (Knight, 1967) mechanisch verflfissigt. Die kontinuierliche Zfichtung des Bacteriums erfolgte nach der 1970 beschriebenen Methode (Bender, 1970). Stickstoffquelle war NH4C1, wachstumslimitierende Kohlenstoffquelle 1,0 ~ Maltose. Die Zellen der FermenterlS.ufe wurden in einer Durchlaufzentrifuge (Sharpies TIP) abzentrifugiert und lyophilisiert, die Kulturfiltrate wurden aufgefangen und bis zur weiteren Aufarbeitung bei 4~ aufbewahrt.

2. Analytische Methoden c~-Amylase, /3-Amylase und Pullulanase wurden nach Vorschrift getestet (Bender u. Wallenfels, 1966; Bernfeld, 1955). Die Einheit der Aktivitfit ist definiert als diejenige Enzymmenge, welche aus den Substraten Amylopectin bzw. Pullulan 1 gMol reduzierender Aldehydgruppen pro min bei 30~ und optimalem pH-Wert freisetzt. Die Aktivitfitsbestimmung der Cyclodextrin-Glucanotransferase sowie die Definition der Einheit werden bei den Ergebnissen beschrieben. Proteinbestimmung mit der Biuretmethode (Beisenherz et al., 1953), Bestimmung des Kohlenhydrats mit Anthron (Spiro, 1966; Viles u. Silverman, 1949), Bestimmung des Reduktionswertes mit dem Nelson-Reagens (Nelson, 1944). Papierchromatographie auf Whatman Nr. 1 in folgenden L6sungsmitteln: Butanol/Pyridin/Wasser (6 : 4 : 4), zweimal aufsteigend bei 85~C zur Trennung der Cyclodextrine (French et al., 1965). Wasser/Athanol/Nitromethan (25:40:35), dreimal absteigend bei 25~ znr Trennung der Maltooligosaccharide (Thoma u. French, 1957). Die getrockneten Chromatogramme wurden durch die Eintauchmethode nach Trevetyan (AgNO3 in Aceton, methanolisches NaOH; Trevelyan et al., 1950) oder im Fall der Cyclodextrine durch Eintauchen der Chromatogramme in sehr verdfinntes I2/KI in Methanol entwickelt (French et al., 1965). Die Fragmentierung der Cyclodextrine wurde durch partielle Hydrolyse'in 0,01 N HC1 bei 98~ durchgeffihrt (French et al., 1965). Horizontale Polyacrylamid-Gel-Elektrophoresenach Grassmann (Grassmann et al., 1951) bei 30 mA und 10~ in 0,05 M Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-HCI-Puffer, pH 8,2. Nach 2,5stfindigem Lauf wurden die Proteine mit 12,5 ~ (w/v) Trichloressigs/iure fixiert and mit Coomassie Blau R 250 angef~rbt (Chrambach et al., 1967). Die spezifische Rotation 1 ~iger L6sungen der Cyclodextrine wnrde in einem Zeiss-Polarimeter bei 589 nm gemessen. Verwendete Enzyme und Substanzen:/?-Amylase (aus Bataten, ca. 500 U/mg Protein) yon Serva, Heidelberg, a-Amylase wurde aus dem Kulturfiltrat des Pilzes Pullulariapullulansisoliert. Pullulanase wurde nach der Methode von Wallenfels (Wallenfels u. Bender, 1974) dargestellt, das Enzym wurde zusfitzlich durch Chromatographie an DEAE-Cellulose-Sfiulen bis zur Einheitlichkeit gereinigt. Difithylaminofithyl-(DEAE)cellulose Servacell 23 SS, Kapazitfit 0,64, 5 0 - 200 mesh, von Serva, Heidelberg. Polymin P (Poly/ithylenimin) vonder BASF, Ludwigshafen, Amylopectin yon Koch & Light, Colnbrook, UK, "Snow flake" Maltodextrin SE 18 von Maizena, Hamburg. Kartoffelst/irke wurde uns vonder Fa. Henkel, Dfisseldoff, tiberlassen, Maltose von Merck, Darmstadt. Maltotriose wurde mit Pullulanase aus Pullulan hergestellt (Bender u. Wallenfels, 1961), Cyclohexaamylose bzw. Cycloheptaamylose wurden aus Stfirkehydrolysaten der Klebsiella-Cyclodextrin-Glucanotransferase gewonnen und nach Cramer gereinigt (Thoma u. Stewart, 1965). Alle anderen verwendeten Substanzen in handelsfiblicher, falls erforderlich, in reinster Form. 3. Die Methoden der Reinigung der Cyclodextrin-Glucanotransferase sowie die zur Identifizierung der durch das Enzym aus

273 Amylopectin gebildeten Produkte verwendeten analytischen Methoden werden im Teil der Ergebnisse beschrieben. ERGEBNISSE

1. Aktivitdtsbestimmung der Cyclodextrin-Glucanotransferase D a s E n z y m y o n Klebsiella pneumoniae M 5 al b e w i r k t eine schnelle A b n a h m e der T r f i b u n g u n d d e r Viscositfit v o n St/irke- bzw. A r n y l o p e c t i n l 6 s u n g e n sowie eine A n d e r u n g d e r e n , , J o d f a r b e " u n t e r A b n a h m e der Intensit/it v o n b l a u n a c h b r a u n . R e d u z i e r e n d e G l u c o s e e n d e n w e r d e n j e d o c h n u r l a n g s a m freigesetzt, so d a b die als M a g ftir die e n z y m a t i s c h e A k t i v i t ~ t bei A m y l a s e n fiblicherweise v e r w e n d e t e M e t h o d e - M e s sung d e r Z u n a h m e des R e d u k t i o n s w e r t e s w/ihrend d e r S p a l t u n g v o n 1,4-c~-Glucanen - nicht h e r a n g e z o g e n w e r d e n k a n n . D i e ffir d i e , , B a c i l l u s macerans-Amylase" a u s g e a r b e i t e t e n Tests sind e n t w e d e r w o h l spezifisch, a b e r u n e x a k t u n d umst~indlich (z.B. T i l d e n u. H u d s o n , 1942), o d e r v611ig unspezifisch (zur U b e r s i c h t s. T h o m a u. Stewart, 1965). D i e M 6 g l i c h k e i t zu e i n e m spezifischen, e x a k t e n u n d einfachen Test ist j e d o c h gegeben, w e n n m a n die E i g e n s c h a f t d e r C y c l o d e x t r i n - G l u c a n o t r a n s f e r a s e zu Glucanosyltransfer-Reaktionen ausnfitzt (French et al., 1954; P a z u r u. M a r s h , 1963). In u n s e r e m T e s t s y s t e m k u p p e l t die C y c l o d e x t r i n - G l u c a n o t r a n s ferase C y c l o h e x a a m y l o s e u n t e r R i n g a u f s p a l t u n g a n einen A c c e p t o r ( M a l t o t r i o s e ) . D i e e n t s t e h e n d e n linea r e n M a l t o s a c c h a r i d e w e r d e n d u r c h /~-Amylase gespalten. W e d e r die G l u c a n o t r a n s f e r a s e n o c h d i e / ~ - A m y l a s e b e w i r k e n allein eine A n d e r u n g des R e d u k t i o n s w e r t e u n t e r d e n ffir d e n Test gewfihlten Bedingungen. Bei s i m u l t a n e r E i n w i r k u n g der E n z y m e w i r d C y c l o h e x a a m y l o s e a u c h o h n e zugeffigten A c c e p t o r gespalten. D i e S p a l t u n g erfolgt j e d o c h in d e r A r t einer a u t o k a t a t y t i s c h e n R e a k t i o n : N a c h anf/inglich n u r z6gernder F r e i s e t z u n g n i m m t die M e n g e r e d u z i e r e n d e r E n d g r u p p e n im V e r l a u f d e r S p a l t u n g steil zu (Abb. J). I n G e g e n w a r t des A c c e p t o r s M a l t o t r i o s e verl/iuft die Z u n a h m e des R e d u k t i o n s w e r t e s fiber einen weiten Bereich d e r R e a k t i o n linear u n d ist bei Uberschul3 an / L A m y l a s e p r o p o r t i o n a l d e r eingesetzten M e n g e an C y c l o d e x t r i n - G l u c a n o t r a n s f e r a s e ( A b b . 1). U n t e r Berficksichtigung d e r T a t s a c h e , d a b Cyclod e x t r i n e k o m p e t i t i v e H e m m s t o f f e d e r / ? - A m y l a s e sind (Thomau. K o s h l a n d , 1960), so dal3 relativ grol3e M e n g e n an / L A m y l a s e u n d kleine an d e m S u b s t r a t C y c l o h e x a a m y l o s e eingesetzt w e r d e n mfissen, schlagen wir zun/ichst den f o l g e n d e n T e s t a n s a t z vor. W i r beh a l t e n uns vor, diesen Test n a c h g e n a u e r e r K e n n t n i s d e r E i g e n s c h a f t e n des Klebsiella-Enzyms e n t s p r e c h e n d zu modifizieren.

274

Arch. Microbiol., Vol. 111 (1977)

p~ 1.0

i,n

-

i

,/// J 3

~ 0.5

~

_

1,6

i

i

72~

5

m

"c

~0,E

IO

UJ

20 40 min (30~

lo

60

4

8

~' I .~ 2 ~s ~

Std (287C)

2

Abb. 1. Spaltung von Cyclohexaamylose durch die CyclodextrinGlucanotransferase von Klebsiella pneumoniae M 5 al und/~-Amylase in Gegenwart und Abwesenheit des Acceptors Maltotriose. Die Testans/itze enthielten in 2 ml 0,03 M Citratpuffer (5 mM an CaC12), pH 6,2, 7,8 mg Cyclohexaamylose, 0,5 mg Maltotriose (nicht bei 5), 20 E/~-Amylase und verschiedene Konzentrationen an CyclodextrinGlucanotransferase. Inkubationstemperatur 30~C, Bestimmung des Reduktionswertes mit Nelson-Reagens. 1 Reduktionswert der Kontrolle ohne Enzym, 2 mit 20 gl, 3 40 ~tl, 4 80 gl einer CyclodextrinGlucanotransferase-L6sung (0,7 E/ml), 5 Zunahme des Reduktionswertes mit 160 gl der Enzymverdfinnung in Abwesenheit von Maltotriose Abb. 2. Synthese der Cyclodextrin-Glucanotransferase und der Pullulanase durch K.pneumoniae M 5 al bei Wachstum mit 1,6~ Kartoffelst~rke. Das Minimalmedium wurde mit 0,06 ~ Caseinhydrolysat und 0,06 ~ Hefeextrakt supplementiert. Der pH-Wert wurde auf 6,5 konstant gehalten. Inkubationstemperatur 28~ Als Inoculum dienten 600 ml einer 16 h alten mit Amylopectin gewachsenen Schiittelkultur. O - ~ - Q Zelldichte; 9 9 Cyclodextrin-Glucanotransferase-Aktivitfit (Kulturfiltrat); A - - - & Pullulanase-Aktivitgt (Zellsuspension); M nicht verwertete Polyglucose

0,03 M Citratpuffer, pH 6,2; 5 mM an CaC12 Cyclohexaamylose 80 mM (in dest. Wasser) Maltotriose 10 mM (in dest. Wasser) /~-Amylase 200 E/ml (in 0,03 M Citratpuffer, pH 6,2) Cyclodextrin-Glucanotransferase max. 0,5 E/ml (in 0,03 M Citratpuffer, pH 6,2)

1,6 ml 0,1 ml 0,1 ml 0.1 ml 0,1 ml 2,0 ml

Nach Durchmischung und Entnahme von 0,5 ml to-Probe (Inaktivierung der Enzyme durch Zugabe von Nelson-Reagens) wird die Reaktionsmischung bei 30~ inkubiert. Nach 10 bzw. 20 min werden 0,5 mlProben entnommen und die freigesetzten reduzierenden Endgruppen mit Nelson-Reagens bestimmt. Die Einheit der Cyclodextrin-GlucanotransferaseAktivitfit ist definiert als diejenige Enzymmenge, welche durch Glucanosyltransfer-Reaktion mit dem

Tabelle 1. Synthese der Cyclodextrin-Glucanotransferase durch KlebsiellapneumoniaeM5al bei Wachstum mit verschiedenen Kohlenstoffquellen. Die Kulturen wurden 20 h bei 28 ~C in Minimalmedium, welches mit 0,06~o Caseinhydrolysat und 0,06~ Hefeextrakt supplementiert war, auf einem Reziprokschgttler geschfittelt. Die Konzentration der Kohlenstoffquellen war 0,8~. Die enzymatische Aktivit~it wurde in dem Kulturfiltrat bestimmt. Zu Vergleichszwecken werden in der Tabelle auch die Aktivit/itswerte angegeben, die bei Wachstum mit 1,6 ~ Kartoffelst/irke bzw. im steady state der kontinuierlichen Zfichtung mit Maltose als wachstumslimitierendem Faktor erhalten wurden Kohlenstoffquelle

Einheiten/ml Kulturfiltrat

Einheiten/mg Trockenzellen

Glycerin D-Glucose Maltose Amylopectin Kartoffelst/irke Kartoffelst/irke, Minimalmedium ohne Caseinhydrolysat und Hefeextrakt 1,6 ~ Kartoffelst/irke stat. Kultivierung Kontin. Zfichtung mit 1 ~ Maltose

0,022 0,019 0,040 0,200 0,320

0,0063 0,0053 0,0114 0,057 0,0914

0,224

0,064

0,700

0,107

0,191

0,048

Acceptor Maltotriose bei pH 6,2 und 30~ so viele lineare Maltooligosaccharide produziert, dab die /?-Amylase pro Minute 1 gMol Maltose abspalten kann.

2. Biologie der Enzymsynthese Der Verlauf des Wachstums von Klebsiellapneumoniae M 5 al und der Synthese der Cyclodextrin-Glucanotransferase mit 1,6 ~o Kartoffelst/irke als Kohlenstoffquelle werden in Abbildung 2 veranschaulicht. Das Bacterium w/ichst ohne wesentliche lag-Phase, nach zweistfindiger Zfichtungsdauer ist im Kulturfiltrat bereits Cyclodextrin-Glucanotransferase-Aktivit~it nachzuweisen. Sic erreicht ihren maximalen Weft mit 0,7 E/ml Kulturfiltrat (0,107 E/rag Trockenzellen) nach 10 h. An zellgebundener Pullulanase sind in der frfihen station/iren Phase 0,96 E/ml Zellsuspension, an zellfreier nach 22stfindiger Kultivierung 0,01 E/ml Kulturfiltrat zu bestimmen. W~ihrend der Gehalt an nicht verwerteter Polyglucose entsprechend der Zunahme an Zellmasse abnimmt und bei Wachstumsende auf einen Wert von 0,8 mg/ml Kulturfiltrat abgesunken ist, gibt das Kulturmedium bereits nach 6sttindiger Kultivierung eine rotbraune ,,Jodfarbe". Sowohl im Wachstumsverlauf wie auch in der Zunahme der im Kulturfiltrat nachzuweisenden Cyclodextrin-Glucanotransferase-Aktivit/it zeigt sich ein diauxischer Knick. Diese Diauxie scheint nicht ausschlieglich auf der Umstellung des Wachstums mit

H. Bender: Cyclodextrin-Glucanotransferase von K.pneumoniae

Ammonium-Stickstoff nach Verbrauch des organisch gebundenen Stickstoffs zu beruhen. Ob in dieser Phase eine Umstellung auf das Wachstum mit Cyclodextrinen erfolgt, wird zur Zeit eingehender untersucht. Die Abh/ingigkeit der Cyclodextrin-Glucanotransferase-Synthese von der Kohlenstoffquelle wird in Tabelle 1 ersichtlich. Nur geringe Mengen an dem Enzym werden von K. pneumoniae bei Wachstum mit Glycerin oder Glucose produziert. Bei statischer Kultivierung erweist sich Maltose als eine sehr schlecht ,,induzierende" Kohlenstoffquelle: 14,3 ~ der mit Kartoffelst/irke synthetisierten Enzymmenge sind im Kulturfiltrat zu bestimmen. Etwa viermal mehr Glucanotransferase werden dagegen im Steady State der kontinuierlichen Ztichtung mit diesem Zucker als wachstumslimitierendem Faktor produziert. Beste ,,induzierende" Kohlenstoffquelle ist bislang jedoch Kartoffelstfirke. K.pneumoniae ist prototroph. Das Bacterium synthetisiert aber mehr Cyclodextrin-Glucanotransferase, wenn dem Minimalmedium geringe

Tabelle 2. Pullulanase-Aktivit/it und intracellul/ire amylolytische Aktivitfit lyophilisierter Zellen von K.pneumoniaeM 5 al. Die Zellen wurden in statischer Kultur mit 1,6 ~ Kartoffelst/irke bzw. kontinuierlich mit i ~ Maltose als wachstumslimitierendem Faktor gezfichtet. 1 g Trockenzellen wurden ad 10 ml in 0,03 M Phosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert und 2 rain lang mit Ultraschall (100 WGerfit, 20 Kc/s) aufgeschlossen. F6r die Bestimmung der enzymatischen Aktivit~it wurden die totalen Homogenate verwendet. Substrat ffir die Bestimmung der amylolytischen Aktivitfit war Amylopectin Art der Kultivierung

Statisch mit 1,6 Kartoffelstiirke Kontinuierlich mit 1 Maltose

Pullulanase Amylolytische (E/nag Aktivit/it (E/mg Trockenzellen) Trockenzellen) pH 5,0

pH 7,0

0,240

0,0094

0,019

0,480

0,0153

0,0327

275

Mengen an Caseinhydrolysat und Hefeextrakt zugeftigt werden. Die intracellul/ire amylolytische Aktivit/it wurde in Homogenaten von Zellen, die in statischer Kultivierung mit Kartoffelstfirke bzw. kontinuierlich mit Maltose als wachstumslimitierendem Faktor geztichtet wurden, bestimmt. Als Substrat ftir diese pauschale Bestimmung der Aktivit/it diente Amylopectin, welches gleichzeitig auch Substrat ftir die Pullulanase ist. Da das intracellul/ire amylolytische Enzymsystem bei dem pH-Wert von 5,0 (dem pH-Optimum der Pullulanase) annfihernd inaktiv ist, kann seine Aktivitfit aus der Differenz der Zunahme der Reduktionswerte in den bei pH 5,0 und pH 7,0 durchgeffihrten Spaltansfitzen ermittelt werden (Tabelle 2).

3. Anreicherung, Reinigung und einige Eigenschaften der Cyc lodextrin-G lucano transferase yon Klebsiella pneumoniae M 5 al

Das extracellul/ire Enzym von K. pneumoniae M 5 al lfiBt sich in einigen wenigen Schritten zu etwa 90 rein darstellen (Tabelle 3). Fiir die Stabilitfit der Cyclodextrin-Glucanotransferase sind Ca2+-Ionen notwendig. Deshalb wurde ftir alle Manipulationen 0,03 M Citratpuffer, pH 6,2, verwendet, der 5 mM an CaCI2 war. In der Beschreibung tier Reinigung wird daranf nicht mehr besonders hingewiesen. 1. 14 1 des gelbbraunen Kulturfiltrats einer 20 h alten, rnit 1,6 ~ Kartoffelst/irke statisch gewachsenen Klebsiella-Kultur wurden auf 4~ abgekiihlt und mit (NH4)2S04 auf eine S/ittigung von 60 ~ gebracht. Die F/illung wurde 20 h bei 4~ aufbewahrt, das gebildete Prficipitat anschliegend durch Zentrifugation (40 rain bei 20000xg) abgetrennt und in 80 ml Citratpuffer suspendiert. Die braunschwarze Pr/icipitatsuspension wurde bei 4~ 2 Tage gegen 21 Citratpuffer dialysiert (zweimaliger Pufferwechsel) und anschliel3end zentrifugiert (60 min bei 50 000 x g). 2. Der immer noch dunkelbraune, trtibe Oberstand wurde mit 2,5 g DEAE-Cellulose (10 ml totales Volumen, die DEAE-Cellulose wurde 24 h mit dem gleichen Puffer /iquilibriert) versetzt. Nach halbst6ndigem Rtihren bei Raumtemperatur wurde zentrifugiert (30 min bei 50 000 x g). Der erhaltene enzymhaltige Oberstand war leicht tr/ib und etwas viscos, jedoch nur noch leicht braun. Neben

Tabelle 3. Anreicherung und Reinigung der Cyclodextrin-Glucanotransferase aus dem Kulturfiltrat einer mit 1,6 ~ Kartoffelst/irke 20 h bei 28 ~C gewachsenen Kultur von K. pneumoniae M 5 al (zur Erl~iuterung s. Text) Schritt

Volumen (ml)

Kulturfiltrat 1. (NIL,)2 SO4-Pr/icipitation Dialyse 2. Negativ-Adsorption an DEAECellulose 3. Prficipitation mit Polymin P. 4. (NH4)2 SO4-Pr/icipitation

14 000 94 86 84 78 28

Einheiten (ml) 0,700 86,5 87 75 79 212,5

Einheiten mg Protein m

m

21,3 22,8 26,6

Totale Akt. (E)

Ausbeute (~)

Pultutanase (total, E)

9800 8130 7480

100 83 76,3

148 141

6300 6162 5998

64,3 63 61,2

0,2

276

Arch. Microbiol., Vol. 111 (1977)

I 10(

I

I

F

/ ~.

95 > 99

0 90 95

Die A b n a h m e der Trfibung der Amylopectinl6sung sowie die Z u n a h m e des Reduktionswertes im Verlauf der Spaltung werden aus A b b i l d u n g 5 ersichtlich. Die nach 24sttindiger I n k u b a t i o n v611ig klare L 6 s u n g trfibte sich wieder, und ein weiges Prficipitat setzte sich ab. Die Fraktionierung der H y d r o l y s e p r o d u k t e ist in Schema 1 zusammengestellt. 1. Sowohl in dem konzentrierten Dialysat wie auch in der nicht dialysierbaren Fraktion bildeten sich nach Zugabe von 10 ml Toluol Priicipitate. Diese wurden durch Zentrifugation abgetrennt und in je 100 ml dest. Wasser suspendiert. Durch Verdampfen des Toluols wurden sie in L6sung gebracht, nochmals mit Toluol pr/icipitiert und nach Abtrennung durch Zentrifugation und L6sung in heiBem dest. Wasser lyophilisiert (als T-Komplex bezeichnet). 2. Die fJberstgnde aus 1. wurden mit je 15 ml Cyclohexan versetzt. Da sich in der nicht dialysierbaren Fraktion des Spaltansatzes kaum Pr~icipitat bildete, wurde diese wie unter 4. beschrieben weiter aufgearbeitet. Das im Dialysat entstandene Prficipitat wurde abzentrifugiert, zur Reinigung einmal mit Cyclohexan umgef'~illtund lyophilisiert (als Ch-Komplex bezeichnet). 3. Der Oberstand des Dialysats aus 2. enthielt noch 8 g Kohlenhydrat mit einem berechneten durchschnittlichen Polymerisationsgrad yon 20,6. Er wurde nach Zugabe von 300 E Pullulanase 24 h bei 30~C inkubiert. Nach dieser Inkubation war der durchschnittliche Polymerisationsgrad auf 9,7 abgesunken. Nach Hitzeinaktivierung der Pullulanase und Zugabe yon 10 ml Cyclohexan wurde das entstandene Pr~cipitat durch Zentrifugation abgetrennt und nach Umfgllung in gleicher Weise wie der verbleibende f2berstand lyophilisiert. 4. Ffir die nicht dialysierbare Fraktion des Spaltansatzes aus 1. liel3 sich ein durchschnittlicher Polymersationsgrad von 53 berechnen (Iodfarbe braunrot). Eine Inkubation mit/3-Amylase verdoppelte, eine solche mit Pullulanase vervierfachte die Menge an reduzierenden Glucoseenden. Keines der Enzyme setzte jedoch EinschluBkomplexe bildende Komponenten frei. Auch eine erneute Inkubation mit Cyclodextrin-Glucanotransferase brachte keinen weiteren Abbau. Die Fraktion wurde mit 100 E Pullulanase und 42,5 E Glucanotransferase 24 h bei 30~ inkubiert. Nach dieser Inkubation war der durchschnittliche Polymerisationsgrad auf 6,5 abgesunken. Der mit Cyclohexan prRzipitierbare EinschluBkomplex und der verbleibende Uberstand wurden lyophilisiert. Einige Eigenschaften der erhaltenen EinschluBkomplexe sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Die

optische Drehung, die LSslichkeit in Wasser bzw. Pyridin, die Abwesenheit reduzierender E n d g r u p p e n sowie die ausgepr/igte Ffihigkeit zur K o m p l e x b i l d u n g u n d die F o r m der gebildeten Kristalle weisen den ChK o m p l e x als Cyclohexaamylose, den T - K o m p l e x als Cycloheptaamylose aus. Bei der C h r o m a t o g r a p h i e nach F r e n c h (French et al., 1965) verh~ilt sich der T - K o m p l e x wie C y c l o h e p t a a m y l o s e (Jodfarbe g e l b ) , der C h - K o m p l e x wie Cyclohexaamylose (Jodfarbe blauviolett). Die Fragmentierungsanalyse (French et al., 1975) ergibt ffir den T - K o m p l e x als gr6Btes Oligosaccharid Maltoheptaose, ffir den C h - K o m p l e x Maltohexaose (Abb. 6). Cyclodextrine sind als kompetitive Hemmstoffe der Amylasen, vor allem der /~-Amylase b e k a n n t ( T h o m a u . Koshland, 1960). Beide der yon der Klebsiella-Cyclodextrin-Glucanotransferase produzierten Cyclodextrine h e m m e n die/?-Amylase, aber auch die Pullulanase y o n K.pneumoniae 1009/III in starkem Mal3e (Tabelle 4). U n t e r den yon uns angewandten Bedingungen produziert das Klebsiella-Enzym aus A m y l o p e c t i n insgesamt 53,36 ~o an Cyclodextrinen. Die Cyclodextrinfraktion selbst setzt sich wie folgt z u s a m m e n : 29,3 Cycloheptaamylose, 47,2 ~o Cyclohexaamylose, 10,7 ~o exo-verzweigter Cyclohexaamylose und 12,8 ~o Cyclohexaamylose, die aus einem Cyclodextrin-Glucanotransferase-Grenzdextrin (25 ~o des eingesetzten A m y lopectins) d u r c h das Klebsiella-Enzym erst nach Entzweigung mit Pullulanase produziert werden. Die C h r o m a t o g r a m m e der Uberst/inde des Spaltansatzes n a c h Entfernung der Cyclodextrine zeigen eine h o m o l o g e Serie von Maltooligosacchariden bis zu einem Polymerisationsgrad yon 10 unter unseren C h r o m a t o g r a p h i e b e d i n g t m g e n (Abb. 7). Gr6Bere Megalosaccharide k 6 n n e n aufgrund der ,,Iodfarbe" u n d des zu ermittelnden durchschnittlichen Polymerisationsgrades k a u m in erwfihnenswerten M e n g e n vor-

H. Bender: Cyclodextrin-GIucanotransferase von K.pneumoniae

279

Abb. 6. Fragmentierungsanalyse des T- bzw. des ChKomplexes. [6st/indige Hydrolyse in 0,01 N HC1 bei 98~C. Chromatographie in Wasser/Athanol/Nitromethan (25:40:35), dreimal absteigend. Das Chromatogramm wurde mit AgNO3 in Aceton und methanolischer NaOH entwickelt; G1 Glucose, G2 Maltose usw.] 1 "Snow flake" Maltodextrin, 2 aus dem ChKomplex gebildete Hydrolyseprodukte, 3 aus dem T-Komplex gebildete Hydrolyseprodukte, 4 Maltotriose Abb.7. Chromatographie der yon der CyclodextrinGlucanotransferase aus Amylopectin gebildeten Spaltprodukte nach Abtrennung der Cyclodextrine. [Chromatographie in Wasser/)kthanol/Nitromethan (25:40: 35), dreimal absteigend. Das Chromatogramm wurde mit AgNO3 in Aceton und methanolischer NaOH entwickelt. G1 Glucose, G2 Maltose usw.] 1 Maltooligosaccharidmischung aus dem Grenzdextrin nach simnltaner Einwirkung von CyclodextrinGlucanotransferase und Pullulanase nach Abtrennung der Cyclohexaamylose, 2 und 3 Maltooligosaccharidmischung aus dem Dialysat des Spaltansatzes nach Abtrennung der Cyclodextrine, 4 Maltotriose, 5 "Snow flake" Maltodextrin

Table 5. Synthese der Cyclodextrin-Glucanotransferase, der Pullulanase und der intracellulfiren amylolytischen Enzyme durch K. pneumoniae M 5 al bei Wachstum mit Cyclohexaamylose bzw. Cycloheptaamylose. Die Kulturen wurden 20 h bei 28~C in dem mit 0,06 Caseinhydrolysat und 0,06 ~ Hefeextrakt supptementierten Minimalmedium auf einem Reziprokschiittter geschfittelt. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle war 0,5 ~. Die Cyclodextrin-Glucanotransferase-Aktivit~it wurde im Kulturfiltrat, die Aktivitfit der anderen Enzyme in Zellhomogenaten bestimmt Kohlenstoffquelle

Cyclohexaamylose Cycloheptaamylose

Cyclodextrin-Glucanotransferase

Pullulanase

Einheiten/ml Knlturfiltrat

Einheiten/mg Trockenzellen

Einheiten/mg Trockenzellen

Amylolytische Enzyme Einheiten/mg Trockenzellen

0,2844 0,250

0,114 0,100

0,076 0,127

0,004 0,007

liegen. Es ist a n z u n e h m e n , dal3 diese Maltooligosaccharide z u m grol3en Teil d u r c h Glucanosyltransfer-Reaktionen des Klebsiella-Enzyms entstanden sind. D a der S t a m m v o n K.pneumoniae M 5 al eine Cyclodextrin-Glucanotransferase synthetisiert, ist es wahrscheinlich, dab er Cyclodextrine als Kohlenstoffquelle verwerten kann. D a s ist in der Tat der Fall (Tabelle 5). Bezogen a u f die gebildete Zellmasse sind sie ausgesprochen gute , , I n d u k t o r e n " ffir die Synthese des Enzyms, weniger gute ffir die Pullulanase u n d ausgesprochen schlechte ffir die intracellul/iren amylolytischen Enzyme. Die H o m o g e n a t e der Zellen, die mit Cyclodextrinen wuchsen, aber auch die mit Kartoffelstfirke u n d (weniger) Maltose kultivierter Zellen besitzen intracellulfire Cyclodextrinase-Aktivit/it (ge-

messen an der Z u n a h m e des Reduktionswertes mit Cyclodextrinen als Substrat). DISKUSSION Wie die mitgeteilten Befunde zeigen, produziert der S t a m m von Klebsiellapneumoniae M 5 al eine extracellulfire Cyclodextrin-Glucanotransferase. Die Synthese des induzierbaren E n z y m s ist v o n d e r gebotenen Kohlenstoffquelle abhfingig. Beste ,,induzierende" Kohlenstoffquellen sind Kartoffelstarke und Cyclodextrine selbst. D a s E n z y m k a n n in wenigen konventionellen Schritten aus dem Kulturfiltrat abgetrennt und in guten A u s b e u t e n zu etwa 90 ~ rein dargestellt werden. N e b e n d e m w o h l b e k a n n t e n Bacillus macerans

280 (zur Ubersicht s. French, 1957; Thoma u. Stewart, 1965) und einem erst vor wenigen Jahren gefundenen Stamm von B. megaterium (Kitahata et al., 1974; Kitahata u. Okada, 1974) sowie einem alkalophilen Bacillus (Nakamura u. Horikoshi, 1976a, b) kennen wir nun erst ein viertes Bacterium (das erste Gramnegative), welches die Ffihigkeit zur Produktion einer Cyclodextrin-Glucanotransferase besitzt. Mit der unerwarteten Isolierung eines solchen Enzyms von einem Klebsiella-Stamm erweitert sich unsere ursprtingliche Fragestellung: 1. Wir haben nun zum ersten Mal einen KlebsiellaStamm, dessen enzymatische Ausstattung es ihm erm6glicht, hervorragend mit Stfirke als Kohlenstoffquelle zu wachsen. AuBerhalb der cytoplasmatischen Membran dieses Bacteriums finden sich die zwei Enzyme Cyclodextrin-Glucanotransferase und Pullulanase. Die nach unseren Untersuchungen echt extracellulfire (Pollock, 1962) Glucanotransferase nimmt die Schltisselstellung ein. Sie versorgt die Zellen mit Produkten, die leicht durch die cytoplasmatische Membran transportiert werden k6nnen, c~-l,6-Verzweigungen, soweit sie in intakten oder teilweise abgebauten Amylopectinmolektilen, in verzweigten Cyclodextrinen oder in einem vonder CyclodextrinGlucanotransferase nicht spaltbaren Grenzdextrin existieren, werden von der mit der externen Membran der Zellen assoziierten Pullulanase 2 hydrolysiert. Es kann angenommen werden, dab die extracellul/ir produzierten Cyclodextrine als solche in die Zelle transportiert und dort weiter abgebaut werden. Daffir spricht das gute Wachstum des Bacterium mit reinen Cyclodextrinen und die intracellul~ir nachzt~weisende Cyclodextrinase-Aktivitfit. Wfirde auch ein Teil der Cyclodextrine extracellulfir durch GlucanosyltransferReaktionen der Cyclodextrin-Glucanotranslerase linearisiert, so gelangten doch in jedem Fall relativ kurze Glucoseketten (mit nur unwesentlich differierenden Kettenlfingen) in die Zelle. Damit aber kennen wir zum ersten Mal recht genau die chemische Natur der durch einen Klebsiella-Stamm extracellulfir aus St/irke gebildeten und durch die cytoplasmatische Membran transportierten Spaltprodukte. Der intracellulfire weitere Abbau der Produkte - im Fall der Cyclodextrine nach Ringspaltung - wird entsprechend der gegebenen Schemata (z.B. Palmer u. W6ber, 1975) durch die Maltodextrinphosphorylase 3 und eine 2 Die Pullulanasedes Stammesvon K. pneumoniae M 5 al wurde bis zur Einheitlichkeitgereinigt. Das reine Enzymzeigt geringere spezifischeAktivitgtmit dem Substrat Pullulan(29 E/mgProtein), jedoch zweimal gr6Bere spezifische Aktivit/it mit dem Substrat Amylopectin als das reine Enzym von K. pneumoniae 1009/III (Seitz, 1975) 3 Die Maltodextrinphosphorylasedes Stammes K.pneumoniae M 5 al wurde in unserem Laboratoriumgereinigtund charakterisiert (Boeltz,1975)

Arch. Microbiol.,Vol. 111 (1977) Amylomaltase-fihnlicheGlucanotransferase4 erfolgen. Zu kl/iren ist noch die Bedeutung der intracellulfiren amylolytischen Enzyme ffir die Einschleusung der Produkte in die intermedifiren Stoffwechselwege. 2. Nach der Analys.e der durch das KlebsiellaEnzym aus Amylopectin gebildeten Spaltprodukte kann ein erster Vergleich mit der Amylase von Bacillusmacerans gezogen werden. Die B. maceransAmylase greift 1,4-e-Glucane vom nicht reduzierenden Ende her an. Bei verzweigten 1,4-c~-Glucanen bleibt ein hochmolekulares, nicht weiter spaltbares Grenzdextrin tibrig (French, 1957). Da ein geringer Prozentsatz verzweigter Cyclodextrine nachgewiesen werden kann (French et al., 1965), mul3 wenigstens ein Teil der Verzweigungen in die cyclischen Produkte eingebaut werden k6nnen. Obwohl auch f/Jr die Amylase von B. macerans Angaben vorliegen, dab ,,bestimmte Enzympr/iparationen" beispielsweise /LGrenzdextrin ohne Bildung cyclischer Produkte zu spalten verm6gen (s. French, 1957; B. macerans produziert im Gegensatz zu unserem Klebsiella-Stamm neben der Cyclodextrin-Glucanotransferase noch extracellulfire e-Amylasen !), ist der Angriff des Klebsiella-Enzyms auf Amylopectin oder Stfirke generell charakterisiert durch die rapide Abnahme der Viscosit/it. Nach allen Erfahrungen der St/irkechemie sollte diese schnelle Viscositfitsabnahme auf einen prim~iren Endomechanismus des Angriffs hindeuten. Exakte Aussagen zu dieser Frage sollen jedoch erst gemacht werden, wenn wir die Eigenschaften des Enzyms besser kennen. Die Analysen unserer Spaltans/itze ergeben dagegen eindeutig, dab die Cyclodextrin-Glucanotransferase von K.pneurnoniae M 5 al unter Bildung gr613erer Mengen an exo-verzweigten Cyclodextrinen tiefer in die Verzweigungen des Amylopectins eindringen kann als das B. macerans-Enzym. Wie erhalten nur 25 ~o des eingesetzten Amylopectins als h6her molekulares, durch das Klebsiella-Enzym allein nicht weiter spaltbares Grenzdextrin, dessen Struktur uns im Zusammenhang mit der Feinstruktur der Amylopectine besonders interessiert. Sowohl f/Jr die B. macerans-Amylase wie auch f/Jr die Cyclodextrin-Glucanotransferase von B. megaterium werden Mengenverhfiltnisse der aus 1,4-~-Glu, canen gebildeten verschiedenen Cyclodextrinen angegeben (Kitahata u. Okada, 1974). Das B. maceransEnzym soil Cyclohexa-, Cyclohepta- und Cyclooctaamylose im Verh/iltnis 2,7:1:1, das B. rnegateriurnEnzym im Verhfiltnis 1 : 2,4 : 1 produzieren. In den yon uns durchgeffihrten Spaltans/itzen des Klebsiella-Enzyms mit Amylopectin oder Stfirke finden Ein Amylomaltase-fihnlichesEnzymyon K. pneumoniae M 5 al wird derzeiteingehenderuntersucht

H. Bender: Cyclodextrin-Glucanotransferase von K. pneumoniae

sich dagegen h6chstens Spuren an Cyclooctaamylose. Nach unserem derzeitigen Kenntnisstand ist es nicht m6glich, exakte Verh/iltniszahlen fiir Cyclohexa- und Cycloheptaamylose zu geben. Prim/ires cyclisches Produkt der Spaltung von 1,4-c~-Glucanen scheint Cyclohexaamylose zu sein. Je nach den Bedingungen ffir die Spaltung nimmt der Gehalt an dieser ab, derjenige an Cycloheptaamylose dagegen zu. Darfiber wird an anderer Stelle berichtet werden. Herrn K. Enzinger danke ich ffir die Mithilfe bei der Kultivierung der Bakterien. Herrn D. Linder danke ich ftir die Durchf/ihrung der Elektrophoresen. Die diesem Bericht zugrundeliegenden Arbeiten wurden mit Mitteln des Bundesministers f/Jr Forschung und Technologie gef6rdert.

LITERATUR Beisenherz, G., Boltze, H.J., Bacher, T., Czok, R., Garbade, K. H., Meyer-Arendt, E., Pfleiderer, G.: Diphosphofructosealdolase, Phosphoglyceraldehyd-dehydrogenase, Milchs~iuredehydrogenase, Glycerophosphat-dehydrogenase und Pyruvatkinase aus Kaninchenmuskulatur in einem Arbeitsgang. Z. Naturforsch. 8b, 555-577 (1953) Bender, H.: Pullulanase von Aerobacteraerogenes. Lokalisation des zellgebundenen Enzyms kontinuierlich geziichteter Zellen. M6gliche Assoziation mit dem /iul3eren Membransystem der Zellen. Arch. Mikrobiol. 71, 331- 352 (1970) Bender, H. : Gewinnung und Trfigerfixicrung spezifischer Enzyme zur kontrollierten Modifikation von Polysacchariden. BCT 17, Jahresbericht, Bundesmin. f. Forsch. u. Technol. (1975) Bender, H., Wallenfels, K. : Untersuchungen an Pullulan. II. Spezifischer Abbau dnrch ein bakterielles Enzym. Biochem. Z. 334, 79--95 (1961) Bender, H., Wallenfels, K. : Pullulanase (an amylopectin and glycogen debranching enzyme) from Aerobacteraerogenes. In: Methods in enzymology, Vol. VIII (E. F. Neufeld, V. Ginsburg, eds.), pp. 555-559. New York-London: Academic Press 1966 Bernfeld, P. : Amylase, c~and ft. In: Methods in enzymology, Vol. 1 (S. P. Colowick, N. O. Kaplan, eds.), pp. 149- 158. New YorkLondon: Academic Press 1955 Boeltz, F. : 1,4-:~-Glucanophosphorylase aus K. pneumoniae M 5 al. Reinigung und Eigenschaften. Diplomarbeit, Universit/it Freiburg (1975) Buchanan, R. E., Gibbons, N. E. (eds.) : Bergey's Manual of determinative bacteriology. Baltimore, Md. : Williams and Wilkins 1974 Chrambach, A., Reisfeld, R. A., Wykoff, M., Zaccari, J. : A procedure for rapid and sensitive staining of protein fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analyt, Biochem. 20, 150154 (1967) Drummond, G.S., Smith, E. E., Whelan, W. J.: Mechanism of action of pullulanase. FEBS Lett. 5, 85-88 (1969) Eisele, B., Rasched, I. R., Wallenfels, K. : Molecular characterization of pullulanase from Aerobacter aerogenes. Europ. J. Biochem. 26, 6 2 - 67 (1972) Essig, U. : Amylomaltase aus K. pneumoniae 1009/III. Diplomarbeit, Universit/it Freiburg (1976) French, D. : The Schardinger Dextrins. Advanc. Carbohydr. Chem. 12, 189-260 (1957) French, D., Levine, M. L , Norberg, E., Nordin, P., Pazur, J. H., Wild, M. G.: Studies on the Schardinger Dextrins. VIII. Cosubstrate specificity in coupling reactions of Macerans-Amylase. J. Amer. chem. Soc. 76, 2387-2390 (1954)

281 French, D., Pulley, A. D., Effenberger, J. A., Rougvie, M. A., Abdullah, M. : Studies on the Schardinger Dextrins. XII. The molecular size and structure of the c5-, e-, (-, and q-dextrins. Arch. Biochem. Biophys. 111, 153-160 (1965) Grassmann, W., Hannig, K., Knedel, M.: Electrophoretic determination of serum proteins on filter paper. Dtsch. reed. Wschr. 76, 333- 336 (1951) Hernandez, E., Pitt, S. J. : Kinetics of utilization of highly polymerised carbon sources (starch) in a chemostat culture of K. pneumoniae. Pullulanase and c~-amylaseactivities. J. appl. Chem. Biotechnol. 25, 297- 304 (1975) Hope, G. C., Dean, A. C. R. : Pullulanase synthesis in Klebsiella aerogenes strains growing in continuous culture. Biochem. J. 144, 403- 411 (1974) Kainuma, K., Kobayashi, S., Ito, T., Suzuki, S.: Isolation and action pattern of maltohexaose producing amylase from Aerobacter aerogenes. FEBS Lett. 26, 281-285 (1972) Kainuma, K., Wako, K., Kobayashi, S., Nogami, A., Suzuki, S. : Purification and some properties of a novel maltohexaoseproducing exoamylase from Aerobacteraerogenes. Biochim. bi0phys. Acta (Amst.) 410, 333-346 (1975) Kitahata, S., Okada, S. : Cyclodextrin glycosyltransferase. II. Action of cyclodextrin transferase from Bacillus megaterium strain No. 5 on starch. Agric. Biol. Chem. 38, 2413-2417 (1974) Kitahata, S., Tsumyama, N., Okada, S.: Purification and some properties of cyclodextrin glycosyltransferase from a strain of bacillus species. Agric. Biol. Chem. 38, 387-393 (1974) Knight, J. W. : Modification and uses of wheat starch. In: Starch: Chemistry and technoIogy, Vol. II, Ind~strial aspects (R. L. Whistler, E. F. Paschall, eds.), pp. 279-291. New York-London: Academic Press 1967 Linder, D., Kurz, G., Bender, H., Wallenfels, K.: 1,4-e-Glucan phosphorylase from K.pneumoniae. Purification and structure. Europ. J. Biochem. (in press, 1976) Nakamura, N., Horikoshi, K. : Characterization and some cultural conditions of a cyclodextrin glycosyttransferase-producing alkalophilic Bacillus sp. Agr. Biol. Chem. 40, 753-757 (1976a) Nakamura, N., Horikoshi, K. : Purification and properties of cyclodextrin-glycosyltransferase of an alkalophilic Bacillus. Agr. Biol. Chem. 40, 935-941 (1976b) Nelson, N.: A photometric adaption of the Somogyi method tbr the determination of glucose. J. biol. Chem. 153, 375 - 380 (1944) Norrman, J., W6ber, G. : Comparative biochemistry of e-glucan utilization in Pseudomonas amyloderamosa and Pseudomonas saccharophila. Physiological significance of variations in the pathways. Arch. Microbiol. 102, 253-260 (1975) Palmer, T. N., W6ber, G.: The metabolic role of debranching enzymes. Biochem. Soc. Trans. 3, 53-56 (1975) Palmer, T. N., W6ber, G., Whelan, W. J.: The pathway of exogenous and endogenous carbohydrate utilization in Escherichia coli: A dual function for the enzymes of the maltose operon. Europ. J. Biochem. 39, 601-612 (1973) Pazur, J. H., Marsh, J. M.: Methyl-c~-maltotetraoside from cyclohexaamylose and methyl-ct-D-glucopyranoside by Maceransamylase. In: Methods in carbohydr, chem., Vol. II (R. L. Whistler, M.L. Wolfrom, eds.), pp. 347-349. New YorkLondon: Academic Press 1963 Pollock, M. R. : Exoenzymes. In: The bacteria, a treatise on structure and function, Vol. IV (J. C. Gunsalus, R. Y. Stanier, eds.), pp. 121-178. New York-London: Academic Press 1962 Richard, C. : Etude antig6nique et biochimique de 500 souches de Klebsiella. Ann. Biol. clin. 31,295-303 (1973) Seitz, J.: Pullulanase aus K.pneumoniaeM 5 al. Reinigung und Eigenschaften. Diplomarbeit, Universit/it Freiburg (1975) Spiro, R. O.: Analysis of sugars found in glycoproteins. In: Methods in enzymology, Vol. VIII (E. F. Neufeld, V. Ginsburg, eds.), pp. 3 - 36. New York-London: Academic Press 1966

282 Thoma, J. A., French, D.: Paper chromatography of homologous saccharides. Selection of solvent components and solvent proportions. Analyt. Chem. 29, 1645-1648 (1957) Thoma, J. A., Koshland, D. E., Jr. : Competitive inhibition by substrate during enzyme action. Evidence for induced-fit theory. J. Amer. chem. Soc. 82, 3329- 3333 (1960) Thoma, J. A., Stewart, L.: Cycloamyloses. In: Starch: Chemistry and technology, Vol. I, Fundamental aspects (R. L. Whistler, E. F. Paschall, eds.), pp. 209-249. New York-London: Academic Press 1965 Tilden, E. B., Hudson, C. S.: Preparation and properties of the amylases produced by Bacillus macerans and B.polymyxa. J. Bact. 43, 527-544 (1942) Trevelyan, W. E., Procter, D, P., Harrison, J. S. : Detection of sugars on paper chromatograms. Nature (Lond.) 166, 444-445 (1950) Vari-Kutka, M., Bender, H. : Gewinnung und Tr/igerfixierung spezifischer Enzyme zur kontrollierten Modifikation yon Polysacchariden. BCT 17, Jahresbericht, Bundesmin. f. Forsch. u. Technol. (1974) Viles, F. J., Silverman, L. : Determination of starch and cellulose with anthrone. Analyt. Chem. 21, 950-953 (1949)

Arch. Microbiol., Vol. 111 (1977) Wallenfels, K., Bender, H. : Kristallisierte Pullulanase. Ger. Often 2 245 342 (el. 12d C) (1974) Wallenfels, K., Bender, H. : Gewinnung und Tr/igerfixierung spezifischer Enzyme zur kontrollierten Modifikation von Polysacchariden. BCT 17, Jahresbericht, Bundesmin. f. Forsch. u. Technol. (1975) Wallenfels, K., Bender, H., Vari-Kutka, M.: Gewinnung und Tr/igerfixierung spezifischer Enzyme zur kontrollierten Modifikation yon Polysacchariden. BCT 17, Jahresbericht, Bundesmin. f. Forsch. u. Technol. (1974) W6ber, G. : The pathway of maltodextrin metabolism in Pseudomonas stutzeri. Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 354, 7 5 - 8 2 (1973) Yokobayashi, K., Akai, H., Sugimoto, T., Hirao, M., Sugimoto, K., Harada, T. : Comparison of the kinetic parameters of Pseudomonas isoamylase and Aerobacter pullulanase. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 293, 197-202 (1973)

Eingegangen am 15. Juli 1976