1209

原

著

Polymerase

chain

reaction法

を 用 い た 初 尿 沈 渣 か ら の淋 菌 の検 出

1)岐阜 大学 医 学 部泌 尿 器 科 学教 室 ,2)同 4)トヨ タ記 念 病 院 泌尿 器 科

,5)東 京共 済 病 院 泌尿 器 科

米 田

尚 生1)出

口

伊藤

康 久1)斉

藤

昭 弘1)坂

玉木

正 義4)前

田

真 一4)斎

河 田

幸 道1)

Key

words:

隆1)山

本

啓 之2)岩

田

英 樹1)

義 人1)伊

藤

鉦 二3)

功5)江

崎

孝 行2)

藤

(平成4年5月1日

受 付)

(平成4年6月9日

受 理)

PCR,

Neisseria

gonorrhoeae,

要 PCR法

微 生物 学 教 室,3)岐 阜 泌 尿 器科

first-voided

urine

旨

に よ り 男 子 尿 道 炎 患 者 の 初 尿 沈 渣 か ら の 淋 菌 の 検 出 を 試 み た.尿

proteinase

Kで

ribosomal

処 理 後,さ

RNA遺

道 炎 患 者 の初 尿 沈 渣 は

らに フェ ノーノ レ抽 出 を お こ な い,templateDNAと

伝 子 の 一 部 に相 補 的 な2つ

のoligonucleotideをprimerと

し た.淋

菌 の16S

し て 用 い,206bpのDNA

増 幅 の 認 め られ た も の を 陽 性 と し た.尿 道 分 泌 物 ま た は 尿 道 擦 過 物 の 淋 菌 培 養 と初 尿 沈 渣 を 用 い たPCR 法 に よ る 淋 菌 の 検 出結 果 との 比 較 で は,淋 菌 培 養 陽 性21例 中19例 でPCR陽 PCR陰

性 で あ り,45例 中43例95.6%と

高 い 一 致 率 で あ った.PCR法

侵 襲 的 で あ り,同 一 検 体 か らchlamydia

trachomatisを

性 で,培 養 陰 性24例 は 全 て で

に よ る初 尿 沈 渣 か らの 淋 菌 検 出 は 非

含 む 複 数 の 菌 種 の 検 出 が で き るた め 臨 床 上 有 用

で あ る と思 わ れ た.

序

鏡 で5コ

文

男 子 尿 道 炎 は淋 菌 性 と非 淋 ― 菌性尿道炎 に分 け ら れ る.我

々はpolymerase

法1)を応 用 して,男 よ びchlamydia

子 の 尿 道 擦 過 物 か らの 淋 菌 お

trachomatisの 検 出方 法 を 報 告 し

て きた が2)3),さ らにPCRに C.tmchomatisの た4).今 回 はPCRに 出 を 試 み,従

chain reaction(PCR)

よ り初 尿 沈 渣 か ら も

検 出 が 可 能 で あ る こ とを 報 告 し よ る初 尿 沈 渣 か らの 淋 菌 の検

来 の尿 道 分 泌 物 の淋 菌 培 養 法 との 比

象 と し た.尿

物 採 取 後 の 初 尿10mlを2,500rpmで15分 分 離 し,沈

渣 と と も に 尿1mlを

ま で 一70℃

に て 冷 凍 保 存 し た.

2.淋

岐 阜 大 学 関 連 の3施 設 を受 診 し,尿 道 炎 の 臨 床 症 状 と尿 道 分 泌 物 中 の 多 核 白 血 球 が1,000倍 の 検 別 刷 請 求 先:(〒500)岐 阜 市 司 町40 岐 阜 大 学 医学 部 泌 尿器 科

尚生

出

尿 道 分 泌 物 また は尿 道 擦 過 物 を 検 出材 料 と して 良 培 地(BBL

3.淋

菌 の 同 定 を 行 っ た.

菌 検 出 の た め のPCR法

Rossanら5)に

的 な2種

microbiology

て 分 離 培 養 を 行 い,Gonocheck-II

ribosomalRNA遺 米田

間 遠 心

残 し てDNA抽

菌 の 分 離 ・同 定

キ ヅ ト(R)にて,淋

1.対 象 お よび 検 出材 料

方,PCRに

よ る検 出 材 料 と して は 尿 道 分 泌 物 また は尿 道 擦 過

systems)に

材 料 と方 法

を対

道 分 泌 物 ま た は尿 道 擦 過 物 を 検 出 材

料 と し て 淋 菌 の 分 離 同 定 を 行 っ た.一

Thayer-Martin改

較 検 討 を行 った.

平 成4年9月20日

以 上 認 め られ た 男 子 尿 道 炎 患 者45例

よ り 明 ら か に さ れ た 淋 菌 の16S 伝 子 の 塩 基 配 列 の一 部 に相 補

類 のoligonucleotide

NG-AとNG-Bを

1210

米田

primerと

し て 用 い た2).PCRの

条 件 は前 回 報 告 の

初 尿 沈 渣 か ら のC.trachomatis検 条 件 で,変 秒,伸

性95℃,20秒,ア

長72℃,30秒

出方 法 と同 一 ニ ー リ ン グ55℃,20

と し,温

度 サ イ ク ル を40回

動 的 に 繰 り返 し た4).PCR後,2%ア

Fig. 1 Influence of amount of template DNA extracted from first-voided urine sediments on DNA amplification by PCR. M, DNA molecular size marker (2174/Hinf I digest); P1, 5,u1 of DNA extraction from swab, only treated with

ガ ロー ス ゲル

に て 電 気 泳 動 を 行 いethidium 206bpのDNAの

自

尚生 他

bromide染

proteinase K; P2, P, sample diluted x10 ; P3, P1 sample diluted X102; B, and C1, 5/z1 of DNA solution from urine; A,. B2 and C2; 1,u1of DNA solution; A3, B3 and C3, 0.2j1 of DNA solution.

色 にて

増 幅 を 観 察 し た.

4.TemplateDNA量

の検討

尿 道 擦 過 物 の 淋 菌 培 養 で 淋 菌 陽 性 との 診 断 され た 尿 道 炎 患 者 の 尿 沈 渣 と 尿1mlと

の混合液 を前 回

報 告 と 同 様 にNP-40,Tween-20,proteinase て 処 理 し,さ に 溶 解 さ せ,検

出 用DNA溶

う ち5μl,1μl,0.2μl(検 2μl使 plate

Kに

ら に フ ェ ノ ー ル 抽 出 後,蒸

液 を 調 整 し た4).こ の 出 用DNAの10倍

用)をtemplateと DNA量

留 水40μl

希釈液

しPCRを

のPCRに

行 い ,tem-

お け るDNAの

増幅へ の

影 響 を 検 討 し た. 5.PCR法

に よる初 尿 か らの 淋 菌 の検 出

検 出 用DNAを

を 用 い,PCRに

よ るDNAの

と 予 想 され るDNA断

調 整 し,そ

の1μl

増 幅 を 行 い,206bp

片 の増 幅 が 認 め られ た 検 体

を 淋 菌 陽 性 と 判 定 し た.DNA断

片 の 認 め られ な

い 検 体 に つ い て は ,0.2μl(検 倍 希 釈 液 の2μl)使

sampleで

混 合 液 か ら前 述 の 方 法

に 従 っ て40μlの

出 用DNA溶

用)と0.04μl(100倍

4μlを 使 用)を 用 い て,さ

ら にPCRを

液 の10 希釈液 の

行 い ,206bp

片 を 認 め た 場 合 を 淋 菌 陽 性 ,3濃

い てDNA断

度 に お

片 の 増 幅 を認 め な い場 合 を 陰 性 と判

定 し た.

はFig-1に

μlで ぱB、,C、 が,1μlで

績

尿 道 分 泌 物 あ る い は 尿 道 擦 過 物45検

示 す よ う にDNA溶

の よ う にNAの

ら れ た.以

体 の うち

良 培 地 お よ びGonocheck-II

い てPCRを

行 う こ と と した .

臨 床 検 体12例

よ る淋 菌 の 検 出

予 想 さ れ るDNA断

量 の検 討

さ ら に 検 出 用DNA

溶 液 の0.2μl,0.04μlを

用 い てPCRを

6,11は

液0.2μlに

検 出 用DNA溶

に て206bpのDNA断

培 養 法 に て 淋 菌 陽 性 と診 断 され た 患 者 の 尿 道 分 理 に て 抽 出 し たDNA

液1μlを

用 い たPCRで

中3濃

は3例

増

度 の い ず れ か で206bp

のDNA増

plateDNAと

れ の 濃 度 で も増 幅 の 認 め ら れ な か っ た26例

行 っ た 場 合 に はtem-

は45例

にDNAの

溶 液5μl,0.5μl,0.05μl(Fig.1;P1∼P3)をtemし てPCRを

増幅

片 の 増 幅 が 認 め られ

は7例,0-04μlで

幅 が み ら れ た.45例

,

片 の 増 幅 が 認 め ら れ た .7,

に206bpのDNA断

た.0.2μlで

再 検 し,5 て ,4は0。04μl

度 の い ず れ に お い て もDNAの

検 出 用DNA溶 中9例

片の

れ ら は 淋 菌 陽 性 と 判 定 し た.

は認 め られ な か った . DNA

して用

の 検 出 例 を 示 す が ,1,

2,3,8,9は206bpと

体 で あ っ た.

泌 物 か らproteinaseK処

DNAと

尿 沈 渣 か ら のPCRに

Fig.2に

幅 が抑 え

上 よ り初 尿 か ら 抽 出 し た 検 出 用DNA う ち1μlをtemplate

3.初

増 幅 が み られ

比 べ,増

溶 液40μlの

10,12は3濃

よ る 検 出 の た め のtemplate

はA3で

は1μlのB2,C2に

キ ッ トに よ り淋 菌 が 分 離 ・同 定 さ れ た も の は21検

2.PCRに

予 想 さ れ るDNA

増 幅 が 認 め ら れ た 。0.2μlで る,B3,C3で

液 が5

増 幅が抑 制 された

4,5,6,7,10,11,12は

菌 の 分 離 ・同 定

Thayer-Martin改

予 想 さ れ るDNA断

はB2,C2で206bpと

増 幅 が 認 め ら れ,こ 成

1.淋

量 に よ っ て206bpと

片 の 検 出 に 差 を 認 め な か っ た.― 一方 初 尿 か ら の

初 尿 沈 渣 お よ び 尿1mlの

DNA断

plateの

幅 の 認 め ら れ た19例

を 淋 菌 陽 性 ,い

感染 症 学 雑 誌

第66巻

ず

を陰 性 第9号

PCRに

Fig.

2

Agarose

ucts

amplified

M,

molecularsize

P,

positive

clinical tilled

gel

electrophoresis

from

first-voided marker

control

with

samples;

N,

of urine

(•‘

PCR

N.

template し,効

I digest);

gonorrhoeae

negative

prod-

sediments.

174/Hinf

1211

よる初 尿 か らの 淋 菌 の検 出 DNAと

し た4). Template

率 的 なPCR条

plate

DNA量

件 を 模 索 し た が,至

control

with

dis-

DNA溶

用 い てPCRを

行 い,陰

希 釈 し,0.2μlと0.04μlの3濃

験DNA1μlで は3例

度 に てPCRを

は9例,0.2μlで

は,陽

よ るC.

性 と判 定 し た57例

Detection

of N. gonorrhoeae

from

first-

by PCR and from ureth-

ral swab by culture

再 中被

は7例,0.04μlで 回報 告 した 初 尿 か

trachomatis検

出 の 場 合 に

中 被 験DNA溶

48例 が 検 出 で き た が,淋

urine sediments

ず 被 験 性例 では

よ る 淋 菌 陽 性19例

で 陽 性 と 判 定 さ れ た.前

ら のPCRに

1

適tem-

の 決 定 は 困 難 で あ り,ま

液1μlを

検 す る こ と と し た. PCRに

voided

減量

; 1•`12,

water.

Table

DNAを

液1μlで

菌 の 場 合 は1μlで

の検 出

率 が 低 く,淋

菌 患 者 の場 合 に は 炎 症 反 応 が 強 い こ

と が 多 く,白

血 球 や そ の 他 の 抑 制 因 子 が 多 く混 入

す る 可 能 性 が あ り, PCRの

抑 制 が か か る た め と考

え ら れ た. 3濃 度 のDNAをtemplateと

して用 い る こ と

に よ り尿 道 分 泌 物 の 淋 菌 培 養 法 の 成 績 と よ く 相 関 した.尿

道 分 泌 物 の 淋 菌 培 養 法 との 比 較 で は培 養

法 陽 性21例 Coincidence

rate:

95.6%(43/45;

で 初 尿 のPCR陽

性 で あ り,培

養 法 陰 性24例 全 て で 初 尿 のPCR陰

性 で あ っ た.

培 養 法 陽 性 で 初 尿 のPCR陰 PCRの

道 分 泌 物 か らの 淋 菌 培 養 法 と初 尿 沈 渣 か

ら のPCRに

尿 道 分 泌 物 また は尿 道 擦 過 物 を 用 い た 淋 菌 培 養 法 と初 尿 で のPCR法 例21例 90.5%で PCRに

と の 比 較 で は,培

中 初 尿 で のPCRに あ り,培

養 法陽 性

よ る 淋 菌 陽 性 例 は19例

養 法 陰 性 例24例

全 てで初尿で の

よ る淋 菌 の 検 出 は 陰 性 で あ り,全 体 の 一 致

率 は45例 中43例95.6%で

あ っ た(Table 考

我 々 はPCR法

報 告 し,さ

1).

察 子 の尿道 擦過 物

trachomatisの

ら に 初 尿 沈 渣 か ら のC.

検 出 方法 を trachomatisの

検 出 も 可 能 で あ る こ と を 報 告 し た.そ 淋 菌 に つ い て も 同 様 にPCRで 出 が 可 能 と 考 え,検 proteinase

Kで

初 尿 沈 渣 か らの 検

討 を 行 っ た.尿

沈 渣 は

処 理 し た だ け で はPCRの

反 応が

抑 制 さ れ る た め,さ DNA以

ら に フ ェ ノ ー ル 抽 出 を 加 え,

外 の 成 分 を 除 去 し,DNAを

平 成4年9月20日

こで 今 回 は

純 化 さ せ,

認 め ら れ,

満 足 で き る 結 果 で あ っ た. で は 生 物 学 的 に 安 定 なDNAを

あ り,集

時 間 検 体 の保 存 が 可 能 で

中 的 検 出 が 可 能 で あ り,同

菌, C. trachomatisだ あ れ ば,他 の 点 もPCR法

一 検 体 か ら淋

け で な く特 異 的 なprimerが

の 病 原 体 の 検 出 も 可 能 で あ る.こ

し,さ

れ ら

の 利 点 と考 え ら れ る.

現 時 点 で は 初 尿 の 沈 渣 をproteinase

DNAと

を 応 用 し て,男

か ら の 淋 菌 お よ びC.

さ ら にPCR法

検 出 材 料 と し て お り,長

よ る淋 菌 の検 出 結 果 の比 較

性 は2例

偽 陰 性 と 考 え ら れ た が,全 体 の 一 致 率 は45

例 中43例95.6%と

と判 定 し た. 4.尿

中19例

Kで

処 理

ら に フ ェ ノ ー ル 抽 出 し, PCRのtemplate し て お り,ま たPCRに

認 め ら れ な い 場 合 に は3濃

てDNAの

増幅 の

度 のtemplateに

て再

検 を 必 要 とす る こ と な ど操 作 が 煩 雑 で あ り,よ

り

簡 便 な 方 法 へ の 改 善 が 必 要 と考 え て い る.し か し, 今 回 の 検 討 か らPCR法

に よ り初 尿 か ら の 淋 菌 の

検 出 は 可 能 で あ り,尿

道 分 泌 物 の 培 養 法 との 比 較

で も 十 分 満 足 の い く結 果 で あ っ た.ま 尿 か ら のC. か ら のPCR法

trachmatisの

た 前 回 の初

検 出 と あ わ せ て,初

尿

を用 い た 病 原 体 の 検 出 は 検 体 採 取

時 に 患 者 に 苦 痛 を 与 え る こ と な く,淋

菌 性 お よび

1212

米田

尚生 他

ク ラ ミジ ア性 尿 道 炎 の有 用 な 診 断 方 法 と な る もの

河 田 幸 道:

と期 待 され る.

男 子 尿 道 炎 患 者 の 尿 道 擦 過 材 料 か ら の

文 1) Saiki,

R. K., Golfando,

S. J., Higuchi, Erlich,

polymerase. 2)

出 口 英 樹,

隆,

Primer

Polymerase

Science,

正 義,

directed

斉 藤 chain

隆,

reaction法

山 本 啓 之,

前 田 真 一,

義 人,

江 崎 孝 行,

玉 木 正 義,

V.:

河 田 幸 道:

RNA

印刷 中

伊 藤康 久 , 玉 木 小 野 一 徳, 斉 藤 功, 江 崎 孝 行,

による

検 出. 感 染 症 誌,

65:

山 本 啓 之 , 岩 田 英 樹,

伊藤

義 人, 玉 木 正 義, 前 田 真 一, 河 田 幸 道:

Polymerase

を 用 い た 初 尿 沈 渣 か ら の

trachomatisの

検 出 . 感 染 症 誌, 印 刷 中

R., Heyndrickz

Nucleotide gene

from

cleic Acids Res., 6)

隆,

江 崎 孝 行,

reaction法

5) Rossan,

に よ る男 子尿 道 炎

感 染 症 誌,

岩 田 英 樹,

功,

chain Chlamydia

岩 田

出口

斉 藤 昭 弘, 坂

斉 藤

DNA

reaction法

1991.

米 田 尚 生, 康 久,

1988.

多 田 晃 司 , 米 田 尚 生,

功,

4)

ezymatic

239: 487-491,

山 本 啓 之,

患 者 か ら の 淋 菌 の 検 出. 出口

S., Scharf , K. B. &

Mullis,

of DNA with a thermostable

伊 藤 康 久, 斉 藤 昭 弘, 坂

前 田 真 一,

3)

G.T.,

chain

trachomatisの

1555-1559,

D. E., Stoffel,

R., Eorn,

H. A.:

amplificaion

Chlamydia

献

Polymerase

黒 木 俊 郎, 金 次 郎:

, L. & Heuverscoyn, H. sequence of a 16S ribosomal Neisseria

gonorrhoeae

渡 辺 祐 子,

山井 志朗 , 小 原

酵 素 抗 体 法(Gonozyme)に

原 の 検 出.

. Nu-

16: 6227, 1988.

感 染 症 誌,

59:

寧,

滝沢

よる リン菌 抗

1236-1240

, 1985.

Detection of Neisseria gonorrhoeae in First-Voided Urine Sediments from Male Urethritis Patients by Polymerase Chain Reaction Hisao KOMEDA1),Takashi DEGUCHI1),Hiroyuki YAMAMOTO2) , Hideki IWATA1), Yasuhisa ITO1),Akihiro SAITO1),Yoshihito BAN1), Shouji ITO3), Masayoshi TAMAKI4),Shinichi MAEDA4),Isao SAITO4), Takayuki EZAKI2)& Yukimichi KAWADA1) 1)Department of Urologyand 2)Department of Microbiology , GifuUniversitySchoolof Medicine,3)Gifu Clinicof Urology,4)Department of Urology,ToyotaMemorialHospital,5)Departmentof Urology,TokyoKyosaiHospital Neisseria gonorrhoeae was detected from first-voided urine sediments of male patients with urethritis by polymerase chain reaction (PCR). Urine and urinary sediment were treated with proteinase K, and DNA was further purified by phenol extraction. Two oligonucleotides based on sequences within a ribosomal RNA gene from N. gonorrhoeae were used as primers for the PCR . A

DNA fragment of 206 bp specific for N. gonorrhoeae was amplified by PCR and detected by agarose gel electophoresis. In 19 specimens of urine sediments collected from 21 patients in whom N . gonorrhoeae was isolated from urethral swab by culture, 206 bp DNA fragment was amplified by PCR. In all specimens of urine sediments from 24 patients in whom cultures for N . gonorrhoeae were negative, no DNA was amplified by the PCR. The overall coincidence rate between the PCR for detecting N . gonorrhoeae in first-voided urine sediments and culture in urethral swab was 95.6% (43/45). PCR procedure for detection of pathogens from first-voided urine sediments would be noninvasive and would be applied for the diagnosis of gonococal urethritis and chlamydial urethritis .

感染 症 学 雑 誌

第66巻

第9号