Z LebensmUnters Forsch (1992) 195:312-315

Zeitschrift f~r

9 Springer-Verlag 1992

Originalarbeit Bestimmung der wasserliislichen Vitamine B1, B2, B6 und B12 in Milch durch HPLC Roland Gauch, Urs Leuenberger und Urs MiiHer Kantonales Laboratorium, Muesmattstrasse 19, CH-3012 Bern, Schweiz Eingegangen am 20. Mai 1992

Determination of the water-soluble vitamins B1, B2, B 6 and B12 in milk by HPLC Summary. Simple methods of determining the water-soluble vitamins Bx, B2, B6 and B~z in milk by HPLC are described. Compared to existing procedures, the following improvements can be realized. The oxidation of vitamin B 1 to thiochrome is stopped by the addition of sodium sulphite. This step significantly increases repeatability. Thiochrome is then extracted with butan-l-ol, which results in fewer co-extracts and greater selectivity. After the hydrolysis of the 5-phosphates of the vitamin B 6 (pyridoxine, pyridoxal and pyridoxamine), these three vitamers are determined by isocratic HPLC as DDS-ionpairs and with fluorimetric detection. As only microbiological methods have so far been used for the determination of minute quantities of vitamin B~2 in milk, a new HPLC procedure is proposed with a detection limit of 0.2 gg vitamin B12/L milk. Zusammenfassung. Es werden einfache HPLC-Methoden beschrieben, die es erlauben, die wasserl6slichen Vitamine Ba, B2, B 6 und B12 in der Milch zu bestimmen. Dabei wurden gegeniiber bestehenden Methoden folgende Verbesserungen erzielt: Bei der Bestimmung von Vitamin B wird die nicht st6chiometrisch verlaufende Oxydation zu Thiochrom durch Zugabe yon Natriumsulfit gestoppt, was zu einer deutlichen Verbesserung der Reproduzierbarkeit ffihrt. Das Oxydationsprodukt Thiochrom wird zudem mit 1-Butanol ausgeschiittelt; dadurch werden st6rende Begleitstoffe abgetrennt und die Selektivit/it erh6ht. Vitamin B 6 (Pyridoxin, Pyridoxal, Pyridoxamin und deren 5-Phosphate): Nach Spaltung der Phosphate werden die 3 Komponenten isokratisch als DDS-Ionenpaare mit HPLC und fluorimetrischer Detektion bestimmt. Vitamin B~2: Da geringe Konzentrationen in Milch bis jetzt nur mikrobiologisch bestimmt werden konnten, wird eine neue HPLC-Methode beschrieben, welche eine Nachweisgrenze von 0,2 gg Vitamin Blz/L Milch aufweist. Correspondence to: U. Leuenberger

1 Einleitung Die Analytik der amtlichen Lebensmittelkontrolle hat sich bezfiglich der Untersuchungsmethoden im wesentlichen auf amtliche Methoden zu stfitzen. Nach diesen Methodensammlungen, wie zum Beispiel dem Schweizerischen Lebensmittelbuch [1], werden einige Vitamine ausschliel31ich mikrobiologisch oder photometrisch/fluorimetrisch bestimmt. So beruht die quantitative Bestimmung von Vitamin B1 auf einem fluorimetrischen Verfahren, jene von Pyridoxal, Pyridoxamin und Vitamin B12 auf mikrobiologischen Methoden. Um die Erfassung aller Vitamine der Gruppe B auch nicht-mikrobiologisch ausgerichteten Untersuchungslaboratorien zu erleichtern, wird nachstehend die Analytik mit Hilfe von HPLC am Beispiel Milch beschrieben. Die Analyse von Thiamin geschieht iiblicherweise fiber das fluorescierende Oxidationsprodukt Thiochrom, welches empfindlich und selektiv nachgewiesen werden kann. Die nicht st6chiometrisch verlaufende Oxidation kann vor [2, 3] oder nach [4] der Chromatographic durchgeffihrt werden. Ersteres erfordert einen kleineren technischen Aufwand, weshalb diesem Prinzip der Vorzug gegeben wurde. Die Oxidation wird neu durch Zugabe yon Natriumsulfit gestoppt, was zu einer deutlichen Verbesserung der Reproduzierbarkeit fiihrt. Das Oxidationsprodukt Thiochrom wird zudem mit 1-Butanol ausgeschiittelt: Dadurch werden st6rende Begleitstoffe abgetrennt und insgesamt die Selektivit/it erh6ht. Vor dem Oxidationsschritt wird ein Teil des entfetteten Hydrolysates abgezweigt und der Bestimmung von Riboflavin zugeffihrt. Die Vitamine B 6, Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxamin liegen in Lebensmitteln teilweise als Phosphate und Glucoside vor. W/ihrend verschiedene Autoren [5-7] diese Substanzen ohne Spaltung einzeln erfassen, geben wir der Erfassung der drei hydrolysierten Vitameren, wie auch bei [8], den Vorzug. Deshalb wurde versucht, eine einfache isokratische HPLC-Methode zu entwickeln, die es gestattet, nach Hydrolyse der entfetteten Milchprobe Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxamin als Ionenpaare fluorimetrisch mit HPLC zu bestimmen.

313 V i t a m i n B12 k a n n m i k r o b i o l o g i s c h [I] o d e r c h r o m a t o g r a p h i s c h [9, 10] u n t e r s u c h t w e r d e n . D i e hier e r s t m a l s vorgestellte A n a l y t i k zur B e s t i m m u n g y o n V i t a m i n B I / in M i l c h b e r u h t , n a c h E n t f e r n u n g v o n F e t t u n d EiweiB, auf der Umwandlung der verschiedenen CobalaminK o m p l e x e z u m C y a n o c o b a l a m i n , einer F e s t p h a s e n e x traktion und anschliegender HPLC. Ein/ihnliches Vorgehen fiir eine synthetische T r o c k e n n a h r u n g w u r d e v o n Iwase [11] beschrieben, w o b e i lediglich d e r C y a n o k o m plex b e r i i c k s i c h t i g t wird, d e r in M i l c h n i c h t v o r k o m m t .

hydrochlorid L6sungen herstellen mit 0,5 mg pro ml Methanol. - Standardl6sung: Ein Aliquot der Stamml6sung mit Wasser auf eine Konzentration von 0,5 gg der 3 Substanzen/ml verdiinnen. Vitamin B12: Stamml6sung: 0,5 mg Cyanocobalamin pro ml abSolutem Ethanol. - Standardl6sung: Ein Aliquot der Stamml6sung mit Methanol/Wasser (3 + 7) auf eine Konzentration von 5 gg Cyanocobalamin/ml verdfinnen.

3 Ausfiihrung

2 Material und Reagentien

3.1 Vitamin B 1

2.1 Gerdte

Fetthaltige Milch 20 rain bei 2 000 U/min und 10 ~ zentrifugieren. 5,0 ml Magermilch in 25 ml MeBkolben pipettieren und mit Wasser bis zur Marke erg/inzen. Je 15 mg Trypsin und Clara-Diastase zusetzen, intensiv schfitteln und 30 rain im Wasserbad bei 40 ~ hydrolysieren. Nach Abkfihlen ca. 5 ml der Zwischenphase feinfiltrieren. Filtrat = Hydrolysat. - Oxydation, Isolierung: Alle Reaktionszeiten sind genau einzuhalten! Gleichzeitig sollen nur 8 Ans/itze oxydiert werden (2 Vergleiche und 6 Hydrolysate): 1,0 ml Hydrolysat resp. Standardl6sung als Vergleich in 10-ml-Schliff-Reagensglaspipettieren. Im Abstand von 15 s jedem Ansatz (rnit Eppendorf-Pipettor) 1,0 ml Kaliumferricyanid-L6sung zusetzen und sofort 5-8 s mit Vortex mischen. Nach genau 2minfitiger Reaktionszeit im Abstand von 15 s jedem Ansatz 0,1 ml Natriumsulfitl6sung zugeben und sofort gut mischen. Nach Zugabe von 0,3 g Natriumchlorid mit 2,0 ml 1-Butanol versetzen, ca. 20 s mit Vortex schfitteln und anschlieBend ca. 2 min mit Tischzentrifuge zentrifugieren. Die 1-Butanol-Phase in 2,5-ml-Gewindeflfischchen transferieren = Vitamin-B 1-Probel6sung. - HPLC: S/iule: Nucleosil-Phenyl, 7 pm, 15 cm. Elutionsmittel: Methanol/Acetonitril/Isobutanol/Wasser (800ml+100ml+ 100 ml + 50 ml), Durchflul3 0,7 ml/min. Detektion: Fluorescenzdetektor Excitation 375 nm, Emission 430 nm. Injektion: 25 gl Vitamin-B 1-Probel6sung oder 25 gl Vitamin-B 1- Standard-L6sung enthaltend 1,25 ng Vitamin B~, was einer Konzentration yon 500 gg Vitamin B~/L Magermilch entspricht.

HPLC-Ausrtistung mit Fluorescenzdetektor LC-240 (Perkin-E1mer, Ueberlingen, BRD) oder mit Spectroflow 783 (Kratos) mit Wolframlampe, Ultraschallbad, Silikon61bad mit Thermostat TCU 2 (Systag), Kiihlzentrifuge (Heraeus), Reagensglas-Schiittler Vortex Genie (Bender und Hobein), Rotationsverdampfer (Biichi), Wasserbad, pH-Meter, Tischzentrifuge (Hettich), Absaugeinheit Visiprep Vacuum Manifold (Supelco), Eppendorf-Pipettor, Adapter zu Chromabond (Macherey-Nagel Art. 730100), Trichtersfiule zu Chromabond, 30 ml (Macherey-Nagel Art. 730103).

2.2 Chemikalien Acetonitril LiChrosolv (Merck Art. 14291), Methanol LiChrosolv (Merck Art. 6007), l-Butanol (Merck Art. 1990), Isobutanol (Merck Art. 984), Ethanol abs. (Merck Art. 983), Salzs/iure 25% (Merck Art. 316), Kaliumcyanid (Merck Art. 4967), n-Dodecylsulfat Na-salz (Merck Art. 13760), Schwefels/iure 95-97% (Merck Art. 731), Kaliumhexacyanoferrat III (Kaliumferricyanid) (Merck Art. 4973), Natriumhydroxid-P1/itzchen (Merck Art. 6498), Natriumsulfit (Merck Art. 6657), Trypsin (Merck Art. 24579), Clara-Diastase (Fluka Art. 27540), Riboflavin (Merck Art. 7609), Thiaminchloridhydrochlorid (Merck Art. 8181), Pyridoxolhydrochlorid=Pyridoxin (Merck Art. 7527), Pyridoxalhydrochlorid (Merck Art. 7523), Pyridoxamindihydrochlorid (Merck Art. 7524), Vitamin B a2 = Cyanocobalamin (Merck Art. 24592), Feinfilter hydrophil 0,45 gin (Macherey-Nagel Art. 718004), Kaliumdihydrogenphosphat (Merck Art. 4873), Chromabond C18ec 1000 mg (Macherey-Nagel Art. 730015), Natriumchlorid (Merck Art. 6404), Eisessig (Merck Art. 63). Kaliumcyanidl6sung: 2 g Kaliumcyanid in 10 ml Wasser. 2,5 mol-Schwefels/iure. Phosphat-Puffer: 2 g Kaliumdihydrogenphosphat in 1 L Wasser 16sen und mit 1 mol-Natronlauge auf pH 5,5 einstellen. Kaliumferricyanid-L6sung: 1,0 g Kaliumferricyanid und 15 g Natriumhydroxid-P1/itzchen in 100 ml Wasser 16sen. Natriumsulfit-L6sung: 1 g Natriumsulfit in 10 ml Wasser 16sen.

3.2 Vitamin B z Aus fetthaltiger Milch wird wie unter 3.1 beschrieben Magermilch gewonnen, hydrolysiert und feinfiltriert. - HPLC: S/iule: Nucleosil100, C18, 5 gm, 15 cm. Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser/Phosphatpuffer 0,2% pH 5,5 (125 m1+785 ml+90 ml), DurchfluB: 1,3 ml/min. Detektion: Fluorescenzdetektor Excitation 455 rim, Emission 525 nm. Injektion: 25 gl Hydrolysat oder 25 gl Standard enthaltend 5 ng Vitamin Bz, was einer Konzentration von 1,0 mg/L Magermilch entspricht.

3.3 Vitamin B 6 2.3 Vergleichsl6sungen Vitamin BI:

Stamml6sung: 5,0 mg Thiaminchlorid-hydrochlorid pro ml Methanol/Wasser (1 +1). Standardl6sung: Ein Aliquot der Stamml6sung mit Wasser auf eine Konzentration von 0,1 gg Thiaminchlorid-hydrochlorid/ml verdiinnen. Vitamin B2: Stamml6sung: 25,0 mg Riboflavin in 1-L-Mel3kolben mit ca. 800 ml Wasser und 1,2 ml Eisessig versetzen, im Ultraschallbad 16sen und mit Wasser zu 1 L erg/inzen. - Standardl6sung: Ein Aliquot der Stamml6sung mit Wasser auf eine Konzentration von 0,2 gg Riboflavin/ml verdiinnen. Vitamin B6: Stamml6sung: Von den 3 Substanzen Pyridoxinhydrochlorid, Pyridoxalhydrochlorid, Pyridoxamindi-

Hydrolyse: Fetthaltige Milch gem/il3 3.1 entfetten. 5,0 ml Magermilch bzw. 5,0ml Standardl6sung in 10ml Reagensglas mit SchraubverschluB pipettieren. 0,2 ml 2,5 mol-Schwefels/iure zusetzen und auf Vortex schiitteln. In Siliconbad von 100 ~ w/ihrend 45 rain hydrolysieren. In Wasser abkiihlen und 20 min bei 2 000 U/ min und 10 ~ zentrifugieren. Oberstand feinfiltrieren. Filtrat= Probel6sung. - HPLC: S/iule: Nucleosil-120-5 C18, 2 x 10 cm+ 1 cm-Vors/iule (Kartuschen-System von Macherey-Nagel), 25 ~ Eluens A: Acetonitril/Wasser/Natrium-Dodecylsulfat (400 m l + 600 ml + 13 g) mit 2,5 mol-Schwefelsfiure aufpH 3,0 einstellen. Eluens B: Acetonitril/Wasser/Natrium-Dodecylsulfat (700 ml + 300 ml+ 13 g) mit 2,5 mol-Schwefels/iure .auf pH 3,0 einstellen. Pumpensteuerung: 0-6 rain 100% Eluens A 1,0 ml/min; 6-23 min 100% Eluens A 2,0 ml/min; 2357 min 100% Eluens B 2,0 ml/min;

314 27-30 min 100% Eluens A 1,0 ml/min. Detektion: Fluorescenzdetektor Excitation 290 nm, Emission 400 nm. Injektion: 25 gl Probe16sung oder 25 gl Standardl6sung nach Hydrolyse enthaltend je 12,5 ng Pyridoxin, Pyridoxal resp. Pyridoxamin, was einer Konzentration vonje 481 gg/L Magermilch entspricht.

siert. Im Unterschied zu anderen Autoren [12, 14] wird die Oxidation des Thiamins zu Thiochrom nicht mit Phosphors/iure, sondern mit Natriumsulfit gestoppt. Dabei wird das fiberschiissige, dreiwertige Eisen durch Reduktion zum zweiwertigen Ion der Reaktion entzogen. Oberdies bleibt durch diesen Schritt der pH-Wert alkalisch und erlaubt die sofortige Extraktion mit 1-Butanol. Dieses L6sungsmittel ist dem Isobutanol (vgl. [1, 3]) bez/iglich Verteilungskoeffizienten iiberlegen. Der Ersatz von C8- bzw. C18-Material durch eine Phenylphase fiihrt zu deutlich symmetrischeren Peaks im Chromatogramm. Bei einer totalen Laufzeit von 8 min betr/igt die Retentionszeit von Thiamin ca. 4 min; beim Zusatz von 0,5 mg Thiamin/L Milch betdigt die Wiederfindungsrate 95 _ 3% (n--- 6). Die Nachweisgrenze der Methode liegt bei ca. 5 pg Thiamin/L Milch.

3.4 Vitamin B12 Vorsicht: Das Arbeiten mit Kaliumcyanid mu6 im Abzug erfolgen. - 150 ml Voll- oder Magerrnilch in einem 250-ml-Erlenmeyer mit 0,30 ml Kaliumcyanid-L6sungmischen. Mit ca. 5 Tropfen Salzs/iure 25% den pH-Wert auf 5,7-6,3 einstellen und 30 rain bei Zimmertemperatur stehen lassen. W/ihrend 5 min in ein Wasserbad yon 50 ~ stellen und anschlieBend den pH-Wert mit Salzs/iure 25% auf 4,3M,6 einstellen (Casein-Ffillung). Erneut w/ihrend 10 min im Wasserbad yon 50 ~ erw/irmen. Feste Anteile durch Zentrifugieren w/ihrend 25 rain bei 2000 U/min und 10 ~ sedimentieren. Den Uberstand durch Faltenfilter filtrieren. 50 ml Filtrat auf eine dutch Durchsaugen yon 15 ml Methanol und 15 ml Wasser vorbereitete Chromabond-S/iule geben. Mit Hilfe der Absaugeinheit bei einem Unterdruck yon ca. 40 mbar (ca. 1 Tropfen/s) das Filtrat durchsaugen. Mit 15 ml Wasser die S/iule waschen. Den Sfiulen-Auslaufkurz an die Wasserstrahlpumpe anschliel3en. Um restliches Wasser zu entfernen, die S/iule 10 min mit der Tischzentrifuge bei 2 000 U/rain zentrifugieren und nochmals ca. 2 rain an die Wasserstrahlpumpe anschlieBen. Eluieren des Vitamins B12 mit ca. 2,4 ml Methanol in ein 2,5-ml-Gewindefl/ischchen. Das Lfsungsmittel mit Stickstoffim Wasserbad bei ca. 65 ~ entfernen. Zuletzt ca. 0,5 ml absolutes Ethanol zugeben und erneut mit Stickstoff entfernen; dabei werden letzte Wasserspuren entfernt. Den Riickstand mit 0,40 ml HPLCEluens versetzen, ca. 10 s mit Vortex schfitteln und ca. 10 min bei 2000 U/rain zentrifugieren. Oberstand=Probel6sung. - HPLC: S/iule: Nucleosil-100, C18, 5 Ixm, 15 cm (25 ~ Elutionsmittel: Methanol/Wasser (300 ml + 700 ml). Durchflul3:0,90 ml/min. Detektion: UV-Detektor, Wellenl/inge 550 nm. Injektion: 100 gl Probel6sung oder 25 gl Standardl6sung enthaltend 125 ng Vitamin BI z, was einer Konzentration von 10.0 p.g/L Milch entspricht.

4.2 Vitamin B e

Die Bestimmung von Vitamin B2 kann aus dem gleichen Milchansatz gemacht werden wie diejenige von Vitamin B~. Nach einer einfachen Entfettung durch Zentrifugation und einer Hydrolyse mit Trypsin und Clara-Diastase wird wie beschrieben chromatographiert. Bei einer totalen Laufzeit von 10 min betr/igt die Retentionszeit yon Vitamin B 2 ca. 6 rain; beim Zusatz von 4,0 mg Vitamin B2/L Milch betr/igt die Wiederfindungsrate 92 _ 4% (n 4). Die Nachweisgrenze der Methode liegt bei ca. 50 pg Thiamin/L Milch.

4.3 Vitamin

Da fiir die Lebensmittelkontrolle irrelevant ist, ob die Vitamin-B-Gruppe in freier oder konjugierter Form vorliegt, drfingt sich eine differenzierte Bestimmung nicht auf. Aus diesem Grunde werden die drei Vitameren Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxamin nach Hydrolyse bestimmt. Dabei werden die drei Komponenten als Ionenpaare mit dem gleichen Eluens chromatographiert, was eine stabile Basisline ergibt (Abb. 1). Durch die Erh6hung der DurchfluBrate w/ihrend der Chromatographie

4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Vitamin B~

Die enzymatische Spaltung erfolgt gem~iB Angaben von (}ties [13]. Durch die parallele Verarbeitung bekannter Mengen Vitamin B 1 werden Verluste von ca. 10% bei der Oxidation und der Extraktion mit l-Butanol kompen-

Pyridoxal

/~ridoxin

Pyridoxal

)

Pyridoxamin

1_ o

10

J "/rZ o

b

a

20 Min.

J Pyridoxamin

J__

L lO

B6

20 Min.

1 0

Pyridoxamin

Abb. 1. a Je 12,5 ng Pyridoxal, Pyridoxin und Pyridoxamin, entsprechend 481 pg/L Milch; b Milchprobe; c Milchprobe mit Zusatz yon je 200 gg/L 10

20 Min.

315

t Cyanocobo[amin

8

b

Cyanocobolamin

+ 0

5

Min.

10 0

5

Min.

10 0

5

Min.

10

Abb. 2. a 125 lxg Cyanocobalamin, entsprechend 6,25 gg Vitamin Biz/L Milch; b Milch-Probe ohne Cyanid-Zugabe; c Milch-Probe mit Cyanid-Zugabe, enthaltend 4 p,gVitamin B12/L

wird die Retentionszeit von Pyridoxamin verkfirzt. Weitere Milchinhaltsstoffe mit gr613erer Retentionszeit werden nach dem Eluieren von Pyridoxamin in kurzer Zeit ausgewaschen. Wurde zwischen der HPLC-S/iule und dem Fluorescenzdetektor der pH-Wert durch Zudosieren von Natronlauge mit einem Flul3 von 0,15 ml/min alkalisch eingestellt, so konnte die Empfindlichkeit wie folgt verfindert werden: Pyridoxal: + 50%, Pyridoxin: - 20%, Pyridoxamin: - 6 0 % . Praktisch die gleichen Ergebnisse wurden mit 0,02, 0,05 und 0,1 mol-Natronlauge sowie mit 0,02 mol-Natronlauge mit 4 g Sulfit/L erzielt. Bei einer totalen Laufzeit von 30 min (Elution von Inhaltstoffen) betragen die Retentionszeiten von Pyridoxal 5,0, Pyridoxin 5,6 und von Pyridoxamin 22 min; beim Zusatz von je 0,5 gg Substanz/L Milch betr/igt die Wiederfindungsrate 95 _ 3% (n = 5). Geringffigige Verluste von Pyridoxamin bei der Hydrolyse werden durch die Parallelbestimmung bekannter Mengen der Vergleichssubstanzen ausgeglichen. Die Nachweisgrenze der Methode liegt bei ca. 2-8 gg der drei Vitameren/L Milch. Die Gehaltsberechnung von Pyridoxin und Pyridoxal kann fiber die Peakh6he, diejenige von Pyridoxamin besser fiber die Peakfl/iche durchgeffihrt werden.

bedingt ein Trennmaterial verwendet werden, welches mit Hexamethyldisiloxan H M D S ( = endcapped) nachsilanisiert wurde. Versuche, Vitamin Bi2 nach F/illung der Proteine nach Carrez zu bestimmen, waren erfolglos, da Vitamin Bl2 mitgef/illt wurde. Vitamin B~2 konnte auch nach Hydrolyse der Proteine durch Proteasen nicht mehr gefunden werden; es scheint aus dem Hydrolysat nicht am C1 s-Material festgehalten zu werden. Vitamin B12 war unter oxidativen Bedingungen mit dem elektrochemischen Detektor nicht nachweisbar. Die Endbestimmung erfolgt durch H P L C mit Detektion der r6tlichen Farbe des Cyanocobalamins (Abb. 2). Bei einer totalen Laufzeit von 10 min betr/igt die Retentionszeit von Vitamin Bt2 ca. 4 rain; beim Zusatz von 20 ~tg Vitamin B~2/L Milch betr/igt die Wiederfindungsrate 95_+4% (n=8). Bei einem Zusatz von 5 gg/L f/illt sie leicht ab auf ca. 92%. Die Nachweisgrenze der Methode liegt bei 0,24),5 pg Vitamin B12/L Milch.

Dank. Herin H. P. Bfihlersei fiir die zuverl/issigeMithilfe bei den experimentellen Arbeiten bestens gedankt.

Literatur

4.4 Vitamin Bi2 Vitamin B12 liegt in der Milch nicht als Cyanokomplex vor. Aus diesem Grunde mug zur Bestimmung zwingend Cyanid zugesetzt werden, um endogene Komplexe in Cyanocobalamin umzuwandeln. Coenzym Bi2 (Deoxyadenosyl-Komplex) und Vitamin Bi 2b (Hydroxikomplex) werden unter den angegebenen Bedingungen praktisch quantitativ in den Cyano-Komplex - das eigentliche Vitamin Bl2 - umgewandelt. Dabei ist wesentlich, dab der pH 6 + 0,3 betr/igt: Bei pH ca. 10 wird das Coenzym Blz unvollst/indig und Vitamin B12 b gar nicht zum Cyanokomplex umgesetzt. Geringe Verluste bei der Isolierung sind nicht durch den Obergang in die Fettphase, sondern wahrscheinlich durch Adsorption an Proteinen und Mitf/illung bedingt. Ffir die Festphasen-Extraktion mul3 un-

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

SchweizerischesLebensmittelbuch, Bd 2, Kap. 62. EDMZ Bern Finglas PM, Faulks RM (1987) J Micronut Anal 3:251 Bognar A (1981) Z Lebensm Unters Forsch 77:431 Wehling RL, Wetzel DL (1984) J Agric Food Chem 32:1326 M611erJ, Bitsch R (1988) Ernaehr Umsch 35:324 Tadera K, Naka Y (1991) Agric Biol Chem 55:563 Toukairin-Oda T, Sakamoto E, Hirose N, Mori M, Itoh T, Tsuge H (1989) J Nutr Sci Vitaminol 35:171 Bognar A (1985) Z Lebensm Unters Forsch 181:200 Wills RBH, Shaw CG, Day WR (1977) J Chromatogr Sci 15:262 Hudson TS, Subramanian S, Allen RJ (1984) J Assoc OffAnal Chem 67:994 Iwase H (1992)J Chromatogr 590:359 Fernando SM, Murphy PA (1990) J Agric Food Chem 38:163 Oetles S (1991) Z Lebensm Unters Forsch 193:347 Metschies M, Schwedt G (1985) Dtsch Lebensm Rundsch 81:385