CIirzica Chimica Acta, 0 Elsevier/North-Holland
CCA
72 (1976) 1’73-180 Biomedical Press,
Amsterdam
Printed
in The
Netherlands
7887
DIPHENOLOXYDASES: GLOBULES ROUGES
PRESENCE
DANS LES MEMBRANES
D. TUIL, M. BERTHELON et J. DEMOS * avec la collaboration technique de B. DAUTREAUX
Institut de Pathologic (France) (Recu
-
le 20 f&rier
MolCculaire
DE
et P. CAUT
** , 24 , rue du Faubourg
Saini-Jacques,
75014 Paris
1976)
Summary Diphenoloxidases:
Presence in the membrane
of human erythrocyte
Diphenoloxidases, enzymes which accelerate the auto-oxidation of epinephrine and Dopa, have been described by one of us in blood platelets. Earlier we identified these enzymes in different animal species and particularly iA human red blood cells. With the object of localising these enzymes and of understanding their function in vivo, we separated the ghosts of red blood cells according to the method described by Fairbanks G., Steck, T.L. and Wallach, D.F.H. (1971) (Biochemistry 1, 2606) and using the protease inhibitors diisopropylfluorophosphate (DFP) (10” M) and 6-aminocaproic acid 10e2 M in sodium phosphate buffer, 5 X 1O-3 M (pH 8). These ghosts, totally free of haemoglobin, were first of all pulverised in liquid nitrogen then treated ultrasonically. The supernatant shows the presence of a band of diphenoloxidase activity on starch gel electrophoresis and two bands on isoelectrofocusing in polyacrylamide gel pH 5 to pH 8 after incubation with 0.02 M Dopa, 0.076 M Tris, 0.005 M citric acid, 0.004 M magnesium, pH 8.7 for 2 h at 37’C. These enzymes differ from (Na, K)-ATPase in that they are neither inhibited by DFP (10-l M) nor by EDTA (1O-2 M) but are inhibited by lead acetate 10m2 M. Like (Na, K)-ATPase diphenoloxidases are present at membranes level. The role in vivo of these diphenoloxidases in ATPase activity of red blood cells is discussed. * A qui toutes communications doivent etre adrew%. ** Groupe tJ 15 de 1’Institut National de la San14 et de la Rwhrrche au Centre National de la Rrchwche Scirntifique.
M6dirale.
Lahoratoirt
asso&
174
Introduction Les diphenoloxydases classees dans la rubrique numero 1.14.18.1 de la nomenclature ont et& trouvees en 1968 par I’un d’entre nous dans les plaquettes sanguines humaines [ 1 J. Ces enzymes accelerent in vitro la transformation de la Dopa en melanine et de l’adrenaline en adrenochrome. Dans le cadre de la myopathie, maladie musculaire genetique, l’un d’entre nous a mis en evidence un variant de ces diphenoloxydases qui presente des modifications de vitesse de migration electrophoretique sur gel d’amidon et une diminution de l’activite specifique dans les extraits plaquettaires humains ]1,2 I. Ulterieurement, nous avons etudie ces enzymes dans differents tissus de diverses especes animales [ 31. Quelle qui soit l’espece consideree, le rein, les globules rouges et les plaquettes sanguines sont apparus comme etant les tissus les plus riches en diphenoloxydases. Le present travail montre que ces enzymes sont presents dans les membranes des globules rouges. Mdthode
et techniques
1. Prkparation
des membranes
de globules rouges
Les membranes de globules rouges sont preparees selon la methode d&rite par Fairbanks et ~011. [4]Au tours de la lyse des globules rouges par le phosphate de sodium 5 X lo-” M, pH 8.0 on ajoute dans le tampon des inhibiteurs de proteases (acide caproique 10Y2 M et diisopropylfluorophosphate (DFP) 10m3 M). Apres plusieurs lavages, les membranes sont congelees avec l’azote liquide, broyees, remises en suspension dans de l’eau bidistillee. La suspension est ultrasonnee pendant 10 min (M.S.E., Power low, amplitude 5). Les debris cellulaires sont elimines par centrifugation a 37 000 X g pendant 30 min. Le surnageant est mis a dialyser dans une solution de tampon Tris/HCl 0.2 M, pH 7.2.
2. Dosage des pro tkines mem branaires La quantite de proteines totales contenue dans les membranes de globules rouges est do&e par la methode de Lowry et exprimee en mg de proteines par ml d’extraits [ 51. Le rendement en proteines totales ainsi obtenu est environ de 400 pg pour 100 ml de sang frais (200 ,ug/ml). 3. Mesure de l’activitc’ oxydante spe’cifique Les mesures d’activite sont faites sur les extraits contenant 0.2 mg de proteines totales par ml selon une methode mise au point par l’un d’entre nous [ 21, d&i&e de la technique proposee par Inchiosa pour le dosage d’activite de 1’ “epinephrine oxidising enzyme” [ 6 1. L’adrenalinr est utilisee comme substrat sous forme de bitartrate d’adrknaline 2.2 X lo-” M dans un tampon Tris/HCl 0.375 M, pH 9.55 et MgC12 0.025 M adjust6 extemporanement a l’air a 37OC apres une incubation de 30 min. On determine la quantite d’adrenochrome formee par l’enregistrement spectro-
175
photometrique continu de la reaction a 485 nm. L’enregistrement est effectue 15 s (secondes) exactement apres l’introduction des extraits membranaires avec successivement trois dilutions de chaque extrait 0.2-0.3 et 0.4 ml (volume final 2.7 ml). Une solution d’adrenochrome dans le rapport molaire de 0.04 par rapport a l’adrenaline est ajoutee comme entrakeur de la reaction enzymatique selon les indications d’Inchiosa [ 61. L’activite mesuree par la pente de la reaction a l’origine est exprimee en 10e2 unites d’absorbance (U.A.) par min et par mg de proteines totales. 4. Electrophore‘se sur gel d’amidon Les electrophoreses des proteines membranaires contenant 0.2 mg/ml de proteines totales sont effect&es sur gel d’amidon conformement a la technique utilisee par l’un d’entre nous avec les extraits plaquettaires [ 1,2]. On utilise une solution de tampon Tris-citrique-magnesium a pH 8.7 (Tris 0.076 M/acide citrique 0.005 M/MgCl* 0.004 M) pendant 4 h a 320 V (40 mA). La migration terminee, le gel est fendu dans le sens de l’epaisseur, immerge dans une solution de Dopa 0.02 M/Tris acide citrique/Mg (pH 8.7) puis incube a 37°C a la lumiere pendant 2 h (la face interne du gel tournee vers la lumiere). L’activite enzymatique se traduit par l’apparition d’une bande noire de melanine qui est supprim&e par l’action du chauffage des extraits a 65°C 10 min ou par l’action de la Pronase. On arrete la reaction par l’immersion du gel dans une solution de tampon acetatelacide acetique/alcool (pH 4.8) acide acetique 0.2 M acetate de sodium 0.2 M et alcool ethylique a 50 pour 100. 5. Isoe’lectrofocalisation SW tube de gel d’acrylamide ci 7.5 pour 100 Cette technique est realiske selon la methode d&rite par Drysdale et al. [7] et par Finlayson et Chrambach [8]. Apres une premiere phase de prefocalisation d’une heure (1 mA par gel), on place a la surface du gel 25 ~1 de solution contenant 0.2 mg/ml de proteines et on retablit a nouveau le courant 1 mA par gel a 500 V et a 4°C pendant 4 h. La migration des proteines s’effectue sur le gel de la cathode vers l’anode. La migration des proteines terminee, le gel est retire du tube, lave a l’eau bidistillee puis plonge dans un tube a essai contenant une solution de Dopa 0.02 M Tris/ 0.076 M acide citrique 0.005 M/MgC12 0.004 M (pH 8.7) puis incube a 37OC pendant 2 h. On arrete la reaction enzymatique par l’immersion du gel dans l’acide trichloracetique a 20 pour 100. Rbultats 1. L ‘activite’ oxydante sptkifique L’activite specifique (pour 1 mg de proteines/ml) des extraits membranaires a ete trouvee de 332 X lo-* U.O./mg/min. (Elle est superieure a celle obtenue avec des globules rouges hemolyses oil elle est trouvee de 43 X lo-’ U.O./mg/ min).
Fig. 1. Electrophork sur gel d’amidon 320 V, 40 mA, 4 h. 1. d’extraits de membranes contenant 0.2 mg de prot6ines totales par ml. 1, sensde la migration t%xtrophort?tique.
de globules rouges
2. Les e’lectrophore‘ses sur gel dhmidon Apres incubation on voit apparaitre une bande nette de mklanine qui temoigne de l’activite enzymatique (Fig. 1). Cette reaction est supprimee par l’acetate de plomb h forte concentration. Le diisopropylfluorophosphate 19,101 et l’ethyldiamine tetra-acetique [ 111 inhibiteurs de 1’ATPase sont sans effet (Figs. 2 et 3). 3. Les iso~lectrofocalisations Les isoelectrofocalisations suivies d’incubation du gel dans une solution de Dopa 0.02 M dans un tampon Tris-citrique-magnesium (pH 8.7) permettent d’observer une bande diffuse d’activite pour des ampholines qui etablissent un gradient de pH de 3 a 10 (Fig. 4). Avec des ampholines pH 5 a 8, on peut dis-
Fig. 2. ElectrophorPse sur gel d’amidon 320 V, 40 mA, 4 h: d’extrait de membranes de globules rouges contenant 0.2 mg de proteines totales par ml en pr6sence de DFP B diffkentes concentrations: 1, +DFP 5 X 10m4 M; 2. + DFP 1 X 10-l M. 1, sensde la migration 6lectrophor6tique.
Fig. 3. Electrophorke SW gel d’amidon 320 V, 40 mA, 4 h: d’extraits de membranes de globules rouges contenant 0.2 mg de protkines tot&s par ml en pr@sence de diffkrents inhibiteurs de 1’ATPase (Na, K). 1, a&t&e de Pb low2 M; 2, EDTA 10Y2 M; 3, DFP 10-l M; 4. DFP lo-” M. ?, sens de la migration Blectrophoktique.
Fig. 4. Iso~lectrofocalisation acrylamide ampholine pH 3 B 10, 4 h B 4’C, 1 mA par gel 500 V: d’extraits membranaires contenant 0.2 mg de protCines totales par ml. 1 et 1 bis. gel en totalit (1, image rkelle et I bis, schema); 2 et 2 bis, gel centr6 SW la bade grossi 2 fois (2, image r&?lle et 2 bis, sch&na). 1. sens de la migration BlectrophorBtique.
Fig. 5. Isoelectrofocalisation acrylamide ampholine pH 5 B 8. 4 h B 4°C. 1 mA par gel 500 V: d’extraits membranaires contenant 0.2 mg de proteines totales par ml. Gel en totalit (1, image rtklle et 1 his, sch&na). I, sens de la migration PlectrophorCtique. Fig. 6. Is&lectrofocalisation acrylamide ampholine pH 5 $ 8, 4 h B 4’C. 1 mA par gel 500 V: d’extraits de membranes de globules rouges contenant 0.2 mg de proteines totales par ml en prhmce de differents inhibiteurs de 1’ATPase (Na, K). 1 et 1 bis. DFP 10-Z M (1. image r&elk et 1 bis, sch&ma): 2 et 2 bis, EDTA 10T2 M (2, image r&k et 2 bis, schema); 3 et 3 bis, DFP 10-l M (3. image r&lle et 3 bis, schema); 4 et 4 bis, acetate de Pb 10m2 M (4. rCelle et 4 bis, schema). J, sensde la migration 6lrrtrophor6tique.
cerner deux bandes d’activite distinctes (Fig. 5). Les isoelectrofocalisations pH 5 a 8 confirment les r&ultats obtenus sur gel d’amidon avec les differents inhibiteurs diisopropylfluorophosphate, ~thyIc~iamine t~tra-ac~tique et acetate de plomb (Fig. 6). Les bandes ne sont pas supprimees par le DFP lo-’ M et 10-l M ou par 1’EDTA 10e2 M. Elles le sont par l’acetate de plomb lo-’ M. Discussion
et conclusion
Ainsi l’adtivite oxydante des extraits tissulaires, d&rite par l’un d’entre nous, qui s’exerce sur la Dopa et l’adrenaline existe dans les membranes des globules rouges. La nature enzymatique de cette activite n’est pas douteuse: elle persiste apres dialyse, elle est supprimee par l’action du chauffage a 65°C 10 min, elle est supprimee par l’action de la pronase apres 10 min, elle est dkcelable apres electrophorese et iso~lectrofocalisation, Comme pour 1“‘epinephrine oxidising enzyme” decrit par Inchiosa dans le muscle uterin de bovin, cette activitk est maximum in vitro a pH alcalin. Elle differe en cela de l’activite peroxydasique de l’hemoglobine qui s’exerce a pH voisin de la neutralite et que nous avons etablie lice i l’heme. Nous l’avons separee des proprietes oxydantes de l’heme par chromatographie sur colonne d’un hkmolysat de globules rouges. L’activite oxydante identifiee dans les membranes des globules rouges est supprimee par l’acetate de plomb i forte concentration mais elle ne l’est pas par les autres inhibiteurs de 1’ATPase. L”‘epinephrine oxidising enzyme” decrit par Inchiosa dans le muscle uterin de bovin et dans divers autres tissus de diverses especes animales [6,7] a des proprietes voisines des diphenoloxydases que nous decrivons chez l’homme. Ces enzymes agissent in vitro sur l’adr~naline i pH alcalin et accblerent sa transformation en adrenochrome en presence de l’oxygene de l’air. In vivo, selon l’auteur, l’adrenochrome forme par l’enzyme sous la forme de zwiterion se comporterait en inhibiteur de l’activite ATPasique de la myosine en se fixant sur sa fonction SH [6].
ATPose
rJCtlve
ATPose
!nhrb&
Ainsi, l’activite ATPasique au niveau des membranes des globules rouges pourrait dependre de la quantite d’adrenochrome forme a partir de l’adrenaline qui diffuse dans les globules rouges dans sa phase circulante [ 13-151 et de l’activite Ce qui est actuellement decrit dans la des diph~noloxydases membranaires. myopathie humaine pourrait donner un argument en faveur de cette interpretation. Certains auteurs ont trouve chez les myopathes une modification de l’activite ATPasique des membranes, des globules rouges en presence d’ouabaine [16,17J. Plus recemment, Rose et cull. trouvent chez les malades et chez les porteurs apparemment normaux de la lesion genetique une fixation accrue de
179
P,, sur certaines prot&nes des membranes des globules rouges isolhes par Alectrophor&e [ 181. L’un d’entre nous a trouvk dans la maladie et comme indice de la l&ion g&&ique une diminution de l’activitb spkcifique des diph&noloxydases au niveau des plaquettes sanguines [ 21 ,elles-m$mes relativement riches en ad& naline [ 191, puis au niveau des globules rouges. On peut alors avancer que ce que les auteurs relatent i propos de la myopathie et qu’ils attribuent i un trouble de la perm&abilit& cellulaire est dfi $ la modification d’activitk des diphbnoloxydases observhe par ailleurs dans la maladie. R&urn6 L’un d’entre nous a identifik dans les plaquettes sanguines des enzymes qui acc&?ent in vitro l’autoxydation de l’adrknaline et de la Dopa (diph&oloxydases). Ces diph&oloxydases sont kgalement pr&entes dans la plupart des tissus et notamment dans les globules rouges des esp&es humaines et animales. Nous avons prkpa& des membranes de globules rouges humains selon la m& thode d&rite par Fairbanks et al. en ajoutant dans la solution tampon des inhibiteurs des proGases. Ces membranes sont ensuite broyt!es dans l’azote liquide et soumises A l’action des ultra-sons. Les extraits recueillis par centrifugation sont ensuite dialys& 18 h contre un tampon Tris/HCl 0.2 M (pH 7.2). L’&ude de l’activitb spkcifique avec l’adrknaline; les klectrophortises sur gel d’amidon et les isoklectrofocalisation suivies d’incubation avec une solution de Dopa, montrent que ces extraits apr$s dialyse sont pourvus d’activitk diphGnoloxydasique. Cette activitk est supprimbe par l’action de la chaleur ti 65”C, 10 min et de la pronase. Certains inhibiteurs de l’activitb ATPasique tels que le diisopropylfluorophosphate (10-l M) et l’kthyldiamine tktra-achtique (lo-* M) sont sans effet sur l’activitk diph&oloxydasique. Par contre, celle-ci est supprim&e par l’acbtate de Plomb ( 10e2 M). Comme pour 1”‘epinephrine oxidising enzyme” dkcrit par Inchiosa dans les espitces animales, l’activiti! des diph&mloxydases humaines et notamment celle que nous avons mise en hvidence dans les membranes des globules rouges, se r& vGle in vitro i pH alcalin (pH 9.55). In vivo, l’intervention de celles-ci sur l’activith ATPasique, par l’intermhdiaire de l’adr&ochrome form6 i partir de 1’ adr&aline contenue dans les globules rouges et dont Inchiosa a montrk le rSle inhibiteur sur les propri&!s ATPasique de la myosine est envisagke. Remerciements Nous remercions 1’Institut National de la Sant4 et de la Recherche Mkdicale qui a permis la Galisation de ce travail, le Cornit FranGais de Soutien ti la Recherche contre la Myopathie (COFRASORM) et 1’Union des Myopathes de France (UMF) qui nous ont aid& par leur subventions. Rkfbrences 1
Demos.
J. (1968)
C.R.
Acad.
2
Demos.
J. (1973)
Clin.
G&net.
3
Tuil,
Berth&m,
4
Fairbanks.
D.
G..
Steck,
Sci.
M. et Demos, T.L.
Paris
267.
677
4, 79 J. (1975)
et Wallach.
D.F.H.
Clin.
Chim.
(1971)
Acta
61,
Biochemistry
219 1, 2606
180
5
Lowry.
6
Inchiosa.
O.H.. Jr., J.W.,
7
Drysdale,
8
Finlayson,
9
Hokin,
L.E.
10
Hokin,
L.E. New J.C.
11
Skou,
Inchiosa.
I3
Bain,
I4
Gedroyc,
N.J..
M.A.
Biochem.
(1967)
Righetti,
G.R.
Press, 12
Rosebrough.
Fan,
P. et Bunn,
et Chrambach.
et Yoda.
A.
et Dahl,
A.L.
A.
(1965)
J.L.
et Randall,
Pharmacol. H.F.
(1971)
(1971)
(1965)
Phys.
Jr., M.A.
W.A.,
Graunt.
Rev.
W.E.
Chem.
193,
265
40,
Acta
97,
Acta
229.
42
291 594
re Bd .
Pathway.
3
Biochem.
Pharmacol.
Vol.
6.
Metabolic
Transport,
Academic
0.
W.
Kamura, Peter,
et Nawago,
I7
Brown,
H.D..
Chattopadhyay.
18
Roses,
A.D.,
Roses,
Worsfold,
596
0. M.
I.B.
et Suffolk,
M. Koskowski,
J.B.,
45,
et Rodriguez,
15
(1930)
(1969) S.V. C.R.
(1937) Sot.
(1939)
Okoyama
et Pearson,
C.hl.
M.J.,
S.K. Miller,
Biol. Igakai’
(1969)
et Patcl, SE.,
J. Physiol.
A.B.
Hull.
105, Zasshi
Malherbe,
H. et Bone.
A.D.
(1954)
Nature
51,
Science
174,
557
233
1047
(1967) K.L.
2032
91,
405 Clin.
Jr..
18,
London
J. Lab.
294,193 Weil
Biol.
York/London
16
19
(1951) Biophys.
Biochem.
Biophys.
Metabolic
R.J. 329
Biochim.
Anal.
Biochim.
(1972)
16,
and
Med.. 157,
Appel,
103 1577 S.H.
(1976)
New
Engl.
J.
Med.
CCA
72 (1976) 1’73-180 Biomedical Press,
Amsterdam
Printed
in The
Netherlands
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DANS LES MEMBRANES
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Institut de Pathologic (France) (Recu
-
le 20 f&rier
MolCculaire
DE
et P. CAUT
** , 24 , rue du Faubourg
Saini-Jacques,
75014 Paris
1976)
Summary Diphenoloxidases:
Presence in the membrane
of human erythrocyte
Diphenoloxidases, enzymes which accelerate the auto-oxidation of epinephrine and Dopa, have been described by one of us in blood platelets. Earlier we identified these enzymes in different animal species and particularly iA human red blood cells. With the object of localising these enzymes and of understanding their function in vivo, we separated the ghosts of red blood cells according to the method described by Fairbanks G., Steck, T.L. and Wallach, D.F.H. (1971) (Biochemistry 1, 2606) and using the protease inhibitors diisopropylfluorophosphate (DFP) (10” M) and 6-aminocaproic acid 10e2 M in sodium phosphate buffer, 5 X 1O-3 M (pH 8). These ghosts, totally free of haemoglobin, were first of all pulverised in liquid nitrogen then treated ultrasonically. The supernatant shows the presence of a band of diphenoloxidase activity on starch gel electrophoresis and two bands on isoelectrofocusing in polyacrylamide gel pH 5 to pH 8 after incubation with 0.02 M Dopa, 0.076 M Tris, 0.005 M citric acid, 0.004 M magnesium, pH 8.7 for 2 h at 37’C. These enzymes differ from (Na, K)-ATPase in that they are neither inhibited by DFP (10-l M) nor by EDTA (1O-2 M) but are inhibited by lead acetate 10m2 M. Like (Na, K)-ATPase diphenoloxidases are present at membranes level. The role in vivo of these diphenoloxidases in ATPase activity of red blood cells is discussed. * A qui toutes communications doivent etre adrew%. ** Groupe tJ 15 de 1’Institut National de la San14 et de la Rwhrrche au Centre National de la Rrchwche Scirntifique.
M6dirale.
Lahoratoirt
asso&
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Introduction Les diphenoloxydases classees dans la rubrique numero 1.14.18.1 de la nomenclature ont et& trouvees en 1968 par I’un d’entre nous dans les plaquettes sanguines humaines [ 1 J. Ces enzymes accelerent in vitro la transformation de la Dopa en melanine et de l’adrenaline en adrenochrome. Dans le cadre de la myopathie, maladie musculaire genetique, l’un d’entre nous a mis en evidence un variant de ces diphenoloxydases qui presente des modifications de vitesse de migration electrophoretique sur gel d’amidon et une diminution de l’activite specifique dans les extraits plaquettaires humains ]1,2 I. Ulterieurement, nous avons etudie ces enzymes dans differents tissus de diverses especes animales [ 31. Quelle qui soit l’espece consideree, le rein, les globules rouges et les plaquettes sanguines sont apparus comme etant les tissus les plus riches en diphenoloxydases. Le present travail montre que ces enzymes sont presents dans les membranes des globules rouges. Mdthode
et techniques
1. Prkparation
des membranes
de globules rouges
Les membranes de globules rouges sont preparees selon la methode d&rite par Fairbanks et ~011. [4]Au tours de la lyse des globules rouges par le phosphate de sodium 5 X lo-” M, pH 8.0 on ajoute dans le tampon des inhibiteurs de proteases (acide caproique 10Y2 M et diisopropylfluorophosphate (DFP) 10m3 M). Apres plusieurs lavages, les membranes sont congelees avec l’azote liquide, broyees, remises en suspension dans de l’eau bidistillee. La suspension est ultrasonnee pendant 10 min (M.S.E., Power low, amplitude 5). Les debris cellulaires sont elimines par centrifugation a 37 000 X g pendant 30 min. Le surnageant est mis a dialyser dans une solution de tampon Tris/HCl 0.2 M, pH 7.2.
2. Dosage des pro tkines mem branaires La quantite de proteines totales contenue dans les membranes de globules rouges est do&e par la methode de Lowry et exprimee en mg de proteines par ml d’extraits [ 51. Le rendement en proteines totales ainsi obtenu est environ de 400 pg pour 100 ml de sang frais (200 ,ug/ml). 3. Mesure de l’activitc’ oxydante spe’cifique Les mesures d’activite sont faites sur les extraits contenant 0.2 mg de proteines totales par ml selon une methode mise au point par l’un d’entre nous [ 21, d&i&e de la technique proposee par Inchiosa pour le dosage d’activite de 1’ “epinephrine oxidising enzyme” [ 6 1. L’adrenalinr est utilisee comme substrat sous forme de bitartrate d’adrknaline 2.2 X lo-” M dans un tampon Tris/HCl 0.375 M, pH 9.55 et MgC12 0.025 M adjust6 extemporanement a l’air a 37OC apres une incubation de 30 min. On determine la quantite d’adrenochrome formee par l’enregistrement spectro-
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photometrique continu de la reaction a 485 nm. L’enregistrement est effectue 15 s (secondes) exactement apres l’introduction des extraits membranaires avec successivement trois dilutions de chaque extrait 0.2-0.3 et 0.4 ml (volume final 2.7 ml). Une solution d’adrenochrome dans le rapport molaire de 0.04 par rapport a l’adrenaline est ajoutee comme entrakeur de la reaction enzymatique selon les indications d’Inchiosa [ 61. L’activite mesuree par la pente de la reaction a l’origine est exprimee en 10e2 unites d’absorbance (U.A.) par min et par mg de proteines totales. 4. Electrophore‘se sur gel d’amidon Les electrophoreses des proteines membranaires contenant 0.2 mg/ml de proteines totales sont effect&es sur gel d’amidon conformement a la technique utilisee par l’un d’entre nous avec les extraits plaquettaires [ 1,2]. On utilise une solution de tampon Tris-citrique-magnesium a pH 8.7 (Tris 0.076 M/acide citrique 0.005 M/MgCl* 0.004 M) pendant 4 h a 320 V (40 mA). La migration terminee, le gel est fendu dans le sens de l’epaisseur, immerge dans une solution de Dopa 0.02 M/Tris acide citrique/Mg (pH 8.7) puis incube a 37°C a la lumiere pendant 2 h (la face interne du gel tournee vers la lumiere). L’activite enzymatique se traduit par l’apparition d’une bande noire de melanine qui est supprim&e par l’action du chauffage des extraits a 65°C 10 min ou par l’action de la Pronase. On arrete la reaction par l’immersion du gel dans une solution de tampon acetatelacide acetique/alcool (pH 4.8) acide acetique 0.2 M acetate de sodium 0.2 M et alcool ethylique a 50 pour 100. 5. Isoe’lectrofocalisation SW tube de gel d’acrylamide ci 7.5 pour 100 Cette technique est realiske selon la methode d&rite par Drysdale et al. [7] et par Finlayson et Chrambach [8]. Apres une premiere phase de prefocalisation d’une heure (1 mA par gel), on place a la surface du gel 25 ~1 de solution contenant 0.2 mg/ml de proteines et on retablit a nouveau le courant 1 mA par gel a 500 V et a 4°C pendant 4 h. La migration des proteines s’effectue sur le gel de la cathode vers l’anode. La migration des proteines terminee, le gel est retire du tube, lave a l’eau bidistillee puis plonge dans un tube a essai contenant une solution de Dopa 0.02 M Tris/ 0.076 M acide citrique 0.005 M/MgC12 0.004 M (pH 8.7) puis incube a 37OC pendant 2 h. On arrete la reaction enzymatique par l’immersion du gel dans l’acide trichloracetique a 20 pour 100. Rbultats 1. L ‘activite’ oxydante sptkifique L’activite specifique (pour 1 mg de proteines/ml) des extraits membranaires a ete trouvee de 332 X lo-* U.O./mg/min. (Elle est superieure a celle obtenue avec des globules rouges hemolyses oil elle est trouvee de 43 X lo-’ U.O./mg/ min).
Fig. 1. Electrophork sur gel d’amidon 320 V, 40 mA, 4 h. 1. d’extraits de membranes contenant 0.2 mg de prot6ines totales par ml. 1, sensde la migration t%xtrophort?tique.
de globules rouges
2. Les e’lectrophore‘ses sur gel dhmidon Apres incubation on voit apparaitre une bande nette de mklanine qui temoigne de l’activite enzymatique (Fig. 1). Cette reaction est supprimee par l’acetate de plomb h forte concentration. Le diisopropylfluorophosphate 19,101 et l’ethyldiamine tetra-acetique [ 111 inhibiteurs de 1’ATPase sont sans effet (Figs. 2 et 3). 3. Les iso~lectrofocalisations Les isoelectrofocalisations suivies d’incubation du gel dans une solution de Dopa 0.02 M dans un tampon Tris-citrique-magnesium (pH 8.7) permettent d’observer une bande diffuse d’activite pour des ampholines qui etablissent un gradient de pH de 3 a 10 (Fig. 4). Avec des ampholines pH 5 a 8, on peut dis-
Fig. 2. ElectrophorPse sur gel d’amidon 320 V, 40 mA, 4 h: d’extrait de membranes de globules rouges contenant 0.2 mg de proteines totales par ml en pr6sence de DFP B diffkentes concentrations: 1, +DFP 5 X 10m4 M; 2. + DFP 1 X 10-l M. 1, sensde la migration 6lectrophor6tique.
Fig. 3. Electrophorke SW gel d’amidon 320 V, 40 mA, 4 h: d’extraits de membranes de globules rouges contenant 0.2 mg de protkines tot&s par ml en pr@sence de diffkrents inhibiteurs de 1’ATPase (Na, K). 1, a&t&e de Pb low2 M; 2, EDTA 10Y2 M; 3, DFP 10-l M; 4. DFP lo-” M. ?, sens de la migration Blectrophoktique.
Fig. 4. Iso~lectrofocalisation acrylamide ampholine pH 3 B 10, 4 h B 4’C, 1 mA par gel 500 V: d’extraits membranaires contenant 0.2 mg de protCines totales par ml. 1 et 1 bis. gel en totalit (1, image rkelle et I bis, schema); 2 et 2 bis, gel centr6 SW la bade grossi 2 fois (2, image r&?lle et 2 bis, sch&na). 1. sens de la migration BlectrophorBtique.
Fig. 5. Isoelectrofocalisation acrylamide ampholine pH 5 B 8. 4 h B 4°C. 1 mA par gel 500 V: d’extraits membranaires contenant 0.2 mg de proteines totales par ml. Gel en totalit (1, image rtklle et 1 his, sch&na). I, sens de la migration PlectrophorCtique. Fig. 6. Is&lectrofocalisation acrylamide ampholine pH 5 $ 8, 4 h B 4’C. 1 mA par gel 500 V: d’extraits de membranes de globules rouges contenant 0.2 mg de proteines totales par ml en prhmce de differents inhibiteurs de 1’ATPase (Na, K). 1 et 1 bis. DFP 10-Z M (1. image r&elk et 1 bis, sch&ma): 2 et 2 bis, EDTA 10T2 M (2, image r&k et 2 bis, schema); 3 et 3 bis, DFP 10-l M (3. image r&lle et 3 bis, schema); 4 et 4 bis, acetate de Pb 10m2 M (4. rCelle et 4 bis, schema). J, sensde la migration 6lrrtrophor6tique.
cerner deux bandes d’activite distinctes (Fig. 5). Les isoelectrofocalisations pH 5 a 8 confirment les r&ultats obtenus sur gel d’amidon avec les differents inhibiteurs diisopropylfluorophosphate, ~thyIc~iamine t~tra-ac~tique et acetate de plomb (Fig. 6). Les bandes ne sont pas supprimees par le DFP lo-’ M et 10-l M ou par 1’EDTA 10e2 M. Elles le sont par l’acetate de plomb lo-’ M. Discussion
et conclusion
Ainsi l’adtivite oxydante des extraits tissulaires, d&rite par l’un d’entre nous, qui s’exerce sur la Dopa et l’adrenaline existe dans les membranes des globules rouges. La nature enzymatique de cette activite n’est pas douteuse: elle persiste apres dialyse, elle est supprimee par l’action du chauffage a 65°C 10 min, elle est supprimee par l’action de la pronase apres 10 min, elle est dkcelable apres electrophorese et iso~lectrofocalisation, Comme pour 1“‘epinephrine oxidising enzyme” decrit par Inchiosa dans le muscle uterin de bovin, cette activitk est maximum in vitro a pH alcalin. Elle differe en cela de l’activite peroxydasique de l’hemoglobine qui s’exerce a pH voisin de la neutralite et que nous avons etablie lice i l’heme. Nous l’avons separee des proprietes oxydantes de l’heme par chromatographie sur colonne d’un hkmolysat de globules rouges. L’activite oxydante identifiee dans les membranes des globules rouges est supprimee par l’acetate de plomb i forte concentration mais elle ne l’est pas par les autres inhibiteurs de 1’ATPase. L”‘epinephrine oxidising enzyme” decrit par Inchiosa dans le muscle uterin de bovin et dans divers autres tissus de diverses especes animales [6,7] a des proprietes voisines des diphenoloxydases que nous decrivons chez l’homme. Ces enzymes agissent in vitro sur l’adr~naline i pH alcalin et accblerent sa transformation en adrenochrome en presence de l’oxygene de l’air. In vivo, selon l’auteur, l’adrenochrome forme par l’enzyme sous la forme de zwiterion se comporterait en inhibiteur de l’activite ATPasique de la myosine en se fixant sur sa fonction SH [6].
ATPose
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ATPose
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Ainsi, l’activite ATPasique au niveau des membranes des globules rouges pourrait dependre de la quantite d’adrenochrome forme a partir de l’adrenaline qui diffuse dans les globules rouges dans sa phase circulante [ 13-151 et de l’activite Ce qui est actuellement decrit dans la des diph~noloxydases membranaires. myopathie humaine pourrait donner un argument en faveur de cette interpretation. Certains auteurs ont trouve chez les myopathes une modification de l’activite ATPasique des membranes, des globules rouges en presence d’ouabaine [16,17J. Plus recemment, Rose et cull. trouvent chez les malades et chez les porteurs apparemment normaux de la lesion genetique une fixation accrue de
179
P,, sur certaines prot&nes des membranes des globules rouges isolhes par Alectrophor&e [ 181. L’un d’entre nous a trouvk dans la maladie et comme indice de la l&ion g&&ique une diminution de l’activitb spkcifique des diph&noloxydases au niveau des plaquettes sanguines [ 21 ,elles-m$mes relativement riches en ad& naline [ 191, puis au niveau des globules rouges. On peut alors avancer que ce que les auteurs relatent i propos de la myopathie et qu’ils attribuent i un trouble de la perm&abilit& cellulaire est dfi $ la modification d’activitk des diphbnoloxydases observhe par ailleurs dans la maladie. R&urn6 L’un d’entre nous a identifik dans les plaquettes sanguines des enzymes qui acc&?ent in vitro l’autoxydation de l’adrknaline et de la Dopa (diph&oloxydases). Ces diph&oloxydases sont kgalement pr&entes dans la plupart des tissus et notamment dans les globules rouges des esp&es humaines et animales. Nous avons prkpa& des membranes de globules rouges humains selon la m& thode d&rite par Fairbanks et al. en ajoutant dans la solution tampon des inhibiteurs des proGases. Ces membranes sont ensuite broyt!es dans l’azote liquide et soumises A l’action des ultra-sons. Les extraits recueillis par centrifugation sont ensuite dialys& 18 h contre un tampon Tris/HCl 0.2 M (pH 7.2). L’&ude de l’activitb spkcifique avec l’adrknaline; les klectrophortises sur gel d’amidon et les isoklectrofocalisation suivies d’incubation avec une solution de Dopa, montrent que ces extraits apr$s dialyse sont pourvus d’activitk diphGnoloxydasique. Cette activitk est supprimbe par l’action de la chaleur ti 65”C, 10 min et de la pronase. Certains inhibiteurs de l’activitb ATPasique tels que le diisopropylfluorophosphate (10-l M) et l’kthyldiamine tktra-achtique (lo-* M) sont sans effet sur l’activitk diph&oloxydasique. Par contre, celle-ci est supprim&e par l’acbtate de Plomb ( 10e2 M). Comme pour 1”‘epinephrine oxidising enzyme” dkcrit par Inchiosa dans les espitces animales, l’activiti! des diph&mloxydases humaines et notamment celle que nous avons mise en hvidence dans les membranes des globules rouges, se r& vGle in vitro i pH alcalin (pH 9.55). In vivo, l’intervention de celles-ci sur l’activith ATPasique, par l’intermhdiaire de l’adr&ochrome form6 i partir de 1’ adr&aline contenue dans les globules rouges et dont Inchiosa a montrk le rSle inhibiteur sur les propri&!s ATPasique de la myosine est envisagke. Remerciements Nous remercions 1’Institut National de la Sant4 et de la Recherche Mkdicale qui a permis la Galisation de ce travail, le Cornit FranGais de Soutien ti la Recherche contre la Myopathie (COFRASORM) et 1’Union des Myopathes de France (UMF) qui nous ont aid& par leur subventions. Rkfbrences 1
Demos.
J. (1968)
C.R.
Acad.
2
Demos.
J. (1973)
Clin.
G&net.
3
Tuil,
Berth&m,
4
Fairbanks.
D.
G..
Steck,
Sci.
M. et Demos, T.L.
Paris
267.
677
4, 79 J. (1975)
et Wallach.
D.F.H.
Clin.
Chim.
(1971)
Acta
61,
Biochemistry
219 1, 2606
180
5
Lowry.
6
Inchiosa.
O.H.. Jr., J.W.,
7
Drysdale,
8
Finlayson,
9
Hokin,
L.E.
10
Hokin,
L.E. New J.C.
11
Skou,
Inchiosa.
I3
Bain,
I4
Gedroyc,
N.J..
M.A.
Biochem.
(1967)
Righetti,
G.R.
Press, 12
Rosebrough.
Fan,
P. et Bunn,
et Chrambach.
et Yoda.
A.
et Dahl,
A.L.
A.
(1965)
J.L.
et Randall,
Pharmacol. H.F.
(1971)
(1971)
(1965)
Phys.
Jr., M.A.
W.A.,
Graunt.
Rev.
W.E.
Chem.
193,
265
40,
Acta
97,
Acta
229.
42
291 594
re Bd .
Pathway.
3
Biochem.
Pharmacol.
Vol.
6.
Metabolic
Transport,
Academic
0.
W.
Kamura, Peter,
et Nawago,
I7
Brown,
H.D..
Chattopadhyay.
18
Roses,
A.D.,
Roses,
Worsfold,
596
0. M.
I.B.
et Suffolk,
M. Koskowski,
J.B.,
45,
et Rodriguez,
15
(1930)
(1969) S.V. C.R.
(1937) Sot.
(1939)
Okoyama
et Pearson,
C.hl.
M.J.,
S.K. Miller,
Biol. Igakai’
(1969)
et Patcl, SE.,
J. Physiol.
A.B.
Hull.
105, Zasshi
Malherbe,
H. et Bone.
A.D.
(1954)
Nature
51,
Science
174,
557
233
1047
(1967) K.L.
2032
91,
405 Clin.
Jr..
18,
London
J. Lab.
294,193 Weil
Biol.
York/London
16
19
(1951) Biophys.
Biochem.
Biophys.
Metabolic
R.J. 329
Biochim.
Anal.
Biochim.
(1972)
16,
and
Med.. 157,
Appel,
103 1577 S.H.
(1976)
New
Engl.
J.
Med.
