Klin. Pädiatr. 203 (1991)
Störungen des Membranskeletts der Erythrozyten bei hereditärer Sphärozytose und Elliptozytose: Bedeutung des molekularen Defektes für Pathogenese und klinischen Schweregrad * S. W. Eber Universitäts-Kinderklinik Göltingen
Zusammenfassung In den letzten Jahren konnte eine stetig zunehmende Zahl von genetisch bedingten Varianten von Membranproteinen der Erythrozyten und Defekten eines membranassoziierten Netzwerkes (Membranskelett) nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen haben die Pathogenese hämolytischer Anämien infolge von Erythrozyten-Membrandefekten vielfach aufgeklärt. Besonders bei der hereditären Sphärozytose und Elliptozytose besteht eine enge Beziehung zwischen dem klinischen Schweregrad und dem jeweiligen Defekt, so daß die biochemische Charakterisierung oftmals eine Aussage über den zu erwartenden Verlauf der Erkrankung und die Notwendigkeit der Splenektomie erlaubt. Das Erythrozytenmembranskelett erstreckt sich an der inneren Oberfläche der Erythrozytenmembran und ist für ihre Stabilität unter der Scherkraftbelastung im Kreislauf verantwortlich. Es besteht aus den Proteinen Spektrin, Aktin, Bande 4. I und Bande 4.9. Spektrin ist das Hauptmembranprotein und liegt nahezu ausschließlich in tetramerer Form vor: ein Tetramer besteht aus 2 Cl!- und 2 ß-Spektrinketten. Mit Hilfe denaturierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen und nativer Agarose-Gelelektrophoresen kann die Zusammensetzung der Membranproteine analysiert werden. Das Verhältnis von tetramerem Spektrin zu dimerem Spektrin wird auf nativen Agarose-Gelelektrophoresen bestimmt. Die Konzentration von Spektrin wird am besten mit einem ELISA unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen humanes Spektrin gemessen. Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion und DNA Sequenzierung konnte die molekulargenetische Ursache einzelner Membranproteindefekte aufgeklärt werden. Die meisten Fälle von hereditärer Sphärozytose können auf einen deutlich verminderten Gehalt an Spektrin zurückgeführt werden. Aufgrund unserer klinisch-hämatologischen und biochemischen Untersu-
Correlation between the clinical severity, erythrocyte morphology and abnormal membrane skeleton in hereditary spherocytosis and elIiptocytosis During recent years an increasing number of inherited variants of erythrocyte membrane proteins and defects of the membrane skeleton could be described. Mostly these defects explain the pathogenesis of hemolytic anemias due to erythrocyte membrane defects. For hereditary spherocytosis and elliptocytosis a dose correlation between the dinical severity and the biochemical defect was found; thus biochemical characterization can give valuable information about the expected course of the disease and the need for splenectomy. The erythrocyte membrane skeleton stretches along the inner surface of the membrane; it provides the stability of the erythrocyte under circulatory shear stress. The membrane skeleton consists of spectrin, actin, band 4.1 and band 4.9. Spectrin is the major component. In the membrane mostly all spectrin self-associates to the tetrameric form: one tetramer is formed by two Cl! and two ßchains. By denaturating SDS polyacrylamide gelelectrophoresis the composition of the membrane proteins can be analysed. The portion of tetrameric and dimeric spectrin is determined on native agarose gel electrophoresis. The concentration of spectrin in the membrane can be measured by an enzyme linked immunosorbent assay using monodonal antibodies against human spectrin. By polymerase chain reaction and DNA sequencing the moleculargenetic cause of singular membrane defects was cIarified. Hereditary spherocytosis was mostly due to a more or less diminished concentration of spectrin. Based on hematological, cIinical and biochemical observations, a new cIassification of spherocytosis (mild, moderate and severe form) is proposed. In addition to routine hematologic determinations and osmotic fragility, erythro-
Abkürzungen HS = Hereditäre Sphärozytose HE = Hereditäre Elliptozytose Sp = Spektrin D = Dimer Klin. Pädiatr. 203 (1991) 284-295 © 1991 F. Enke Verlag Stuttgart
• Nach einem Vortrag, gehalten auF der 36. Tagung der Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie, Frankfurt, 30. 11. bis I. 12. 19'10.
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chungen wird eine neue Einteilung der hereditären Sphärozytose (leichte, mittelschwere und schwere Form) vorgeschlagen, die neben den klassischen Untersuchungsmethoden (Zeichen der gesteigerten Hämolyse, osmotische Resistenz) auch die Konzentration von Spektrin berücksichtigt. Die Erkrankung verläuft um so schwerer, je niedriger die Spektrin-Konzentration der Erythrozyten ist. Die hereditäre Elliptozytose kann in ca. 30070 der Fälle auf eine gestörte Tetramerisierung von Spektrin zurückgeführt werden. Meistens liegen Defekte des N-terminalen 80000 Dalton schweren al-Peptids vor. Die defekte a-Kette kann durch Analyse der Peptide nach begrenzter tryptischer Verdauung des Spektrins näher charakterisiert werden. Nach dem veränderten Molekulargewicht des anomalen tryptischen al Peptids werden die varianten Spektrin a-Ketten als Spektrin a f / 46 , Sp a l / 50 , Sp a 1i65 , Sp a l174 und Sp a l178 bezeichnet. Für die Mehrzahl der varianten a-Ketten konnte ein spezieller Austausch einer Aminosäure in der Peptidsequenz nachgewiesen werden. Bisher wurden nur wenige Patienten mit hereditärer Elliptozytose infolge einer verkürzten ßSpektrinkette beschrieben. Die Verkürzung der ß-Kette ist auf den Verlust des C-terminalen phosphorylierten Peptids zurückzuführen. Molekulare Ursache dafür ist ein Defekt am 3'Ende des ß-Spektringens, der zu einem vorzeitigen Kettenabbruch in der Peptidsynthese führt. Die Indikation zur Splenektomie wird zunehmend zurückhaltender gestellt. Die Patienten mit der schweren Sphärozytose und Elliptozytose, die regelmäßig transfundiert werden müssen, sollten im Kleinkindesalter nicht vor dem 3. Lebensjahr - splenektomiert werden. Bei Patienten mit mittelschwerer Sphärozytose ist die Splenektomie nur in den Fällen erforderlich, in denen aufgrund schwerer hämolytischer Krisen rezidivierende Transfusionen erforderlich sind und eine ausgeprägte Leistungsminderung infolge der chronischen hämolytischen Anämie besteht.
Einleitung
Die Erythrozytenmembrandefekte sind in Mitteleuropa bei weitem die häufigste Ursache für angeborene hämolytische Anämien. In Deutschland muß man von ca. 30000 Patienten mit diesen Erkrankungen ausgehen. Klinisch inapparente Anlageträger für rezessiv vererbte hämolytische Anämien sind weitaus häufiger. Aufgrund von Screening-Untersuchungen gibt es allein für die hereditäre Sphärozytose 760000 Genträger (Eber et al. , 1991). Infolge der vielfach charakteristischen Erythrozytenmorphologie unterscheidet man 5 Krankheiten (Tabelle
Tab. 1 Hereditäre Erkrankungen infolge von Erythrozytenmembrandefekten ~E_rk_ra_n_k_U_n_ge_n
1. 2 3. 4. 5.
Hereditäre Hereditäre Hereditäre Hereditäre Hereditäre
1
Sphärozytose (HS) Elliptozytose (HEl Pyropoikilozytose (HPPI Stomatozytose Akanthozytose
Häufigkeit 1: 5000 1 : 5000 selten selten selten
Klin. Pädiatr. 203 (1991) cyte spectrin content is taken into account. The disease severity correlates with the diminution of spectrin. In hereditary elliptocytosis the concentration of tetrameric spectrin is reduced in about 30% of the patients. Defects of the N-terminal a I 80000 dalton peptide are predominantly found. The defective a chain can be furt her studied by analysis of "tryptic" peptides after limited tryptic digestion of the spectrin. According to the reduced molecular weight of the anomalous tryptic a I peptide the variant spectrin a chains are designed as Spectrin a 1I46, Sp a 1l50 , Sp a 1l65 , Sp a ll74 and Spa 1l78 • In most cases a single amino acid substitution of the a chain could be proven. Until now only singular patients with hereditary elliptocytosis due to a shortened spectrin ß chain have been described. The shortening of the ß chain is due to a loss of the C-terminal phosphorylated peptide. The molecular cause is a defect at the 3'end of the ß spectrin gen, resulting in apremature termination of the peptide chain-synthesis. The indication for splenectomy should be very restricted. Patients with severe spherocytosis and elliptocytosis who are regularly transfused, should be splenectomized in early childhood - not under the age of 2 years. Patients with a moderate spherocytosis should be splenectomized only if recurrent, severe, transfusion dependent hemolytic crises occur and a decrease of vitality and physical ability caused by chronic hemolytic anemia persists.
I). Am häufigsten kommt die hereditäre Sphärozytose vor. Sie hat unter den Membrandefekten die größte klinische Bedeutung; abgesehen von heterozygoten Anlageträgern für die rezessive Form erkranken die meisten Genträger an einer mehr oder weniger schweren hämolytischen Anämie. Trotz ähnlicher Häufigkeit ist die klinische Bedeutung der hereditären Elliptozytose weitaus geringer, da die meisten Anlageträger keine klinische Symptomatik entwickeln. Eine Sonderform der hereditären Elliptozytose ist die seltene hereditäre Pyropoikilozytose: Patienten mit dieser schweren hämolytischen Anämie werden auch durch die Splenektomie nicht vollständig geheilt.
In den letzten Jahren wurde eine stetig zunehmende Zahl von genetisch bedingten Varianten von Membranproteinen und Defekten eines Membran-assoziierten Netzwerkes beschrieben (Übersichtsartikel u. a. von Palek, 1985; Becker und Lux, 1985; Davies und Lux, 1989; Pekrun und Gratzer, 1990). Viele Membranproteindefekte führen zu einer Instabilität der Erythrozytenmembran, die eine Fragmentation, Poikilozytose und Verkürzung der Erythrozyten-Lebensdauer bewirkt. Infolge des Verlustes von Zelloberfläche oder der veränderten physikalisch-chemischen Membraneigenschaften kommt es zu
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Störungen des Membranskeletts der Erythrozyten
S. W. Eber
Klin. Pädiatr. 203 (1991) verschiedenen anomalen Zellformen (Sphärozyten oder Elliptozyten u. a.). Besonders bei der hereditären Sphärozytose und Elliptozytose besteht eine enge Beziehung zwischen dem klinischen Schweregrad und dem jeweiligen Defekt, so daß sich aus der biochemischen Charakterisierung oftmals klinisch anwendbare Konsequenzen, z. B. im Hinblick auf die Notwendigkeit der Splenektomie ergeben.
Glykophorin C
Prot'ln 3
Glykophonn A
Aufbau der Erythrozytenmembran
Die Membran des Erythrozyten ist aus zwei Teilen aufgebaut, nämlich einer äußeren Lipiddoppelschicht, der Plasmamembran und einem inneren membranständigen Netzwerk, dem Membranskelett (Abb. I) (Übersichtsartikel von Gardner und Bennett, 1989; Bennett, 1990). Die Nomenklatur der Erythrozytenmembranproteine nach Fairbanks et al. (1971) und Steck (1974) ist in Tabelle 2 dargestellt. Die Plasmamembran wird von den integralen Proteinen (Bande 3, Glycophorin A und C) durchdrungen. Bande 3 besteht aus einem integralen ovaloiden Anteil in der Plasmamembran und einem zytoplasmatischen, stabförmigen Anteil, der der Verbindung zwischen Plasmamembran und Membranskelett dient. An der inneren Oberfläche des Erythrozyten erstreckt sich das Netzwerk des Membranskeletts (Abb. I). Es besteht aus den peripheren Proteinen Spektrin, Aktin, Bande 4.1 und 4.9. Ein Spektrinmolekül besteht aus 2 verschiedenen Proteinketten, einer {X- und einer ß-Kette. Diese Verbindung wird als Spektrin-Dimer bezeichnet. Um die Fäden des Netzwerkes bilden zu können, lagern sich die Spektrin-Dimere zu höheren Polymeren zusammen. Es entstehen Tetramere und in geringerem Umfang Spektrin-Oligomere von bis zu 12 Ketten. Erst diese Tetramere und Oligomere können ein durchgehendes Protein-Netzwerk aufbauen, das die äußere Doppellipidschicht stabilisiert. Die Knotenpunkte des Membranskeletts bestehen aus kurzen Aktinfilamenten, die durch Tropomyosin und Bande 4.9 stabili-
Tab. 2
G3PD
Homoglobin
Abb. 1
Shematische Darstellung der Erythrozytenmembran (nach Davies und Lux, 1989) Die LIpiddoppelschicht Wird von Bande 3, Glykophorin A und Glykophorln C durchdrungen Bande 3 ragt mit einem stabförmlgen Anteil, an dem das Membranskelett verankert ist,ln das Zeilinnere. Das Membranskelett besteht aus Spektrin, Aktin, Bande 4 1 und Bande 4 9 Tropomyosin stabilisiert die kurzen Aktlnfilarnente. Uber Ankyrin (Bande 2.1) ist das Membranskelett an Bande 3, über Bande 4.1 an Glykophorin C gebunden
siert werden. An jedem Knotenpunkt setzen im Durchschnitt 6 Spektrinmoleküle an, so daß eine sechseckige Grundstruktur des Membranskeletts entsteht (Liu et al.. 1987). Die Verbindung von Spektrin und Aktin wird durch die Bande 4.1 gefestigt. Über 2 Verankerungsproteine, nämlich Ankyrin und Protein 4.1, ist das Membranskelett an Bande 3 und Glycophorin C in der Lipiddoppclschicht gebunden. Ankyrin bindet Spektrin an den zytoplasmatischen Anteil von Bande 3. Es wird vermutet, daß diese Bindung durch Bande 4.2 verstärkt wird. Bande 4.1 bindet das Membranskelett an das Glycophorin C.
Die Hauptmembranproteine des menschlichen Erythrozyten"'
Elektrophoretische Bande ci
ProteIn 1>1
Molekulargewicht
1 und 2
Spektrin
240000 220000
2.1
Ankyrin
215000
3b)
Anionenkanal
90000- 120000
Anzahl von Molekülen pro Zelle 240000 100000 1200000
4.1
80000
200000
4.2
72000
240000
4.9
50000
100000
5
Aktin
42000
500000
6
Glyzerlnaldehyd-3Phosphatdehydrogenase
36000
500000
71 } 7.2 7.3
Tropomyosin u a. Proteine
30000 } 28000 26000
400000
24000
100000
8 9
Globin
17000
", ausgenommen die Glykoproteine Bande 3 Ist ein Integrales Protein, Bande 7 besteht aus Integralen und peripheren Proteinen; die übrlg,m Prot,:Inll Sind P'lflphf:f ,I nach Fairbanks et al. (19711 und Steck (1974) 1>1
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Analyse der Erythrozytenmembranproteine Bei Verdacht auf einen Erythrozytenmembrandefekt sollte eine biochemische Analyse der Membranproteine erfolgen. Die Zusammensetzung der Membranproteine wird am besten durch SDS-PolyacrylamidGelelektrophoresen nach Lämmli (1970) (Abb. 2) und Fairbanks et al. (1971) untersucht. Für die Bestimmung der Konzentration von tetramerem und dimerem Spektrin werden gereinigte, weitgehend hämoglobinfreie Erythrozytenmembranen in einem Medium niedriger Ionenstärke bei 0 0 inkubiert. Bei diesen Bedingungen zerfällt das Membranskelett in seine Einzelbestandteile: Spektrin, Aktin und Bande 4.1. Spektrin-Tetramere und Spektrin-Dimere bleiben erhalten und können auf einer nativen Agarose-Gelelektrophorese getrennt werden. Die relative Konzentration von Spektrin-Tetramer unr. -Dimer wird densitometrisch ermittelt. Bei ca. '/3 der Patienten mit Elliptozytose ist die Konzentration von tetramerem Spektrin infolge verschiedener Spektrin (X- und ß-Ketten-Varianten vermindert (Palek, 1985). Zur näheren Charakterisierung der Spektrin (X-Ketten Varianten kann eine begrenzte tryptische Verdauung des Spektrins durchgeführt werden
Protein, Spektrin-
Z.l Aktin 6 7,1 7.2
t
! t
__ ~ _ _...
~3=-7 Ganze Eryt hrozytenmembran
Tab. 3
Triton SheLLs
Abb. 2 SDS PoIyacrylamid-Gelelektrophorese der Erythrozytenmembran , Im linken Teil der Abbildung ist die Auftrennung der Membranproteine in der gesamten Erythrozytenmembran dargestellt, im rechten Teil die der peripheren Proteine des Membranskeletts (Triton Shellsl (nach vorheriger Abtrennung der integralen Proteine mit einem nichtionischen Detergens)
Klin. Pädiatr. 203 (1991) (Marchesi et al., 1987). Die "tryptischen Peptide" werden nach ihrer Größe und Ladung mit ein- und zweidimensionalen Elektrophoresetechniken - z. T. in Kombination mit isoelektrischer Fokussierung - analysiert. Die Konzentration von Spektrin in den Erythrozyten wurde bisher durch Farbstoffelution der Proteinbanden aus SDS-Polyacrylamid Gelelektrophoresen (Eber et al., 1990) oder durch Radio-Imuno Assay (Agre et al., 1985 und 1986) bestimmt. Zur einfacheren Bestimmung der Spektrinkonzenlration setzen wir seit kurzem einen "Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay" (EUSA) unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen humanes Spektrin ein.
Hereditäre Sphärozytose Das klinische Bild zeigt eine große Variationsbreite (Tab. 3). Die sogenannte "typische Sphärozytose" kann einen leichten oder mittel schweren Verlauf nehmen (Becker und Lux, 1985). Sie wird autosomal dominant vererbt. Ca. 80070 der Patienten mit Sphärozytose weisen eine Verminderung von Spektrin in der Erythrozytenmembran auf (Agre et al., 1985 und 1986; Eber et al., 1990). Die Verminderung der Spektrinkonzentration ist charakteristisch für die Sphärozytose und wird bei keiner anderen normozytären Anämie gefunden (Agre et aI., 1986). Die verminderte Spektrinkonzentration geht mit einer erniedrigten Spektrindichte in der Membran einher; die Spektrinkonzentration wird dabei entweder auf Bande 3 (Waugh und Agre, 1988) oder auf die Phospholipide (Eber et al., 1990) bezogen. Die erniedrigte Spektrindichte ist für die Pathogenese der Sphärozytose von entscheidender Bedeutung. Nach den Untersuchungen von Waugh und Agre (1988) verursacht sie Veränderungen von physikalisch-rheologischen Materialeigenschaften der Erythrozytenmembran: die Membranelastizität und der Widerstand der Eryhtrozytenmembran gegen Oberflächenveränderungen (Bildung von Membranabschnürungen) sind um so niedriger, je geringer die Konzentration an Spektrin pro Bande 3 in den Erythrozyten ist. Dadurch kommt es zum zunehmenden Oberflächenverlust der Erythrozyten und zur Bildung von rigiden Sphärozyten, die in der Milz vorzeitig abgebaut werden. Die Ursache der erniedrigten Spektrinkonzentration ist in den meisten Fällen von "typischer Sphärozytose" nicht bekannt; diskutiert werden neben verschiedenen Spektrinvarianten auch funktionelle Störungen oder verminderte Konzentrationen von Ankyrin oder Bande 3.
Defekte der Membranproteine bel hereditärer Sphärozytose
Krankheitsbild
Vererbung
ProteIndefekt
Häufigkeit
"Typische" HS (leicht, mittelschweri
Autosomal dominant
Erniedrigter Spektringehalt um 20-50%
=80% aller Patienten mit HS
Schwere HS
Autosomal rezessiv
Erniedrigter Spektringehalt um 40-60% infolge einer defekten Spektrin-a-Kette
=3% aller Patienten mit HS
Schwere HS mit neurologischen Störungen
Autosomal dominant
Erniedrigter Ankynngehalt
selten
Mittelschwere HS
Autosomal dominant
Gestörte Bindung von Spektrin am ProteIn 4 1
selten
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Störungen des Membranskelells der Erythrozyten
S. W. Eber
K/in. Pädiatr. 203 (/99/) Eine rezessiv vererbte Sphärozytose konnten wir bei ca. 20070 unserer Patienten nachweisen (Eber et al. , 1990). Eine ähnliche Häufigkeit wurde auch von Bekker und Lux (1985) beschrieben. Bei 3070 unserer Patienten lag eine "atypische" schwere Verlaufsform der rezessiven Sphärozytose vor. Diese Patienten benötigen regelmäßige Transfusionen, um die Hämoglobinkonzentration über 6 g/dl zu halten. Die Spektrinkonzentration ist um 4060070 vermindert (Agre et al., 1982, 1985 und 1986; Eber et al. , 1990). Ursache der verminderten Spektrinkonzentration sind Defekte der Spektrin ex-Kette: bei der begrenzten tryptischen Verdauung der ex-lI-Region entstehen anomale Peptide mit saurem, isoelektrischem Punkt (Winke/mann et al. , 1989).
Eine ähnliche Beziehung zum Schweregrad der Sphärozytose fanden wir auch, indem wir die Bestimmung der osmotischen Fragilität der Erythrozyten semiquantitativ auswerteten (Eber et al. , 1990). Es wurden dabei die NaCI-Konzentrationen bei Beginn der osmotischen Hämolyse (1070 Hämolyse), bei mittlerer Hämolyse (50 070 Hämolyse) und bei vollständiger Hämolyse (100070) getrennt nach der Untersuchung im frischen und 24 Stunden inkubierten Blut berücksichtigt. Heterozygote Anlageträger der Sphärozytose haben eine normale bis leicht erhöhte osmotische Fragilität. Die Erythrozyten von Patienten mit leichter, mittelschwerer und schwerer Verlaufsform hämolysieren bei um so höheren NaCI-Konzentration, je schwerer die Erkrankung verläuft (Schröter und Eber, 1989).
In seltenen Fällen konnte eine Zuordnung des Sphärozytose-Gens zum kurzen Arm des Chromosoms 8 nachgewiesen werden, auf dem das Ankyrin-Gen lokalisiert ist (Lux et al. , 1990; Costa et aL, 1990). Bei einer Deletion auf dem kurzen Arm von Chromosom 8 wurde ein Syndrom, bestehend aus schwerer Sphärozytose, psychomotorischer Entwicklungsverzögerung und Dysmorphiezeichen beschrieben (Chi/cote et aL, 1987; Kitetani et aL, 1988). Ursache dieser Sonderform der Sphärozytose ist eine auf 50070 erniedrigte Konzentration von Ankyrin, die zu einer sekundären Spektrinverminderung auf 80070 der Norm führt (Lux et aL, 1990). Eine weitere Sonderform der Sphärozytose konnte auf eine defekte ßSpektrinkette mit abnormer SH-Brückenbildung zurückgeführt werden (Becker et aL, 1987). Dadurch kommt es zu einer um 50070 verminderten Bindung von Spektrin an Protein 4.1 (Wolfe et aL, 1982; Goodman et aL, 1982).
Aufgrund der Untersuchung von 80 Patienten mit Sphärozytose wird eine neue Einteilung der Sphärozytose in 3 Schweregrade (leichte, mittelschwere und schwere Verlaufsform) vorgeschlagen (Eber et al., 1990). Die Einteilung basiert auf der unterschiedlichen Konzentration von Hämoglobin und Bilirubin, sowie der RetikulozytenzahL Sie wird durch die semiquantitative
Die Beziehung zwischen dem klinischen Schweregrad und dem Spektringehalt der Erythrozyten wird in Abb. 3 dargestellt: die Spektrin-Konzentration war normal bei symptomlosen, heterozygoten Anlageträgern für die rezessive Sphärozytose, und nur geringfügig vermindert bei Patienten mit leichter Sphärozytose; bei Patienten mit mittelschwerer Verlaufsform war sie auf 6272070 der Norm deutlich vermindert. Eine Verminderung der Spektrin-Konzentration auf 60070 der Norm konnten wir auch bei zwei Patienten mit schwerer Sphärozytose nachweisen: die Spektrin-Konzentration ihrer Erythrozyten ist möglicherweise noch wesentlich geringer als dargestellt, da die Patienten regelmäßig transfundiert wurden.
Tab. 4
Normal ( n =13)
§
250
. 200 )(
~
N 0
a.
~
'::l .>< ~
HS-Anlag~
(n=4 )
t t
150
0
L~ichl
(n=7 )
tt
Mill~lschw~r
( n =6) Schw~r
(n = 2)
4
~ 100
E L &
.>< Ul
Abb. 3
Spektrlnkonzentratlon in den Erythrozyten von Patienten mit unterschiedlich schwerer Sphärozytose (leichte, rnlttelschwere und schwere Verlaufsform), sowie bel asymplomatlschen heterozygoten Anlageträger für rezessive HS Die Konzentration von Spektrln pro Erythrozyt Wild als Anzahl der Moleküle pro Zelle angegeben; sie wird aus der rnolaren Konzentration von Spektrin unter Berücksichtl(lung der Loschmldtschen Zahl (1 Mol = 6,022 x 10 71 Moleküle) berechnet
Klinische Schweregrade der hereditären Sphärozytose HS-Anlage
Leichte HS
Mittelschwere HS
Schwere HS"
Hämoglobin (g/dl)
Normal
Retikulozyten (%)
2 50-80
6 8 >10 > 3 40 60
Normal
Normal oder gering erhöht
Deutlich erhöht
Deutlich erhoht
Gering erhöht
Deutlich erhoht
Deutlich erhöht
Deutlich erhoht
Bilirubin Img/dl) Spektringehalt" (% des Normalwertes) Osmotische Fragilität Frisches Blut Inkubiertes Blut
" Werte vor TransfUSion
"
Normal (Mittelwert ± SD) 226±35 x 10 3 Moleküle pro Zelle
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Störungen des Membranskeletts der Erythrozyten
Knapp die Hälfte der Patienten zeigen eine leichte Verlaufsform mit kompensierter hämolytischer Anämie. Transfusionsbedürftige hämolytische Krisen kommen nur vereinzelt vor; nur wenige unserer Patienten mußten wegen einer aplastischen Krise transfundiert werden. Eine mittelschwere Form der Sphärozytose liegt bei ca. 50010 der Patienten vor. Die Patienten haben eine chronische hämolytische Anämie. Aufgrund einer schweren Hyperbilirubinämie und Anämie ist im Neugeborenenalter oftmals eine Austauschtransfusion oder eine Transfusion erforderlich. In vielen Fällen treten im Kindesalter hämolytische Krisen auf, die z. T. Transfusionen erfordern. Eine schwere transfusionsbedürftige aplastische Krise haben wir bei unseren Patienten nur jeweils einmal beobachtet. Sie wird meist durch Parvovirus B 19 verursacht (Lefrere et al., 1986; Pekrun et al., 1988); nach der Infektion kann man von einer lebenslangen Immunität ausgehen. Eine schwere, autosomal rezessive vererbte Form konnten wir bei 2 Patienten beobachten. Diese Patienten benötigen regelmäßige Transfusionen, um die Hämoglobinkonzentration über 6 g/dl zu halten.
Indikation zur Splenektomie
Ziel der Splenektomie ist es, schwere transfusionsbedürftige hämolytische oder aplastische Krisen, sowie die Bildung von Gallenstein zu vermeiden (Dacie, 1985). Bei Patienten mit ausgeprägter chronischer hämolytischer Anämie bestehen zudem eine verminderte Belastbarkeit und ein Vitalitätsverlust, die die Entwicklung und
Tab. 5
Lebensqualität der Patienten z. T. beeinträchtigen können. Die Indikation zur Splenektomie wird allerdings zunehmend zurückhaltender gestellt, da trotz Pneumkokkenimpfung und mehrjähriger postoperativer PenicillinProphylaxe 1-2% der splenektomierten Patienten an einer schweren Postsplenektomie-Infektion (overwhelming postsplenectomy infection = OPSI) (Hays et al. , 1984; Golematis et al., 1989) erkranken, an der bis zu 50% der Patienten versterben (Holschneider et al., 1983). Die Patienten mit der schweren SphäroZYtose sollten im Kleinkindesalter splenektomiert werden, insbesondere um eine transfusionsbedingte Virusübertragung und eine schwere sekundäre Organhämosiderose zu vermeiden. Aufgrund der besonderen Gefährdung durch Postsplenektomie-Infektionen bei Splenektomie in den ersten beiden Lebensjahren (Heier, 1980; Eraklis et al. , 1967) sollte die Operation möglichst nicht vor dem 3. bis 4. Lebensjahr erfolgen. Patienten mit der mittelschweren Form sollten nur dann splenektomiert werden, wenn aufgrund schwerer hämolytischer Krisen rezidivierende Transfusionen erforderlich sind und eine ausgeprägte Leistungsminderung infolge der chronischen hämolytischen Anämie besteht. Die Patienten mit der leichten Form müssen in aller Regel im Kindes- und Jugendalter nicht splenektomiert werden (Eber et al., 1990). Das optimale chirurgische Vorgehen bei Patienten mit leichter und mittelschwerer Sphärozytose, die eine "symptomatische" Cholelithiasis entwickeln aber keine gehäuften transfusions bedürftigen hämolytischen Krisen durchgemacht haben, ist noch nicht gesichert. Während die meisten Autoren bisher die einzeitige Cholezystektomie und Splenektomie empfahlen (Dacie, 1985) erscheint uns dieses Vorgehen in Anbetracht neuer Methoden zur Gallensteinentfernung [laparoskopische Cholezystektomie (Trede et al. , 1990), extrakorporale Stoßwellentherapie (Sackmann et al., 1988) und endoskopische Sphinkterotomie bei Choledocholithiasis (Goekcora et al. , 1989)] nicht mehr gerechtfertigt; symptomatische Gallenblasensteine sollten auch im Kindesalter durch laparoskopische Cholezystektomie - ggf. in Kombination mit einer vorherigen Zertrümmerung großer Steine durch extrakorporale Stoßwellentherapie - entfernt werden.
Defekte der Membranproteine bei hereditärer Elliptozytose
Krankheitsbild "Gewöhnliche" HE Heterozygot Compound heterozygot Homozygot Doppelt heterozygot Sphärozytäre HE Heterozygot Homozygot Stomatozytäre HE
Klinischer Verlauf
Proteindefekt
Häufigkeit
Leicht, gelegentlich mit infantiler Poikilozytose
Gestörte Spektrlnselbstassoziation infolge von {}- oder ß-Ketten- Varianten
:= 30% der Patienten mit HE
MItteischwer Schwer Schwer (hereditäre Pyropolkilozytose)
Leicht Schwer Leicht
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Spektrin a-KettenVariante + erniedrigter Spektrlngehalt
Selten Selten Selten
Erniedrigter Protein 4.1-Gehalt
:= 10% der Patienten mit HE Selten
Anomales Protein 3
Nur in Südost-Asien
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Auswertung der osmotischen Fragilität im frischen und inkubierten Blut sowie die Bestimmung der Spektrin-Konzent ration ergänzt (Tabelle 4). Asymptomatische Anlageträger bilden eine vierte Gruppe, zu der nur heterozygote Verwandte von Patienten mit rezessiver Sphärozytose gehören. Diese Anlageträger können nur durch hämotologische Untersuchungen in Verbindung mit der osmotischen Fragilität und ggf. auch der Autohämolyse der Erythrozyten erkannt werden. Der Spektringehalt der Erythrozyten ist normal.
Klin. Pädiatr. 203 (1991)
S. W. Eber
Klin. Pädiatr. 203 (1991) Hereditäre Elliptozytose Die meisten hereditären Elliptozytosen können heutzutage auf einen biochemischen Defekt zurückgeführt werden. Damit lassen sich biochemisch definierte Krankheitsbilder mit jeweils charakteristischem klinischen Verlauf unterscheiden (Palek, 1985). Es konnten insbesondere drei große Gruppen voneinander abgegrenzt werden (Tabelle 5): die "gewöhnliche" Elliptozytose, die sphärozytäre Elliptozytose und die stomatozytäre Elliptozytose. "Gewöhnliche" Elliptozytose Die Patienten zeigen einen unterschiedlich schweren Verlauf, je nachdem ob sie heterozygot, compound-heterozygot oder homozygot für die Erkrankung sind. In ca. 30070 der Fälle findet sich eine gestörte Spektrin-Selbstassoziation mit verminderter Tetramerbildung und erhöhter Konzentration von Spektrin-Dimer (Liu et al. , 1982). In der Mehrzahl der Fälle konnten verschiedene Varianten der Spektrin-Ci.-Kette nachgewiesen werden (Coetzer et al., 1990a, b; Marchesi et al., 1987). Es handelt sich dabei um genetisch bedingte Defekte des N-terminalen 80 Kilodalton schweren Ci. I-Peptids, das nach begrenzter tryptischer Verdauung der Ci.-Kette entsteht und das für die Aneinanderlagerung der Spektrin-Dimere zu Tetramer verantwortlich ist. Bisher wurden 5 verschiedene Varianten beschrieben (Coetzer et al., I 990a) (Abb. 4). Sie werden nach dem veränderten Molekulargewicht des anomalen Ci. I-Peptids als Spektrin Ci. I 78 (Morte et al. , 1988), Spektrin Ci. I 74 (Schröter und Eber, 1989), Spektrin Ci. I 65 (Garbarz et al., 1986), Spektrin Ci. I 46 (Coetzer et al. , 1987) und Spektrin Ci. I 50b (Marchesi et al., 1987) bezeichnet. Durch die Bestimmung der Aminosäuren-Sequenz konnte jeweils ein spezifischer Austausch in der Peptid-Kette nachgewiesen werden (Morle et al. , I990a; Coetzer et al., 1990a; Marchesi et al., 1987). Die Ci. I 74Variante ist heterogen und wird sowohl durch Ci. SpektrinDefekte (Morle et al., 1990b) als auch durch ß SpektrinDefekte (Pothier et al., 1987) bedingt: durch Defekte der ß Spektrin-Kette kommt es vermutlich infolge einer Konformationsänderung des Ci. ß Dimers zu einer verstärkten Spaltung an der Ci. I 74-tryptischen Verdauungsstelle (Arginin 39 und Lysin 42, Boivin et al. , 1990). Der klinische Schweregrad der Elliptozytosen infolge varianter Spektrin Ci.-Ketten wird durch 3 biochemische Determinanten bestimmt: die genaue Art des
Ci. I178
CXli7J.
[
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I
Ci.I!SO b
I
Es gibt zwei Sonder formen der Elliptozytose infolge varianter Spektrin Ci.-Ketten: die hereditäre Pyropoikilozytose und die hereditäre Elliptozytose mit infantiler Poikilozytose. Patienten mit der seltenen hereditären Pyropoikilozytose haben eine schwere, transfusionsbedürftige hämolytische Anämie. Sie sind doppelt heterozygot und weisen neben der Störung der Spektrin-Selbstassoziation eine verminderte Konzentration von Spektrin in der Membran auf (Coetzer und Palek, 1986). Bei ca. 10070 der Patienten mit "gewöhnlicher Elliptozytose" tritt im ersten Lebensjahr eine infantile Poikilozytose auf. Dabei besteht eine schwere, z. T. transfusionsbedürftige poikilozytäre Anämie in der Neugeborenenzeit; die gesteigerte Hämolyse ist in den ersten 2-3 Lebensjahren weitgehend rückläufig (Palek, 1985). Parallel dazu geht ein Übergang der Erythrozytenmorphologie von einer ausgeprägten Poikilozytose zu einer homogenen Elliptozytose einher (Abb. 5). Bisher wurden nur wenige Patienten mit Elliptozytose infolge einer defekten Spektrin ß-Kette beschrieben (Dhermy et al., 1982; Ohanian et al., 1985; Pothier et al., 1987; Eber et al., 1988). Alle Patienten wiesen eine Verkürzung der ß-Kette am C-terminalen Ende auf. Biochemische und molekulargenetische Untersuchungen ließen die Pathogenese und molekulare Ursache dieser seltenen Erkrankungen nahezu lückenlos klären (Eber et al., 1988; Gallagher et al., 1990; Yoon et al., 1991); sie werden im folgenden bei einer großen Familie deutscher Abstammung mit mittelschwerer Elliptozytose und verkürzter ß-Kette (Spektrin Göttingen ß205) exemplarisch dargestellt (s. a. Abschnitt "molekulargenetische Untersuchungen). Der Schweregrad der Erkrankung und die Veränderung der Erythrozytenmorphologie waren abhängig von der Konzentration an unpolymerisiertem, dimeren Spektrin; die nur leicht betroffene 70jährige Patientin (lilA) hatte einer Erhöhung des dimeren Spektrins in der Ery-
Trypti SChi Pcr:ptide.
I Anomalv: Spaltungsstcr:lle
L-l
// • • 35
39
Arg
Arg
Trp
Ci.l/5S Ci.I!46
strukturellen Defektes, die relative Konzentration an Spektrin-Dimer und die Gesamtkonzentration von Spektrin in der Erythrozyten-Membran (Coetzer et al., 1990a, b). Spektrin Ci. I 74- und Spektrin Ci. I 46-Defekte verlaufen schwerer als Spektrin Ci. I 65-Defekte (Coetzer et al. , 1990b). Die Konzentration von unpolymerisiertem dimerem Spektrin ist um so höher, je schwerer die Erkrankung verläuft: bei homozygoten Patienten mit Ci. 1 74-Defekt ist die Spektrin-Selbstassoziation nahezu vollständig aufgehoben, so daß alle Spektrine in dimerer Form vorliegen (Coetzer et al. , I990b).
S.r
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148-149
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254 Lcr:u
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Pro
- - -1 COOH
Re.Det,tlve Saquv:nzcr:n
Anomale. Ammosaure
Abb. 4 Tryptlsche Peptid-Varianten Infolge mutierter Spektrin a-Ketten. Es werden die anomalen tryptischen Spaltungsstellen und die Defekte der Aminosäurensequenz bel VarliJnten des N-terminalen 80000 Dalton schweren Peptids der Spektrin aKette la I 801 dargestellt Die Spektrln a-Kette besteht aus 20 repetitiven Sequenzen; das normale a I Peptid IJI streckt Sich davon über die sechs N-terrrlinilll~1I Sequenzen Spektrln a I"" Ist auf elnlJ Inswtloll von Leucln In POSition 149 zuruckzufuhrell, lH" allen anderen Varianten ISp a"I", Sp a' "', Sp a '14 ", Sp a'l',,,) liegt ein Isoli,~rt"r AlrlIIH)SillJ re-Austausch vor
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Klin. Pödiatr. 203 (1991)
S. W. Eber
SPEKTRI N
zyten werden unter der Scherkraftbelastung im Kreislauf leichter zerstört. Es entstehen z. T. mikrozytäre, poikilozytäre Erythrozytenfragmente, die in der Milz vorzeitig abgebaut werden .
oe
0'
0,5
.2. c 2
Sphärozytäre Elliptozytose und stomatozytäre Elliptozytose
Ö.
6 III
~ 0,5
°
'23
R~lativ~ Warderungsgeschwindlgkeit
--
~PROTEIN
------ ~ RADIOAKTIVITÄT
Abb. 9 Densltometrlsche Auswertung des Spektrin-Berelchs einer Coomassle Blue gefärbten SDS-Gelelektrophorese (durchgezogene Llnlel und eines Autoradiogramms (gestrichelte LInie) Erythrozytenmembranen des Patienten J B. (IV.lll mit Eillptozytose und defekter ß-Kette des Spektrins (HE lSpD ß205_ SpD]) und einer Kontrolle wurden mit 132 P-gammal-ATP versetzt und auf eine SDS-Gelelektrophorese aufgetragen. Radioaktive Banden wurden nachgewiesen, indem das getrocknete Gel auf einen Röntgenfilm gelegt wurde. Die Laufrichtung der SDS-Gelelektrophorese ist in der densitometrlschen Auswertung von links nach rechts wiedergegeben Spektrin des Patienten, das die normale ß- und anomale ß '-Kette enthielt, zeigte nur einen radioaktiven Peak, der auf die normale ß-Kette zurückzuführen war. Die anomale ß' -Kette zeigte keine Aufnahme von Radioaktivität
Normale
Tetramerbildung
ß
~::=::;===:::=::=c=:;;::====~ 0(
ß
f - - SPEKTRIN - DIMER----H-- SPEKTRIN - DIMER---l
Fehlende Tetramerbildung beim Patienten ß'
0(
~==o
Störungen des Membranskeletts der Erythrozyten bei hereditärer Sphärozytose und Elliptozytose: Bedeutung des molekularen Defektes für Pathogenese und klinischen Schweregrad * S. W. Eber Universitäts-Kinderklinik Göltingen
Zusammenfassung In den letzten Jahren konnte eine stetig zunehmende Zahl von genetisch bedingten Varianten von Membranproteinen der Erythrozyten und Defekten eines membranassoziierten Netzwerkes (Membranskelett) nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen haben die Pathogenese hämolytischer Anämien infolge von Erythrozyten-Membrandefekten vielfach aufgeklärt. Besonders bei der hereditären Sphärozytose und Elliptozytose besteht eine enge Beziehung zwischen dem klinischen Schweregrad und dem jeweiligen Defekt, so daß die biochemische Charakterisierung oftmals eine Aussage über den zu erwartenden Verlauf der Erkrankung und die Notwendigkeit der Splenektomie erlaubt. Das Erythrozytenmembranskelett erstreckt sich an der inneren Oberfläche der Erythrozytenmembran und ist für ihre Stabilität unter der Scherkraftbelastung im Kreislauf verantwortlich. Es besteht aus den Proteinen Spektrin, Aktin, Bande 4. I und Bande 4.9. Spektrin ist das Hauptmembranprotein und liegt nahezu ausschließlich in tetramerer Form vor: ein Tetramer besteht aus 2 Cl!- und 2 ß-Spektrinketten. Mit Hilfe denaturierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen und nativer Agarose-Gelelektrophoresen kann die Zusammensetzung der Membranproteine analysiert werden. Das Verhältnis von tetramerem Spektrin zu dimerem Spektrin wird auf nativen Agarose-Gelelektrophoresen bestimmt. Die Konzentration von Spektrin wird am besten mit einem ELISA unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen humanes Spektrin gemessen. Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion und DNA Sequenzierung konnte die molekulargenetische Ursache einzelner Membranproteindefekte aufgeklärt werden. Die meisten Fälle von hereditärer Sphärozytose können auf einen deutlich verminderten Gehalt an Spektrin zurückgeführt werden. Aufgrund unserer klinisch-hämatologischen und biochemischen Untersu-
Correlation between the clinical severity, erythrocyte morphology and abnormal membrane skeleton in hereditary spherocytosis and elIiptocytosis During recent years an increasing number of inherited variants of erythrocyte membrane proteins and defects of the membrane skeleton could be described. Mostly these defects explain the pathogenesis of hemolytic anemias due to erythrocyte membrane defects. For hereditary spherocytosis and elliptocytosis a dose correlation between the dinical severity and the biochemical defect was found; thus biochemical characterization can give valuable information about the expected course of the disease and the need for splenectomy. The erythrocyte membrane skeleton stretches along the inner surface of the membrane; it provides the stability of the erythrocyte under circulatory shear stress. The membrane skeleton consists of spectrin, actin, band 4.1 and band 4.9. Spectrin is the major component. In the membrane mostly all spectrin self-associates to the tetrameric form: one tetramer is formed by two Cl! and two ßchains. By denaturating SDS polyacrylamide gelelectrophoresis the composition of the membrane proteins can be analysed. The portion of tetrameric and dimeric spectrin is determined on native agarose gel electrophoresis. The concentration of spectrin in the membrane can be measured by an enzyme linked immunosorbent assay using monodonal antibodies against human spectrin. By polymerase chain reaction and DNA sequencing the moleculargenetic cause of singular membrane defects was cIarified. Hereditary spherocytosis was mostly due to a more or less diminished concentration of spectrin. Based on hematological, cIinical and biochemical observations, a new cIassification of spherocytosis (mild, moderate and severe form) is proposed. In addition to routine hematologic determinations and osmotic fragility, erythro-
Abkürzungen HS = Hereditäre Sphärozytose HE = Hereditäre Elliptozytose Sp = Spektrin D = Dimer Klin. Pädiatr. 203 (1991) 284-295 © 1991 F. Enke Verlag Stuttgart
• Nach einem Vortrag, gehalten auF der 36. Tagung der Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie, Frankfurt, 30. 11. bis I. 12. 19'10.
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chungen wird eine neue Einteilung der hereditären Sphärozytose (leichte, mittelschwere und schwere Form) vorgeschlagen, die neben den klassischen Untersuchungsmethoden (Zeichen der gesteigerten Hämolyse, osmotische Resistenz) auch die Konzentration von Spektrin berücksichtigt. Die Erkrankung verläuft um so schwerer, je niedriger die Spektrin-Konzentration der Erythrozyten ist. Die hereditäre Elliptozytose kann in ca. 30070 der Fälle auf eine gestörte Tetramerisierung von Spektrin zurückgeführt werden. Meistens liegen Defekte des N-terminalen 80000 Dalton schweren al-Peptids vor. Die defekte a-Kette kann durch Analyse der Peptide nach begrenzter tryptischer Verdauung des Spektrins näher charakterisiert werden. Nach dem veränderten Molekulargewicht des anomalen tryptischen al Peptids werden die varianten Spektrin a-Ketten als Spektrin a f / 46 , Sp a l / 50 , Sp a 1i65 , Sp a l174 und Sp a l178 bezeichnet. Für die Mehrzahl der varianten a-Ketten konnte ein spezieller Austausch einer Aminosäure in der Peptidsequenz nachgewiesen werden. Bisher wurden nur wenige Patienten mit hereditärer Elliptozytose infolge einer verkürzten ßSpektrinkette beschrieben. Die Verkürzung der ß-Kette ist auf den Verlust des C-terminalen phosphorylierten Peptids zurückzuführen. Molekulare Ursache dafür ist ein Defekt am 3'Ende des ß-Spektringens, der zu einem vorzeitigen Kettenabbruch in der Peptidsynthese führt. Die Indikation zur Splenektomie wird zunehmend zurückhaltender gestellt. Die Patienten mit der schweren Sphärozytose und Elliptozytose, die regelmäßig transfundiert werden müssen, sollten im Kleinkindesalter nicht vor dem 3. Lebensjahr - splenektomiert werden. Bei Patienten mit mittelschwerer Sphärozytose ist die Splenektomie nur in den Fällen erforderlich, in denen aufgrund schwerer hämolytischer Krisen rezidivierende Transfusionen erforderlich sind und eine ausgeprägte Leistungsminderung infolge der chronischen hämolytischen Anämie besteht.
Einleitung
Die Erythrozytenmembrandefekte sind in Mitteleuropa bei weitem die häufigste Ursache für angeborene hämolytische Anämien. In Deutschland muß man von ca. 30000 Patienten mit diesen Erkrankungen ausgehen. Klinisch inapparente Anlageträger für rezessiv vererbte hämolytische Anämien sind weitaus häufiger. Aufgrund von Screening-Untersuchungen gibt es allein für die hereditäre Sphärozytose 760000 Genträger (Eber et al. , 1991). Infolge der vielfach charakteristischen Erythrozytenmorphologie unterscheidet man 5 Krankheiten (Tabelle
Tab. 1 Hereditäre Erkrankungen infolge von Erythrozytenmembrandefekten ~E_rk_ra_n_k_U_n_ge_n
1. 2 3. 4. 5.
Hereditäre Hereditäre Hereditäre Hereditäre Hereditäre
1
Sphärozytose (HS) Elliptozytose (HEl Pyropoikilozytose (HPPI Stomatozytose Akanthozytose
Häufigkeit 1: 5000 1 : 5000 selten selten selten
Klin. Pädiatr. 203 (1991) cyte spectrin content is taken into account. The disease severity correlates with the diminution of spectrin. In hereditary elliptocytosis the concentration of tetrameric spectrin is reduced in about 30% of the patients. Defects of the N-terminal a I 80000 dalton peptide are predominantly found. The defective a chain can be furt her studied by analysis of "tryptic" peptides after limited tryptic digestion of the spectrin. According to the reduced molecular weight of the anomalous tryptic a I peptide the variant spectrin a chains are designed as Spectrin a 1I46, Sp a 1l50 , Sp a 1l65 , Sp a ll74 and Spa 1l78 • In most cases a single amino acid substitution of the a chain could be proven. Until now only singular patients with hereditary elliptocytosis due to a shortened spectrin ß chain have been described. The shortening of the ß chain is due to a loss of the C-terminal phosphorylated peptide. The molecular cause is a defect at the 3'end of the ß spectrin gen, resulting in apremature termination of the peptide chain-synthesis. The indication for splenectomy should be very restricted. Patients with severe spherocytosis and elliptocytosis who are regularly transfused, should be splenectomized in early childhood - not under the age of 2 years. Patients with a moderate spherocytosis should be splenectomized only if recurrent, severe, transfusion dependent hemolytic crises occur and a decrease of vitality and physical ability caused by chronic hemolytic anemia persists.
I). Am häufigsten kommt die hereditäre Sphärozytose vor. Sie hat unter den Membrandefekten die größte klinische Bedeutung; abgesehen von heterozygoten Anlageträgern für die rezessive Form erkranken die meisten Genträger an einer mehr oder weniger schweren hämolytischen Anämie. Trotz ähnlicher Häufigkeit ist die klinische Bedeutung der hereditären Elliptozytose weitaus geringer, da die meisten Anlageträger keine klinische Symptomatik entwickeln. Eine Sonderform der hereditären Elliptozytose ist die seltene hereditäre Pyropoikilozytose: Patienten mit dieser schweren hämolytischen Anämie werden auch durch die Splenektomie nicht vollständig geheilt.
In den letzten Jahren wurde eine stetig zunehmende Zahl von genetisch bedingten Varianten von Membranproteinen und Defekten eines Membran-assoziierten Netzwerkes beschrieben (Übersichtsartikel u. a. von Palek, 1985; Becker und Lux, 1985; Davies und Lux, 1989; Pekrun und Gratzer, 1990). Viele Membranproteindefekte führen zu einer Instabilität der Erythrozytenmembran, die eine Fragmentation, Poikilozytose und Verkürzung der Erythrozyten-Lebensdauer bewirkt. Infolge des Verlustes von Zelloberfläche oder der veränderten physikalisch-chemischen Membraneigenschaften kommt es zu
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Störungen des Membranskeletts der Erythrozyten
S. W. Eber
Klin. Pädiatr. 203 (1991) verschiedenen anomalen Zellformen (Sphärozyten oder Elliptozyten u. a.). Besonders bei der hereditären Sphärozytose und Elliptozytose besteht eine enge Beziehung zwischen dem klinischen Schweregrad und dem jeweiligen Defekt, so daß sich aus der biochemischen Charakterisierung oftmals klinisch anwendbare Konsequenzen, z. B. im Hinblick auf die Notwendigkeit der Splenektomie ergeben.
Glykophorin C
Prot'ln 3
Glykophonn A
Aufbau der Erythrozytenmembran
Die Membran des Erythrozyten ist aus zwei Teilen aufgebaut, nämlich einer äußeren Lipiddoppelschicht, der Plasmamembran und einem inneren membranständigen Netzwerk, dem Membranskelett (Abb. I) (Übersichtsartikel von Gardner und Bennett, 1989; Bennett, 1990). Die Nomenklatur der Erythrozytenmembranproteine nach Fairbanks et al. (1971) und Steck (1974) ist in Tabelle 2 dargestellt. Die Plasmamembran wird von den integralen Proteinen (Bande 3, Glycophorin A und C) durchdrungen. Bande 3 besteht aus einem integralen ovaloiden Anteil in der Plasmamembran und einem zytoplasmatischen, stabförmigen Anteil, der der Verbindung zwischen Plasmamembran und Membranskelett dient. An der inneren Oberfläche des Erythrozyten erstreckt sich das Netzwerk des Membranskeletts (Abb. I). Es besteht aus den peripheren Proteinen Spektrin, Aktin, Bande 4.1 und 4.9. Ein Spektrinmolekül besteht aus 2 verschiedenen Proteinketten, einer {X- und einer ß-Kette. Diese Verbindung wird als Spektrin-Dimer bezeichnet. Um die Fäden des Netzwerkes bilden zu können, lagern sich die Spektrin-Dimere zu höheren Polymeren zusammen. Es entstehen Tetramere und in geringerem Umfang Spektrin-Oligomere von bis zu 12 Ketten. Erst diese Tetramere und Oligomere können ein durchgehendes Protein-Netzwerk aufbauen, das die äußere Doppellipidschicht stabilisiert. Die Knotenpunkte des Membranskeletts bestehen aus kurzen Aktinfilamenten, die durch Tropomyosin und Bande 4.9 stabili-
Tab. 2
G3PD
Homoglobin
Abb. 1
Shematische Darstellung der Erythrozytenmembran (nach Davies und Lux, 1989) Die LIpiddoppelschicht Wird von Bande 3, Glykophorin A und Glykophorln C durchdrungen Bande 3 ragt mit einem stabförmlgen Anteil, an dem das Membranskelett verankert ist,ln das Zeilinnere. Das Membranskelett besteht aus Spektrin, Aktin, Bande 4 1 und Bande 4 9 Tropomyosin stabilisiert die kurzen Aktlnfilarnente. Uber Ankyrin (Bande 2.1) ist das Membranskelett an Bande 3, über Bande 4.1 an Glykophorin C gebunden
siert werden. An jedem Knotenpunkt setzen im Durchschnitt 6 Spektrinmoleküle an, so daß eine sechseckige Grundstruktur des Membranskeletts entsteht (Liu et al.. 1987). Die Verbindung von Spektrin und Aktin wird durch die Bande 4.1 gefestigt. Über 2 Verankerungsproteine, nämlich Ankyrin und Protein 4.1, ist das Membranskelett an Bande 3 und Glycophorin C in der Lipiddoppclschicht gebunden. Ankyrin bindet Spektrin an den zytoplasmatischen Anteil von Bande 3. Es wird vermutet, daß diese Bindung durch Bande 4.2 verstärkt wird. Bande 4.1 bindet das Membranskelett an das Glycophorin C.
Die Hauptmembranproteine des menschlichen Erythrozyten"'
Elektrophoretische Bande ci
ProteIn 1>1
Molekulargewicht
1 und 2
Spektrin
240000 220000
2.1
Ankyrin
215000
3b)
Anionenkanal
90000- 120000
Anzahl von Molekülen pro Zelle 240000 100000 1200000
4.1
80000
200000
4.2
72000
240000
4.9
50000
100000
5
Aktin
42000
500000
6
Glyzerlnaldehyd-3Phosphatdehydrogenase
36000
500000
71 } 7.2 7.3
Tropomyosin u a. Proteine
30000 } 28000 26000
400000
24000
100000
8 9
Globin
17000
", ausgenommen die Glykoproteine Bande 3 Ist ein Integrales Protein, Bande 7 besteht aus Integralen und peripheren Proteinen; die übrlg,m Prot,:Inll Sind P'lflphf:f ,I nach Fairbanks et al. (19711 und Steck (1974) 1>1
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Analyse der Erythrozytenmembranproteine Bei Verdacht auf einen Erythrozytenmembrandefekt sollte eine biochemische Analyse der Membranproteine erfolgen. Die Zusammensetzung der Membranproteine wird am besten durch SDS-PolyacrylamidGelelektrophoresen nach Lämmli (1970) (Abb. 2) und Fairbanks et al. (1971) untersucht. Für die Bestimmung der Konzentration von tetramerem und dimerem Spektrin werden gereinigte, weitgehend hämoglobinfreie Erythrozytenmembranen in einem Medium niedriger Ionenstärke bei 0 0 inkubiert. Bei diesen Bedingungen zerfällt das Membranskelett in seine Einzelbestandteile: Spektrin, Aktin und Bande 4.1. Spektrin-Tetramere und Spektrin-Dimere bleiben erhalten und können auf einer nativen Agarose-Gelelektrophorese getrennt werden. Die relative Konzentration von Spektrin-Tetramer unr. -Dimer wird densitometrisch ermittelt. Bei ca. '/3 der Patienten mit Elliptozytose ist die Konzentration von tetramerem Spektrin infolge verschiedener Spektrin (X- und ß-Ketten-Varianten vermindert (Palek, 1985). Zur näheren Charakterisierung der Spektrin (X-Ketten Varianten kann eine begrenzte tryptische Verdauung des Spektrins durchgeführt werden
Protein, Spektrin-
Z.l Aktin 6 7,1 7.2
t
! t
__ ~ _ _...
~3=-7 Ganze Eryt hrozytenmembran
Tab. 3
Triton SheLLs
Abb. 2 SDS PoIyacrylamid-Gelelektrophorese der Erythrozytenmembran , Im linken Teil der Abbildung ist die Auftrennung der Membranproteine in der gesamten Erythrozytenmembran dargestellt, im rechten Teil die der peripheren Proteine des Membranskeletts (Triton Shellsl (nach vorheriger Abtrennung der integralen Proteine mit einem nichtionischen Detergens)
Klin. Pädiatr. 203 (1991) (Marchesi et al., 1987). Die "tryptischen Peptide" werden nach ihrer Größe und Ladung mit ein- und zweidimensionalen Elektrophoresetechniken - z. T. in Kombination mit isoelektrischer Fokussierung - analysiert. Die Konzentration von Spektrin in den Erythrozyten wurde bisher durch Farbstoffelution der Proteinbanden aus SDS-Polyacrylamid Gelelektrophoresen (Eber et al., 1990) oder durch Radio-Imuno Assay (Agre et al., 1985 und 1986) bestimmt. Zur einfacheren Bestimmung der Spektrinkonzenlration setzen wir seit kurzem einen "Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay" (EUSA) unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen humanes Spektrin ein.
Hereditäre Sphärozytose Das klinische Bild zeigt eine große Variationsbreite (Tab. 3). Die sogenannte "typische Sphärozytose" kann einen leichten oder mittel schweren Verlauf nehmen (Becker und Lux, 1985). Sie wird autosomal dominant vererbt. Ca. 80070 der Patienten mit Sphärozytose weisen eine Verminderung von Spektrin in der Erythrozytenmembran auf (Agre et al., 1985 und 1986; Eber et al., 1990). Die Verminderung der Spektrinkonzentration ist charakteristisch für die Sphärozytose und wird bei keiner anderen normozytären Anämie gefunden (Agre et aI., 1986). Die verminderte Spektrinkonzentration geht mit einer erniedrigten Spektrindichte in der Membran einher; die Spektrinkonzentration wird dabei entweder auf Bande 3 (Waugh und Agre, 1988) oder auf die Phospholipide (Eber et al., 1990) bezogen. Die erniedrigte Spektrindichte ist für die Pathogenese der Sphärozytose von entscheidender Bedeutung. Nach den Untersuchungen von Waugh und Agre (1988) verursacht sie Veränderungen von physikalisch-rheologischen Materialeigenschaften der Erythrozytenmembran: die Membranelastizität und der Widerstand der Eryhtrozytenmembran gegen Oberflächenveränderungen (Bildung von Membranabschnürungen) sind um so niedriger, je geringer die Konzentration an Spektrin pro Bande 3 in den Erythrozyten ist. Dadurch kommt es zum zunehmenden Oberflächenverlust der Erythrozyten und zur Bildung von rigiden Sphärozyten, die in der Milz vorzeitig abgebaut werden. Die Ursache der erniedrigten Spektrinkonzentration ist in den meisten Fällen von "typischer Sphärozytose" nicht bekannt; diskutiert werden neben verschiedenen Spektrinvarianten auch funktionelle Störungen oder verminderte Konzentrationen von Ankyrin oder Bande 3.
Defekte der Membranproteine bel hereditärer Sphärozytose
Krankheitsbild
Vererbung
ProteIndefekt
Häufigkeit
"Typische" HS (leicht, mittelschweri
Autosomal dominant
Erniedrigter Spektringehalt um 20-50%
=80% aller Patienten mit HS
Schwere HS
Autosomal rezessiv
Erniedrigter Spektringehalt um 40-60% infolge einer defekten Spektrin-a-Kette
=3% aller Patienten mit HS
Schwere HS mit neurologischen Störungen
Autosomal dominant
Erniedrigter Ankynngehalt
selten
Mittelschwere HS
Autosomal dominant
Gestörte Bindung von Spektrin am ProteIn 4 1
selten
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Störungen des Membranskelells der Erythrozyten
S. W. Eber
K/in. Pädiatr. 203 (/99/) Eine rezessiv vererbte Sphärozytose konnten wir bei ca. 20070 unserer Patienten nachweisen (Eber et al. , 1990). Eine ähnliche Häufigkeit wurde auch von Bekker und Lux (1985) beschrieben. Bei 3070 unserer Patienten lag eine "atypische" schwere Verlaufsform der rezessiven Sphärozytose vor. Diese Patienten benötigen regelmäßige Transfusionen, um die Hämoglobinkonzentration über 6 g/dl zu halten. Die Spektrinkonzentration ist um 4060070 vermindert (Agre et al., 1982, 1985 und 1986; Eber et al. , 1990). Ursache der verminderten Spektrinkonzentration sind Defekte der Spektrin ex-Kette: bei der begrenzten tryptischen Verdauung der ex-lI-Region entstehen anomale Peptide mit saurem, isoelektrischem Punkt (Winke/mann et al. , 1989).
Eine ähnliche Beziehung zum Schweregrad der Sphärozytose fanden wir auch, indem wir die Bestimmung der osmotischen Fragilität der Erythrozyten semiquantitativ auswerteten (Eber et al. , 1990). Es wurden dabei die NaCI-Konzentrationen bei Beginn der osmotischen Hämolyse (1070 Hämolyse), bei mittlerer Hämolyse (50 070 Hämolyse) und bei vollständiger Hämolyse (100070) getrennt nach der Untersuchung im frischen und 24 Stunden inkubierten Blut berücksichtigt. Heterozygote Anlageträger der Sphärozytose haben eine normale bis leicht erhöhte osmotische Fragilität. Die Erythrozyten von Patienten mit leichter, mittelschwerer und schwerer Verlaufsform hämolysieren bei um so höheren NaCI-Konzentration, je schwerer die Erkrankung verläuft (Schröter und Eber, 1989).
In seltenen Fällen konnte eine Zuordnung des Sphärozytose-Gens zum kurzen Arm des Chromosoms 8 nachgewiesen werden, auf dem das Ankyrin-Gen lokalisiert ist (Lux et al. , 1990; Costa et aL, 1990). Bei einer Deletion auf dem kurzen Arm von Chromosom 8 wurde ein Syndrom, bestehend aus schwerer Sphärozytose, psychomotorischer Entwicklungsverzögerung und Dysmorphiezeichen beschrieben (Chi/cote et aL, 1987; Kitetani et aL, 1988). Ursache dieser Sonderform der Sphärozytose ist eine auf 50070 erniedrigte Konzentration von Ankyrin, die zu einer sekundären Spektrinverminderung auf 80070 der Norm führt (Lux et aL, 1990). Eine weitere Sonderform der Sphärozytose konnte auf eine defekte ßSpektrinkette mit abnormer SH-Brückenbildung zurückgeführt werden (Becker et aL, 1987). Dadurch kommt es zu einer um 50070 verminderten Bindung von Spektrin an Protein 4.1 (Wolfe et aL, 1982; Goodman et aL, 1982).
Aufgrund der Untersuchung von 80 Patienten mit Sphärozytose wird eine neue Einteilung der Sphärozytose in 3 Schweregrade (leichte, mittelschwere und schwere Verlaufsform) vorgeschlagen (Eber et al., 1990). Die Einteilung basiert auf der unterschiedlichen Konzentration von Hämoglobin und Bilirubin, sowie der RetikulozytenzahL Sie wird durch die semiquantitative
Die Beziehung zwischen dem klinischen Schweregrad und dem Spektringehalt der Erythrozyten wird in Abb. 3 dargestellt: die Spektrin-Konzentration war normal bei symptomlosen, heterozygoten Anlageträgern für die rezessive Sphärozytose, und nur geringfügig vermindert bei Patienten mit leichter Sphärozytose; bei Patienten mit mittelschwerer Verlaufsform war sie auf 6272070 der Norm deutlich vermindert. Eine Verminderung der Spektrin-Konzentration auf 60070 der Norm konnten wir auch bei zwei Patienten mit schwerer Sphärozytose nachweisen: die Spektrin-Konzentration ihrer Erythrozyten ist möglicherweise noch wesentlich geringer als dargestellt, da die Patienten regelmäßig transfundiert wurden.
Tab. 4
Normal ( n =13)
§
250
. 200 )(
~
N 0
a.
~
'::l .>< ~
HS-Anlag~
(n=4 )
t t
150
0
L~ichl
(n=7 )
tt
Mill~lschw~r
( n =6) Schw~r
(n = 2)
4
~ 100
E L &
.>< Ul
Abb. 3
Spektrlnkonzentratlon in den Erythrozyten von Patienten mit unterschiedlich schwerer Sphärozytose (leichte, rnlttelschwere und schwere Verlaufsform), sowie bel asymplomatlschen heterozygoten Anlageträger für rezessive HS Die Konzentration von Spektrln pro Erythrozyt Wild als Anzahl der Moleküle pro Zelle angegeben; sie wird aus der rnolaren Konzentration von Spektrin unter Berücksichtl(lung der Loschmldtschen Zahl (1 Mol = 6,022 x 10 71 Moleküle) berechnet
Klinische Schweregrade der hereditären Sphärozytose HS-Anlage
Leichte HS
Mittelschwere HS
Schwere HS"
Hämoglobin (g/dl)
Normal
Retikulozyten (%)
2 50-80
6 8 >10 > 3 40 60
Normal
Normal oder gering erhöht
Deutlich erhöht
Deutlich erhoht
Gering erhöht
Deutlich erhoht
Deutlich erhöht
Deutlich erhoht
Bilirubin Img/dl) Spektringehalt" (% des Normalwertes) Osmotische Fragilität Frisches Blut Inkubiertes Blut
" Werte vor TransfUSion
"
Normal (Mittelwert ± SD) 226±35 x 10 3 Moleküle pro Zelle
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288
Störungen des Membranskeletts der Erythrozyten
Knapp die Hälfte der Patienten zeigen eine leichte Verlaufsform mit kompensierter hämolytischer Anämie. Transfusionsbedürftige hämolytische Krisen kommen nur vereinzelt vor; nur wenige unserer Patienten mußten wegen einer aplastischen Krise transfundiert werden. Eine mittelschwere Form der Sphärozytose liegt bei ca. 50010 der Patienten vor. Die Patienten haben eine chronische hämolytische Anämie. Aufgrund einer schweren Hyperbilirubinämie und Anämie ist im Neugeborenenalter oftmals eine Austauschtransfusion oder eine Transfusion erforderlich. In vielen Fällen treten im Kindesalter hämolytische Krisen auf, die z. T. Transfusionen erfordern. Eine schwere transfusionsbedürftige aplastische Krise haben wir bei unseren Patienten nur jeweils einmal beobachtet. Sie wird meist durch Parvovirus B 19 verursacht (Lefrere et al., 1986; Pekrun et al., 1988); nach der Infektion kann man von einer lebenslangen Immunität ausgehen. Eine schwere, autosomal rezessive vererbte Form konnten wir bei 2 Patienten beobachten. Diese Patienten benötigen regelmäßige Transfusionen, um die Hämoglobinkonzentration über 6 g/dl zu halten.
Indikation zur Splenektomie
Ziel der Splenektomie ist es, schwere transfusionsbedürftige hämolytische oder aplastische Krisen, sowie die Bildung von Gallenstein zu vermeiden (Dacie, 1985). Bei Patienten mit ausgeprägter chronischer hämolytischer Anämie bestehen zudem eine verminderte Belastbarkeit und ein Vitalitätsverlust, die die Entwicklung und
Tab. 5
Lebensqualität der Patienten z. T. beeinträchtigen können. Die Indikation zur Splenektomie wird allerdings zunehmend zurückhaltender gestellt, da trotz Pneumkokkenimpfung und mehrjähriger postoperativer PenicillinProphylaxe 1-2% der splenektomierten Patienten an einer schweren Postsplenektomie-Infektion (overwhelming postsplenectomy infection = OPSI) (Hays et al. , 1984; Golematis et al., 1989) erkranken, an der bis zu 50% der Patienten versterben (Holschneider et al., 1983). Die Patienten mit der schweren SphäroZYtose sollten im Kleinkindesalter splenektomiert werden, insbesondere um eine transfusionsbedingte Virusübertragung und eine schwere sekundäre Organhämosiderose zu vermeiden. Aufgrund der besonderen Gefährdung durch Postsplenektomie-Infektionen bei Splenektomie in den ersten beiden Lebensjahren (Heier, 1980; Eraklis et al. , 1967) sollte die Operation möglichst nicht vor dem 3. bis 4. Lebensjahr erfolgen. Patienten mit der mittelschweren Form sollten nur dann splenektomiert werden, wenn aufgrund schwerer hämolytischer Krisen rezidivierende Transfusionen erforderlich sind und eine ausgeprägte Leistungsminderung infolge der chronischen hämolytischen Anämie besteht. Die Patienten mit der leichten Form müssen in aller Regel im Kindes- und Jugendalter nicht splenektomiert werden (Eber et al., 1990). Das optimale chirurgische Vorgehen bei Patienten mit leichter und mittelschwerer Sphärozytose, die eine "symptomatische" Cholelithiasis entwickeln aber keine gehäuften transfusions bedürftigen hämolytischen Krisen durchgemacht haben, ist noch nicht gesichert. Während die meisten Autoren bisher die einzeitige Cholezystektomie und Splenektomie empfahlen (Dacie, 1985) erscheint uns dieses Vorgehen in Anbetracht neuer Methoden zur Gallensteinentfernung [laparoskopische Cholezystektomie (Trede et al. , 1990), extrakorporale Stoßwellentherapie (Sackmann et al., 1988) und endoskopische Sphinkterotomie bei Choledocholithiasis (Goekcora et al. , 1989)] nicht mehr gerechtfertigt; symptomatische Gallenblasensteine sollten auch im Kindesalter durch laparoskopische Cholezystektomie - ggf. in Kombination mit einer vorherigen Zertrümmerung großer Steine durch extrakorporale Stoßwellentherapie - entfernt werden.
Defekte der Membranproteine bei hereditärer Elliptozytose
Krankheitsbild "Gewöhnliche" HE Heterozygot Compound heterozygot Homozygot Doppelt heterozygot Sphärozytäre HE Heterozygot Homozygot Stomatozytäre HE
Klinischer Verlauf
Proteindefekt
Häufigkeit
Leicht, gelegentlich mit infantiler Poikilozytose
Gestörte Spektrlnselbstassoziation infolge von {}- oder ß-Ketten- Varianten
:= 30% der Patienten mit HE
MItteischwer Schwer Schwer (hereditäre Pyropolkilozytose)
Leicht Schwer Leicht
289
Spektrin a-KettenVariante + erniedrigter Spektrlngehalt
Selten Selten Selten
Erniedrigter Protein 4.1-Gehalt
:= 10% der Patienten mit HE Selten
Anomales Protein 3
Nur in Südost-Asien
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Auswertung der osmotischen Fragilität im frischen und inkubierten Blut sowie die Bestimmung der Spektrin-Konzent ration ergänzt (Tabelle 4). Asymptomatische Anlageträger bilden eine vierte Gruppe, zu der nur heterozygote Verwandte von Patienten mit rezessiver Sphärozytose gehören. Diese Anlageträger können nur durch hämotologische Untersuchungen in Verbindung mit der osmotischen Fragilität und ggf. auch der Autohämolyse der Erythrozyten erkannt werden. Der Spektringehalt der Erythrozyten ist normal.
Klin. Pädiatr. 203 (1991)
S. W. Eber
Klin. Pädiatr. 203 (1991) Hereditäre Elliptozytose Die meisten hereditären Elliptozytosen können heutzutage auf einen biochemischen Defekt zurückgeführt werden. Damit lassen sich biochemisch definierte Krankheitsbilder mit jeweils charakteristischem klinischen Verlauf unterscheiden (Palek, 1985). Es konnten insbesondere drei große Gruppen voneinander abgegrenzt werden (Tabelle 5): die "gewöhnliche" Elliptozytose, die sphärozytäre Elliptozytose und die stomatozytäre Elliptozytose. "Gewöhnliche" Elliptozytose Die Patienten zeigen einen unterschiedlich schweren Verlauf, je nachdem ob sie heterozygot, compound-heterozygot oder homozygot für die Erkrankung sind. In ca. 30070 der Fälle findet sich eine gestörte Spektrin-Selbstassoziation mit verminderter Tetramerbildung und erhöhter Konzentration von Spektrin-Dimer (Liu et al. , 1982). In der Mehrzahl der Fälle konnten verschiedene Varianten der Spektrin-Ci.-Kette nachgewiesen werden (Coetzer et al., 1990a, b; Marchesi et al., 1987). Es handelt sich dabei um genetisch bedingte Defekte des N-terminalen 80 Kilodalton schweren Ci. I-Peptids, das nach begrenzter tryptischer Verdauung der Ci.-Kette entsteht und das für die Aneinanderlagerung der Spektrin-Dimere zu Tetramer verantwortlich ist. Bisher wurden 5 verschiedene Varianten beschrieben (Coetzer et al., I 990a) (Abb. 4). Sie werden nach dem veränderten Molekulargewicht des anomalen Ci. I-Peptids als Spektrin Ci. I 78 (Morte et al. , 1988), Spektrin Ci. I 74 (Schröter und Eber, 1989), Spektrin Ci. I 65 (Garbarz et al., 1986), Spektrin Ci. I 46 (Coetzer et al. , 1987) und Spektrin Ci. I 50b (Marchesi et al., 1987) bezeichnet. Durch die Bestimmung der Aminosäuren-Sequenz konnte jeweils ein spezifischer Austausch in der Peptid-Kette nachgewiesen werden (Morle et al. , I990a; Coetzer et al., 1990a; Marchesi et al., 1987). Die Ci. I 74Variante ist heterogen und wird sowohl durch Ci. SpektrinDefekte (Morle et al., 1990b) als auch durch ß SpektrinDefekte (Pothier et al., 1987) bedingt: durch Defekte der ß Spektrin-Kette kommt es vermutlich infolge einer Konformationsänderung des Ci. ß Dimers zu einer verstärkten Spaltung an der Ci. I 74-tryptischen Verdauungsstelle (Arginin 39 und Lysin 42, Boivin et al. , 1990). Der klinische Schweregrad der Elliptozytosen infolge varianter Spektrin Ci.-Ketten wird durch 3 biochemische Determinanten bestimmt: die genaue Art des
Ci. I178
CXli7J.
[
'"
I
Ci.I!SO b
I
Es gibt zwei Sonder formen der Elliptozytose infolge varianter Spektrin Ci.-Ketten: die hereditäre Pyropoikilozytose und die hereditäre Elliptozytose mit infantiler Poikilozytose. Patienten mit der seltenen hereditären Pyropoikilozytose haben eine schwere, transfusionsbedürftige hämolytische Anämie. Sie sind doppelt heterozygot und weisen neben der Störung der Spektrin-Selbstassoziation eine verminderte Konzentration von Spektrin in der Membran auf (Coetzer und Palek, 1986). Bei ca. 10070 der Patienten mit "gewöhnlicher Elliptozytose" tritt im ersten Lebensjahr eine infantile Poikilozytose auf. Dabei besteht eine schwere, z. T. transfusionsbedürftige poikilozytäre Anämie in der Neugeborenenzeit; die gesteigerte Hämolyse ist in den ersten 2-3 Lebensjahren weitgehend rückläufig (Palek, 1985). Parallel dazu geht ein Übergang der Erythrozytenmorphologie von einer ausgeprägten Poikilozytose zu einer homogenen Elliptozytose einher (Abb. 5). Bisher wurden nur wenige Patienten mit Elliptozytose infolge einer defekten Spektrin ß-Kette beschrieben (Dhermy et al., 1982; Ohanian et al., 1985; Pothier et al., 1987; Eber et al., 1988). Alle Patienten wiesen eine Verkürzung der ß-Kette am C-terminalen Ende auf. Biochemische und molekulargenetische Untersuchungen ließen die Pathogenese und molekulare Ursache dieser seltenen Erkrankungen nahezu lückenlos klären (Eber et al., 1988; Gallagher et al., 1990; Yoon et al., 1991); sie werden im folgenden bei einer großen Familie deutscher Abstammung mit mittelschwerer Elliptozytose und verkürzter ß-Kette (Spektrin Göttingen ß205) exemplarisch dargestellt (s. a. Abschnitt "molekulargenetische Untersuchungen). Der Schweregrad der Erkrankung und die Veränderung der Erythrozytenmorphologie waren abhängig von der Konzentration an unpolymerisiertem, dimeren Spektrin; die nur leicht betroffene 70jährige Patientin (lilA) hatte einer Erhöhung des dimeren Spektrins in der Ery-
Trypti SChi Pcr:ptide.
I Anomalv: Spaltungsstcr:lle
L-l
// • • 35
39
Arg
Arg
Trp
Ci.l/5S Ci.I!46
strukturellen Defektes, die relative Konzentration an Spektrin-Dimer und die Gesamtkonzentration von Spektrin in der Erythrozyten-Membran (Coetzer et al., 1990a, b). Spektrin Ci. I 74- und Spektrin Ci. I 46-Defekte verlaufen schwerer als Spektrin Ci. I 65-Defekte (Coetzer et al. , 1990b). Die Konzentration von unpolymerisiertem dimerem Spektrin ist um so höher, je schwerer die Erkrankung verläuft: bei homozygoten Patienten mit Ci. 1 74-Defekt ist die Spektrin-Selbstassoziation nahezu vollständig aufgehoben, so daß alle Spektrine in dimerer Form vorliegen (Coetzer et al. , I990b).
S.r
L _ _-'-..,.-,-_L-_.....L..-,_---'-_----'
148-149
t
• LC!u
254 Lcr:u
255 Sir
• •
Pro
Pro
465 Glu
+
Pro
- - -1 COOH
Re.Det,tlve Saquv:nzcr:n
Anomale. Ammosaure
Abb. 4 Tryptlsche Peptid-Varianten Infolge mutierter Spektrin a-Ketten. Es werden die anomalen tryptischen Spaltungsstellen und die Defekte der Aminosäurensequenz bel VarliJnten des N-terminalen 80000 Dalton schweren Peptids der Spektrin aKette la I 801 dargestellt Die Spektrln a-Kette besteht aus 20 repetitiven Sequenzen; das normale a I Peptid IJI streckt Sich davon über die sechs N-terrrlinilll~1I Sequenzen Spektrln a I"" Ist auf elnlJ Inswtloll von Leucln In POSition 149 zuruckzufuhrell, lH" allen anderen Varianten ISp a"I", Sp a' "', Sp a '14 ", Sp a'l',,,) liegt ein Isoli,~rt"r AlrlIIH)SillJ re-Austausch vor
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Klin. Pödiatr. 203 (1991)
S. W. Eber
SPEKTRI N
zyten werden unter der Scherkraftbelastung im Kreislauf leichter zerstört. Es entstehen z. T. mikrozytäre, poikilozytäre Erythrozytenfragmente, die in der Milz vorzeitig abgebaut werden .
oe
0'
0,5
.2. c 2
Sphärozytäre Elliptozytose und stomatozytäre Elliptozytose
Ö.
6 III
~ 0,5
°
'23
R~lativ~ Warderungsgeschwindlgkeit
--
~PROTEIN
------ ~ RADIOAKTIVITÄT
Abb. 9 Densltometrlsche Auswertung des Spektrin-Berelchs einer Coomassle Blue gefärbten SDS-Gelelektrophorese (durchgezogene Llnlel und eines Autoradiogramms (gestrichelte LInie) Erythrozytenmembranen des Patienten J B. (IV.lll mit Eillptozytose und defekter ß-Kette des Spektrins (HE lSpD ß205_ SpD]) und einer Kontrolle wurden mit 132 P-gammal-ATP versetzt und auf eine SDS-Gelelektrophorese aufgetragen. Radioaktive Banden wurden nachgewiesen, indem das getrocknete Gel auf einen Röntgenfilm gelegt wurde. Die Laufrichtung der SDS-Gelelektrophorese ist in der densitometrlschen Auswertung von links nach rechts wiedergegeben Spektrin des Patienten, das die normale ß- und anomale ß '-Kette enthielt, zeigte nur einen radioaktiven Peak, der auf die normale ß-Kette zurückzuführen war. Die anomale ß' -Kette zeigte keine Aufnahme von Radioaktivität
Normale
Tetramerbildung
ß
~::=::;===:::=::=c=:;;::====~ 0(
ß
f - - SPEKTRIN - DIMER----H-- SPEKTRIN - DIMER---l
Fehlende Tetramerbildung beim Patienten ß'
0(
~==o
