Z. Orthop. 130 (1992)

Differenzierung von knochenbildenden Zellen : Systeme und Regulatoren H. Mayer, A. Scutt, E. Wingender

Zusammenfassung Der Knochen ist ein komplexes Netzwerk aus unterschiedlichen Zelltypen in einer definierten extrazellulären Matrix. Die Zellen interagieren untereinander und mit der extrazellulären Matrix. Die Koordination von Proliferation und nachfolgender Differenzierung ist ein wesentliches Charakteristikum für die Entwicklung und Etablierung eines Gewebes. Eine Anzahl von Modellen wurden etabliert, in denen diskrete Elemente dieses Netzwerks studiert werden können. In dem experimentellen Modell der ektopischen Knochenbildung kann die Bildung von neuem Knochen induziert werden. Die Proteine sind als zugehörig zu der TGF-ß-Superfamilie charakterisiert. Mittels der Zellkulturtechnik konnten während der Ausbildung des osteogenen Potentials eine zeitliche Abfolge von drei unterschiedlichen Perioden charakterisiert werden. Das Zellkulturmodell wird intensiv genutzt, um Effekte von Substanzen auf Osteoblasten-Zellproliferation und Differenzierung zu studieren. Die Ergebnisse können nicht leicht auf den Knochen als Ganzes übertragen werden, da sie keine Hinweise über die Differenzierungskinetik einer Zelle in ihrer natürlichen Umgebung geben. In vitro-Organkulturmodelle, in denen die unterschiedlichen Stadien der Differenzierung anwesend sind, könnten in Zukunft eine stärkere Bedeutung bei der Aufklärung der Zell/Zell- und Zell/ Matrix-Interaktion für die Osteoblasten-Differenzierung bekommen. Das Kaskade der Ereignisse im Differenzierungsprozeß muß strikt reguliert sein. Der Differenzierungsprozeß ist durch Kombination des endokrinen Systems und lokal wirkender Faktoren kontrolliert. Die Effekte der klassischen Calcium-regulierenden Hormone, Vitamin D und PTH an der Osteoblasten-Differenzierung sind besprochen. Von einer großen Anzahl von Wachstumsfaktoren wurde gezeigt, daß sie regulatorische Agentien sind, die die Knochenzellaktivität modulieren. Wachstumsfaktoren, die lokal von Knochenzellen synthetisiert werden, sind von besonderem Interesse für das Studium der Knochenbildung.

Die Koordination von Proliferation und nachfolgender Differenzierung ist ein wesentliches Charakteristikum für die Entwicklung und Etablierung eines Gewebes. Knochenbildung beinhaltet eine geordnete Abfolge von Proliferation osteogener Vorläuferzellen und einer nachfolgenden Differenzierung, die zu extrazellulärer

Z. Orthop. 130 (1992) 276-284 © 1992 F. Enke Verlag Stuttgart

Differentiation of Osteogenetic Cells: Systems and Regulators Bone formation comprises a complex but ordered sequence of events, beginning with the proliferation of chondrogenic and osteogenic precursor cells followed by their subsequent differentiation, ultimately leading to extracellular matrix maturation and mineralisation. Several models have been established which recreate discrete elements of this network. Factors induce ectopic bone formation, when implanted into muscle pouches, have been characterized as members of the TGF-ß-superfamily. Detailed information about the couse of OB-differentiation has been obtained from an in vitro model system. The process of mineralisation was found to consist of three distinct time periods: a proliferative phase, a period of extracellular matrix maturation and mineralisation. The development of each states depends an each other. This model is not as complex as the whole organ and cannot of course lead to any conclusion about the kinetic differentiation path of a cell in its normal spatial environment. Different organ culture systems are described and through the application of sensitive methods the differentiation can be studied in the normal spatial environment. The cascade of events in the differentiation process must be strictly regulated. Hormones and growth factors in many cases show a bone-forming and/or bone-resorbing action. The effects of the classical calcium regulating hormones Vitamin D and PTH an OB-differentiation are reviewed. A large number of growth factors have been shown to effect OB. Growth factors, that have been isolated from the bone matrix are of particular interest to bone formation.

Matrix-Reifung und Mineralisation führt. Die lokale Kontrolle von Knochenzellfunktionen beruht auf einer dynamischen Balance von zahlreichen möglichen Faktoren systemischen und lokalen Ursprungs. Die Identifizierung von lokalen Knochenfaktoren erlaubt das Studium ihrer Regulation, ihres Zelltypursprungs, ihrer Ablagerung und Reaktivierung und ihrer Wirkung. Damit ist ein Weg geöffnet, die kausale Rolle von Wachstumsfaktoren bei Proliferation, Differenzierung und Zell-Zell-Signaltransfer bei Knochenwachstum und Knochenumbau zu untersu-

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

276

Differenzierung von knochenbildenden Zellen: Systeme und Regulatoren

Osteoblasten-Zelldifferenzierung bei der Knochenregeneration in vivo Der Knochen ist ein komplexes Organ aus Knochen-, Knorpel-, fibrösem und blutbildendem Gewebe. Bei der Entwicklung des Knochens müssen diese vier Gewebe zusammenwirken. Ein Charakteristikum des Knochens ist weiter seine außergewöhnliche Fähigkeit für Wachstum, dauerndem Umbau und Regeneration im postnatalen Leben. Zu diesen Fähigkeiten tragen Proliferation von prädifferenzierten Osteoblasten-Vorläuferzellen und Differenzierung von mesenchymalen Zellen bei. Zell-Differenzierung kann in zwei Phasen unterteilt werden, einer morphogenetischen Phase und einer Cytodifferenzierungs-Phase. Die morphogenetische Phase besteht aus Zell-Disaggregation, -Wanderung, -Reaggregation und -Proliferation. Die Cytodifferenzierungsphase führt zu einem reifen funktionierenden spezialisierten Gewebe. Dies kann experimentell gezeigt werden, wenn demineralisierte Knochenmatrix (2) oder bone morphogenetic protein (BMP) (3) in den Muskel eines Nagers implantiert wird. In diesem experimentellen System disaggregieren perivaskuläre mesenchymale Zellen, wandern zum Gebiet des Implantats, reaggregieren, proliferieren und differenzieren in Knorpelgewebe und Knochengewebe. Die Quantität des gebildeten Knochens ist proportional der Menge des implantierten Materials. Der morphologische Ablauf ist derselbe, wie er bei embryonaler enchondraler Knochenbildung und Frakturheilung bei Erwachsenen beobachtet wird.

Zelldifferenzierung mit Hilfe der Zellkulturtechnik Mit Hilfe der Zellkulturtechnik konnte erstmals die Existenz von Osteoblasten (OB)- Vorläuferzellen gezeigt werden. OB können sich aus einer pluripotenten fibroblastoiden Stammzelle RCT 3.1 mit myogenem, adipogenem und chondrogenem Potential entwikeln. Durch Subklonierung wurden neue bipotentiale Klone und monopotentiale Linien gewonnen. Eine davon differenziert zu Chondrozyten (4) (Abb. 1). Eine klonierte Subpopulation von Zellen aus Knochenmark führte zu Knochenbildung, wenn diese Zellen in Muskel von Ratten implantiert wurden. Zellen von anderen Organen wie Milz und Niere führten jedoch zu keiner Knochenbildung. Dar-

pluripotente Stammzelle

Wachstumsstop

reife Zelle (Kulturmodell)

Konfluenz Mehrschichtigkeit

Osteocyt (Primärer Osteoblast)

determinierte t I, Konfluenz Progenitorzelle

Konfluenz

Adipocyt (3T3-Präadipocyt)

Myotube (Primärer Myoblast)

Abb. 1 . Differenzierungsschema einer pluripotenten Stammzelle. Die dargestellten Differenzierungsvorgänge können in Zeltkultur an einer bestimmten Ausgangszelllnie (RCJ 3) nachvollzogen werden (modifiziert nach A. J. Friedenstein et al. (1987) Cell Tissue 20: 263-272)

aus kann geschlossen werden, daß wenigstens zwei Typen von OB-Vorläufern existieren: 1. solche, die spontan direkt in OB differenzieren können und 2. solche, die induziert werden müssen, um OB zu bilden (5).

Detailliertere Information über den Verlauf der OB-Differenzierung wurde von einem in vitro Modellsystem erhalten (6). In diesem Modell wurde eine Mischpopulation von knochenbildenden Zellen aus Kalvarien der Ratte mit FCS, Ascorbinsäure und organischem Phosphat kultiviert. Nach 6 Tagen wurden die Kulturen konfluent, um den B. Tag waren sie in mehreren Schichten dicht gepackt und um den 16. Tag hatten sie eine dichte extrazelluläre Matrix synthetisiert und bekamen ein durchscheinendes Aussehen. Vom 9. Tag an waren Areale zu sehen, und diese nahmen weiter an Größe und Anzahl bis um den 21. Tag zu und waren als große (0,5 mm2) mineralisierte knochenähnliche Inseln (nodules) erkennbar. In Querschnitten zeigten diese Inseln viele der Charakteristika eines schwammartigen Knochens in vivo: fibroblastoide Zellen in der Außenschicht, darunter kubische Osteoblasten-ähnliche Zellen und weiter innen Osteocyten- ähnliche Zellen, die komplett von kollagenöser Matrix umgeben sind und in ihrer Umgebung Mineralisation durch Ablagerung von Hydroxylapatitkristallen aufweisen. Die Anzahl der gebildeten Inseln stand in einem linearen Verhältnis zu der Zahl der ausplattierten Zellen. Durch Verdünnungsanalyse konnte gezeigt werden, daß sich nur 0,3 Wo der Ursprung-Zellen zu einer knochenähnlichen Insel entwickeln. In der geringen Effizienz liegt die Hauptschwierigkeit dieses Differenzierungssystems. Der Differenzierungsverlauf beinhaltet drei unterschiedliche Zeitperioden: 1. eine proliferative Periode, charakterisiert durch ein hohes Niveau von Kollagen Typ 1 mRNA und der Expression von Zellzyklus- und Zellwachstums-Genen; 2. eine Periode von extrazellulärer Matrix- Reifung (ECM), charakterisiert durch die Induktion von alkalischer Phosphatase und 3. eine Periode von Mineralisation, charakterisiert durch 10- bis 100-fachen Anstieg des mRNA-Niveaus für Osteopontin und Osteokalzin. Zwei Restriktionspunkte existieren, bei denen Signale empfangen werden, bevor die Abfolge weitergehen kann. Der erste Restriktionspunkt tritt auf, wenn die Proliferation herunterreguliert ist und die ECM- Reifung induziert wird, der zweite, wenn Mineralisation einsetzt. Diese Ergebnisse haben zu einem Modell für Osteoblasten-Entwicklung geführt, das besagt, daß Proliferation, Differenzierung und

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

chen. Die Anwesenheit einer Vielzahl von unterschiedlichen Wachstumsfaktoren in der Knochenmatrix und die Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptoren auf einer Zelle läßt vermuten, daß Zellteilung und Zelldifferenzierung durch eine Kombination von integrierenden und konkurrierenden Stimuli bestimmt wird. Jedoch gibt es eine Reihe von ungeklärten wichtigen Fragen in diesen Prozessen. Kann ein Faktor nur Proliferation induzieren und erlaubt er damit das Ablaufen der Differenzierung als ein präzise bestimmtes internes Programm der Zelle (biologische Uhr)? Oder bestimmt er die Anzahl der Zellteilungen, die während des Differenzierungsprogramms stattfinden? Es ist dabei denkbar, daß die Zelle insensitiv für den Wachstumsfaktor wird (Rezeptordownregulation) oder daß die Wachstumskontrolle durch negative Regulatoren durchgeführt wird (negatives Rückkopplungsmodell) (1).

Z. Orthop. 130 (1992) 277

Z. Orthop . 130 (1992)

Entwicklungsschritte 1 Proliferation 1 Matrixentwicklung 1 Mineralisierung

DNA c-myc Histone

H. Mayer und Mitarb.

hat. Erhöhte Sensitivität auf Dexamethason wurde in der ersten Subkultur aus einer mit Dexamethason behandelten Anfangskultur beobachtet (11). Diese Langzeitwirkungen unterstützen das Modell der progressiven OB- Differenzierung.

Differenzierung in Organkulturmodellen mit aufsteigender Komplexität Tage

Proliferation Collagen ECM ECM Fibronectin Reifung Mineralisation Biosynthesis

L- Negativregulation 41 Negativregulation des Zellwachstums der Matrixreifung

Abb. 2 . Ein Modell der Beziehung zwischen Proliferation und Differenzierung im Ablauf der Osteoblasten-Differenzierung (modifiziert nach G. S. Stein et al. (1990) FASEB 4: 31113122).

ECM voneinander abhängig sind. Die Proliferation unterstützt einerseits die Synthese von ECM, die Reifung von ECM reguliert andererseits die Zellproliferation herunter und die Mineralisation von ECM reguliert die ECMReifung herunter (Abb. 2). Die Ausbildung des osteogenen Potentials von undifferenzierten Zellen wird durch ein dreidimensionales Zellwachstum begünstigt. Verschiedene Systeme wurden aufgebaut, um das Wachsen von kompakten Zellkolonien zu ermöglichen (Agarose, Methylzellulose, Mikrocarrierkügelchen und Kollagen Typ 1 Netzwerke). Die osteoblastenähnliche Zelle MC3T3-E1 wächst in einem Kollagennetzwerk mit abnehmender Zelldichte von oben nach unten. In diesem 3D-Kultursystem in FCS, Ascorbinsäure und ß-Glycerophosphat konnte Synthese von Kollagen Typ 1, hohe Expression von Osteocalcin und alkalischer Phosphatase (APase) sowie Mineralisation beobachtet werden. Die Kontrollzellen, NIH3T3 Fibroblasten, passierten das Netzwerk und bildeten darunter ein konfluentes Monolayer ohne Charakteristika von OB (7). Wachstumsfaktoren modulieren in Zellkultur Differenzierungsereignisse. Kontinuierliche Kultur in Gegenwart z. B. von epidermal growth factor (EGF) oder transforming growth factor (TGF-ß) resultierten in einer dosisabhängigen Inhibition der Bildung von Inseln, während ersterer Zellproliferation und die Zelldichte steigerte und letzterer beide Parameter unterdrückte. Effekte von pulsierender Gabe waren analog (8). Forskolin, das Adenylatcyclase-Aktivität induziert, zeigte einen biphasischen Effekt. Es inhibierte bei 10-5M und bei 10-9M steigerte es die Bildung von Inseln (9). Kontinuierliche Gabe von Dexamethason stimulierte dosisabhängig die Anzahl und Größe von Inseln um ca. 10001o. Es wurde deshalb vermutet, daß für die Ausbildung oder Aufrechterhaltung eines bestimmten Grades an Differenzierung Glucocorticoid erforderlich ist (10). Ein Memory- Mechanismus wurde in diesem System beschrieben, der darin besteht, daß ein kurzer Puls in der Anfangskultur Langzeitwirkung

Im Zellkultursystem kann das Differenzierungspotential einer Zelle studiert werden. Über den kinetischen Differenzierungsverlauf einer Zelle in ihrer räumlichen Umgebung kann dieses System naturgemäß keine Aussage machen. Es gibt jedoch vermehrt Hinweise für die Wichtigkeit von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion und ihren Einfluß auf die Zelldifferenzierung und Organentwicklung. Unterschiedliche Organkultursysteme stehen zur Verfügung. Eine räumliche und funktionelle Beziehung bei der Differenzierung von Osteoblasten-Vorläuferzellen zu OB bei der Knochenbildung ist im gefalteten Periosteum von Kalvarien in vitro (12) beschrieben. Mittels Markierung mit 3H-Thymidin konnte kein differenzieller Übergang von fibroblastoiden und osteogenen Zellen beobachtet werden. Dies zeigt, daß keine signifikante Erneuerung osteogener aus fibroblastoiden Zellen erfolgte. Wenn alle proliferierenden osteogenen Vorläuferzellen durch hohe Dosen von 3H-Thymidin in 1 oder 2 Tagen abgetötet wurden, differenzierten keine OB und es ereignete sich keine Knochenbildung. Dies zeigte, daß OB für Knochenbildung von proliferierenden Vorläufern abstammen. Ein überwiegender Teil von OB- Vorläuferzellen differenzierten auch ohne Zellteilung zu alkalische Phosphatase-positiven Zellen. Zum Studium der Knorpelentwicklung steht z. B. das Sternum vom embryonalen Huhn zur Verfügung. Es stellt ein nahezu homogenes Organ dar, das aus Chondrozyten besteht (13). PTH-induzierte Effekte auf Knorpelzellen in Zellkultur sind im Sternum ebenfalls nachweisbar. Der kondyle Knorpel in der Mandibel stellt einen sekundären Typ von Knorpel dar, der von dem Ektomesenchym der Neuralleiste abstammt. Unterschiedliche Schichten von Zellen verschiedenen Differenzierungsgrades, wie Zonen von Perichondrium, Chondro-Progenitor-Zellen und Chondroblasten, von hypertrophischen Chondrozyten, von mineralisiertem Knorpel, sind charakteristisch im Längsschnitt zu sehen. Dabei scheinen unterschiedliche Zonen unterschiedlich auf externe Faktoren zu reagieren. Die äußere proliferierende Zone wird durch eine Anzahl von Faktoren wie Parathormon (PTH(1-34)), Vitamin D3 (1,25(OH)2D3), insulin like growth factor (IGF-I), Insulin und TGF-ß stimuliert (14, 15). Die Organkultur embryonaler Extremitäten zeigt die höchste Komplexität an Organisation und kann als erforderliches Glied zwischen in vivo Studien und Untersuchungen auf zellulärem Niveau angesehen werden. Einige Parameter sind bei einer Kulturdauer von 9 Tagen vergleichbar mit einer Zunahme von 3 Tagen im Ei. Zellproliferation, Differenzierung von Chondrozyten, Zunahme von APase in OB, Bildung von neuem Osteoid und Mineralisation können bestimmt werden. Es wurde jedoch gegenüber der Entwicklung im Ei eine höhere Expansion der knorpeligen Epiphysen, nekrotische Veränderungen

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

278

Differenzierung von knochenbildenden Zellen: Systeme und Regulatoren

Durch Anwendung spezifischer Methoden, wie z. B. selektiver Zerstörung von Zellen, Nachweis von Transkripten in situ sollte in vitro im Organ der Ablauf der Differenzierung und Mineralisation genauer beschreibbar werden.

Caiciotrope Hormone und Knochenwachstumsfaktoren Hormone und Wachstumsfaktoren zeigen vielfach knochenresorbierende und/oder knochenaufbauende Wirkung. Ein bestimmter Faktor kann eine knochenresorbierende Wirkung haben, wobei er direkt oder indirekt knochenabbauende Zellen aktiviert. Weiter kann ein bestimmter Faktor eine knochenaufbauende Wirkung haben, wobei er direkt knochenabbauende Zellen inaktiviert und/oder knochenaufbauende Zellen aktiviert. Für diese Ambivalenz ist Parathormon ein klassisches Beispiel.

Parathormon und osteogene Differenzierung Parathormon (PTH) ist einer der Hauptregulatoren vieler den Knochen betreffenden Prozesse. Ein bekannter Effekt ist die Calciummobilisierung aus der Skelettmasse unter Aktivierung noch nicht in ihrer Struktur bekannten Osteoklasten-aktivierender Faktoren in Osteoblasten. Auch anabole Wirkungen wie die Steigerung der Proliferation von Osteoblasten und Chondrocyten und positive knochenaufbauende Wirkung sind dokumentiert. Verschiedene Aktivitäten des PTH sind teilweise in unterschiedlichen funktionellen Domänen des Hormonmoleküls lokalisiert (Abb. 3). Unterschiedliche Konzentrationen von PTH aktivieren drei unterschiedliche second messengers in seinen Zielzellen: Adenylatcyclase, den cytosolischen Anstieg von Caz+ und die Freisetzung von Inositol 1,4,5-Trisphosphat (IP3). Es ist daher auch ein „Polyhormon" genannt worden (18). Es ist daher eine legitime Frage, ob dieses Hormon auch die Differenzie-

t

37 34

IM

rungsvorgänge beeinflußt, die zu reifen OB bzw. Chondrocyten führen. Die Synthese von Kollagen 1 bei OB beginnt noch während der proliferativen Phase zu den frühesten Anzeichen beginnender Reifung, gefolgt von der Expression der alkalischen Phosphatase, Osteonectin, Osteopontin, Osteocalcin und der Mineralisierung der gebildeten Matrix (19,20). Die Kollagen-Bilanz von OB wird durch PTH auf zwei Wegen negativ beeinflußt: zum einen reduziert PTH(1-34) die Kollagensynthese, zum anderen stimuliert es gleichzeitig die Aktivität des Kollagen-abbauenden Enzyms, der Kollagenase (21). Auch andere Proteasen werden durch PTH stimuliert, wie z. B. der Plasminogenaktivator (22). Ein weiterer Differenzierungsmarker, die alkalische Phosphatase, wird durch PTH(1-34) inhibiert. Zum Unterschied zu diesen Befunden deuten erste Experimente an, daß das mittregionale PTH(28-48) die APase-Aktivität leicht erhöht. Auch für das carboxyterminale Fragment PTH(53-84) ist eine stimulierende Wirkung auf die APase berichtet worden (23). Für die Differenzierung von Chondrocyten ist ein wesentliches Merkmal die Umschaltung von Kollagen Typ 1 auf den knorpelspezifischen Typ II sowie die Expression weiterer spezifischer Matrixproteine (24,25). Die Ausbildung eines differenzierten Chondrocyten-Phänotyps wird durch Retinoide oder durch Phorbolester gehemmt, dieser Effekt kann jedoch durch PTH wieder aufgehoben werden (26). Zur Untersuchung der Chondrocytenreifung können mandibuläre Condylen embryonaler oder neonataler Mäuse herangezogen werden. Dabei ist festzustellen, daß unter dem Einfluß des intakten PTHMoleküls (84 Aminosäuren) oder seiner aminoterminalen 34 Aminosäuren = PTH(1-34) eine starke Zunahme der Zone der proliferierenden Vorläuferzellen zu beobachten ist (27). Ähnliche Effekte von PTH(1-34) sind für andere Chondrocytenkultur-Systeme beschrieben worden (28,29). Das mittregionale PTH-Fragment PTH(28-48) beeinflußt demgegenüber nicht die Proliferation der Chondroprogenitorzellen, scheint jedoch verstärkt Zellen in das hypertrophe Stadium zu überführen (24,27). Die proliferativen Effekte von PTH könnten weiter über induzierte Wachstumsfaktoren vermittelt werden. PTH moduliert TGF-ßEffekte, weshalb dieser Faktor auch als Mediator vieler PTH-Effekte auf den Knochen diskutiert wird (30). Weiter wird IGF-1 als Mediator diskutiert (31).

Vitamin D und osteogene Differenzierung

84

C

N Minimaldomäne Mitogene ■ar cAMP- "Core'Stimulation Domäne

APase - stimulierende Domäne

tt

Spaltstellen

Abb. 3 . Modell der funktionellen Domänen im PTH-Molekül. Das aminoterminale Fragment PTH(1-34) stimuliert optimal die cAMP- Synthese in PTH-Zielzellen, die minimale Domäne dafür liegt im Bereich 1-27. In der Mitte des Moleküls liegt eine mitogene „Core"-Domäne, die z.B. für die Stimulation der DNASynthese in Chondrocyten essentiell ist. Ihr benachbart liegen proteolytische Spaltstellen. Dem Carboxylterminus konnte eine stimulierende Wirkung auf die alkalische Phosphatase von Osteoblasten-Zellen zugeordnet werden.

Das Skelettsystem ist außerdem ein wichtiges Zielorgan für den biologisch aktiven Vitamin D3-Metaboliten 1x,25-Dihydroxycholecalciferol (1,25(OH)2D3). Es aktiviert knochenabbauende und -aufbauende Effekte. Bezogen auf die OB-Markergene manifestiert sich seine Aktivität z.B. in einer Reduktion der Kollagen 1-Synthese auf Transkriptionsebene (32). 1,25(OH)2D3 stimuliert die APase in Osteoblasten (33). Es steigert zudem die Expression der Rezeptoren für IGF-I (34), dessen anabole Wirkung auf Osteoblasten bereits gut dokumentiert ist, und stimuliert die Synthese einer TGF-ß-ähnlichen Aktivität (35). In Chondrocyten embryonaler Hühner steigert 1,25(OH)2D3 die DNA- Synthese und fördert die Chondrocytenreifung zum hypertrophen Phänotyp (36). Umge-

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

im Knochenmark und sekundäre Knorpelbildung als Artefakt beschrieben (16). Die Kalzium- Bilanz kann unter Einfluß von Faktoren bestimmt werden. PTH(1-34) mobilisiert dabei dosisabhängig Kalzium (17).

Z. Orthop. 130 (1992) 279

H. Mayer und Mitarb.

Z. Orth op. 130 (1992)

kehrt führt Vitamin-D-Defizienz zur Hemmung der Chondrocytenreifung, was sich u.a. in einer veränderten Proteoglykansynthese äußert (37). Darüber hinaus beeinflußt Vitamin D3 eine Vielzahl von Genen positiv oder negativ in nahezu allen Geweben, z. B. die regulatorisch bedeutsamen Oncogene c-myc und c-myb (beide negativ) sowie Gras und c-fos (beide positiv reguliert) (38). Besonders interessant ist dabei die Induktion von c-fos durch 1,25(OH)2D3, da sowohl der heterodimere Komplex der Oncogenprodukte c- Fos/c-Jun als auch der Vitamin-D3Rezeptor als DNA-bindende Transkriptionsfaktoren fungieren, die zudem noch in komplexem Wechselspiel stehen. Dies ist besonders gut untersucht worden an der Expression von Osteocalcin, einem Differenzierungsmarker für Osteoblasten. Die Osteocalcin-Transkription wird durch Vitamin D3 positiv reguliert, und ein entsprechendes Vitamin-D-responsives Element (VDRE) ist im Osteocalcin-Promotor identifiziert worden (39,40,41,42). Dieses Element enthält im Rattengen eine perfekte, im humanen Gen eine stark degenerierte AP-1-Erkennungsstelle (43). Der Transkriptionsfaktor AP-1 ist identisch mit dem cFos/c-Jun Heterodimer. Daraus wurde von Stein und Mitarbeitern das folgende Modell abgeleitet (19): Stark proliferierende, aber noch nicht oder kaum differenzierende Zellen haben eine hohe Konzentration an aktivem AP-1, das den Vitamin-D-Rezeptor von der Bindung an den Osteocalcin-Promotor ausschließt (Abb. 4). Mit dem Ende der proliferativen und dem Beginn der Differenzierungsphase sinkt der Spiegel an AP-1 (die c-fos-Expression unterliegt einem negativen Feed-back- Mechanismus), das entsprechende Promotorelement wird frei für Bindung und Aktivierung durch den Vitamin-D-Rezeptor. Anders liegen möglicherweise die Verhältnisse bei der Kollagen-I-Expression: dieses Matrixprotein wird bereits während der proliferativen Phase gebildet. In Übereinstimmung damit findet man ein AP-1-Element nicht überlappend, sondern in der Nachbarschaft zu einem angenommenen VDRE (19). Retinoide (RA) spielen eine Rolle in der Knochenentwicklung. Retinoide stimulieren Knochenresorption und inhibieren Kollagensynthese in vitro (44), auf der anderen Seite werden RA-Rezeptoren intensiv und

e2

Osteoeateln

a I Collagen

Abb. 4 . Modell der proliferationsabhängigen Genregulation. In der proliferativen Phase werden die Produkte der Protoonkogene c-fos und c-jun exprimiert, die als Heterodimer an AP-1Sequenzen binden (Consensussequenz TGACGTCA). Ist eine AP-1-Sequenz (kreuzschraffierter Kasten) Teil eines anderen regulatorischen Elementes, z.B. eines Vitamin-D-regulatorischen Elementes (VDRE, weißer Kasten) wie im Osteocalcin-Gen, unterdrückt sie dessen Funktion indem sie die Bindung des Vitamin-D-Rezeptors (VDR) verhindert (links). Ist sie ihm dagegen nur benachbart, wie im Fall des Kollagens 1, kann dieses Gen auch in der proliferativen Phase reguliert werden (rechts). (Modell nach Owen et al., PNAS 87, 9990-9994, 1990)

spezifisch in der kalzifizierenden Front während der Knochenentwicklung exprimiert (45). Drei Subtypen von Rezeptoren sind beschrieben, a, ß und y (46), wobei in situ gezeigt wurde, daß RA-Rezeptoren (RAR) in Epithelien, Mesenchym der Flügelknochen und embryonalen Fingern uniform und in der spezifisch kalzifizierenden Front der Finger nach der Geburt exprimiert wird. MC3T3-E,-Zellen können durch RA zur Differenzierung in Zellen mit OB-Eigenschaften induziert werden (47). In ROS 17/2.8 erhöht RA 2-3fach die Rezeptorzahl von 1,25(OH)2D3, was zu einem Abfall von APase-Aktivität und PTH-stimulierbarer cAMP-Synthese führte (48).

Mitglieder der TGF-ß-Superfamilie und osteogene Differenzierung Von besonderem Interesse für die OB-Differenzierung sind Wachstumsfaktoren, die aus der Knochenmatrix isoliert wurden. Von einer großen Zahl von Wachstumsfaktoren wurde gezeigt, daß sie Proliferation von primären OB-Vorläuferzellen induzieren (49,50,51) (Tab. 1). Dabei sind am besten Mitglieder der TGF-ß-Superfamilie bekannt. Die TGF-ß- Superfamilie enthält mindestens 10 Gene, die eng verwandt mit TGF-ß, sind und einer weiteren Reihe, die weiter entfernt sind, wie Müllerian inhibition substance (MIS), decapentaplegic protein (DPP) und vegetal protein-1 (Vgl). TGF-ß, als Prototyp ist ein Homodimer von 25 kD und wird synthetisiert als ein Prä-pro-TGF-ß von 390 AS, das eine 29 AS lange hydrophobe Leadersequenz enthält, die nach Abspaltung pro-TGF-ß ergibt. Nach Spaltung an einer basischen Spaltstelle entsteht die monomere Form von TGF-ß,, die dimerisiert. Innerhalb der TGF-ß-Familie sind 9 Cysteine bei TGF-ß und 7 Cysteine bei BMPs konserviert. Die rekombinanten Proteine sind Homodimere. Es ist jedoch möglich, daß in der Natur Heterodimere auftreten können (TGF-ß,/ß2 und BMP2/OP-1). Die Synthese und das Arrangement ist dabei komplex und beinhaltet mehrere Prozessierungsschritte. TGF-ß, wurde zuerst von menschlichen Blutplättchen isoliert. TGF-ß, und TGF-ß2 wurden in Knochenextrakt des Rindes und in Blutplättchen des Schweins identifiziert. TGF-ß3 ist hauptsächlich in Zellinien mesenchymalen Ursprungs exprimiert. TGF-ß4 wurde von der Chondrocyten-Genbank des Huhns kloniert (52, 53). TGF-ß, EGF, bFGF und TNF-cx sind potente Mitogene auf primäre Osteoblastenzellpopulationen. Jedoch unterdrücken letztere die Antwort auf TGF-ß (51). TGF-ß kann eine bimodale Proliferation über eine komplexe Kontrolle eines autokrinen Zirkels von PDGF-AA induzieren. Bei niedriger Konzentration wird autokrine PDGF-AA-Sekretion stimuliert, die bei höherer Konzentration von TGF-ß abnimmt, wobei die PDGF-Rezeptorcc-Untereinheit herunterreguliert wird (54). TGF-ß ist ein potentes Agens für Zellen mesenchymalen Ursprungs, Fibroblasten und wahrscheinlich auch für Makrophagen. Es wurde berichtet, daß TGF-ß eine terminale Differenzierung von bronchial epithelialen Zellen bewirkt. Widersprüchlich ist, ob es die Differenzierung von Adipozyten und Myoblasten inhibieren kann. TGF-ß stimuliert die Produktion von extrazellulärer Matrix und erhöht die Expression von Proteaseinhibitoren wie plasminogen activator inhibitor (PAI-1) und tissue inhibitor of metallopro-

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

280

Differenzierung von knochenbildenden Zellen: Systeme und Regulatoren Z. Orthop. 130 (1992)

281

Tab. 1 Abkürzung

Synonyme

rel. Molekülmasse

Wirkung auf Knochen in vitro; in vivo

insulinähnliche IGF-1 Somatomedin C "mul7 650 Wachstumsfaktoren IGF-2 tipllcation-stimulating 7 470 activity" (MSA) "fibroblast aFGF ECGF* 17000 + growth factors" bFGF "prostatic growth 1 6 000 factor" "platelet-derived PDGF- "osteosarcom-derived growth factor" AA, BB, growth factor" 30 000 AB ßz-Mikroglobulin ß2-M "bone-derived growth 1 1 800 ± factor" (BDGF) "transforming TGF-ß1 "cartilage-inducing A 25 000 + + growth factor-ß" TGF-ß2 factors" (CIF) B 25000 TGF-ß3 25 000 TG F-ß4 25 800 TGF-ß5 25 000 "hone morpho- (Homodimere) genetic proteins" BMP-2 25 800 + + BMP-3 Osteogenin? 29 000 + + BMP-4 26 200 + + BMP-5 31 200 + + BMP-6 31 400 + + BMP-7 OP-1 31 400 + + BMP2/ (Heterodimer) 28 600 + OP-1 OIF + (Gemisch) 28 000 + TGFß-112 + in vitro: proliferierende Eigenschaft auf Osteoblasten + in vivo: osteogene Eigenschaft bei lokaler Applikation

tease (TIMP) (55). Injiziert in das Periosteum von neonatalen Ratten, stimuliert es eine Verdickung des Knochens (56). In anderen Systemen zeigt TGF-ß eine Inhibition der Proliferation, der Expression von APase-Aktivität und Osteocalcin (57). In Organkultur stimuliert TGF-ß Knochenresorption in neonatalen Maus- Kalvarien, jedoch inhibiert es Resorption im foetalen Extremitäten-Knochen der Ratte (58). TGF-ß liegt im Knochen in hoher Konzentration vor und wurde mit EGF, TGF- a und anderen Mitogenen in konditioniertem Medium von fötalen RattenKalvarien nachgewiesen (59). Bei der enchondralen Knochenbildung zeigt sich eine Akkummulierung von TGF-ß, wenn Knorpel durch Knochen ersetzt wird , was auf eine präferentielle Kompartimentierung von TGF-ß in der Mineralisierungsphase hinweist (60). Transkripte der TGF-ß-Superfamilie treten sowohl temporär in der embryonalen Entwicklung als auch konstitutiv in unterschiedlichen Geweben im Erwachsenen auf (61). Während der Progression von Zellen aus dem Mesenchym zu Chondroblast, Chondrozyt, hypertrophischem Knorpel werden unterschiedliche Transkripte der TGF-ß-Superfamilie transient exprimiert. Eine sehr interessante Untergruppe sind die Bone morphogenetic proteins (BMPs). Sie zeigen nach Implantation in den Muskel von Nagern Knochenbildung und in Frakturen verstärkte Heilung. Proteine der BMP-

Familie wurden aus dem Knochen isoliert und kloniert (62). Von rBMP-2-Protein wurde gezeigt, daß es ektopische Knochenbildung in vivo induziert (63). Die Substanz rekapituliert den Prozeß, wie er bei der embryonalen Extremitätenentwicklung und bei Frakturheilung auftritt. Aufgrund ihrer Sequenzhomologie werden die BMPs in drei Gruppen eingeteilt werden. Es ist zu vermuten, daß sie distinkte Regulatoren der Chondro- und Osteogenese sind. Proteine mit geringerer Verwandtschaft sind Activine und Inhibine. Inhibin besteht aus einer wund je einer ß-Einheit A und B. Die ß-Einheit kann als AA-Homodimer(Activin A) oder ß-Heterodimer (ActivinAB) isoliert werden. Activin-A induziert DNA-Synthese und Kollagensynthese in OB-angereicherten Zellen von fötalen Parietalknochen der Ratte. Diese Effekte sind jedoch geringer als die Effekte von TGF-ß. Die Activin AEffekte könnten zumindest teilweise über distinkte Activin A-Rezeptoren vermittelt werden (62).

Inhibitoren der Osteoblasten -Proliferation in vitro Wenig Aufmerksamkeit wurde bisher der Frage geschenkt, wie die Zellproliferation terminiert wird. Nach dem Modell der negativen Rückkopplungskontrolle wären es negative Regulatoren (65,66). Es gibt einige Berichte, daß Serum Wachstumsinhibitoren enthält. Leuke-

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

Wachstumsfaktoren

H. Mayer und Mitarb.

Z. Orthop . 130 (1992) mia inhibitory factor (LIF), der die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen inhibiert, zeigte unterschiedliche Effekte auf Knochenzellinien (67). LIF inhibierte Proliferation, APase und Kollagen Typ 1 mRNA-Niveau der MC 3T3 E1-Zellinie, die einen undifferenzierten Status darstellt (68). LIF hatte keinen Effekt auf APase in einer ausdifferenzierten Osteoblastenzellinie ROS 17/2.8.

Extrazelluläre Matrix als Reservoir für Wachstumsfaktoren Es wird generell angenommen, daß die Zelle und ihre extrazelluläre Matrix (ECM) reziprok interaktiv sind[69J. Der Auf- und Abbau einer ECM wird komplex durch Faktoren reguliert. In vitro-Studien zeigen, daß Faktoren bei OB, die die Synthese von Kollagen- und Nichtkollagen-Proteinen stimulieren, auch bei der Regulation von degradatischen Prozessen involviert sind. Die Akkummulation von ECM wird dabei vor allem durch Produktion von Fibronektin und Procollagen, der Inhibitoren TIMP und PAI-1 und durch Reduktion von Plasminogenaktivatoren und Procollagenase erreicht. Die ECM kann Wachstumsfaktoren komplexieren. Ein maskierendes Protein (MP) neutralisiert TGF-ß,-Aktivität unter physiologischen Bedingungen. In vitro kann durch Dissoziation TGFß1 aktiviert werden. MP ist ein heterodimeres Glykoprotein von 39 kD und ca. 120 kD. Die große Einheit enthält 18 EGF-ähnliche Repeatsf701. Ein aus Knochen isoliertes Protein induziert in Kombination mit TGFß, oder TGF-ß2 subkutan Knochen, jedoch nicht allein (72). Wachstumsfaktoren stehen somit in einer erneuerbaren Form durch Bildung von latenten Komplexen zur Verfügung, neben ihrer Verpackung in Blutplättchen (PDGF und TGF-ß). Gerade im Knochen könnte diese Komplexierung ein Reservoir darstellen, das verfügbar gemacht werden kann. Diese Art von Präsentation in einer bestimmten Kombination von Faktoren in der Mikroumgebung könnte zu einer Feinregulation während des Knochenremodellings und des Knochenwachstums benutzt werden. Von Proteoglycanen ist bekannt, daß sie Wachstumsfaktoren binden und dabei als Reservoir und für eine verbesserte Präsentation zu ihren Rezeptoren eine Rolle spielen können"". Decorin beispielsweise bindet und neutralisiert TGF-ß. Die Synthese von Decorin und weiteren Proteoglycanen wird wiederum von TGF-ß stimuliert. Es wurde gezeigt, daß Heparin-Bindung von bFGF obligatorisch ist für die Bindung an seinen hoch affinen Rezeptor (induced-Fit-Modell) 1731 Basis-Membranproteine könnenWachstumsfaktor-Aktivität aufweisen. Laminin kann Proliferation von OB induzieren und die Differenzierung bis zur Bildung von nodules beschleunigen 174. Laminin enthält EGF-ähnliche repeats und diese zeigen Wachtumsfaktor-Aktivität auf Zellen, die einen EGF-Rezeptor tragen. Von mitogenen Funktionen anderer Matrixproteine ist wenig bekannt, außer Fibronektin und Thrombospondin, das eine Anzahl von EGF-ähnlichen Domänen enthält. Amphiregulin aus der EGF-Familie bindet an den EGF-Rezeptor und ist ein schwaches Mitogen. Wachstumsfaktor-Aktivität in einem großen Strukturprotein könnte bedeuten, daß diese Wirkung lokal und weniger kontrolliert ist als diffundierbare kleine Wachstumsfaktoren.

MyoD : Ein Paradigma für ein osteogenes Mastergen? Über diese einzelne spezifische Gene steuernden Mechanismen hinaus ist jedoch zu erwarten, daß der Anstoß zur Differenzierung durch ein vorhergehendes Ereignis gegeben wird. In einem anderen System, der Differenzierung von Muskelzellen, sind einige Gene identifiziert worden, deren Produkte ein solches primäres Ereignis auslösen können. Besonders gut untersucht sind Struktur und Wirkung von MyoD (für Myoblast Determination Gene), aber auch andere, verwandte Proteine wurden identifiziert (75). Sie alle sind Transkriptionsfaktoren für muskelspezifische Gene nach „erzwungener" Expression auch in nicht-myogenen Zellen (76). Sie gehören ihrem Bauplan nach zu einer gemeinsamen Klasse, den HelixLoop-Helix-Proteinen. Sie bewirken u. a. Wachstumsstop (77) und sind in der Lage, undifferenzierte Zellen in Kultur zu einer myogenen Differenzierung zu veranlassen. Sie unterliegen selbst vielfältigen Regulationsmechanismen, z. B. einer positiven Autoregulation (78) und einer Repression durch Transformation durch ras oder fos (79) sowie durch FGF oder TGF-ß (80). Darüber hinaus wurde ein negativer Regulator gefunden, der ebenfalls ein HelixLoop-Helix-Protein ist, jedoch keine basische DNA-bindende Domäne besitzt. Er geht mit Proteinen wie MyoD ein Dimer ein, das jedoch nicht funktionell ist (81). Dieses „Id-Protein" wird ubiquitär exprimiert, jedoch sinkt sein mRNA-Level nach Induktion myogener Differenzierung in den dazu geeigneten Zellen. Es wäre daher von offensichtlichem Interesse, derartige Mastergene für die osteogene bzw. chondrogene Differenzierung zu isolieren. Die Steuerung ihrer Expression könnte einen befähigen, das Wachstum neuen Knochen- bzw. Knorpelgewebes gezielt zu veranlassen.

Danksagung Wir möchten uns bei B. Seeger-Kunth und S. Peters für die Schreib- und Sekretariatsarbeiten bei der Anfertigung des Manuskripts bedanken.

Abkürzungen

OB FCS ECM 3D EGF TGF IGF-I APase PTH RA PAI TIMP BMP LIF MP PDGF Myo D

Osteoblasten Foetales Kälberserum Extrazelluläre Matrix Dreidimensional Epidermal growth factor Transforming growth factor Insulin-like growth factor 1 Alkalische Phosphatase Parathormon Retinoide Plasminogen activator inhibitor Tissue inhibitor of metalloprotease Bone morphogenetic protein Leukemia inhibitory factor Maskierendes Protein

Platelet derived growth factor Myoblast determination gene

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

282

FGF Fibroblast growth factor MIS Müllerian inhibition substance DPP Decapentaplegic protein Vg-1 Vegetal protein OP-1 Osteogenic protein I

1P3 Inositol 1,4,5-trisphoshat

Literatur: Cross, M. and Dexter, T. M. (1991). Growth Factors in Development, Transformation, and Tumorogenesis. Cell 64: 271-280 2 Urist, M. R. (1965). Bone formation by autoinduction. Science 150: 893-899 Wang, E. A., Rosen, V., Cordes, P., Hewick, R. M., Kriz, M. J., Luxenberg, D. P., Sibley, B. S. and Wozney, J. M. (1988). Purification and characterization of other distinct bone inducing factors. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 9484-9488 4 Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K. and Gerasimov, U. W. (1987). Bone marrow osteogenic stem cells: In vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue 20: 263-272 Grigoriadis, A. E., Heersche, J. N. M. and Aubin, J. E. (1990). Continuously Growing Bipotential and Monopotential Myogenic, Adipogenic, and Chondrogenic Subclones Isolated from the Multipotential RCJ 3.1 Clonal Cell Line. Developmental Biology 142: 313-318 6 Owen, T. A., Aronow, M., Shalhoub, V., Barone, L. M., Wilming, L., Tassinari, M. S., Kennedy, M. B., Pockwinse, S., Lian, J. B. and Stein, G. S. (1990). Journal of Cellular Physiology 143: 420-430 Casser-Bette, M., Murray, A. B., Cross, E. I., Erfle, V. and Schmidt, J. (1989). Bone Formation by Osteoblast-Like Cells in a Three-Dimensional Cell Culture. Calcif Tissue International 45: 1-11 8 Antosz, M. E., Bellows, C. G. and Aubin, J. E. (1989). Effects of Transforming Growth Factor ß and Epidermal Growth Factor an Cell Proliferation and the Formation of Bone Nodules in Isolated Fetal Rat Calvaria Cells. Journal of Cellular Physiology 140: 386-395 Turksen, K., Grigoriadis, A. E., Heersche, J. N. M. and Aubin, J. E. (1990). Forskolin has biphasic effects an osteoprogenitor cell differentiation in vitro. Journal of Cellular Physiology 142: 61-69 10 Bellows, C. G., Heersche, J. N. M. and Aubin, J. E. (1990). Determination of the Capacity for Proliferation and Differentiation of Osteoprogenitor Cells in the Presence and Absence of Dexamethasone. Developmental Biology 140: 132-138 " Bellows, C. G., Aubin, J. E. andHeersche, J. N. M. (1987). Physiological concentrations of glucocorticoids stimulate formation of bone nodules from isolated rat calvaria cells in vitro. Endocrinology 121, No. 6: 1985-1992 12 McCulloch, C. A. G., Fair, C. A., Tenenbaum, H. C., Limeback, H. and Homareau, R. (1990). Clonal Distribution of Osteoprogenitor Cells in Cultured Chick Periostea: Functional Relationship to Bone Formation. Developmental Biology 140: 352-361 Reginato, A. M., Lash, J. W. and Jimenez, S. A. (1986) Biosynthetic expression of type x collagen in embryonic chick sternum cartilage during development. J. Biol. Chem. 261: 2897-2904 14 Silbermann, M. (1990). In vitro systems for inducers of cartilage and bone development. Biomaterials 11: 47-49 1 5 Silbermann, M., Shurtz-Swirski, R., Lewinson, D., Shenzer, P. and Mayer, H. (1991). In vitro response of neonatal condylar cartilage to simultaneous exposure to the parathyroid hormone fragments 1-34, 28-48 and 53-84 hPTH. Cacif. Tissue Int. 48: 260-266 I6 Roach, H. I. (1990). Long-Term Organ Culture of Embryonic Chick Femora: A System for Investigating Bone and Cartilage Formation at an Intermediate Levelof Organization. Journal of Bone and Mineral Research 5: 85-99 " Duvos, C., Hollnagel, A., Wingender, E. and Mayer, H. (1991) Anabolic properties of hPTH mid-region. J. Endocr. Invest. 14 (Suppl. 3) Mallette, L. E. (1991) The Parathyroid Polyhormones: New Concepts in the Spectrum of Peptide Hormone Action. Endocrine Reviews 12, 2: 110-117 19 Stein, G. S., Lian, J. B., and Owen, T. A. (1990) Relationship of cell growth to the regulation of tissue-specific gene expression during osteoblast differentiation. FASEB J. 4: 3111-3123 20 Strauss, P. G., Cross, E. I., Schmidt, J., and Erfle, V. (1990) Gene expression during osteogenic differentiation in mandibular condyles in vitro. J. Cell. Biol. 110: 1369-1378 zl Vernillo, A. T., Ramamurthy, N. S., Lee, H.-M., and Rifkin, B. R. (1990) The effect of phenytoin an collagenase and gelatinase activities in UMR 106-01 rat osteoblastic osteosarcoma cells. Matrix 10: 27-32

Z. Orthop. 130 (1992)

22 Hamilton, J. A., Lingelbach, S., Partridge, N. C., and Martin, T. J. (1985) Regulation of plasminogen activator production by bone-resorbing hormones in normal and malignant osteoblasts. Endocrinology 116: 2186-2191 23 Murray, T. M., Rao, I. G., Muzaffar, S. A. and Ly, H. (1989) Human parathyroid hormone carboxylterminal peptide (53-84) stimulates alkaline phosphatase activity in dexamethasone-treated rat osteosarcoma cells in vitro. Endocrinology 124: 1097-1099 24 Silbermann, M., Von der Mark, K., and Heinegard, D. (1990) An immunohistochemical study of the distribution of matrical proteins in the mandibular condyle of neonatal mice. II. Non-collagenous proteins. J. Anat. 170: 23-31 zs Stirpe, N. S., and Goetinck, P. F. (1989) Gene regulation during cartilage differentiation: Temporal and spatial expression of link Protein and cartilage matrix protein in the developing limb. Development 107: 23-33 26 Fukuo, K., Takigawa, M., Tajima, K., Enomoto, M., Kumahara, Y., and Suzuki, F. (1986) Comparison of inhibition by a tumor promoter (12-O-tetradecanoyl- phorbol-13-acetate) of expression of the differentiated phenotype of chondrocytes in rabbit costal chondrocytes in culture with inhibition by retinoic acid. J. Biochem. 99: 385-396 Shurtz-Swirski, R., Lewinson, D., Shenzer, P., Mayer, H., and Silbermann, M. (1990). Effects of parathyroid hormone fragments an the growth of murine mandibular condylar cartilage in vitro. Acta Endocrinol. (Copenh.) 122: 217-226 28 Pines, M., and Hurwitz, S. (1988) The effect of parathyroid hormone and atrial natriuretic peptide an cyclic nucleotides production and Proliferation of avian epiphyseal growth plate chondroprogenitor cells. Endocrinology 123: 360-365 29 Koike, T., Iwamoto, M., Shimazu, A., Nakashima, K., Suzuki, F., and Kato, Y. (1990) Potent mitogenic effects of parathyroid hormone (PTH) an embryonic chick and rabbit chondrocytes. Differential effects of age an growth, proteoglycan, and cyclic AMP responses of chondrocytes to PTH. J. Clin. Invest. 85: 626-631 3° Centrella, M., McCarthy, T. L., and Canalis, E. (1988) Parathyroid hormone modulates transforming growth factor ß activity and binding in osteoblast-enriched cell cultures from fetal rat parietal bone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5889-5893 31 McCarthy, T. L., Centrella, M. and Canalis, E. (1990) Cyclic AMP induces insulin-like growth factor 1 synthesis in osteoblast-enriched cultures. J. Biol. Chem. 265: 15353-15356 32 Lichtler, A., Stover, M. L., Angilly, J., Kream, B. and Rowe, D. W. (1989) Isolation and characterisation of the rat a 1(I) collagen promotor. J. Biol. Chem. 264: 3072-3077 33 Egrise, D., Martin, D., Neve, P., Verhas, M., and Schoutens, A. (1990) Effects and interactions of 17Beta- estradiol, T3 and 1,25(OH)2D3 an cultured osteoblasts from mature rats. Bone and Mineral 11: 273-283 34 Kurose, H., Yamaoka, K., Okada, S., Nakajima, S., and Seino, Y. (1990) 1,25- Dihydroxyvitamin D3 [1,25-(OH)2D3] increases insulinlike growth factor 1 (IGF- I) receptors in clonal osteoblastic cells. Study an interaction of IGF-I and 1,25- (OH)2D3. Endocrinology 126: 2088-2094 31 Petkovich, P. M., Wrana, J. L., Grigoriadis, A. E., Heersche, J. N. M., and Sodek, J. (1987) 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Epidermal Growth Factor Receptors and Transforming Growth Factor ßLike Activity in a Bone-derived Cell Line. J. Biol. Chem. 262: 1342413428 36 Gerstenfeld, L. C., Kelly, C. M., Von Deck, M., and Lian, J. B. (1990) Effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3 an induction of chondrocyte maturation in culture: Extracellular matrix gene expression and morphology. Endocrinology 126: 1599- 1609 3' Carrino, D. A., Lidor, C., Edelstein, S., and Caplan, A. I. (1989) Proteoglycan synthesis in vitamin D-deficient cartilage: Recovery from vitamin D deficiency. Connect. Tissue Res. 19: 135-147 38 Minghetti, P. P., and Norman, A. W. (1988) 1,25(OH)2- Vitamin D3 receptors: gene regulation and genetic circuitry. FASEB J. 2: 30433053 39 Markose, E. R., Stein, J. L., Stein, G. S., and Lian, J. B. (1990) Vitamin D-mediated modifications in protein-DNA interactions at two promoter elements of theosteocalcin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1701-1705 Kerner, S. A., Scott, R. A., and Pike, J. W. (1989) Sequence elements in the human osteocalcin gene confer basal activation and inducible response to hormonal vitamin D3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4455-4459 Morrison, N. A., Shine, J., Fragonas, J.-C., Verkest, V., McMenemy, M. L., and Eisman, J. A. (1989) 1,25- Dihydroxyvitamin D-responsive element and glucocorticoid repression in the osteocalcin gene. Science 246: 1158- 1161

283

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

Differenzierung von knochenbildenden Zellen: Systeme und Regulatoren

Z. Orthop. 130 (1992)

H. Mayer und Mitarb.: Differenzierung von knochenbildenden Zellen

42 Ozono, K., Liao, J., Kerner, S. A., Scott, R. A., and Pike, J. W. (1990) The vitamin D-responsive element in the human osteocalcin gene. Association with a nuclear proto- oncogene enhancer. J. Biol. Chem. 265: 21881-21888 43 Schüle, R., Umesono, K., Mangelsdorf, D. J., Bolado, J., Pike, J. W., and Evans, R. M. (1990) Jun-Fos and receptors for vitamins A and D recognize a common response element in the human osteocalcin gene. Cell 61: 497-504 44 Dickson, I. and Walls, J. (1985) Vitamin A and bone formation. Biochem. J. 226: 789-795 45 Noji, S., Yamaai, T., Koyama, E., Nohno, T. and Taniguchi, S. (1989) Spatial and temporal expression pattern of retinoic acid receptor genes during mouse bone development. FEBS Letters 257: 93-96 46 Zelent, A., Krust, A., Petkovich, M., Kastner, P. and Chambon, P. (1989) Cloning of murine a and ß retinoic acid receptors and a novel receptor predominantly expressed in skin. Nature 339: 714-717 47 Nakayama, Y., Takahashi, K., Noji, S., Muto, K., Nishijima, K. and Taniguchi, S. (1990) Functional modes or retinoic acid in mouse osteoblastic clone MC3T3-E1, proved as a target cell for retinoic acid. FEBS Letters 261: 93-96 48 Grigoriadis, A. E., Petkovich, P. M., Rosenthal, E. E. and Heersche, J. N. M. (1986) Modulation by Retinoic Acid of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Effects an Alkaline Phosphatase Activity and Parathyroid Hormone Responsiveness in an Osteoblast-Like Osteosarcoma Cell Line. Endocrinology 119: 932-939 a9 Canalis, E., McCarthy, T. L. and Centrella, M. (1991) Growth factors and cytokines in bone cell metabolism. Annu. Rev. Med. 42: 17-24 so Centrella, M., McCarthy, T. L. and Canalis, E. (1988). Skeletal tissue and transforming growth factor ß. The FASEB Journal 2: 3066-3073 5' Centrella, M., McCarthy, T. L. and Canalis, E. (1987). Mitogenesis in fetal rat bone cells simultaneously exposed to type ß transforming growth factor and other growth regulators. The FASEB Journal 1: 312-317 s2 Massague, J. (1985) The transforming growth factors. TIBS June 1985: 237-240 13 Lyons, R. M. and Moses, H. L. (1990) Transforming growth factors and the regulation of cell proliferation. Eur. J. Biochem. 187: 467473 54 Battegay, E. J., Raines, E. W., Seifert, R. A., Bowen-Pope, D. F. and Ross, R. (1990) TGF-ß Induces Bimodal Proliferation of Connective Tissue Cells via Complex Control of an Autocrine PDGF Loop. Cell 63: 515-524 ss Wrana, J. L., Maeno, M., Hawrylyshyn, B., Yao, K.-L., Domenicucci, C. and Sodek, J. (1988) Differential Effects of Transforming Growth Factor-ß an the Synthesis of Extracellular Matrix Proteins by Normal Fetal Rat Calvarial Bone Cell Populations. The Journal of Cell Biology 106: 915-924 16 Noda, M. and Camilliere, J. J. (1989) In Vivo Stimulation of Bone Formation by Transforming Growth Factor-ß. Endocrinology 124:2991-2994 s7 Noda, M. (1989) Transcriptional regulation of osteocalcin production by type ß transforming growth factor in rat osteoblast-like cells. Endocrinology 124: 612-617 68 Tashjian, A. H., Voekel, E. F., Lazzaro, M., Singer, F. R., Roberts, A. B., Derynck, R., Winkler, M. E., Levine, L. (1981) a and ß human transforming growth factors stimulate prostaglandin production and bone resorption in cultured mouse calvaria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4535-4538 s9 Centrella, M. and Canalis, E. (1985) Transforming and nontransforming growth factors are present in medium conditioned by fetal rat calvariae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7335-7339 60 Carrington, J. L., Roberts, A. B., Flanders, K. C., Roche, N. S. and Reddi, A. H. (1988) Accumulation, Localization, and Compartmentation of Transforming Growth Factor ß During Endochondral Bone Development. The Journal of Cell Biology 107: 1969-1975 61 Lyons, K. M., Pelton, R. W. and Hogan, B. L. M. (1989) Patterns of expression of murine Vgr-1 and BMP-2a RNA suggest that transforming growth factor-ß-like genes coordinately regulate aspects of embryonic development. Genes & Development 3: 1657-1668 62 Celeste, A. J., Iannazzi, J. A., Taylor, R. C., Hewick, R. M., Rosen, V., Wang, E. A. and Wozney, J. M. (1990) Identification of transforming growth factor ß family members present in bone-inductive prote-

in purified from bovine bone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 98439847 63 Wang, E. A., Rosen, V., D'Allessandro, J. S., Bauduy, M., Cordes, P., Harada, T., Israel, D. I., Hewick, R. M., Kerns, K. M., LaPan, P., Luxenberg, D. P., McQuaid, D., Moutsatsos, I. K., Nove, J., and Wozney, J. M. (1990) Recombinant human bone morphogenetic Protein induces bone formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 22202224 64 Centrella, M., McCarthy, T. L. and Canalis, E. (1991) Activin-A Binding and Biochemical Effects in Osteoblast-Enriched Cultures from Fetal-Rat Parietal Bone. Molecular and Cellular Biology 11: 250-258 bs Weinberg, R. A. (1989). Positive and Negative Controls an Cell Growth. Biochemistry 28: 8263-8269 66 Miyazaki, K. and Horio, T. (1989). Growth Inhibitors: Molecular Diversity and Roles in Cell Proliferation. In Vitro Cellular & Developmental Biology 25: 866- 872 67 Rodan, S. B., Wesolowski, G., Hilton, D. J., Nicola, N. A. and Rodan, G. A. (1990). Leukemia Inhibitory Factor Binds with High Affinity to Preosteoblastic RCT-1 Cells and Potentiates the Retinoic Acid Induction of Alkaline Phosphatase. Endocrinology 127: 1602-1608 68 Noda, M., Vogel R. L., Hasson D. M., Rodan, G. A. (1990). Leukemia inhibitory factor suppresses proliferation, alkaline phosphatase activity, and type 1 collagen messenger ribonucleic acid (mRNA) level and enhanced osteopontin mRNA levels in murine osteoblast-like (MC3T3E1) cells. Endocronology 127: 185-90 69 Alexander, C. M. and Werb, Z. (1989) Proteinases and extracellular matrix remodeling. Current Opinion in Cell Biology 1: 974-982 70 Tsuji, T., Okada, F., Yamaguchi, K., and Nakamura, T. (1990) Molecular cloning of the large subunit of transforming growth factor type ß masking protein and expression of the mRNA in various rat tissues. Cell Biology 87: 8835-8839 71 Bentz, H., Chang, R.-J., Thompson, A. Y., Glaser, C. B. and Rosen, D. M. (1990) Amino acid sequence of bovine osteoinductive Factor. J. Biol. Chem. 265: 5024- 5029 72 Ruoslahti, E., and Yamaguchi, Y. (1991) Proteoglycans as Modulators of Growth Factor Activities. Cell 64: 867-869 73 Yayon, A., Klagsbrun, M., Esko, J. D., Leder, P., and Ornitz, D. M. (1991) Cell Surface, Heparin-like Molecules Are Required for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor to Its High Affinity Receptor. Cell 64: 841-848 74 Panayotou, G., End, P., Aumailley, M., Timpl, R. and Engel, J. (1989) Domains of Laminin with Growth-Factor Activity. Cell 56: 93101 Olson, E.N. (1990) MyoD family: a paradigm for development? Genes & Development 4: 1454-1461 7 6 Weintraub, H., Tapscott, S., Davis, R., Thayer, M., Adam, M., Lassar, A. and Miller, A.D. (1989) Activation of muscle specific genes in pigment, nerve, fat, liver and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5434-5438 Sorrentino, V., Pepperkok, R., Davis, R.L., Ansorge, W. and Phillipson, L. (1990) Cell proliferation inhibited by MyoDl independently of myogenic differentiation. Nature 345: 613-615 78 Thayer, M.J., Tapscott, S.J., Davis, R.L., Wright, W.E., Lassar, A.B. and Weintraub, H. (1989) Positive Autoregulation of the Myogenic Determination Gene MyoDl. Cell 58: 241-248 Lassar, A.B., Thayer, M.J., Overall, R. W. and Weintraub, H. (1989) MyoD is a sequence-specific DNA binding protein requiring region of myc homology to bind to the muscle creative kinase enhancer. Cell 58: 659-667 80 Vaidya, T.B., Rhodes, S.J., Taparowsky, E.J. and Konieczny, S.F. (1989) Fibroblast Growth Factor and Transforming Growth Factor ß Repress Transcription ofthe Myogenic Regulatory Gene MyoDl. Mol. Cell. Biol. 9: 3576-3579 81 Benezra, R., Davis, R.L., Lockshon, D., Turner, D.L. and Weintraub, H. (1990) The protein Id: A Negative Regulator of Helix-LoopHelix DNA Binding Proteins. Cell 61: 49-59

Priv. Doz. Dr. H. Mayer Gesellschaft für Biotechnologische Forschung Mascheroder Weg 1 3300 Braunschweig

Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.

284