1448
Pernice u. a.: Sabyhamsternieren-Zellen zum Nachweis antinukleärer Antikörper
Deutsche Medizinische Wothensthrltt
Dtsch. med. 'Wschr. 103 (1978), 1448-1453
Babyhamsternieren-Zellen als Antigen für den Nachweis von antinukleären Antikörpern W. Pernice, R. Scherer, G. Lüben, C.-P. Sodomann und H. H. Sedlacek Behringwerke AG, Marburg/Lahn, Universitäts-Hautklinik München und Medizinische Universitätsklinik MarburgfLahn
Zum Nachweis antinukleärer Antikörper wurden als Antigen auf Objektträgern mit Aceton fixierte Babyhamsternieren-(BHK-)Zellen verwendet. Sie sind bei Beachtung bestimmter Lagerungsvorschriften (Trockenmittel, 4 °C) bisher 12 Monate haltbar. Im Hinblick auf Spezifität, Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Differenzierbarkeit der Fluoreszenztypen erscheint der BHK-Zelltest anderen vergleichend angewendeten Immunfluoreszenzmethoden (Hühnererythrozyten, Rattenleberschnitte und Crithidien) überlegen. Das ergibt sich aus Untersuchungen an 73 Patientenseren (Lupus erythèmatodes disseminatus, medikamentös induzierter Lupus erythematodes, Lupus erythematodes discoides, Vasculitis allergica, progressive Sklerodermie, Dermatomyositis) und 36 Kontroilseren.
Baby hamster kidney cells as antigen for demonstration of antinuclear antibodies Baby hamster kidney cells fixed in acetone on glass slides were used as antigen for demonstration of antinuclear antibodies. Where certain storage conditions were observed (drying agent, 4 °C) they have kept for 12 months up to now. As regards specificity, sensitivity, reproducibility, and differentiation of fluorescent types the baby hamster kidney cell test appears superior to other immunofluorescence methods used (chicken erythrocytes, rat liver sections, andcrithidiae). These results were obtained in 73 sera from patients with disseminated lupus erythematodes, drug-induced lupus erythematodes, discoid erythematodes, allergic vasculitis, progressive scleroderma, dermatomyositis, and 36 control sera.
Der Nachweis antinukleärer Antikörper stellt einen
Als Screening-Methoden zum Nachweis von anti-
wichtigen Befund zur Diagnose des systemischen Lupus erythematodes dar. Bei negativem Befund ist die Diagnose so gut wie ausgeschlossen. Ein positiver Befund muß jedoch nicht beweisend sein, da antinukleäre Anti-
nukleären Antikörpern sind heute der indirekte Immunfluoreszenztest unter Verwendung von Gefrierschnitten von Rattenleber bzw. Rattennieren (10) oder von Hühnererythrozyten (8) und die Untersuchung des LE-Zell-Phänomens (9) am weitesten verbreitet. Im Radioimmunoassay nachgewiesene Antikörper gegen DoppelstrangDNA gelten heute als relativ spezifisch für einen systemi-
körper auch bei zahlreichen immunpathologischen System-
erkrankungen anderer Art vorkommen (11, 13, 14): bei »mixed connective tissue disease« (Sharp-Syndrom) und medikamentös ausgelöstem Lupus erythematodes in 100%, bei chronisch-aggressiver Hepatitis in 75%, Sjögien-Syndrom in 70%, progressiver Sklerodermie in 60%,
Dermatomyositis in 40%, primär-biliärer Zirrhose in 40%, kryptogener Zirrhose in 38%, Lupus erythematodes discoides in 35%, Panarteriitis nodosa in 15%, rheumatoider Arthritis in 25%, Myasthenia gravis in 21%, Psoriasis vulgaris in 29%, weiterhin bei allergischer Vaskulitis, Colitis ulcerosa, Morbus Addison, Pemphigus, perniziöser Anämie, Thyreoiditis, Malignomen, bei Gewebsschädigung und (niedrige Titer) auch im Alter, besonders bei Frauen. Antinukleäre Antikörper können als Autoantikörper
gegen einsträngige und (oder) doppelsträngige DesDxyribonucleinsäure (DNA), Ribonucleinsäure (RNA), NTucleoprotein, Histon und extrahierbare nukleäre Antigene mit und ohne nukleäre RNA (SM-Protein, ENA) erichtet sein (14). Die gebräuchlichen Testmethoden dienen dem Screenng, dem spezifischen Nachweis bestimmter Antikörper md der Verlaufsbeurteilung der Erkrankung (2, 16, 17). )012-0472/78
0915 - 1448
schen Lupus erythematodes (SLE). Diese Methode bewährt
sich besonders gut zur Therapiekontrolle (3, 11, 21, 26). Allerdings sind wie beim Nachweis des LE-Zell-Phäno-
mens positive Befunde nur in etwa zwei Drittel der SLF.-Fälle zu erwarten. Folgende weitere Methoden, verbunden mit kleineren oder größeren Nachteilen, finden Verwendung: Immunfluoreszenztechnik mit Kulturzelleh aus Tumor- (7, 19), Amnion- oder Kaninchennierengewebe (15) mit menschlichen Leukozyten oder mit Crithidia luciliae (1), Immunperoxidasetechniken, Gegenstromelektrophorese und Elektroimmundiffusion (6, 18, 22), Agglutinationstests mit an Erythro. zyten, Latex oder Bentonit gebundenen Antigenen (ein- und doppelsträngige DNA, Histon-DNA-Komplex), Präzipitationsmethoden, Komplementbindungsreaktionen und Antiglobulinverbrauchstest.
Die Palette der Testmethoden auf antinukleäre Antikörper (ANA) ist groß, jedoch sind die heute routinemäßig angewendeten Techniken zeit- und kostenaufwendig und führen teils zu falsch-positiven, teils zu falsch-negativen Ergebnissen. Deshalb stellt sich immer noch die Frage nach einem einfach durchführbaren, empfindlichen Screening-Test zum Nachweis von antinukleären Antikörpern.
$ 03.00 © 1978 Georg Thieme Publishers
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Q Georg Thieme Verlag, Stuttgart
'449
Pernice u. a.: Babyhamsternieren-Zellen rum Nachweis antinukleärer Antikörper
Im folgenden wird ein Immunfluoreszenz-Test-Kit zum Nachweis von antinukleären Antikörpern vorgestellt, in dem als Antigen eine Babyhamsternieren-
(BHK-)Zelle (24) verwendet wird.
Material und Methoden 1. Präparation des Antigens: Als Antigen wurden die für die Herstellung von Vakzinen gebräuchlichen BHK-Zellen vom Stamm Pirbright benutzt. Sie wuchsen adhäsiv-einschichtig und zeichneten sich durch einen blastenartigen polyploiden Zellkern aus. Die Zellen wurden von der Wand des Kulturgefäßes abtrypsiniert und in Gefäßen, die mit Objektträgern ausgelegt waren, etwa 24 Stunden gehalten. Auf diese Weise entstand auf den Objektträgern ein lockerer Zellrasen. Die bewachsenen Objektträger wurden dreimal in isotonischer Kochsalzlösung gewaschen und die Zellen nachfolgend mit Aceton fixiert. Die Lagerung erfolgte unter Luftabschluß mit Trokkenmittel bei 4 °C. Die Präparation der Kryostat-Rattenleberschnitte erfolgte nach Holborow und Mitarbeitern (10), die der Hühnererythrozyten nach Fischer und Dorzewski (8). An Stelle der von Aarden und Mitarbeitern (1) vorgeschlage-
nen Crithidia luciliae wurde Crithidia fasciculata verwendet. Die Flagellaten wurden in 0,1% Formalin abgetötet, dreimal in PBS (»phosphate buffered sahne«) gewaschen und in Mengen von je 10 tl einer etwa S%igen Suspension auf Reaktionsfeldern von Objektträgern 30 Minuten lang getrocknet.
Die Seren stammten von behandelten Patienten mit systemischem, diskoidem und medikamentös induziertem Lupus erythematodes, progressiver Sklerodermie, Dermatomyositis und GardnerSyndrom (Tabelle 1). Die Seren aller Patienten waren zum Zeitpunkt der Blutentnahme
im indirekten Immunfluoreszenztest auf antinukleäre Antikörper mit Rattenleberschnitten positiv.
Die Seren wurden bei 20 °C tiefgefroren gelagert, nach Auftauen mit Natriumazid versetzt und innerhalb von 14 Tagen ausgewertet. Die Seren der zweiten Serie wurden allerdings erst 4 Monate nach Lagerung bei + 4 °C untersucht.
S. Die Tests wurden, für alle Substrate in gleicher Weise, wie folgt durchgeführt: Das jeweilige Antigen auf den Reaktionsfeldern wurde 30 Minuten in der feuchten Kammer mit den in PBS verdünnten Patientenseren inkubiert und dann innerhalb von 30 Minuten dreimal in PBS gewaschen.
Als markierter Antikörper wurde ein Fluoresceinisothiocyanat(FITC-)Ziege-Antihumanglobulin der Behringwerke AG verwendet,
Charge Nr. 638, F/P-Quotient 3,0; spezifischer Antikörperanteil 100/o ± 50/o. Bei einer Arbeitsverdünnung von 1 : 20 wurde keine unspezifische Hintergrundfluoreszenz beobachtet.
Nach dem Waschen der Präparate wurden die Reaktionsfelder mit dem Konjugat in Arbeitsverdünnung beschichtet, wiederum für 30 Minuten in der feuchten Kammer inkubiert und dreimal in PBS gewaschen.
Die Auswertung der Präparate erfolgte nach Eindecken in Glycerin mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops der Fa Zeiss (Universal Forschungsmikroskop) im Auflicht (Lichtquelle: HBO 50, Erregerfilter: G 455, KP 500, Teilerspiegel: FT 510, Sperrfilter: LP 520 im III RS-Kondensor). Die Präparate wurden nach folgenden Kriterien beurteilt: maximale Fluoreszenzstärke aller Titerstufen (+ bis + + + +), Titerendpunkt und Fluoreszenztyp. Antikörper gegen Doppelstrang-DNA wurden mit Hilfe eines käuflichen Testkits der Fa. Amersham (Braunschweig) bestimmt. Die Durchführung des Tests erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Alle Probandenseren wurden mit Serumpuffer im Verhältnis 1: 10 vorverdünnt und in Doppelansätzen gemessen.
Ergebnisse ANA-positive Präparate unterschieden sich deutlich von ANA-negativen. Die BHK-Zellen ließen sich hierbei besonders gut beurteilen, außerdem waren die Fluoreszenztypen sehr gut differenzierbar (Abbildung 1*). Die BHK-Zellen zeigten vergleichsweise die größte Empfindlichkeit, es ergaben sich keine falsch-positiven *
Abbildung 1 siehe Tafel Seite 1436
Tab. 1. Übersicht über das Untersuchungsmaterial Anzahl* . rie
Kennziffer
Anzahl** 2. Serie
(überalterte Seren)
1
Anzahl der untersuchten LE-Seren
36
37
2
Anzahl der untersuchten Kontrollseren
12
24
3
klinische Daten von den LE-Seren erhältlich bei
24
30
3a
Die Seren stammten von unterschiedlichen Patienten
18
22
3b
davon hatten klinisch einen systemischen Lupus erythematodes
S
3c
davon hatten einen Lupus erythematodes discoides
2
6
3d
davon hatten eine Sklerodermie
S
6
3e
davon hatten eine allergische Vaskulitis
2
3f
davon hatten eine Dermatomyositis
2
3g
davon hatten Verdacht auf Gardner-Syndrom
3h
davon hatten einen medikamentös ausgelösten Lupes erythematodes
3i
zum Zeitpunkt der Blutentnahme hatten von den Seren 320 einen Titer einen Titer < 320
*
(6 Seren)
2
(16 Seren)
(19 Seren) 1
0
1
2
0
28
17 5
8
(14 Seren)
7
1
1
Seren bei - 20 oc gelagert, aufgetaut, mit Na-Azid versetzt, in der kalten Jahreszeit verschickt und vor der Testung 2 Wochen bei + 4 °C gelagert ** Seren bei - 20 °C gelagert, aufgetaut, in der warmen Jahreszeit verschickt, mit Natriumazid versetzt und vor der Testung 4 Monate bei + 4 °C gelagert bei 15 Seren semiquantitative Angaben
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Nr. 37, 15. September 1978, 103. Jg.
Deutsche Medizinische Wochenschrift
Pernice u. a.: Babyhamsternieren-Zellen zum Nachweis antinukleärer Antikörper
Befunde. So waren von 36 Patientenseren (erste Serie) bei
Doppelbestimmung 31 mit Hilfe des BHK-Zell-Tests 16), mit Hühnererythrozyten 24, mit positiv (Titer Hilfe der Rattenleberschnitte 19 und im Radioimmunoassay auf Doppelstrang-DNA nur elf Patientenseren. Von diesen elf Patientenseren ergaben sich in zehn Fällen die
höchsten Titerstufen mit dem BHK-Zell-Test (Abbildung 2). Von 24 Seren (18 Patienten) lagen detaillierte klinische Daten vor. Davon stammten sechs Seren von fünf Patienten mit systemischem Lupus erythematodes. in Doppelbestimmung waren mit BHK-Zellen fünf, mit Leberschnitten vier und mit Hühnererythrozyten sechs Seren positiv. Ein Serum eines SLE-Patienten wurde dabei mit dem BHK-Test falsch-negativ beurteilt, da eine sehr starke Plasmafluoreszenz auftrat, die eine schwache Ringfluoreszenz verdeckte. Mit Hilfe der Rattenleber-
schnitte konnte diese nachgewiesen werden. Von den BH K
Titer 16000
4000
s
..
1000
I
s
250
sechs SLE-Seren waren mit dem Radioimmunoassay drei Seren positiv. Von 19 Seren, die von 13 Patienten mit Erkrankungen wie Lupus erythematodes discoides (n = 2), Skierodermie (n S), allergischer Vaskulitis (n = 2), Dermatomyositis (n = 2) und medikamentös ausgelöstem
Lupus erythematodes (n = 2) stammten, waren bei Doppelbestimmung 16 mit BHK-Zellen, 13 mit Hühnererythrozyten, neun mit Rattenleberschnitten und sechs
Seren im Radioimmunoassay auf Doppelstrang-DNA positiv.
Von 28 Patientenseren mit einem ANA-Titer von t 320 zum Zeitpunkt der Blutentnahme hatten mit BHK-Zellen 24, mit Rattenleberschnitten acht und mit 250. In Hühnererythrozyten sechs Seren einen Titer dieser Gruppe waren sieben Patientenseren im Rádioimmunoassay positiv. Mit Hühnererythrozyten waren bei Doppelbestimmung drei Seren von den zwölf Kontroilseren positiv (Titer 16) auf antinukleäre Antikörper. Mit Rattenleberschnitten, BHK-Zellen oder im Radioimmunoassay auf Doppelstrang-DNA ergaben sich bei Doppelbestimmungen keine reproduzierbaren falschpositiven Werte (Abbildung 3, Tabelle 2). Der ANA-Test mit Crithidien ergab nur bei einer einzigen Patientin (zwei Seren) mit schwerer Verlaufsform
eines systemischen Lupus erythematodes positive Befunde. In diesem Fall konnten auch im Radioimmunohochtitrig Anti-D oppelstrang-D NA-Antikörper nachgewiesen werden. Wie Tabelle 3 zeigt, sind die mit niedrigtitrigen, überass ay
64 16
alterten (Lagerung im aufgetauten Zustand über 4 Monate) Seren gewonnenen Befunde wenig reproduzierbar,
I
4
jedoch erhält man auch hier mit den BHK-Zellen vergleichsweise die besten Ergebnisse. 27
24
8
220
74
660
2000
Anti OS-DNA RIA lEinheiten/mI)
Im Radioimmunoassay positive Seren ergaben im BHK-Zelltest und mit Hühnererythrozyten gleichermaßen positive Befunde, während Kryostat-Rattenleber-
Leber
Titer
A
Erythro
16000
zyten A
Titer 16000 4000
4000 1000
.
s
1000
5
250
5 250
$
5
64
64 16
.
4
8
24
b) Anti-DS-DNA
.
16
I 27
s.
s
4
660 74 220 (Einheiten/mI)
2000
27
8
24
74
220
660
2000
c Anti-DS-DNA (Einheiten/mI)
Abb. 2. Korrelation der Ergebnisse verschiedener Immunfluoreszenzmethoden mit den Ergebnissen des Radioimmunoassay (RIA). a) BHK-ZeIlen, b) Leberschnitte, c) Hühnererythrozyten.
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Pernice u. a.: Babyhamsternieren-Zellen zum Nachweis antinukleärer Antikörper
Mr. 37, 15. September 1978, 103. Jg.
Tab. 2. Ergebnisse mit frischen Seren (1. Serie)
antinukleäre Faktoren reproduzierbar positiv bei Doppelbestimmung (Titer 16)
Zahl der
Gruppe
Seren
Kennziffer**
BHK-
Zellen
Leberschnitte
antinukleäre Faktoren mindestens einmal positiv bei Doppelbestimmung
Titer
Antikörper gegen HühnerDoppelerythrostrang-DNA zyten
16)
BHKZellen
Leberschnitte
Hühnereiythrozyten
gesamte LE-Seren
36
1
31
19
24
11
34
29
32
5
4
6
3
6
S
6
16
9
13
6
18
14
17
26
17
18
26
6
7
26 26
24
8
11
7)
Seren von SLE-Patienten
6
ANA-positive Seren von Nicht-SLE-Patienten
19
3ch
Seren mit Ausgangstiter 320
28
3i
*(24
3i
5
2
6
4
8
5
6
2
0
0
3
0
0
1
S
3b
Seren mit Ausgangs-
titer < 320
8
Kontroilseren *
12
positiv , Titer 250 Die Kennziffern beziehen sich auf Tabelle 1
Tab. 3. Ergebnisse mit überalterten Seren (2. Serie)
von den positiven reproduzierbar positiv
Gruppierung
Zahl Kennder ziffer*
Seren
BHK 2-4 Einzelbestimmungen
Leberschnitte 2-3 Einzelbestimmungen
Hühnererythrozyten 2-3 Einzelbestim-
körper gegen DoppelstrangDNA
fixiert unfixiert fixiert unfixiert mungen gesamte LE-Seren
37
1
Seren von SLE-Patienten
14
Nicht-SLEPatienten
Seren mit Titer 320
positiv mehr als die Hälfte der Einzelbestimmungen
RIA Anti-
Hühnererythrozyten 2-4 Einzelbestimfixiert unfixiert fixiert unfixiert mungen BHK
2-4 Einzelbestimmungen
Leberschnitte 2-3 Einzelbestimmungen
7**
7**
25**
6
2
2
10
5
0
0
0
4
4
7
2
1
1
4
1
1
1
0
0
0
2
O
O
O
O
O
O
29**
12
3
3
3
10
13
3b
7
2
2
2
7
6
10
16
3cg
2
3
3
17
3i
4
1
3
5
3i
0
24
2
O
17**
Seren von
1
1
Seren mit
Titer < 320 Kontrollseren
Ø
O
O
* Die Kennziffern beziehen sich auf Tabelle 1 ** positiv mindestens eine Einzelbestimmung
schnitte deutlich weniger empfindlich waren. In den Seren, die von Patienten mit systemischem Lupus erythe-
matodes stammten, konnten antinukleäre Antikörper häufiger und mit höheren Titern gefunden werden als in Seren von Patienten mit Erkrankungen wie diskoidem und medikamentös induziertem Lupus erythematodes, Skierodermie, allergischer Vaskulitis, Dermatomyositis und Gardner-Syndrom. Das könnte bedeuten, daß antinukleäre Antikörper von SLE-Patienten stabiler sind als
die der anderen Gruppe. Da die anfangs hochtitrigen Seren in gleichem Maße im Verlauf der Lagerung negativ wurden wie die anfangs niedrigtitrigen, kann eine Titerabhängigkeit ausgeschlossen werden.
Diskussion Der BHK-Zelltest auf antinukleäre Faktoren entspricht im Spektrum der Befunde etwa dem bei Verwendung von Rattenleberschnitten. Jedoch ist der BHK-Zelltest gegenüber den Gefrierschnitt-Immunfluoreszenz-Techniken einfacher durchführbar, da die BHK-Zellobjektträger sofort gebrauchsfertig sind. Der Test ist deutlich empfindlicher als die Methode mit Kryostat-Rattenleberschnitten. Zwei Erklärungsmöglichkeiten bieten sich hierfür an: 1. Das blastenartige polyploide Kernmaterial hat besonders gute antigene Eigenschaften, 2. die BHKZellen sind mit Kern und Plasma auf dem Objektträger
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(RIA)
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Deutsche Medizinische Wothenadirift
Titer 16000
1000
-..'--
--
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-
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61
-
16
.
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s.
.5
s
1
,' BHK Lb
-
.
-
4
o
..
.
250
5s Ery Cr BHK Lb Ery Cr BHK
SLE 5 Patienten
6 Seren
Sklerodermie 5 Patienten 7 Seren
-
Lb
..5
Ery Cr BHK Lb Ery Cr BHK Lb Ery Cr BHK
Dermatomyositis 2 Patienten
5 Seren
LE discoides
2 Patienten 2 Seren
allergische
Vaskulitis 2 Patienten 2 Seren
Lb
Ery Cr BHK Lb Ery
Cr
medikamentöser
Kontrollen
LE Patienten
12 Patienten 12 Seren
2
2 Seren
Abb. 3. Ergebnisse der verschiedenen Immunfluoreszenzmethoden. Vergleich der Methoden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und Spezi fität (BHK = Babyhamsternieren-Zelle, Lb = Kryostat-Rattenleberschnitte, Ery = Hühnererythrozyten, Cr Crithidien).
ausgebreitet, so daß eine Hintergrundfluoreszenz im all-
gemeinen sehr wenig in Erscheinung tritt. In seltenen Fällen kann jedoch eine starke, durch das Patientenserum bedingte Plasmafluoreszenz eine vorhandene schwache Ringfluoreszenz verdecken. Solche Seren müssen, zum
Beispiel mit Rattenlebergefrierschnitten oder Hühnererythrozyten, nachuntersucht werden. Gegenüber Hühnererythrozyten und Crithidien hat der BHK-Zelltest mit den Rattenleberschnitten gemeinsam den Vorteil, daß unterschiedliche Fluoreszenztypen differenziert werden können. Die Bedeutung der Fluoreszenztypen für die Differentialdiagnose wird in der Literatur unterschiedlich beurteilt (12, 17, 20, 25), aber eine gewisse Korrelation
der Ring- und homogenen Fluoreszenz mit im Radioimmunoassay nachgewiesenen Anti-Doppelstrang-DNAund Antinucleoprotein-Antikörpern beim systemischen Lupus erythematodes, der nukleolären Fluoreszenz mit Anti-RNA und Anti-Ribonucleoprotein-Antikörpern bei der Sklerodermie und der RNAase-empfindlichen »speckled« Fluoreszenz mit extrahierbaren Kernantigenen (ENA) bei der »mixed connective tissue disease« ist gegeben (14).
Die Hühnererythrozyten-Methode erlaubt keine Differenzierung der Fluoreszenztypen. »Speckled« Fluoreszenztypen werden meist nicht erfaßt (4), und das Auftreten von falsch-positiven Befunden ist ein weiterer Nachteil der Methode, mit derenHi1fe sich primär Einstrang-DNA-Antikörper nachweisen lassen.
Demgegenüber lassen sich mit Hilfe von Crithidien relativ spezifisch Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörper
nachweisen. Crithidien sollen in ihren Kinetoblasten reine Doppelstrang-DNA enthalten (1, 23). Positive Be-
funde, die mit Hilfe des Radioimmunoassay bestätigt wurden, ergaben sich aber nur bei eiñer Patientin (zwei Seren). Bei weiteren neun Seren, die positiv im Radioimmunoassay waren, konnten aber mit dem Crithidientest keine Autoantikörper gefunden werden. Diese Befunde deuten auf eine hohe Spezifität, aber niedrige Empfindlichkeit dieses Substrates hin. Das steht in Übereinstimmung mit den Befunden von Federlin (persönliche Mitteilungen).
Dagegen werden in der Literatur in etwa 60% von SLE-Fällen positive Befunde angegeben. Die differierenden Angaben könnten einerseits durch eine unterschied-
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liche Auswahl von Patienten in unterschiedlichen Krankheitsstadien begründet sein. Andererseits ergeben jedoch die radioimmunologischen Untersuchungen häufiger positive Befunde, als aufgrund der klinischen Parameter zu
Carr, R. I., D. Koffler, V. Agnello, H. G. Kunkel: Studies on DNA antibodies using DNA labelled with actinomycin.D ('H) or dimethyl ('H) sulphate. Clin. exp. Immunol. 4 (1969),
Hammond: Fluorescent antibody technic as a routine procedure in the diagnosis of lupus erythematosus using stored tissue culture cells. Amer. J. clin.
527.
Path. 45 (1966), 117.
erwarten wäre. Das könnte mit der großen Instabilität
Cleymaet, J. E., R. M. Nakamura: Indirect immunofluorescent antinuclear antibody tests. Comparison of sensitivity and specificiryof different substrates. Amer. J. clin. Path. 58 (1972),
Nakamura, R. M.: Immunopathology. Clinical Laboratory Concepts and Methods (Little, Brown and Company: Boston 1974), 247.
der Doppelstrang-DNA zusammenhängen. Letztlich können Einstrang-DNA-Verunreinigungen im RIA-Test auf Doppelstrang-DNA nie ganz ausgeschlossen werden, so daß möglicherweise positive Befunde im Radioimmuno-
assay in der Nicht-SLF.-Gruppe auf Verunreinigungen der Testkitreagenzien mit Einstrang-DNA beruhen. Andererseits wurden die Patienten klinisch nur ausnahmsweise auf Antikörper gegen Doppelstrang-DNA untersucht, so daß zum Beispiel bei schwerer Vaskulitis eine Entwicklung in Richtung auf einen systemischen Lupus erythematodes eventuell nicht erkannt wurde. Negative Befunde im Radioimmunoassay bei SLE-Patienten können durchaus dadurch erklärt werden, daß sich die meisten der untersuchten Patienten in klinischer Remission befanden. Zu falsch-negativen Befunden. mit Screening-Tests auf antinukleäre Antikörper kann es bei Exazerbationen des systemischen Lupus erythematodes kommen, wenn freie Desoxyribonucleinsäure zirkuliert. Derartige Fälle müs-
sen zum Beispiel mit Hilfe der Gegenstromelektrophorese (5, 22), weiter untersucht werden.
Durch den BHK-Zelltest auf antinukleäre Faktoren kann die Diagnose in Richtung auf eine »pararheumatische« Erkrankung gelenkt werden. Da sich diese Krankheitsgruppe in ihrer Autoantikörperspezifität, also auch
in ihrem Fluoreszenztyp und ihrem Antikörpertiter unterscheidet, kann auch in gewissen Grenzen die Diagnose eingeengt werden. Bei positivem Nachweis von antinukleären Faktoren kann dann eine Spezifizierung der Autoantikörper durch den Nachweis von Anti-Doppelstrang-D NA-Antikörpern, RNAase-empfindlichen ENA-Antikörpern, Immunkomplexen, lymphozytotoxischer Aktivität, Thrombozytenautoantikörpern, CoombsAntikörpern und basalmembranfixiertem Immunglobulin erfolgen und so die Diagnose gesichert werden.
388.
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Wir danken Dr. Schweinsberg, Behringwerke AG, für die freundliche Überlassung der fertig präparierten BHK-Zellobjektträger, Dr. Enders, Behringwerke AG, für die Züchtung und Überlassung der Crithidien und für die Hinweise zu deren Fixierung und Prof. Dr. Federlin, Medizinische Klinik der Universität Gießen, für seine Diskussionsbemerkungen zum BHK-ZelI- und Crithidien-Test. Literatur
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Dr. W. Pernice, Dr. G. Lüben, Dr. H. H. Sedlacek Behringwerke AG 3550 Marburg Dr. R. Scherer Dermatologische Klinik und Poliklinik der Universität 8000 München 2, Frauenlobstr. 9
Prof. Dr. C.-P. Sodomann Medizinische Universitätsklinik 3550 Marburg, Mannkopffstr. 1
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Nr. 37, 15. September 1978, 103. Jg.
Pernice u. a.: Sabyhamsternieren-Zellen zum Nachweis antinukleärer Antikörper
Deutsche Medizinische Wothensthrltt
Dtsch. med. 'Wschr. 103 (1978), 1448-1453
Babyhamsternieren-Zellen als Antigen für den Nachweis von antinukleären Antikörpern W. Pernice, R. Scherer, G. Lüben, C.-P. Sodomann und H. H. Sedlacek Behringwerke AG, Marburg/Lahn, Universitäts-Hautklinik München und Medizinische Universitätsklinik MarburgfLahn
Zum Nachweis antinukleärer Antikörper wurden als Antigen auf Objektträgern mit Aceton fixierte Babyhamsternieren-(BHK-)Zellen verwendet. Sie sind bei Beachtung bestimmter Lagerungsvorschriften (Trockenmittel, 4 °C) bisher 12 Monate haltbar. Im Hinblick auf Spezifität, Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Differenzierbarkeit der Fluoreszenztypen erscheint der BHK-Zelltest anderen vergleichend angewendeten Immunfluoreszenzmethoden (Hühnererythrozyten, Rattenleberschnitte und Crithidien) überlegen. Das ergibt sich aus Untersuchungen an 73 Patientenseren (Lupus erythèmatodes disseminatus, medikamentös induzierter Lupus erythematodes, Lupus erythematodes discoides, Vasculitis allergica, progressive Sklerodermie, Dermatomyositis) und 36 Kontroilseren.
Baby hamster kidney cells as antigen for demonstration of antinuclear antibodies Baby hamster kidney cells fixed in acetone on glass slides were used as antigen for demonstration of antinuclear antibodies. Where certain storage conditions were observed (drying agent, 4 °C) they have kept for 12 months up to now. As regards specificity, sensitivity, reproducibility, and differentiation of fluorescent types the baby hamster kidney cell test appears superior to other immunofluorescence methods used (chicken erythrocytes, rat liver sections, andcrithidiae). These results were obtained in 73 sera from patients with disseminated lupus erythematodes, drug-induced lupus erythematodes, discoid erythematodes, allergic vasculitis, progressive scleroderma, dermatomyositis, and 36 control sera.
Der Nachweis antinukleärer Antikörper stellt einen
Als Screening-Methoden zum Nachweis von anti-
wichtigen Befund zur Diagnose des systemischen Lupus erythematodes dar. Bei negativem Befund ist die Diagnose so gut wie ausgeschlossen. Ein positiver Befund muß jedoch nicht beweisend sein, da antinukleäre Anti-
nukleären Antikörpern sind heute der indirekte Immunfluoreszenztest unter Verwendung von Gefrierschnitten von Rattenleber bzw. Rattennieren (10) oder von Hühnererythrozyten (8) und die Untersuchung des LE-Zell-Phänomens (9) am weitesten verbreitet. Im Radioimmunoassay nachgewiesene Antikörper gegen DoppelstrangDNA gelten heute als relativ spezifisch für einen systemi-
körper auch bei zahlreichen immunpathologischen System-
erkrankungen anderer Art vorkommen (11, 13, 14): bei »mixed connective tissue disease« (Sharp-Syndrom) und medikamentös ausgelöstem Lupus erythematodes in 100%, bei chronisch-aggressiver Hepatitis in 75%, Sjögien-Syndrom in 70%, progressiver Sklerodermie in 60%,
Dermatomyositis in 40%, primär-biliärer Zirrhose in 40%, kryptogener Zirrhose in 38%, Lupus erythematodes discoides in 35%, Panarteriitis nodosa in 15%, rheumatoider Arthritis in 25%, Myasthenia gravis in 21%, Psoriasis vulgaris in 29%, weiterhin bei allergischer Vaskulitis, Colitis ulcerosa, Morbus Addison, Pemphigus, perniziöser Anämie, Thyreoiditis, Malignomen, bei Gewebsschädigung und (niedrige Titer) auch im Alter, besonders bei Frauen. Antinukleäre Antikörper können als Autoantikörper
gegen einsträngige und (oder) doppelsträngige DesDxyribonucleinsäure (DNA), Ribonucleinsäure (RNA), NTucleoprotein, Histon und extrahierbare nukleäre Antigene mit und ohne nukleäre RNA (SM-Protein, ENA) erichtet sein (14). Die gebräuchlichen Testmethoden dienen dem Screenng, dem spezifischen Nachweis bestimmter Antikörper md der Verlaufsbeurteilung der Erkrankung (2, 16, 17). )012-0472/78
0915 - 1448
schen Lupus erythematodes (SLE). Diese Methode bewährt
sich besonders gut zur Therapiekontrolle (3, 11, 21, 26). Allerdings sind wie beim Nachweis des LE-Zell-Phäno-
mens positive Befunde nur in etwa zwei Drittel der SLF.-Fälle zu erwarten. Folgende weitere Methoden, verbunden mit kleineren oder größeren Nachteilen, finden Verwendung: Immunfluoreszenztechnik mit Kulturzelleh aus Tumor- (7, 19), Amnion- oder Kaninchennierengewebe (15) mit menschlichen Leukozyten oder mit Crithidia luciliae (1), Immunperoxidasetechniken, Gegenstromelektrophorese und Elektroimmundiffusion (6, 18, 22), Agglutinationstests mit an Erythro. zyten, Latex oder Bentonit gebundenen Antigenen (ein- und doppelsträngige DNA, Histon-DNA-Komplex), Präzipitationsmethoden, Komplementbindungsreaktionen und Antiglobulinverbrauchstest.
Die Palette der Testmethoden auf antinukleäre Antikörper (ANA) ist groß, jedoch sind die heute routinemäßig angewendeten Techniken zeit- und kostenaufwendig und führen teils zu falsch-positiven, teils zu falsch-negativen Ergebnissen. Deshalb stellt sich immer noch die Frage nach einem einfach durchführbaren, empfindlichen Screening-Test zum Nachweis von antinukleären Antikörpern.
$ 03.00 © 1978 Georg Thieme Publishers
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Q Georg Thieme Verlag, Stuttgart
'449
Pernice u. a.: Babyhamsternieren-Zellen rum Nachweis antinukleärer Antikörper
Im folgenden wird ein Immunfluoreszenz-Test-Kit zum Nachweis von antinukleären Antikörpern vorgestellt, in dem als Antigen eine Babyhamsternieren-
(BHK-)Zelle (24) verwendet wird.
Material und Methoden 1. Präparation des Antigens: Als Antigen wurden die für die Herstellung von Vakzinen gebräuchlichen BHK-Zellen vom Stamm Pirbright benutzt. Sie wuchsen adhäsiv-einschichtig und zeichneten sich durch einen blastenartigen polyploiden Zellkern aus. Die Zellen wurden von der Wand des Kulturgefäßes abtrypsiniert und in Gefäßen, die mit Objektträgern ausgelegt waren, etwa 24 Stunden gehalten. Auf diese Weise entstand auf den Objektträgern ein lockerer Zellrasen. Die bewachsenen Objektträger wurden dreimal in isotonischer Kochsalzlösung gewaschen und die Zellen nachfolgend mit Aceton fixiert. Die Lagerung erfolgte unter Luftabschluß mit Trokkenmittel bei 4 °C. Die Präparation der Kryostat-Rattenleberschnitte erfolgte nach Holborow und Mitarbeitern (10), die der Hühnererythrozyten nach Fischer und Dorzewski (8). An Stelle der von Aarden und Mitarbeitern (1) vorgeschlage-
nen Crithidia luciliae wurde Crithidia fasciculata verwendet. Die Flagellaten wurden in 0,1% Formalin abgetötet, dreimal in PBS (»phosphate buffered sahne«) gewaschen und in Mengen von je 10 tl einer etwa S%igen Suspension auf Reaktionsfeldern von Objektträgern 30 Minuten lang getrocknet.
Die Seren stammten von behandelten Patienten mit systemischem, diskoidem und medikamentös induziertem Lupus erythematodes, progressiver Sklerodermie, Dermatomyositis und GardnerSyndrom (Tabelle 1). Die Seren aller Patienten waren zum Zeitpunkt der Blutentnahme
im indirekten Immunfluoreszenztest auf antinukleäre Antikörper mit Rattenleberschnitten positiv.
Die Seren wurden bei 20 °C tiefgefroren gelagert, nach Auftauen mit Natriumazid versetzt und innerhalb von 14 Tagen ausgewertet. Die Seren der zweiten Serie wurden allerdings erst 4 Monate nach Lagerung bei + 4 °C untersucht.
S. Die Tests wurden, für alle Substrate in gleicher Weise, wie folgt durchgeführt: Das jeweilige Antigen auf den Reaktionsfeldern wurde 30 Minuten in der feuchten Kammer mit den in PBS verdünnten Patientenseren inkubiert und dann innerhalb von 30 Minuten dreimal in PBS gewaschen.
Als markierter Antikörper wurde ein Fluoresceinisothiocyanat(FITC-)Ziege-Antihumanglobulin der Behringwerke AG verwendet,
Charge Nr. 638, F/P-Quotient 3,0; spezifischer Antikörperanteil 100/o ± 50/o. Bei einer Arbeitsverdünnung von 1 : 20 wurde keine unspezifische Hintergrundfluoreszenz beobachtet.
Nach dem Waschen der Präparate wurden die Reaktionsfelder mit dem Konjugat in Arbeitsverdünnung beschichtet, wiederum für 30 Minuten in der feuchten Kammer inkubiert und dreimal in PBS gewaschen.
Die Auswertung der Präparate erfolgte nach Eindecken in Glycerin mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops der Fa Zeiss (Universal Forschungsmikroskop) im Auflicht (Lichtquelle: HBO 50, Erregerfilter: G 455, KP 500, Teilerspiegel: FT 510, Sperrfilter: LP 520 im III RS-Kondensor). Die Präparate wurden nach folgenden Kriterien beurteilt: maximale Fluoreszenzstärke aller Titerstufen (+ bis + + + +), Titerendpunkt und Fluoreszenztyp. Antikörper gegen Doppelstrang-DNA wurden mit Hilfe eines käuflichen Testkits der Fa. Amersham (Braunschweig) bestimmt. Die Durchführung des Tests erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Alle Probandenseren wurden mit Serumpuffer im Verhältnis 1: 10 vorverdünnt und in Doppelansätzen gemessen.
Ergebnisse ANA-positive Präparate unterschieden sich deutlich von ANA-negativen. Die BHK-Zellen ließen sich hierbei besonders gut beurteilen, außerdem waren die Fluoreszenztypen sehr gut differenzierbar (Abbildung 1*). Die BHK-Zellen zeigten vergleichsweise die größte Empfindlichkeit, es ergaben sich keine falsch-positiven *
Abbildung 1 siehe Tafel Seite 1436
Tab. 1. Übersicht über das Untersuchungsmaterial Anzahl* . rie
Kennziffer
Anzahl** 2. Serie
(überalterte Seren)
1
Anzahl der untersuchten LE-Seren
36
37
2
Anzahl der untersuchten Kontrollseren
12
24
3
klinische Daten von den LE-Seren erhältlich bei
24
30
3a
Die Seren stammten von unterschiedlichen Patienten
18
22
3b
davon hatten klinisch einen systemischen Lupus erythematodes
S
3c
davon hatten einen Lupus erythematodes discoides
2
6
3d
davon hatten eine Sklerodermie
S
6
3e
davon hatten eine allergische Vaskulitis
2
3f
davon hatten eine Dermatomyositis
2
3g
davon hatten Verdacht auf Gardner-Syndrom
3h
davon hatten einen medikamentös ausgelösten Lupes erythematodes
3i
zum Zeitpunkt der Blutentnahme hatten von den Seren 320 einen Titer einen Titer < 320
*
(6 Seren)
2
(16 Seren)
(19 Seren) 1
0
1
2
0
28
17 5
8
(14 Seren)
7
1
1
Seren bei - 20 oc gelagert, aufgetaut, mit Na-Azid versetzt, in der kalten Jahreszeit verschickt und vor der Testung 2 Wochen bei + 4 °C gelagert ** Seren bei - 20 °C gelagert, aufgetaut, in der warmen Jahreszeit verschickt, mit Natriumazid versetzt und vor der Testung 4 Monate bei + 4 °C gelagert bei 15 Seren semiquantitative Angaben
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Nr. 37, 15. September 1978, 103. Jg.
Deutsche Medizinische Wochenschrift
Pernice u. a.: Babyhamsternieren-Zellen zum Nachweis antinukleärer Antikörper
Befunde. So waren von 36 Patientenseren (erste Serie) bei
Doppelbestimmung 31 mit Hilfe des BHK-Zell-Tests 16), mit Hühnererythrozyten 24, mit positiv (Titer Hilfe der Rattenleberschnitte 19 und im Radioimmunoassay auf Doppelstrang-DNA nur elf Patientenseren. Von diesen elf Patientenseren ergaben sich in zehn Fällen die
höchsten Titerstufen mit dem BHK-Zell-Test (Abbildung 2). Von 24 Seren (18 Patienten) lagen detaillierte klinische Daten vor. Davon stammten sechs Seren von fünf Patienten mit systemischem Lupus erythematodes. in Doppelbestimmung waren mit BHK-Zellen fünf, mit Leberschnitten vier und mit Hühnererythrozyten sechs Seren positiv. Ein Serum eines SLE-Patienten wurde dabei mit dem BHK-Test falsch-negativ beurteilt, da eine sehr starke Plasmafluoreszenz auftrat, die eine schwache Ringfluoreszenz verdeckte. Mit Hilfe der Rattenleber-
schnitte konnte diese nachgewiesen werden. Von den BH K
Titer 16000
4000
s
..
1000
I
s
250
sechs SLE-Seren waren mit dem Radioimmunoassay drei Seren positiv. Von 19 Seren, die von 13 Patienten mit Erkrankungen wie Lupus erythematodes discoides (n = 2), Skierodermie (n S), allergischer Vaskulitis (n = 2), Dermatomyositis (n = 2) und medikamentös ausgelöstem
Lupus erythematodes (n = 2) stammten, waren bei Doppelbestimmung 16 mit BHK-Zellen, 13 mit Hühnererythrozyten, neun mit Rattenleberschnitten und sechs
Seren im Radioimmunoassay auf Doppelstrang-DNA positiv.
Von 28 Patientenseren mit einem ANA-Titer von t 320 zum Zeitpunkt der Blutentnahme hatten mit BHK-Zellen 24, mit Rattenleberschnitten acht und mit 250. In Hühnererythrozyten sechs Seren einen Titer dieser Gruppe waren sieben Patientenseren im Rádioimmunoassay positiv. Mit Hühnererythrozyten waren bei Doppelbestimmung drei Seren von den zwölf Kontroilseren positiv (Titer 16) auf antinukleäre Antikörper. Mit Rattenleberschnitten, BHK-Zellen oder im Radioimmunoassay auf Doppelstrang-DNA ergaben sich bei Doppelbestimmungen keine reproduzierbaren falschpositiven Werte (Abbildung 3, Tabelle 2). Der ANA-Test mit Crithidien ergab nur bei einer einzigen Patientin (zwei Seren) mit schwerer Verlaufsform
eines systemischen Lupus erythematodes positive Befunde. In diesem Fall konnten auch im Radioimmunohochtitrig Anti-D oppelstrang-D NA-Antikörper nachgewiesen werden. Wie Tabelle 3 zeigt, sind die mit niedrigtitrigen, überass ay
64 16
alterten (Lagerung im aufgetauten Zustand über 4 Monate) Seren gewonnenen Befunde wenig reproduzierbar,
I
4
jedoch erhält man auch hier mit den BHK-Zellen vergleichsweise die besten Ergebnisse. 27
24
8
220
74
660
2000
Anti OS-DNA RIA lEinheiten/mI)
Im Radioimmunoassay positive Seren ergaben im BHK-Zelltest und mit Hühnererythrozyten gleichermaßen positive Befunde, während Kryostat-Rattenleber-
Leber
Titer
A
Erythro
16000
zyten A
Titer 16000 4000
4000 1000
.
s
1000
5
250
5 250
$
5
64
64 16
.
4
8
24
b) Anti-DS-DNA
.
16
I 27
s.
s
4
660 74 220 (Einheiten/mI)
2000
27
8
24
74
220
660
2000
c Anti-DS-DNA (Einheiten/mI)
Abb. 2. Korrelation der Ergebnisse verschiedener Immunfluoreszenzmethoden mit den Ergebnissen des Radioimmunoassay (RIA). a) BHK-ZeIlen, b) Leberschnitte, c) Hühnererythrozyten.
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1450
1451
Pernice u. a.: Babyhamsternieren-Zellen zum Nachweis antinukleärer Antikörper
Mr. 37, 15. September 1978, 103. Jg.
Tab. 2. Ergebnisse mit frischen Seren (1. Serie)
antinukleäre Faktoren reproduzierbar positiv bei Doppelbestimmung (Titer 16)
Zahl der
Gruppe
Seren
Kennziffer**
BHK-
Zellen
Leberschnitte
antinukleäre Faktoren mindestens einmal positiv bei Doppelbestimmung
Titer
Antikörper gegen HühnerDoppelerythrostrang-DNA zyten
16)
BHKZellen
Leberschnitte
Hühnereiythrozyten
gesamte LE-Seren
36
1
31
19
24
11
34
29
32
5
4
6
3
6
S
6
16
9
13
6
18
14
17
26
17
18
26
6
7
26 26
24
8
11
7)
Seren von SLE-Patienten
6
ANA-positive Seren von Nicht-SLE-Patienten
19
3ch
Seren mit Ausgangstiter 320
28
3i
*(24
3i
5
2
6
4
8
5
6
2
0
0
3
0
0
1
S
3b
Seren mit Ausgangs-
titer < 320
8
Kontroilseren *
12
positiv , Titer 250 Die Kennziffern beziehen sich auf Tabelle 1
Tab. 3. Ergebnisse mit überalterten Seren (2. Serie)
von den positiven reproduzierbar positiv
Gruppierung
Zahl Kennder ziffer*
Seren
BHK 2-4 Einzelbestimmungen
Leberschnitte 2-3 Einzelbestimmungen
Hühnererythrozyten 2-3 Einzelbestim-
körper gegen DoppelstrangDNA
fixiert unfixiert fixiert unfixiert mungen gesamte LE-Seren
37
1
Seren von SLE-Patienten
14
Nicht-SLEPatienten
Seren mit Titer 320
positiv mehr als die Hälfte der Einzelbestimmungen
RIA Anti-
Hühnererythrozyten 2-4 Einzelbestimfixiert unfixiert fixiert unfixiert mungen BHK
2-4 Einzelbestimmungen
Leberschnitte 2-3 Einzelbestimmungen
7**
7**
25**
6
2
2
10
5
0
0
0
4
4
7
2
1
1
4
1
1
1
0
0
0
2
O
O
O
O
O
O
29**
12
3
3
3
10
13
3b
7
2
2
2
7
6
10
16
3cg
2
3
3
17
3i
4
1
3
5
3i
0
24
2
O
17**
Seren von
1
1
Seren mit
Titer < 320 Kontrollseren
Ø
O
O
* Die Kennziffern beziehen sich auf Tabelle 1 ** positiv mindestens eine Einzelbestimmung
schnitte deutlich weniger empfindlich waren. In den Seren, die von Patienten mit systemischem Lupus erythe-
matodes stammten, konnten antinukleäre Antikörper häufiger und mit höheren Titern gefunden werden als in Seren von Patienten mit Erkrankungen wie diskoidem und medikamentös induziertem Lupus erythematodes, Skierodermie, allergischer Vaskulitis, Dermatomyositis und Gardner-Syndrom. Das könnte bedeuten, daß antinukleäre Antikörper von SLE-Patienten stabiler sind als
die der anderen Gruppe. Da die anfangs hochtitrigen Seren in gleichem Maße im Verlauf der Lagerung negativ wurden wie die anfangs niedrigtitrigen, kann eine Titerabhängigkeit ausgeschlossen werden.
Diskussion Der BHK-Zelltest auf antinukleäre Faktoren entspricht im Spektrum der Befunde etwa dem bei Verwendung von Rattenleberschnitten. Jedoch ist der BHK-Zelltest gegenüber den Gefrierschnitt-Immunfluoreszenz-Techniken einfacher durchführbar, da die BHK-Zellobjektträger sofort gebrauchsfertig sind. Der Test ist deutlich empfindlicher als die Methode mit Kryostat-Rattenleberschnitten. Zwei Erklärungsmöglichkeiten bieten sich hierfür an: 1. Das blastenartige polyploide Kernmaterial hat besonders gute antigene Eigenschaften, 2. die BHKZellen sind mit Kern und Plasma auf dem Objektträger
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(RIA)
1452.
Pernice u. a. Babyhamsternieren-Zellen zum Nachweis antinukleârer Antikörper
Deutsche Medizinische Wothenadirift
Titer 16000
1000
-..'--
--
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-
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61
-
16
.
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-
-
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-'
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s.
.5
s
1
,' BHK Lb
-
.
-
4
o
..
.
250
5s Ery Cr BHK Lb Ery Cr BHK
SLE 5 Patienten
6 Seren
Sklerodermie 5 Patienten 7 Seren
-
Lb
..5
Ery Cr BHK Lb Ery Cr BHK Lb Ery Cr BHK
Dermatomyositis 2 Patienten
5 Seren
LE discoides
2 Patienten 2 Seren
allergische
Vaskulitis 2 Patienten 2 Seren
Lb
Ery Cr BHK Lb Ery
Cr
medikamentöser
Kontrollen
LE Patienten
12 Patienten 12 Seren
2
2 Seren
Abb. 3. Ergebnisse der verschiedenen Immunfluoreszenzmethoden. Vergleich der Methoden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und Spezi fität (BHK = Babyhamsternieren-Zelle, Lb = Kryostat-Rattenleberschnitte, Ery = Hühnererythrozyten, Cr Crithidien).
ausgebreitet, so daß eine Hintergrundfluoreszenz im all-
gemeinen sehr wenig in Erscheinung tritt. In seltenen Fällen kann jedoch eine starke, durch das Patientenserum bedingte Plasmafluoreszenz eine vorhandene schwache Ringfluoreszenz verdecken. Solche Seren müssen, zum
Beispiel mit Rattenlebergefrierschnitten oder Hühnererythrozyten, nachuntersucht werden. Gegenüber Hühnererythrozyten und Crithidien hat der BHK-Zelltest mit den Rattenleberschnitten gemeinsam den Vorteil, daß unterschiedliche Fluoreszenztypen differenziert werden können. Die Bedeutung der Fluoreszenztypen für die Differentialdiagnose wird in der Literatur unterschiedlich beurteilt (12, 17, 20, 25), aber eine gewisse Korrelation
der Ring- und homogenen Fluoreszenz mit im Radioimmunoassay nachgewiesenen Anti-Doppelstrang-DNAund Antinucleoprotein-Antikörpern beim systemischen Lupus erythematodes, der nukleolären Fluoreszenz mit Anti-RNA und Anti-Ribonucleoprotein-Antikörpern bei der Sklerodermie und der RNAase-empfindlichen »speckled« Fluoreszenz mit extrahierbaren Kernantigenen (ENA) bei der »mixed connective tissue disease« ist gegeben (14).
Die Hühnererythrozyten-Methode erlaubt keine Differenzierung der Fluoreszenztypen. »Speckled« Fluoreszenztypen werden meist nicht erfaßt (4), und das Auftreten von falsch-positiven Befunden ist ein weiterer Nachteil der Methode, mit derenHi1fe sich primär Einstrang-DNA-Antikörper nachweisen lassen.
Demgegenüber lassen sich mit Hilfe von Crithidien relativ spezifisch Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörper
nachweisen. Crithidien sollen in ihren Kinetoblasten reine Doppelstrang-DNA enthalten (1, 23). Positive Be-
funde, die mit Hilfe des Radioimmunoassay bestätigt wurden, ergaben sich aber nur bei eiñer Patientin (zwei Seren). Bei weiteren neun Seren, die positiv im Radioimmunoassay waren, konnten aber mit dem Crithidientest keine Autoantikörper gefunden werden. Diese Befunde deuten auf eine hohe Spezifität, aber niedrige Empfindlichkeit dieses Substrates hin. Das steht in Übereinstimmung mit den Befunden von Federlin (persönliche Mitteilungen).
Dagegen werden in der Literatur in etwa 60% von SLE-Fällen positive Befunde angegeben. Die differierenden Angaben könnten einerseits durch eine unterschied-
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4000
Pernice u. a.: Babyhamsternieren-Zellen zum Nachweis antinukleärer Antikörper
'453
liche Auswahl von Patienten in unterschiedlichen Krankheitsstadien begründet sein. Andererseits ergeben jedoch die radioimmunologischen Untersuchungen häufiger positive Befunde, als aufgrund der klinischen Parameter zu
Carr, R. I., D. Koffler, V. Agnello, H. G. Kunkel: Studies on DNA antibodies using DNA labelled with actinomycin.D ('H) or dimethyl ('H) sulphate. Clin. exp. Immunol. 4 (1969),
Hammond: Fluorescent antibody technic as a routine procedure in the diagnosis of lupus erythematosus using stored tissue culture cells. Amer. J. clin.
527.
Path. 45 (1966), 117.
erwarten wäre. Das könnte mit der großen Instabilität
Cleymaet, J. E., R. M. Nakamura: Indirect immunofluorescent antinuclear antibody tests. Comparison of sensitivity and specificiryof different substrates. Amer. J. clin. Path. 58 (1972),
Nakamura, R. M.: Immunopathology. Clinical Laboratory Concepts and Methods (Little, Brown and Company: Boston 1974), 247.
der Doppelstrang-DNA zusammenhängen. Letztlich können Einstrang-DNA-Verunreinigungen im RIA-Test auf Doppelstrang-DNA nie ganz ausgeschlossen werden, so daß möglicherweise positive Befunde im Radioimmuno-
assay in der Nicht-SLF.-Gruppe auf Verunreinigungen der Testkitreagenzien mit Einstrang-DNA beruhen. Andererseits wurden die Patienten klinisch nur ausnahmsweise auf Antikörper gegen Doppelstrang-DNA untersucht, so daß zum Beispiel bei schwerer Vaskulitis eine Entwicklung in Richtung auf einen systemischen Lupus erythematodes eventuell nicht erkannt wurde. Negative Befunde im Radioimmunoassay bei SLE-Patienten können durchaus dadurch erklärt werden, daß sich die meisten der untersuchten Patienten in klinischer Remission befanden. Zu falsch-negativen Befunden. mit Screening-Tests auf antinukleäre Antikörper kann es bei Exazerbationen des systemischen Lupus erythematodes kommen, wenn freie Desoxyribonucleinsäure zirkuliert. Derartige Fälle müs-
sen zum Beispiel mit Hilfe der Gegenstromelektrophorese (5, 22), weiter untersucht werden.
Durch den BHK-Zelltest auf antinukleäre Faktoren kann die Diagnose in Richtung auf eine »pararheumatische« Erkrankung gelenkt werden. Da sich diese Krankheitsgruppe in ihrer Autoantikörperspezifität, also auch
in ihrem Fluoreszenztyp und ihrem Antikörpertiter unterscheidet, kann auch in gewissen Grenzen die Diagnose eingeengt werden. Bei positivem Nachweis von antinukleären Faktoren kann dann eine Spezifizierung der Autoantikörper durch den Nachweis von Anti-Doppelstrang-D NA-Antikörpern, RNAase-empfindlichen ENA-Antikörpern, Immunkomplexen, lymphozytotoxischer Aktivität, Thrombozytenautoantikörpern, CoombsAntikörpern und basalmembranfixiertem Immunglobulin erfolgen und so die Diagnose gesichert werden.
388.
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Wir danken Dr. Schweinsberg, Behringwerke AG, für die freundliche Überlassung der fertig präparierten BHK-Zellobjektträger, Dr. Enders, Behringwerke AG, für die Züchtung und Überlassung der Crithidien und für die Hinweise zu deren Fixierung und Prof. Dr. Federlin, Medizinische Klinik der Universität Gießen, für seine Diskussionsbemerkungen zum BHK-ZelI- und Crithidien-Test. Literatur
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Dr. W. Pernice, Dr. G. Lüben, Dr. H. H. Sedlacek Behringwerke AG 3550 Marburg Dr. R. Scherer Dermatologische Klinik und Poliklinik der Universität 8000 München 2, Frauenlobstr. 9
Prof. Dr. C.-P. Sodomann Medizinische Universitätsklinik 3550 Marburg, Mannkopffstr. 1
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Nr. 37, 15. September 1978, 103. Jg.
