Journal o/the neurological Sciences, 1975, 26: 335-348 ~C Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam - Printed in The Netherlands

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Desoxyribonucleasen in spontanen und experimentellen Tumoren des Nervensystems K. TEMPEL, D. STAVROU UND W. WEIDENBACH Institut fiir Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie (Vorstand: Pro£ Dr. D. Hegner), Lehrstuhl ~ r Allgemeine Pathologie und Neuropathologie (Prof. Dr. E. Dahme ) des Fachbereichs Tiermedizin der Universitdt Miinchen, und Abteilung Jfir Neurochirurgie des Klinikums rechts der Isar der Technischen Universitdt Miinchen ( Chefarzt : Dr. W. Weidenbach), Miinchen ( B.R.D. ) (Eingegangen am 2, April, 1975)

EINLEITUNG

Ffir die Beurteilung der biologischen Wertigkeit von Tumoren des Nervensystems sind die bislang fiblichen Kriterien der Allgemeinpathologie unzureichend. Deshalb wurde in letzter Zeit zu der Frage der Objektivierung der Dignit~it neurogener Tumoren, die sowohl ffir das operative als auch ftir das postoperative Vorgehen von besonderer Bedeutung ist, wiederholt Stellung genommen (Lit. bei Stavrou, Z~inker, Weidenbach und Knedel 1973; Wollemann 1974). Diese Untersuchungen betreffen im wesentlichen das Verhalten cytoplasmatischer Enzyme und deren Isoenzyme bei verschiedenen Hirntumoren. Taper, Brucher und Doyen (1971) haben mit ihrer histochemischen Studie auf das Fehlen von Nucleasen bei malignen Hirntumoren hingewiesen. Zahlreiche Proliferationsreize vergr6ssern das in vitro gemessene Verh/iltnis (Q) der Aktivit~iten von Desoxyribonuclease II (DNase II, EC 3.1.4.6) und DNase I (EC 3.1.4.5) (Tempel 1971; Tempel und Hollatz 1973; Hollatz, Tempel und Wulffius 1975). Zu den Ursachen geh6rt ein Aktivit~itsanstieg der DNase II (Allfrey und Mirsky 1953: Lehman 1967) und/oder ein AktivitS,tsabfall der DNase I (Laszlo, Ove, Shingleton und Morris 1969; Tempel, 1971; Tempel und Hollatz 1973; Hollatz et al. 1975). Unter der somit naheliegenden Annahme, dab Q den allgemeineren Ausdruck eines DNasen-abhangigen Regulationssystems der DNA-Synthese darstellt, darf man erwarten, daB sich der Quotient im Zusammenhang mit Tumorwachstum irreversibel und weitgehend vom Tumortyp erh6ht. In Fortsetzung yon Untersuchungen an der durch Di~ithylnitrosamin cancerisierten Rattenleber (Tempel und Hollatz 1973) wird im folgenden vergleichend fiber das Die Untersuchungen wurden mit Untersttitzung durch die Deutsche Forschungsgemeinschafl (SFB 51 E/13) durchgeffihrt. Korrespondenz: Priv.-Doz. Dr. D. Stavrou, Lehrstul fiir Allgemeine Pathologie und Neuropathologie am Institut ftir Tierpathologie der Universit/it MiJnchen, 8000 Mfinchen 22, VeterinS.rstr. 13, B.R.D.

336

K. TEMPEL, D. STAVROU, W. WEIDENBACH

Verhalten von DNasen in spontanen und experimentell induzierten neurogenen Tumoren verschiedener Species berichtet. Als m6gliche Bezugsgr6ssen der F,nzymaktivit~iten wurden DNA- und RNA-Konzentration in der Regel mitbestimmt.

MATERIAL UND METHOI)IK

Als Untersuchunqsmaterial dienten die in Tabelle I aufgefiihrten Gewebe. TABELLE I SPONTANE (MENSCH) UND EXPERIMENTELLE (RAI'I'E) NEUROGENETUMOREN, DIE FI~'R DEN DESOXYRIllONI]CLEASENNACtlWEIS VERWENDET "vVURDEN

,½"])ccicA

TlgtHOl'Cn

Material Mensch

Raxte

,4. Kontrollen

1. Grosshirn 2~ N. ischiadicus

3

10 10

3 35 18 7

3 I 2 16

36 20 23

63

22

85

B. Tumoren

1, 2. 3. 4,

Oligodendrogliome Astrocytome Glioblastome Neurinome

Gesamt (Tumoren)

Zur histologischen Untersuchung wurde das Tumormaterial in 6 °/igem neutralen Formol fixiert, danach in Paraplast ® eingebettet und die Schnitte nach den in der neuroonkologischen Diagnostik iiblichen Verfahren gef~irbt. Fiir die Charakterisierung der Tumoren wurde der Nachweis des ftir das Nervensystem spezifischen Proteins S-100 mit Hilfe der Immunodiffusion nach Ouchterlony (1948) durchgeftihrt. N~ihere Angaben fiber die Reinigung des Antigens sowie fiber die Gewinnung yon Anti-S-100-Immunserum finden sich bei Haglid und Stavrou (1973) sowie bei Stavrou und Hagtid (1973). Ffir die Induktion der neurogenen Tumoren wurden 30 Sprague--Dawley-Ratten beiderlei Geschlechts aus institutseigener konventioneller Haltung verwendet. Den 4 Monate alten Tieren wurden w6chentlich 50 mg/kg 1-Phenyl-3,3-dimethyltriazen (Kp= 114°C bei 11 Torr)* nach den Angaben von Druckrey, Ivankovic und Preussmann (1967) subcutan im Sacralbereich injiziert. N~ihere Angaben zur Versuchsanordnung finden sich bei Stavrou (1969). Die biochemische Untersuchung erstreckte sich auf die DNA- und RNA-Konzentrationen sowie auf die Aktivit~iten yon DNase I, DNase II und DNase I-Inhibitor. Zu diesem Zweck wurden die Gewebsproben unter Ktihlung zusammen mit 0,14 M NaC1-L6sung (1:25, G/V) 2 min lang bei 1500 U/min nach Potter-Elvehjem (Homo* Herrn Prof. Dr. R. Grashey, lnstitut fiir Organische Chemle der Universit~it Miinchen, sind wir fiir die Oberlassung des Carcinogens zu D a n k verpflichtet.

DESOXYRIBONUCLEASEN BE1 NEUROGENEN TUMOREN

337

genatisator Potter S der Fa. Braun, Melsungen) oder bei ca. 30.000 U/min im Drehmesserhomogenisator der Fa. Bfihler, Tiibingen, bei 4q5°C homogenisiert. Zur Bestirnmung der DNasen wurde die Methode yon Allfrey und Mirsky (1953) geringg-radi~ modifiziert: Der Ansatz zur Messung der DNase I bestand aus 0,5 ml der Gewebshomogenate, 2,0 ml Tris-HC1-Puffer (Tris-Konzentration 0,033 M~ pH 7,3), 0,5 ml einer 0,25 ~ igen w/~ssrigen L6sung hochmolekularer DNA (Desoxyribonucleins~iure, Na-salz, aus Kalbsthymus, mind. 9 5 ~ DNA, Mol.-Gewicht 8 900 000, EGA-Chemie Keppler und Reif, Steinheim a. Albuch) und MgCI2 ensprechend einer Endkonzentration von 0,0026M. Zur Messung der DNase IIAktivit~it wurden 0,5 ml der Homogenate, zusammen mit 2,0 ml NatriumacetatPuffer (Natriumacetat-Konzentration der Ans~itze entsprechend 0,26M~ pH 4J) und 0,5 ml der Substratl6sung inkubiert. Die Inkubationsdauer betrug 60 min. Ausdruck der Enzymaktivit~iten waren die w:,ihrend der Inkubation bei 37°C in Trichloressigs~iure-LSsung (Zus~itze entsprechend einer Endkonzentration von 0,76M) 16slich gewordenen DNA-Abbauprodukte. Sie wurden spektrophotometrisch (Spektralphotometer PMQ II der Fa. C. Zeiss, Stuttgart-Oberkochen) sowohl im UV-Bereich bei 260 nm (Abzug der Trichloressigs~iure-Eigenextinktion) als auch mit der DischeReaktion (Allfrey und Mirsky 1953) bei 600 nm erfasst. Das Reaktionsgemisch zur Messung der DNase I-Inhibitor-Aktivitdt enthielt 2,0 ml Tris-HC1-Puffer, pH 7,3, 0,5 ml der 0,25~o igen DNA-L6sung, 0,0026M MgC12 und 0,12 ml physiol. KochsalzlSsung (Vergleichsstandard) oder 0,12 ml Homogenat (Hemmstoffansatz). Nach Zugabe yon 0,5 ml einer 0,001 ~o (G/V), w~issrigen DNase I-L6sung (Desoxyribonuclease I aus Rinderpankreas, salzfrei, lyophilisiert, Aktivit~it etwa 450 E/mg, Schuchardt De 0,66) wurde die Extinktionszunahme des Reaktionsgemisches 3 min lang bei 260 nm im Abstand von jeweils 30 sec bei Zimmertemperatur in 0,5 cm-Quarzkiivetten gemessen. Als Vergleichsgemisch (100-Punkt-Abgleich) diente der enzymfreie Ansatz. Zur Bestimmung der Nucleinsdure-Konzentrationen wurden 2 ml der Homogenate mit 4 ml einer kalten, 6~igen Trichloressigs~iurel6sung (TCE) versetzt und anschliessend 10 min bei 4000 × g zentrifugiert. Die Sedimente wurden anschliessend 2 mal mit 6% iger TCE und 2 mal mit 10~ Kaliumacetat enthaltendem Athanol 96~ig gewaschen und im Anschluss daran 15 min lang bei 90°C in 10~oiger TCE solubilisiert. Die DNA-Konzentration wurde mit der Dische- (Allfrey und Mirsky 1953; Messung der Extinktionsdifferenz zwischen 600 und 650 nm), die RNA-Konzentration mit der Orcin-Reaktion (Shatkin 1969) erfasst. Zur Berechnung der Enzymaktivit~iten und der Nucleins~iure-Konzentrationen dienten die bereits andernorts mitgeteilten und experimentell ~iberpr~iften Vergleichs- bzw. Bezugswerte (Tempel und Hollatz 1973). ERGEBNISSE

Bei den induzierten PNS-Tumoren (Abb. 1) handelt es sich um zellreiche Tumoren mit sehr wechselnden strukturellen Merkmalen. Neben Arealen, die aus spindeligen Zellen mit st~ibchenf6rmigen Kernen bestehen, finden sich Tumorbezirke mit pleomorphen, cytoplasmaarmen Zellen, die runde oder ovale Kerne erkennen lassen. W~ihrend die spindeligen Zellen eine charakteristische Anordnung in Form von

338

K. TEMPEL, D. STAVROU, W. WEIDENBACH

Abb. 1. Experimentelles Neurinom des N. ischiadicus der Ratte (a) mit Arealen yon niedrigem (b) bzw. hohem Differenzierungsgrad (d). Reticular strukturiertes experimentelles Neurinom (c). Immunodiffusion auf 1%igem Agargel zum Nachweis des S-100-Proteins. In das Zentrum (1) wurde Anti-S-100-Serum (1:5) und in die Peripherie 1 /~g S-100 (5), Puffer (6), Nierenextrakt (7) sowie Neurinomextrakt (2-4) in verschiedenen Verdiinnungen (2 = 1:40,3 = 1:20,4 = 1:5) eingefiillt. Das Anti-S-100-Serum pracipitiert nur mit dem S-100 und dem Tumorextrakt. (b, c, d: Nissl-Fbg., x 120)

DESOXYRIBONUCLEASEN BEI NEUROGENEN -fUMOREN

339

~bb. 2. Acusticusneurinomedes Menschen (a-b) mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad. Experimen.'liesOligodendrogliom (c), Astrocytom (d) und pleornorphes Gliom (e) der Ratte. (a-e: Nissl-Fbg., × 120)

340

K. TEMPEL, D. STAVROIt~, W. WEIDENBACH

Str6men und Wirbeln zeigen, lassen sich bei den pleomorphen Bezirken architektonische Formationen kaum nachweisen. Mitosenzahl und Faserreichtum sind yon Areal zu Areal sehr unterschiedlich. Fibrill~ire Areale sind faserreich und mitosenarm, hingegen pleomorphe Areale sind reich an Mitosen bzw. riesenzell~ihnlichen Bildungen und zeigen nur Ans~itze zur Faserbildung. Einer dieser Tumoren (371/72) zeigt gr6sstenteils eine reticul~ire Struktur (Abb. lc) und setzt sich aus chromatinreichen Zellen zusammen, die sowohl rhythmische Architekturen als auch progressive Erscheinungen vermissen lassen. Bei den Acusticusneurinomen des Menschen handelt es sich durchweg um fibrill~ire Neurinome (Abb. 2). W~ihrend sechs dieser Tumoren durch einen hohen Differenzierungsgrad gekennzeichnet sind (Abb. 2a), fallen bei einem Tumor vermehrte Zelldichte, einzelne Mitosen und das Fehlen yon schwannomcharakteristischen Formationen, wie Palisadenbildungen etc., auf (Abb. 2b). Die im Rahmen dieser Untersuchung verwendeten Gliome wurden nach den Angaben von Ztilch (1956) und unter Beriicksichtigung der Gradeinteilung von Miiller und Schr6der (1968) klassifiziert~ Bei den experimentellen Gliomen der Ratte handelt es sich in der Regel um zetlreiche Tumoren, die zahlreiche Mitosen, riesenzelliihnliche Bildungen, Monsterzelten (Abb. 2e) und strassenartige Nekrosen aufweisen. Diese Tumoren entsprechen ~ abgesehen v o n d e r geringen Stromabeteiligung -- der Struktur nach den Glioblastomen des Menschen. Unter den experimentellen Gliomen findet sich auch eine geringe Anzahl von Tumoren, die einen hohen Differenzierungsgrad erreichen und auf Grund cytologischer und arehitektonischer Merkmale als Oligodendro- (Abb. 2c) bzw. Astrocytome (Abb. 2d) erkannt werden k6nnen. Niiheres zur Morphologie experimenteller neurogener Tumoren findet sich bei Wechsler, Kleihues, Matsumoto, Ztilch, Ivankovic, Preussmann und Druckrey (1969) und Stavrou (1971). Sowohl bei den spontanen als auch bei den experimentellen neurogenen Tumoren konnten mit Hilfe der zweidimensionalen Immundiffusion Prgcipitationslinien beobachtet werden (Abb. ld), die auf das Vorkommen des S-100-Proteins bei den Tumorhomogenaten hindeuten. Die wesentlichsten Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen sind in den Tabellen 2-5 sowie in den Abb. 3-5 zusammengestellt. Bezogen auf die Gewichtseinheit Frischgewicht (FG), vergr6sserten sich DNAKonzentration, DNase II-Aktivit~it und Q in den experimentellen Neurinomen der Ratte gegentiber normalem Vergleichsgewebe um den Faktor 3,3, 4,0 bzw. 3,7. Bei g!eicher Bezugsbasis ergaben DNase 1- uncl DNase I-lnhibitor-Aktivitgt sowie die RNA-Konzentration keine signifikanten Unterschiede (Tab. 2, Abb. 3 und 4). Die Gewebsproben von Neurinomen des Menschen mit hohem Differenzierungsgrad (Abb. 2a) waren hinsichtlich ihrer DNA- und RNA-Konzentration sowie ihrer DNase I-Aktivit~it nicht signifikant von normalem Nervengewebe der Ratte abgrenzbar. Die DNase II-Aktivit~it lag rd. 50}~ unter den entsprechenden Werten von Nervengewebe der Ratte. Die Variationskoeffizienten des Neurinomgewebes waren durchweg h6her. Auch unter Beriieksichtigung der grossen Schwankungsbreite von Neurinomgewebe l~isst die Gewebsprobe eines Neurinoms des Menschen mit morphologischen Malignit~itsmerkmalen (Abb. 2b) eine um den Faktor 3 h6here DNase II-Aktivitfit erkennen.

341

DESOXYRIBONUCLEASEN BEI NEUROGENEN TUMOREN TABELLE2

DNA, RNA, DNASEN UND AKTIVITATSVERHALTNIS(DNASE II: DNASE 1=Q) tN NEURINOMPROBENVERSCHIEDENER SPECIES. Konzentrationsgaben in mg/g FG, Aktivit~.tsangaben in #g freigesetzten DNA-P/min/g FG. Species/Material

n

DNA

RNA

DNase ll

DNase I

Q

6

2,35 -+ 1,20 1,05

1,44 +_1.41 2,19

6.86 +_2,37 17,23

3,39 -+2,37 1,17

2.13 +_1.06 13,0

12,78 +_3,83

3,08 +_0,74

4,14 +_0,43

6,59 3,35 +1,81

1,06 216,36 -+7,07

A. Mensch

1. PNS-Tumoren (a) Schwannom I (b) Schwannom I-II

1

B. Ratte

1. N. ischiadicus

10

1,48 -+0,54

2,21 -+0,15

2. PNS-Tumoren (a) Schwannom I (b) Schwannom II

1 15

5,25 4,82 +_2,36

4,10 3,16 -+1,34

7,61 52,27 -+18,00

TABELLE 3 DNA, RNA, DNASEN UND AKTIVIT,~TSVERH~,LTNIS(DNAsE n: ONASE I = Q) IN OLIGODENDROGLIOMPROBEN VON MENSCHUND RATTE Konzentrations- und Aktivit~itsangaben wie in Tab. 2. Species~Material

n

DNA

RNA

DNase H

DNase I

Q

A. Mensch

1. Grosshirn

3

0,87 -+0,27

1,10 -+0,38

2,73 -+ 1,53

1,93 -+ 1,05

1,17 -+0,25

2. Oligodendrogliom I

2

1,05

1,44

4,10 .4__2,00

2,85 -+0,60

1,30 -+0,30

3. Oligodendrogliom II

1

2,70

14,27

4,57

3,21

10

1,34 -+0,24

2,23 -+0,16

7,52 -+ 1,88

3,15 -+0,50

2,31 0,35

3

4,91 +0,50

+3,00 +_1.00

55,98 +7,00

4,59 -+1,33

12,61 -+3,23

B. Ratte

1. Grosshirn

2. Oligodendrogliom II

Da sich die Aktivit~it der DNase I gleichzeitig verminderte, ergibt sich ein rd. 6fach h6herer Wert f/Jr das Aktivit~itsverh~iltnis beider DNasen (Tab. 2). Zwischen normalem Hirngewebe des Menschen und 20ligodendrogliomen mit hohem Differenzierungsgrad bestanden hinsichtlich DNA- und RNA-Konzentration sowie der Werte ffir Q keine signifikanten Unterschiede (Tab. 3). Die Aktivit~iten beider DNasen waren erh6ht. Demgegenfiber hatten sich DNA-Konzentration, DNase II-Aktivit~it, DNase I-Aktivit~it und Q - - verglichen mit Normalgewebe - - bei 1 Oligodendrogliom II, um den Faktor 3, 5, 2,25 bzw. 3 vergr6ssert.

342

K. TEMPEL, D. STAVROU, W. WEIDENBACH

TABELLE 4 D N A , R N A , DNASEN UND AKTJVIT~,TSVERn~.LT~ISfDNAsE H: DNASE ~= Q)IN ASTROCWVOMPROaENYON MENSCH U N D RATTE

Konzentrations- und Aktivit~itsangabenwie in Tab. 2 Species~Material

n

DNA

RNA

DNase II

DNa~w 1

Q

9

1,24 ± 0,94

I. 11 0.63

5,79 4,20

3,96 3.50

1,53 0,70

10

1.81 ± 0,65

1,49 0,85

8,43 4,90

3.C,5 2.20

2,31 2, I 1

Astrocytom I1

8

2,14 ± 0.79

1,72 0.90

9,00 6,90

3,12 1.5~

3.23 1,98

Astrocytom II-II1

8

2,47 ± 1,25

1,37 0,80

7,58 4,72

2J~ 1,94

4,17 2.55

1

2,47

1,44

9,00

I,~;9

5,64

A. Mensch

Astrocytom I Astrocytom I-II

B. Ratte

Astrocytom I-II

TABELLE 5 D N A , R N A , DNASEN

U N D AKTI VIT,~TSVERH~.LTNIS

(DNAsE n : DNASE I = Q) IN GLIOBLASTO~fPROBENYON

MENSCH U N D RATTLE

Konzentrations- und Aktivit~itsangabenwie in Tab. 2. Species

n

DNA

RNA

DNase II

DNase I

Q

18

2,82 5- 1,35

1,85 1,07

7,85 4,61

1,79 1,11

4,74 2,40

2

1,95

0,20

8,32

1,46

5,70

A. Mensch

Glioblastom

B. Ratte

Glioblastom

Der Richtung nach gleich, dem Umfang nach ausgepr~igter war die Ver~inderung der pleomorphen Oligodendrogliome der Ratte (Tab. 3). In Astrocytomen vergr6ssern sich DNA-Konzentration und Q mit zunehmender Malignit~it weitgehend species-unabh~ingig (Tab. 4). Die Vergr'6sserung von Q beruht vor allem aufdem Aktivit~itsanstieg der DNase II. Mit einem Korrelationskoeffizienten von r=0,34 (n=35, P