T h e o r e t i c a l and A p p l i e d G e n e t i c s 47, 275-283 (1976) 9 by S p r i n g e r - V e r l a g 1976

Spezifische Giemsa-Fiirbung von heterochromatischen Chromosomensegmenten bei Vicia [aba, Allium cepa und Paeonia tenuffolia B. F riebe Institut fiir Angewandte

Genetik

der Freien

Universit~it Berlin

D i f f e r e n t i a l G i e m s a Staining of H e t e r o c h r o m a t i e R e g i o n s in the C h r o m o s o m e s of Vicia faba, Allium cepa and

Paeonia tenuifolia S u m m a r y . H y p o t h e s e s f o r the m e c h a n i s m of d i f f e r e n t i a l G i e m s a s t a i n i n g of e u c h r o m a t i n and h e t e r o c h r o m a t i n a r e d i s c u s s e d . The b a n d i n g - p a t t e r n s of Vicia faba, Allium cepa and Paeonia tenuifo~ia a r e d e s c r i b e d . H e t e r o c h r o m a t i c c h r o m o s o m e s e g m e n t s h a v e b e e n i d e n t i f i e d in m e t a p h a s e c h r o m o s o m e s to c o r r e s p o n d with t h o s e to be found in i n t e r p h a s e n u c l e i . The fact that th e n u m b e r of c h r o m o c e n t e r s is u s u a l l y s m a l l e r than the n u m b e r of G i e m s a bands in the m e t a p h a s e c h r o m o s o m e s is s u p p o s e d to be due to f u s i o n of h e t e r o c h r o m a t i c s e c t i o n s d u r i n g i n t e r p h a s e . Within each s p e c i e s n o n - h o m o l o g o u s c h r o m o s o m e s exhibit s i m i l a r p a t t e r n s . The s i g n i f i c a n c e of t h i s p h e n o m e n o n , which has b e e n c a l l e d " a e q u i l o c a l h e t e r o c h r o m a c y " by H e i t z , i s so f a r unknown. Z u s a m m e n f a s s u n g . Im t h e o r e t i s c h e n Teil w e r d e n die v e r s c h i e d e n e n H y p o t h e s e n fiber den M e c h a n i s m u s d e r u n t e r s c h i e d l i c h e n G i e m s a - F ~ i r b u n g yon E u - und H e t e r o c h r o m a t i n d i s k u t i e r t . Im e x p e r i m e n t e l l e n Tell w i r d das G i e m s a - B a n d e n m u s t e r bei Vicia faba, Allium cepa und Paeonia tenuifolia b e s c h r i e b e n . Sowohl in den s t a r k k o n d e n s i e r t e n M e t a p h a s e - C h r o m o s o m e n a l s auch in den I n t e r p h a s e - K e r n e n kbnnen d i e h e t e r o c h r o m a t i s c h e n C h r o m o s o m e n s e g m e n t e auf G r u n d d e r s t ~ r k e r e n G i e m s a - F ~ i r b u n g v o m E u c h r o m a t i n u n t e r s c h i e d e n w e r d e n . Di e Zahl d e r C h r o m o c e n t r e n i s t jedoch in den m e i s t e n F~illen k l e i n e r a l s d i e d e r G i e m s a - B a n d e n in den M e t a p h a s e - C h r o m o s o m e n , was auf die F u s i o n h e t e r o c h r o m a t i s c h e r C h r o m o s o m e n a b s c h n i t t e in d e r Interphase hinweist. I n n e r h a l b e i n e r A r t z e i g e n auch n i c h t - h o m o l o g e C h r o m o s o m e n ein ~ h n l i c h e s G i e m s a - B a n d e n m u s t e r . D i e s e ftir e i n e A r t c h a r a k t e r i s t i s c h e V e r t e i l u n g yon E u - und H e t e r o c h r o m a t i n w u r d e yon H e i t z (1935) a l s " i i q u i l o k a l e H e t e r o c h r o m a t i e " b e z e i c h n e t . D ie Bedeutung d i e s e r E r s c h e i n u n g ist w e i t g e h e n d unbekannt. 1. E i n l e i t u n g D ie yon G i e m s a 1935 e n t w i c k e l t e A z u r - E o s i n - L 6 s u n g findet s e i t l a n g e m i h r e Anwendung in d e r F ~ r b u n g yon P r o t o z o e n und B l u t a u s s t r i c h e n . D ie s p e z i f i s c h e G i e m s a - F ~ i r b u n g yon h e t e r o c h r o m a t i s c h e n C h r o m o s o m e n s e g m e n t e n w u r d e z u e r s t yon P a r d u e und Gall 1970 im c e n t r o m e r i s c h e n C h r o m a t i n d e r Maus b e o b a c h t e t . D a r auf aufbauend konnten F ~ i r b e t e c h n i k e n e n t w i c k e l t w e t d e n , die e i n e I d e n t i f i z i e r u n g e i n z e l n e r C h r o m o s o m e n auf Gru n d i h r e s G i e m s a - B a n d e n m u s t e r s e r m S g l i c h e n . D a m i t w u r d e e i n e g e n a u e r e A n a l y s e yon c h r o m o s o m a l e n A b e r r a t i o n e n m S g l i c h , was b e s o n d e r s ffir d i e H u m a n c y t o g e n e t i k yon g r o g e r B e d e u t u n g i s t . E i n e w e i t e r e Anwendung l i n d e n die B a n d e n - T e c h n i k e n in d e r Zficht u n g s f o r s c h u n g , so z u m B e i s p i e l bei d e r G e n o m a n a l y s e von Tritieale, wo m a n W e i z e n - und R o g g e n - C h r o m o s o m e n auf Gr u n d c h a r a k t e r i s t i s c h e r G i e m s a - B a n d e n u n t e r s c h e i d e n k a n n . W e i t e r h i n s e i auf d ie g r oBe B e deutung d i e s e r M e t h o d e n b e i t a x o n o m i s c h e n und p h y l o genetischen Untersuchungen hingewiesen. Nach H e i t z 1935 b e z e i c h n e t m a n C h r o m o s o m e n a b s c h n i t t e , d i e in d e r I n t e r p h a s e und in tier m i t o t i s c h e n

und meiotischen Kondensation

Prophase

auf Grund

des Chromatins

der st~rkeren

eine intensivere

als die fibrigen Chromosomenabschnitte heterochromatisch. in homologen

Fakultatives

strukturelles

vom

auf Grund

Euchromatin

in beiden

homologen

werden

kann.

Chromosomensegmente

sich durch folgende Eigenschaften I. DNA-Replikation

oder

der stiirkeren Kondensation

unterschieden

Heterochromatische

als zeigt

einen unterschied-

w~ihrend konstitutives

Heterochromatin

Chromosomen

aufweisen,

Heterochromatin

Chromosomensegmenten

lichen Kondensationsgrad,

F~irbung

lassen

charakterisieren:

findet sp~ter als im Euchro-

matin statt 2. hoher Gehalt an repetitiven DNA-Sequenzen 3. starke unspezifische 4. spezifische

5. nach Applikation vorzugt

Heterochromatische

Mutagenenbe-

beteiligt

F~rbeeigenschaften. Chromosomenabschnitte

transcriptionsinaktiv

ten Major-Gene

auf K~ilte-Behandlung

yon chemischen

an Aberrationen

6. charakteristische

weitgehend

Paarungstendenzen

Reaktionen

(Barigozzi

sind

und enthalten nur sel-

und Di Pasquale

1953).

276

B. F r i e b e : S p e z i f i s c h e G i e m s a - F ~ i r b u n g

G e n e t i s c h e E x p e r i m e n t e ( B a k e r 1958) z e i g e n w e i t e r -

r i n . Mit A u s n a h m e des E o s i n s r e c h n e t m a n die i i b r i -

h i n , dab i n n e r h a l b h e t e r o c h r o m a t i s c h e r C h r o m o s o -

gen F a r b s t o f f k o m p o n e n t e n z u r G r u p p e d e r T h i a z i n e ,

m e n s e g m e n t e kein C r o s s i n g - o v e r s t a t t f i n d e t wodureh

die sich u n t e r e i n a n d e r n u t in d e r Anzahl d e r M e t h y l -

U n t e r s c h i e d e in den K a r t e n a b s t ~ n d e n b e i m V e r g l e i c h

g r u p p e n u n t e r s c h e i d e n . Die T h i a z i n f a r b s t o f f e z e i c h n e n

von R e k o m b i n a t i o n s k a r t e n und c y t o l o g i s c h e n C h r o m o -

sich durch s t a r k ausgepr~igte m e t a c h r o m a t i s c h e E i g e n -

s o m e n k a r t e n h e r v o r g e r u f e n w e r d e n . Auch c y t o l o g i -

s c h a f t e n a u s , das heiBt m i t s t e i g e n d e r F a r b s t o f f k o n -

s c h e n B e o b a c h t u n g e n best~itigen, dab die A u s b i l d u n g

z e n t r a t i o n o d e r Bindung an g e e i g n e t e S u b s t r a t e t r i t t

yon C h i a s m a t a im H e t e r o c h r o m a t i n u n t e r d r i i c k t w i r d

e i n e A b n a h m e des E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t e n und eine

( L i n n e r t 1955; Fox et a l . 1973; M a r k s 1974).

W e l l e n l R n g e n v e r s c h i e b u n g infolge yon hydrophoben

F r e n s t e r (1969) konnte k e i n e s i g n i f i k a n t e n U n t e r -

Stapeleffekten und D i m e r - b z w . P o l y m e r - B i l d u n g auf.

s c h i e d e i m D N A - H i s t o n - V e r h ~ i l t n i s und in d e r H i s t o n -

Die von C o m i n g s (1975a) b e o b a c h t e t e n Wellenl~ingen-

z u s a m m e n s e t z u n g im E u - und H e t e r o c h r o m a t i n f e s t -

v e r s c h i e b u n g e n nach d e r Bindung e i n z e l n e r F a r b s t o f f -

s t e l l e n . Dagegen u n t e r s c h e i d e n sich e u - und h e t e r o -

k o m p o n e n t e n an DNA e r S f f n e n M 6 g l i c h k e i t e n z u r A n -

c h r o m a t i s c h e C h r o m o s o m e n a b s c h n i t t e i m Gehalt an

alyse der molekularen Mechanismen der differentiel-

N i c h t - H i s t o n - P r o t e i n e n , P h o s p h o p r o t e i n e n und P h o s -

l e n G i e m s a - F ~ i r b u n g yon E u - und H e t e r o c h r o m a t i n . C o m i n g s (1975a) konnte auch nach d e r F ~ r b u n g

pholipiden ~ N a c h A r r i g h i u n d H s u (1971a, 1971b)z~ihlt m a n C h r o -

m i t M e t h y l e n b l a u o d e r A z u r A, B und C c h a r a k t e r i -

m o s o m e n s e g m e n t e mit intensiver Giemsa-F~irbung

s t i s c h e C h r o m o m e n - B a n d e n b e o b a c h t e n . Die F~irbung

zum k o n s t i t u t i v e n H e t e r o c h r o m a t i n . Die b e v o r z u g t e

m i t T h i o n i n , das k e i n e M e t h y l g r u p p e enth~ilt, e r g a b n u r

G i e m s a - F ~ r b u n g yon c e n t r o m e r i s c h e m H e t e r o c h r o -

in e i n z e l n e n F~illen ein s c h w a c h e s B a n d e n m u s t e r , was

matin bezeichnet

man

auch als C-Banden,

stark gef~irbte interkalare menabschnitte Neben

und terminale

auch als G-Banden

et al. (1968) entwickelte

Bander~-Technik

eine unterschiedliche

Eu-

urd Heterochromatin.

rochromen

kSnnen

charakteristisehe weitgehende

Nach

im

Banden

tJbereinstimmung

Ganner

lassen

nis und Sanchez Feulgen-, gehend

(Rodman

m i t DNA e i n z u g e h e n v e r m a g .

yon

mit fluo2 . 2 . G i e m s a - T e c h n i k e n bei t i e r i s c h e n und p f l a n z l i c h e n

werden,

et al. 1971).

Objekten Fiir S i u g e r - C h r o m o s o m e n konnten zahlreiche G i e m s a T e c h n i k e n e n t w i c k e l t w e r d e n , die e i n e d i f f e r e n t i e l l e

1970;

Auch

und Tahiliani,

die

1973; Yu-

1974) beschriebenen

und Karmin-Banden

mit den Giemsa-

die eine

et al. 1969; Vosa,

1973; Greilhuber

Alcianblau-

F~irbung

mit den Giemsa-Banden

1971; Evans

yon einigen Autoren

B e s t a n d t e i l d e r G i e m s a - L b s u n g , da es k e i n e Bindung

Chromosomenabschnitten

(Caspersson

und Evans

Fluoreszenz-

der F~rbung

beobachtet

G i e m s a - F ~ i r b u n g yon E u - und H e t e r o c h r o m a t i n e r f o r derlich ist. Eosin Y erwies sich als n ic h twirks a m e r

UV-Fluoreszenz-Mikroskop

und den sp~t replizierenden erkennen

werden. auch die

ermSglicht

yon Caspersson

nigstens einer Methylgruppe zur unterschiedlichen

Chromoso-

bezeichnet

der Giemsa-F~irbung

d a r a u f schlieBen l~Bt, dab das V o r h a n d e n s e i n yon w e -

w~ihrend

sind weit-

undFluoreszenz-Banden

iden-

tisch.

F~irbung yon c e n t r o m e r i s c h e m ( P a r d u e u n d Gall 1970 ; A r r i g h i und Hsu 1971a; Chen und Ruddle 1971 ; S u m n e r 1972; M e r r i c k et a l . 1973; F i s k e s j 6 1974a) und i n t e r k a l a r e m H e t e r o c h r o m a t i n ( E v a n s et a l . 1971; Schnedl 1971; S h i r a i s h i und Yosida 1972; S e a b r i g h t 1972; H a n s e n - M e l a n d e r et a l . 1974) e r m b g l i c h e n . Bei den m e i s t e n C - B a n d e n - T e c h n i k e n w e r d e n luftt r o c k e n e Pr~iparate fiir k u r z e Zeit m i t Alkali b e h a n -

2. T h e o r e t i s c h e B e t r a c h t u n g e n z u r d i f f e r e n t i e l l e n

d e l t . Nach dem Entw~issern in Alkohol w i r d in SSC bei

Giemsa-F~irbun~

60 b i s 65 0 C i n k u b i e r t und a n s c h l i e B e n d mit g e p u f f e r t e r G i e m s a - L b s u n g gefiirbt. E s s i n d a b e r auch C - B a n d e n -

2.1. Zusammensetzung

und Eigenschaften

der Giemsa-

LSsung

h a l t e n ( M c K e n z i e und Lubs 1973 ; McKay 1973 ; M e r r i c k

Die Giemsa-LSsung Methylenblau

T e c h n i k e n b e k a n n t , die k e i n e A l k a l i - B e h a n d l u n g b e i n -

enth~ilt die Farbstoffe

und dessen

Oxidationsprodukte

Eosin Y, Azur

et al. 1973). A,

Kato und Moriwaki (1972) k o n n t e n nach d e r B e h a n d -

B und C. Als LSsungsmittel

dient ein aus gleichen

lung mit den v e r s c h i e d e n s t e n A g e n z i e n ( o r g a n i s c h e

Teilen bestehendes

von Methanol

und a n o r g a n i s c h e S a l z e , P u f f e r , B a s e n , P r o t e i n - D e n a -

Gemisch

und Glyce-

B. F r i e b e : Spezifische Giemsa-F~irbung

277

turierungsmittel, Chelatbildner, Detergenzien) G-Ban-

s a - F ~ i r b u n g von E u - und H e t e r o c h r o m a t i n ist w e i t g e -

den beobachten. Die Vorbehandlungen sind jedoch wie

hend unbekannt. Zur Zeit werden folgende Hypothesen

McKay (1973) und Yunis und S a n c h e z (1973) z e i g e n

diskutiert :

k o n n t e n , z u r u n t e r s c h i e d l i c h e n G i e m s a - F ~ i r b u n g yon E u - und H e t e r o c h r o m a t i n nicht unbedingt e r f o r d e r l i c h . Vosa und M a r c h i (1972) und N a t a r a j a n und N a t a r a jan (1972) b e s c h r e i b e n e r s t m a l s die b e v o r z u g t e G i e m -

D e n a t u r i e r u n g und s p e z i f i s c h e R e n a t u r i e r u n g yon repetitiven DNA-Sequenzen Dutch Hybridisierung mit m a r k i e r t e r Nukleins~ur e gelang es P a r d u e und Gall ( 1 9 7 0 ) , in den C - B a n d e n

s a - F ~ i r b u n g yon p f l a n z l i c h e m H e t e r o c h r o m a t i n . E s folg-

d e r Maus die S a t e l l i t e n - D N A zu l o k a l i s i e r e n , die sich

t e n w e i t e r e A r b e i t e n yon v e r s c h i e d e n e n A u t o r e n an u n -

d u r c h e i n e n b e s o n d e r s hohen Gehalt an r e p e t i t i v e n

t e r s c h i e d l i c h e n O b j e k t e n ( S c h w e i z e r 1973; Stack und

D N A - S e q u e n z e n a u s z e i c h n e t . B r i t t e n und Kohne (1968)

C l a r k e 1973a, 1973b; T a k e h i s a und Utsumi 1973; DSbel

k o n n t e n z e i g e n , dab d i e s e S a t e l l i t e n - D N A u n t e r g e e i g -

et a l . 1973; S a r m a u n d N a t a r a j a n 1973; M e r k e r 1973 ;

n e t e n B e d i n g u n g e n s c h n e l l e r r e n a t u r i e r t a l s die f i b r i -

M a r k s und S e h w e i z e r 1974 ; M a r k s 1974; F i l i o n 1974 ;

ge DNA. Auch fiir a n d e r e h e t e r o c h r o m a t i s c h e C h r o -

F i s k e s j 5 1974b; Stack 1974 ; M e r r i t t und B u r n s 1974 ;

m o s o m e n a b s c h n i t t e konnte e i n h o h e r A n t e i l an r e p e t i -

W e i m a r c k 1974; Gill und K i m b e r 1974a; 1974b; Vosa

tiven DNA-Sequenzen nachgewiesen werden. Versohie-

1974 ; V e r m a und Bees 1974 ; E1-Gadi und E l k i n g t o n

dene A u t o r e n ( A r r i g h i und Hsu 1971a, 1971b; Schnedl

1975 ; D a r v e y und G u s t a f s o n 1975 ; H a d l a c z k y und B e l e a

1971 ; E v a n s et a l . 1971 ) v e r t r e t e n d i e A u f f a s s u n g , dab

1975 ; Singh und Lelley 1975 ; W e i m a r c k 1975).

D e n a t u r i e r u n g und s p e z i f i s c h e R e n a t u r i e r u n g yon r e -

Z w i s c h e n den G i e m s a - T e c h n i k e n b e i P f l a n z e n und

p e t i t i v e n D N A - S e q u e n z e n die u n t e r s c h i e d l i c h e G i e m -

T i e r e n b e s t e h e n n u r geringffigige U n t e r s c h i e d e . Nach

s a - F ~ i r b u n g yon E u - und H e t e r o c h r o m a t i n h e r v o r r u -

der Behandlung mit einem e - m i t o t i s c h e n Agens (Col-

f e n . D i e s e H y p o t h e s e s e t z t v o r a u s , dab die F a r b s t o f f -

ehicin, c~-Monobromnaphthalin, 8-Hydroxyquinolin,

k o m p o n e n t e n d e r G i e m s a - L S s u n g eine b e s o n d e r e Affi-

E i s w a s s e r ) und dem F i x i e r e n ( A l k o h o l / E i s e s s i g )

nitgt gegenfiber r e n a t u r i e r t e r D o p p e l s t r a n g - D N A auf-

folgt in den m e i s t e n F~illen die H y d r o l y s e in Salzs~iure.

weisen.

B e s o n d e r e S c h w i e r i g k e i t e n t r e t e n bei d e r M a c e r i e r u n g

C o m i n g s et a l . (1973) k o n n t e n z e i g e n , dab die DNA

und P r e p a r a t i o n yon p f l a n z l i c h e m Gewebe auf, da die

in c e n t r o m e r i s c h e m H e t e r o c h r o m a t i n in e i n e r k f i r z e -

p e k t i n - und c e l l u l o s e h a l t i g e n Zellw~nde die E i n w i r k u n g s -

r e n Zeit (20 s) r e n a t u r i e r t als die DNA in den C h r o -

mSglichkeit der verschiedenen Agenzien herabsetzen.

m o s o m e n a r m e n (3 b i s 5 m i n ) . W e i t e r h i n konnte j e -

In v i e l e n F~illen ist es e r f o r d e r l i c h , die Zellw~inde

doeh fiir n a t i v e , d e n a t u r i e r t e und r e n a t u r i e r t e DNA s o -

durch geeignete enzymatische Behandlung ( P e k t i n a s e ,

wohl i n t e n s i v e a l s auch s c h w a c h e G i e m s a - F ~ i r b u n g n a e h -

C e l l u l a s e , C y t a s e ) a b z u b a u e n . Anschlief~end w e r d e n

gewiesen werden.

die i s o l i e r t e n m e r i s t e m a t i s c h e n Z e l l e n in 45 g i g e r E s sigs~iure g e q u e t s c h t , wobei zu b e a c h t e n i s t , dab die

C u l l i s und S c h w e i z e r (1974) u n t e r s u e h t e n d e n D N A Gehalt yon v e r s e h i e d e n e n Anemone-Arten und v e r g l i -

C h r o m o s o m e n gentigend a u s g e b r e i t e t und dennoch nicht

chert ihn m i t dem Gehalt an r e p e t i t i v e n D N A - S e q u e n z e n

aus dem M e t a p h a s e - V e r b a n d h e r a u s g e l 6 s t w e r d e n .

und d e r Menge an G i e m s a - p o s i t i v e m H e t e r o c h r o m a t i n .

Naeh d e m A b l S s e n tier D e c k g l ~ s e r ( T r o e k e n e i s m e t h o d e )

E s z e i g t e s i c h , dab d e r Gehalt an r e p e t i t i v e n D N A - S e -

und dem E n t w ~ s s e r n in Alkohol w e r d e n die P r ~ i p a r a t e

q u e n z e n ( z w i s c h e n 53 und 67 P r o z e n t ) w e d e r m i t dem

an d e r Luft g e t r o e k n e t und a n s c h l i e B e n d m i t v e r s c h i e -

D N A - G e h a l t p r o Z e l l e noch m i t d e r Anzahl und GrSBe

d e n e n A g e n z i e n (NaOH, Ba(OH) 2, H a r n s t o f f , R i b o n u -

tier G i e m s a - B a n d e n k o r r e l i e r t i s t .

k l e a s e , T r i c h l o r e s s i g s ~ u r e ) v o r b e h a n d e l t . Danach w i r d

W e i t e r e Einw~inde gegen d i e s e Hypothese e r g a b e n

in g e e i g n e t e n P u f f e r g e m i s c h e n (SSC, M c I l v a i n e - P u f f e r ,

sich d u r c h A r b e i t e n fiber die u n t e r s c h i e d l i c h e F~irbung

S S r e n s e n - P h o s p h a t p u f f e r ) i n k u b i e r t und a n s e h l i e B e n d

yon D o p p e l s t r a n g - und E i n z e l s t r a n g - D N A mit A c r i d i n -

m i t g e p u f f e r t e r G i e m s a - L 6 s u n g gef~irbt.

o r a n g e . S t o c k e r t und L i s a n t i (1972) k o n n t e n mit z u n e h m e n d e r R e n a t u r i e r u n g s d a u e r keine adequate Zu-

2 . 3 . H y p o t h e s e n fiber den M e c h a n i s m u s d e r u n t e r ~

n a h m e in d e r A n z a h l und GrSBe d e r G i e m s a - B a n d e n

s c h i e d l i e h e n G i e m s a - F ~ i r b u n g yon E u - u n d H e t e r o c h r o -

f e s t s t e l l e n . Auch b e w i r k t die N a c h f i x i e r u n g mit F o r m -

matin

aldehyd den V e r l u s t tier d i f f e r e n t i e l l e n G i e m s a - F ~ i r -

Die m o l e k u l a r e G r u n d l a g e d e r u n t e r s e h i e d l i e h e n G i e m -

b u n g , obwohl w e i t e r h i n D e - und R e n a t u r i e r u n g s v o r -

B. F r i e b e : S p e z i f i s c h e G i e m s a - F ~ i r b u n g

278

g~inge b e o b a c h t e t w e r d e n k o n n t e n . D i e s e B e o b a c h t u n -

C a s p e r s s o n et a l . (1969) b e o b a c h t e t e n nach d e r

gen z e i g e n , dab D e - und R e n a t u r i e r u n g s v o r g ~ n g e ,

F~irbung m i t F l u o r o c h r o m e n e i n e s t a r k e U V - F l u o r e s -

wenn i i b e r h a u p t , n u r e i n e n g e r i n g e n EinfluB auf die

zenz in A / T - r e i c h e n D N A - S e q u e n z e n , w~ihrend in DNA-

s p e z i f i s c h e G i e m s a - F ~ r b u n g yon h e t e r o c h r o m a t i s c h e n

S e q u e n z e n mit hohem G / C - G e h a l t e i n e v e r m i n d e r t e

Chromosomensegmenten ausiiben.

U V - F l u o r e s z e n z f e s t g e s t e l l t w e r d e n k o n n t e . Die A r b e i t e n yon C o m i n g s et a l . (1975b) z e i g e n jedoch, dab

Selektive Extraktion Comings

yon DNA

et al. (1973)

C-Banden-Techniken

auch die F l u o r e s z e n z - B a n d e n e h e r d u r c h s p e z i f i s c h e

konnten bei den verschiedenen sowohl

bei der Alkali-Behandlung

als auch bei der Inkubation in SSC tion yon DNA

beobachten

Biochemische zeigen,

(insgesamt

menarmen

extrahiert

sche DNA

weitgehend

Im Gegensatz

vorwiegend

weniger

DNA

extrahiert.

wird, w~hrend

DNA

als Ursache

die centromeri-

gegen Extraktion

geschfitzt

meisten

als 9 Prozent Gegen

der chromosomalen

die selektive Extraktion

der unterschiedlichen

Beobachtung,

dab auch nach der Behandlung

bei dieser Technik DNA

spricht jedoch die

werden

mit Tryp-

konnten,

obwohl

nur eine sehr geringe Extraktionvon

(1,3 Prozent)

zu verzeichnen

Unterschiedlicher

war.

Durch

Phasenkontrast-

McKay

Nach

McKay

mosomalen

Proteinen

Nach

der Behandlung

Agenzien

DNA

und Heterochromatin

proteolytischen

im Bandenmuster

auf Grund

Giemsa-F~rbung yon bestimmten sa-F~rbung

unterscheiden, Proteinen

hinweist.

was

auf den EinfluB

bei der differentiellen Giem-

Nach

Comings

delt es sich dabei vorwiegend

um

et al. (1973) han-

Nicht-Histon-Prote-

ine, da die Histone bei der S~iurefixierung lyse weitgehend

entfernt

(Frenster

den bei verschiedenen ten diese Proteine

im Eu-

terschiedlicher den. Dadurch Anordnung

der

und Heterochromatin

Art und Weise

in un-

sterisch ver~ndert

kSnnte es zu lokalen Anderungen

der Chromatinfibrillen

bildung yon Chromosomen-Banden

Ent-

wie Ca 2+ und Mg 2+, kbnn-

und Heterochromatin

und damit kommen.

auf den Konden-

spezifische Wechselwirkungen Proteinen

und

eine hervorragende Comings

und

wer-

in der zur Aus-

DNA-Se-

Rolle spielen.

Okada

eines Vergleichs

zwischen

repetitiven

(1974)

zwischen

gelangten

dem

Chromomerenmuster somen

meiotischer

zu der Auffassung,

F~rbung

als Ursache anzusehen

und dem

Pachyt~in-Chromo-

dab die st~rkere

sation yon eentromerischem chromatin

auf

G-Bandenmu-

ster mitotischer Metaphase-Chromosomen

Konden-

und interkalarem

der differentiellen

Hetero-

Giemsa-

ist.

Eine weitere Best~itigung findet diese Hypothese yon Merritt und Burns

analysierten.

Sie beobachteten

Effekt dieser Agenzien

zwar

auch in unbehandelten

bei Nicotiana

auf die unterschiedliche

gen, inwieweit

Pr~iparaten

Kon-

konnten aber

diese Unterschiede

feststellen.

Die oben genannten diese Hypothese,

Agenzien

einen steigernden

densation yon Eu- und Heterochromatin, im Phasenkontrast

( 1974 ), die

c-mitotischen

auf die differentielle Giemsa-F~irbung

et al. 1973). Durch beobachteten

Unterschiede

in situ erkl~iren.

der Chromatinfibrillen

den EinfluB von verschiedenen

Behandlungen

Kationen,

den ein-

beobachteten

durch die Arbeiten

Comings

zug yon bivalenten

gibt es

in vivo. Die zwischen

Zusammensetzung

im Eu1969;

und Hydro-

Weiterhin

yon Eu-

lieBen sich dann durch den modifi-

chromosomalen

Grund

Aus-

Kondensation

quantitative als auch quali-

in der

Nieht-Histon-Proteine bestehen

werden.

dafiir, dab sowohl

tative Unterschiede

Chro-

ihrer charakteristischen

die

identisch sind.

Effekt der Vorbehandlungen

k6nnten

Auch

nachzuweisen,

sind die Giemsa-Banden

zelnen Banden-Techniken

quenzen mit verschiedenen

lassen sich eu- und heterochromatische

mosomenabschnitte

Hinweise

und chro-

(1973)

gelang es

ohne Vorbehandlung

Chromosomen-Banden

druck einer unterschiedlichen

zierenden

zwischen

(i974),

mit den Giemsa-Banden

sationsgrad Wechselwirkungen

der Chromatin-

und UV-Mikroskopie

(i973) und Marks

weitgehend

Dabei Spezifische

Kondensationsgrad

fibrillen

und F~rbung

yon

Giemsa-F~r-

und Heterochromatin

beobachtet

ist.

G-Banden-

bung yon Eu-

sin Giemsa-Banden

s e n z u s a m m e n s e t z u n g d e r DNA h e r v o r g e r u f e n w e r d e n .

Befunde

aus den Chromoso-

dazu wird bei den

de im DNA-Gehalt a l s d u r c h U n t e r s c h i e d e in d e r B a -

bis zu 81 Prozent).

und elektronenmikroskopische

dal~ diese DNA

Techniken

eine starke Extrak-

D N A - P r o t e i n - W e c h s e l w i r k u n g e no d e r d u r c h U n t e r s c h i e -

Beobachtungen

sprechen

fiir

jedoch miissen weitere Arbeiten zeisie aufrecht erhalten werden

kann.

B. F riebe : Spezifisehe Giemsa-F~irbung

279

3. B e o b a c h t u n g e n z u r d i f f e r e n t i e l l e n G i e m s a - F i r b u n g

Chromosomen

3 . 1 . M a t e r i a l und M e t h o d e n

denmusters in vier Gruppen einteilen (Abb. la u. b) :

Vicia faba: V e r s c h i e d e n e A u t o r e n ( V o s a und M a r c h i 1972 ; S c h w e i z e r 1973 ; T a k e h i s a und U t s u m i 1973 ; D 6 be l et a l . 1973) u n t e r s u c h t e n das G i e m s a - B a n d e n m u s t e r bei Vicia faba. B e i m V e r g l e i c h d e r v e r s c h i e d e n e n M e t h o d e n z e i g t e s i c h j e d o c h , dab d ie b e o b a c h t e t e n B a n den n u r e i n e g e r i n g e R e p r o d u z i e r b a r k e i t a u f w i e s e n . D i e b e s t e n E r g e b n i s s e konnten m i t d e r i n e i n i g e n P u n k te n a b g e ~ n d e r t e n M e t h o d e von S c h w e i z e r e r z i e l t w e r den: 1. S a m e n yon Vicia faba( ' A c k e r p e r l e ', E r n t e 1975) auf f e u c h t e m P e r l i t a n k e i m e n 2. nach ffinf Tagen P r i m ~ r w u r z e l n a b s c h n e i d e n und ffir z w e i Stunden m i t e i n e r 0 , 0 5 %igen C o l c h i c i n LSsung b e h a n d e l n 3. 3 h f i x i e r e n in : ~ t h a n o l / E i s e s s i g (3 : 1) 4. 15 - 2 0 h in 96 %igen ~ t h a n o l 5. 5 m i n H y d r o l y s e in 0, 2 N HC1 bei 60 ~ 6. 4 h in 10 ~ i g e r P e k t i n a s e - L S s u n g b e i 37 o C 7. 1 bis 3 h in 45 %iger E s s i g s ~ i u r e 8. q u e t s c h e n in 45 %iger E s s i g s ~ u r e 9. D e c k g l a s a b s p r e n g e n ( T r o c k e n e i s m e t h o d e ) 1 0 . 5 m i n in 45 %i g e n :~thanol 11. 5 m i n in 96 %igen 2{thanol 12. l u f t t r o c k n e n ( c a . 7 2 h ) 13. I h i n k u b i e r e n in M c I l v a i n e - P u f f e r pH 7 , 2 bei 65oC 14. 15. 16. 17. 18.

3 m a l 3 m i n w a s c h e n in a q . d e s t . 5 m i n in 45 %igen )kthanol 5 m i n in 96 %i g e n ~ t h a n o l lufttrocknen (ca. 24h) 10 b i s 15 m i n f~irben in 2 %iger G i e m s a - L S s u n g ( M e r c k A r t 9204 verdfinnt m i t S S r e n s e n - P h o s p h a t p u f f e r pH 7 , 2 ) 19. 1 m i n w a s c h e n in a q . d e s t . 20. l u f t t r o c k n e n ( c a . l h ) 21. d i f f e r e n z i e r e n in X y l o l ( c a . 12h) 22. l u f t t r o c k n e n ( c a . l h ) 23. e i n b e t t e n in E u p a r a l M c I l v a i n e - P u f f e r pH 7 , 2 : 2,75 g Z i t r o n e n s ~ i u r e - m o n o h y d r a t + 6 2 , 2 5 g Na~HP04 • 12 H 2 0 / L a q . d e s t . S b r e n s e n - P h o s p h a t p u f f e r pH 7 , 2 : 8 , 6 2 g Na~ HPO4 x 2 H=O + 2 , 4 9 g K H 2 P O 4 / L a q . d e s t . Allium cepa: Z w i e b e l n von A~lium cepa w u r d e n auf f e u c h t e m P e r l i t a n g e k e i m t . Nach f~inf b i s acht Tagen w u r d e n d i e W u r z e l n a b g e s e h n i t t e n und fiir zwei Stunden m i t e i n e r 0 , 0 5 %igen C o l c h i c i n - L 6 s u n g b e h a n d e l t . D i e W e i t e r b e h a n d l u n g e r f o l g t e naeh d e r yon Singh und L e l l e y (1975) m e d i f i z i e r t e n Technik yon Gill und K i m b e r (1974a), die sich durch r e l a t i v e Einfachheit a u s z e i c h net und gut r e p r o d u z i e r b a r e E r g e b n i s s e l i e f e r t , und nach d e r b ei Vicia faba b e s c h r i e b e n e M e t h o d e . Paeonia tenuifolia: Z u r A n a l y s e d e r d i f f e r e n t i e l l e n G i e m s a - F ~ i r b u n g in den m e i o t i s c h e n C h r o m o s o m e n v o n Paeoniatenuifolia w u r d e n d ie P o l l e n m u t t e r z e l l e n aus den A n t h e r e n p r ~ i p a r i e r t . D ie F ~ r b u n g e r f o l g t e nach d e r M e t h o d e yon Singh und L e l l e y ( 1 9 7 5 ) , m it d e r d i e besten E r g e b n i s s e e r z i e l t werden konnten.

lassen sich auf Grund des G i e m s a - B a n -

I. das Satellitenchromosomenpaar mit fiinfscharf voneinander abgegrenzten Banden: eine im centromerischen Chromatin, zwei im S a t - C h r o m o s o m e n a r m

in

der N~ihe des Centromers, eine im Bereich des Nukleolus-Organisators und eine im anderen C h r o m o s o m e n a r m in der Nihe des Centromers, 2. drei C h r o m o s o m e n p a a r e mit einer Bande in der Mitte des langen A r m s , 3. ein C h r o m o s o m e n p a a r mit einer starken und einer schwachen Bande in der Mitte des langen A r m s , 4. ein C h r o m o s o m e n p a a r mit drei Banden im centromer-nahen bis mittleren Abschnitt des langen A r m s . Auch in den weitgehend entspiralisierten ProphaseChromosomen

konnten zahlreiche C h r o m o s o m e n s e g -

mente mit intensiver Giemsa-F~irbung beobachtet werden, deren Zahl mit z u n e h m e n d e m Kondensationsgrad der Chromosomen abnimmt. Die Interphase-Kerne enthalten stark gef~irbte Chromocentren yon unterschiedlicher Anzahl und Gr6Be (Abb.4a). Nach einer geringfiigigen Anderung der oben beschriebenen Technik (bei Punkt 10., II., 15. und 16. start 5 min nur 2 min entw~ssern in Alkohol und Reduzierung der F~irbedauer auf 8 bis I0 rain) weisen vorwiegend die Centromere und das mit d e m NukleolusOrganisator assoziierte Chromatindes Satelliten-Chromosoms

eine intensive Giemsa-F~irbung auf (Abb. Ic).

Die beobachteten Chromosomenabschnitte mit starker Giemsa-F~irbung sind weitgehend mit den von anderen Autoren beschriebenen G i e m s a - B a n d e n identisch. Keine der bisher bekannten Giemsa-Techniken e r m 6 g l i ch t jedoch den N a c h w e i s a l l e r b ei Vicia faba b e o b a c h t e t e n G i e m s a - B a n d e n . D i e U n t e r s c h i e d e z w i s c h e n den v e r s c h i e d e n e n Methoden t r e t e n b e s o n d e r s bei der differentiellen Giemsa-Firbung

im B e r e i c h d es N u k l e o l u s -

O r g a n i s a t o r s und i m c e n t r o m e r i s c h e n C h r o m a t i n h e r v o r . So konnte in D b e r e i n s t i m m u n g m i t V o s a und M a r c h i ( 1 9 7 2 ) , T a k e h i s a und U t s u m i (1973)

sowie

Dbbel et a l . (1973) i m B e r e i c h d es N u k l e o l u s - O r g a n i s a t o r s e i n e s t a r k e Bande b e o b a c h t e t w e r d e n , w ~ h r e n d S c h w e i z e r (1973)

in d i e s e m C h r o m o s o m e n s e g m e n t

3 . 2 . E r g e b n i s s e und D i s k u s s i o n

keine intensive Giemsa-F~irbung feststellen konnte.

vicia faba: Vicia faba b e s i t z t Kinf a k r o c e n t r i s c h e C h r o -

S c h w e i z e r und Dbbel et a l . konnten i m c e n t r o m e r i s c h e n

m o s o m e n p a a r e und ein m e t a e e n t r i s c h e s C h r o m o s o m e n -

C h r o m a t i n yon Vicia faba k e i n e G i e m s a - B a n d e n l o k a -

p a a r , d as den N u k l e o i u s - O r g a n i s a t o r enth~ilt. In a l l e n

l i s i e r e n . Nach d e r oben b e s c h r i e b e n e n Technik w e i s e n

C h r o m o s o m e n konnten c h a r a k t e r i s t i s c h e G i e m s a - B a n -

j e d o c h auch d i e C e n t r o m e r e e i n e i n t e n s i v e G i e m s a -

den b e o b a c h t e t w e r d e n . D i e m i t o t i s c h e n M e t a p h a s e -

F ~ r b u n g a u f . A u c h d i e M e t h o d e yon T a k e h i s a und U t -

B. F r i e b e : Spezifische Giemsa-Farbung

Abb.l. Vi'icia faba; a ) Karyotyp mit C-Banden; b ) mitotische Metaphase mit G-Banden; c ) mitotische Metaphase mit C-Banden

sumi gestattet u. a. eine spezifische Giemsa-Farbung

Trotz zahlreicher Versuche konnten in den meioti-

von centromerischem Chromatin.

schen Chromosomen von Vicia faba keine Giemsa-Ban-

Die meisten Ciemsa-Banaen entsprechen den von

denbeobachtet werden. Die unterschiedliche Giemsa-

Heitz ( 1935) bei Vicia faba beschriebenen heterochro-

Farbung von heterochromatischen Chromosomenseg-

matischen Chromosomensegmenten. Autoradiographi-

menten in d e r Mitosis und Meiosis von Vicia faba deutet

sche Untersuchungen (Evans 1964 ; Lima-de-Faria 1969)

auf eine besondere Struktur d e s Heterochromatins bei

zeigen, da13 Chromosomenabschnitte mit intensiver

d i e s e r Art hin.

Giemsa-Farbung auch eine spate DNA-Replikat ion und

A Z l i w n cepa: Nach Anwendung d e r Methode von Singh

nach d e r Farbung mit Fluorochromen eine charakteri-

und Lelley ( 1975 ) konnten ausschlieRlich in den termina-

stische UV-Fluoreszenz aufweisen ( Caspersson e t a1

len ~ h r o m o s o m e n s e ~ m e n t edne r acht metacentrischen

1969; Vosa 1970).

.

bis submetacentrischen Chromosomenpaare mehr oder

B. F r i e b e : Spezifische Giemsa-Farbung

Abb.2. AlZiwn cepa; a ) mitotische Metaphase mit GBanden; b ) mitotische Metaphase mit G - und C-Banden weniger s t a r k e Giemsa-Banden beobachtet werden ( Abb. 2 a ) . Eine intensive Giemsa-Farbung weisen auch die Chromocentren in den Interphase-Kernen auf ( ~ b b 4b). . Auch nach d e r bei v i d a faba beschriebenen Methode konnten zunachst nur in den terminalen Chromosomenabschnitten Giemsa-Banden beobachtet werden. Nach d e r Modifizierung d i e s e r Technik (5. 5 min Hydrolyse in 0 , 1 N HC1 bei 60° C ; 6. keine Pektinase-Behandlung; 10.

, 11. ,

15. und 16. 2 min entwassern in

96 % igen ~ t h a n o l ;12. ca. 14 Tage lufttrocknen; 18. 10 min farben in 2 %iger~ i e m s a - L o s u n g ) zeigen jedoch neben den telornerischen Chromosomenabschnitten auch

; a ) meiotische Metaphase Abb.3. Paeonia tenuifo~ia I ; b ) meiotische Amphase I ; c ) mitotische Anaphase

Abb.4. Interphase-Kerne mit Chromocentren; a ) Vi'ida faba ; b ) AZZiwn cepa ; c ) Paeonia tenuifoZia

282

B. F r i e b e : S p e z i f i s c h e G i e m s a - F ~ r b u n g

die C e n t r o m e r e e i n e i n t e n s i v e G i e m s a - F ~ i r b u n g ( A b b . 2 b ) . W e i t e r h i n konnte in e i n i g e n F ~ l l e n auch im B e r e i c h des N u k l e o l u s - O r g a n i s a t o r s e i n e s c h w a c h e G i e m sa-Bande beobachtet werden. Die b e o b a c h t e t e n C h r o m o s o m e n s e g m e n t e m i t differ e n t i e l l e r G i e m s a - F ~ i r b u n g z e i g e n eine g r e b e t J b e r e i n s t i m m u n g m i t den yon Stack und C l a r k e (1973a, 1973b), Stack ( 1 9 7 4 ) , F i s k e s j 5 (1974b) und E1-Gadi und E1kington (1975) b e s c h r i e b e n e n G i e m s a - B a n d e n . Die von G r e i l h u b e r (1974) e n t w i c k e l t e K a r m i n - B a n d e n - T e c h nik und die F ~ r b u n g m i t F l u o r o c h r o m e n ( V o s a 1970) e r m S g l i c h t n u t die s p e z i f i s c h e F~irbung d e r t e r m i n a l e n C h r o m o s o m e n a b s c h n i t t e . Dagegen k o n n t e n mit Hilfe yon a u t o r a d i o g r a p h i s c h e n Methoden sowohl in t e l o m e r i s c h e m a l s auch in c e n t r o m e r i s c h e m C h r o m a t i n sp~it r e p l i z i e r e n d e D N A - S e q u e n z e n n a c h g e w i e s e n werden.

Paeonia tenui f o l i a : Paeonia tenui f o l i a b e s i t z t fiinf C h r o m o s e m e n p a a r e . Sowohl in den m e i o t i s c h e n (Abb. 3a und 3b) als auch in den m i t o t i s c h e n C h r o m o s o m e n ( A b b . 3c) w e i s e n die C e n t r o m e r e eine i n t e n s i v e G i e m s a - F ~ i r b u n g auf. Neben d i e s e n c e n t r o m e r i s c h e n B a n den z e i g e n zwei C h r o m o s o m e n p a a r e e i n e t e r m i n a l e Bande in e i n e m C h r o m o s o m e n a r m . Auch bet Paeonia

t e n u i f o l i a konnten in den I n t e r p h a s e - K e r n e n s t a r k g e f~rbte C h r o m o c e n t r e n beobachtet w e r d e n (Abb. 4 c ) . D anksagung. Frau Prof~ Dr. G. Linnert danke ich fiir die tiberlassung des Themas und die freundliche Unterstiitzung der Arbeit; fiir die freundliche Beratung hinsichtitch methodischer Fragen bin ich den Herren Dr. R. J. Singh und Dr. T. Lelley zu groBem Dank verpflichtet.

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