Arch. Microbiol. 105, 143-151 (1975) - 9 by Springer-Verlag 1975

Die Wirkung von blauem und rotem Licht auf die Synthese ribosomaler R N A bei Chlorella M. STEUP Pflanzenphysiologisches Institut der Universit/it G6ttingen Eingegangen am 26. Juni 1975 Effect of Blue and Red Light on the Synthesis of R i b o s o m a l R N A in Chlorella Abstract. In autotrophic cultures of Chlorella pyrenoidosa

(strain 211-8b) incorporation of tritiated guanosine and uridine into ribosomal RNA is stimulated by light. Blue light of wavelengths around 457 nm is considerably more effective than red light around 679 nm (5 - 10 -I~ Einstein c m - Z s e c -1 for both). This effect can be demonstrated for young daughter cells (at the end of the dark period) and for older cells (at the end of the light period). It is shown to depend on a regulation of rRNA-synthesis. The blue light dependent enhancement of incorporation is more pronounced in the cytoplasmic rRNA (25 and 18 s) than in the chloroplast rRNA (23 and 16s). Blue light of low intensity (1 . 10 -1~ Einstein cm-2sec -1) has nearly the same effectivity as the fivefold intensity, whereas red light of equal quantum fluxes enhances incorporation only slightly compared with the dark control. The blue light dependent enhancement of rRNA-synthesis continues in the following darkness in contrary to that caused by red light. This enhancement is also found in DCMU-poisened cultures. In contrast to this, in red light in presence of DCMU, incorporation into rRNA is nearly the same as in dark. It is concluded that the regulation of rRNA-synthesis in red light is closely connected to complete photosynthesis, while in blue light an additional regulation takes place independent of photosynthesis.

Zusammenfassung. Bei autotrophen Synchronkulturen von Chlorella pyrenoidosa (Stamm 211-8b) wird der Einbau yon

~H-markiertem Guanosin und Uridin in die ribosomale RNA durch Licht stimuliert. Dabei ist blaues Licht der Wellenl~inge um 457 nm erheblich wirksamer als Rotlicht um 679 nm (jeweils 5 . 1 0 - J0 Einstein cm 2sec- 1). Dieser Effect ist bei jungen Autosporen (am Ende der Dunkelphase) und bei /ilteren Zellen (am Ende der Lichtphase) nachweisbar. Er beruht auf einer lichtabh/ingigen Regulierung der rRNA-Synthese. Die blaulichtabhgngige Steigerung des Einbaus ist bei der cytoplasmatischen rRNA (25 und 18 s) ausgepr/igter als bei der plastidS.ren rRNA (23 und 16 s). Schwaches Blaulicht (1 9 10 -1~ Einstein cm-2sec -1) hat fast die gleiche Wirksamkeit wie die fiinffache Energie, w~ihrend schwaches Rotlicht der gleichen Quantenstromdichte die Markierung nur geringffigig gegentiber der Dunkelparallelen erh6ht. Die blaulichtabhfingige Steigerung der rRNA-Synthese hfilt im Gegensatz zu der durch Rotlicht ausgel6sten im nachfolgenden Dunkel an. Sie ist auch in DCMUvergifteten Kulturen nachweisbar. Dagegen sinkt im Rot in Gegenwart von DCMU der Einbau in die rRNA auf annfihernd den Wert der Dunkelkontrolle. Es wird gefolgert, dab die Regulierung der rRNA-Synthese im Rotlicht in enger Bindung an die Photosynthese, im Blaulicht dagegen zusfitzlich fiber einen Photosynthese-unabh~ingigen Mechanismus erfolgt.

Key words: rRNA-Synthesis - Regulation by Blue and Red Light - Chlorella pyrenoidosa - Polyacrylamide Electrophoresis.

D e r Stoffwechsel von Grtinalgen wird in auff/illiger Weise durch den blauen und roten Spektralbereich des sichtbaren Lichts reguliert. Diese Lichtwirkungen wurden zunfichst an den Unterschieden im K o h l e n hydrat- und Proteingehalt von Blau- und R o t l i c h t kulturen e r k a n n t (Pirson u. Kowallik, 1960). In weiteren U n t e r s u c h u n g e n wurde bei verschiedenen M i k r o o r g a n i s m e n eine Vielzahl von Lichtwirkungen a u f Stoffwechselprozesse nachgewiesen, von denen die meisten d e m blauen Spektralbereich zuzuordnen sind (Ubersichtsreferate: Kowallik, 1970; Voskresenskaya, 1972). FaBt m a n verschiedene Befunde z u s a m m e n , so

ergibt sich folgendes Bild: Rotlicht f6rdert die Speicherung von photosynthetisch gebildeten oder aus d e m M e d i u m a u f g e n o m m e n e n K o h l e n h y d r a t e n , wfihrend Blaulicht den A b b a u von Speicherkohlenhydraten und die Sauerstoffaufnahme f6rdert sowie eine Reihe verschiedener Synthesen - so die Bildung von R N A , Protein, Chlorophyll, Carotinoid (Dresbach u. K o wallik, 1974) und P o l y p h o s p h a t (Steup u. Pirson, 1974) - steigert. A u f G r u n d der bisher ftir Blau- und Rotlichteffekte vorliegenden Aktionsspektren k o m m t ftir Rotlichtwirkungen Chlorophyll, ffir Blaulichtwirkungen ein Flavin oder C a r o t i n o i d als wirksames

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Arch. Microbiol., Vol. 105, No. 2 (1975)

Pigment in Frage. Einige Blaulichteffekte, aber keine Rotlichtwirkungen konnten auch bei chlorophyllfreien Mutanten nachgewiesen werden (Kowallik, 1970). Genauere Kenntnisse fiber den Mechanismus der Lichtwirkungen und ihre Abh~ingigkeit untereinander fehlen noch. Die vorliegenden Untersuchungen befassen sich mit dem Kurzzeiteinbau markierter Vorstufen in ribosomale R N A unter dem EinfluB des blauen und roten Spektralbereichs. Sie gingen v0n der Frage aus, ob die schon frtiher beobachtete langfristige Zunahme des Gehalts an G e s a m t - R N A im Blaulicht (Kowallik, 1962) auf einer innerhalb weniger Minuten verstfirkten RNA-Synthese beruht, die somit einen wichtigen Schritt innerhalb des Gesamtkomplexes der farblichtabh~ingigen Stoffwechselregulation darstellt, oder ob es sich hierbei um einen erst langsam anlaufenden Sekundfireffekt handelt. Die Untersuchungen b e schrfinkten sich auf die r R N A , die weitaus gr6Bte R N A - F r a k t i o n (Ssymank, 1971). Markierungsexperimente mit der r R N A haben zudem den Vorteil, dab sie durch die gelelektrophoretische Trennbarkeit von plastidfirer und cytoplasmatischer r R N A methodisch die Voraussetzung ffir eine genauere Lokalisierung einer Farblichtwirkung in der Zelle bieten.

Material und Methoden Die Untersuchungen wurden mit Synchronkulturen der einzelligen Grfinalgen Chlorellapyrenoidosa (Stamm 211-8 b der Algensammlung des Pflanzenphysiologischen Instituts der Universitfit G6ttingen) durchgeffihrt. Die Synchronisierung der Algen erfolgte nach Kuhl u. Lorenzen (1964) im regelm~iBigenLichtdunkelwechsel (14:10 Std, 18000 Lux WeiBlicht, 32~C) mit t~iglicher Verdfinnung der Algensuspension auf die relative Zellzahl 100 vor dem Beginn der Lichtperiode. Zur Bestrahlung der Algen mit Farblicht wurden eine Xenonhochdrucklampe (Osram XBO 450 bzw. 900 W) und Interferenzfilter (Schott IL) mit maximaler Durchlfissigkeit bei 457 bzw. 6,79 nm und einer Halbwertsbreite von 10 nm verwendet. Die Farblichtenergien wurden mit einem Ger~it der Fa. Yellow Springs Instruments Co. gemessen. Beide Lichtqualit~iten waren auf annfihernd gleiche Quantenstromdichte eingestellt; wenn nicht anders angegeben, wurden 5.10 s0 Einstein cm-2sec -1 eingestrahlt (1300 erg cm-Zsec -I bei 457 nm und 900 erg em 2sec-~ bei 679 nm). Ffir die Markierungsexperimente wurden junge Autosporen oder 14 Std alte Zellen verwendet. Die Autosporen wurden unmittelbar vor dem Ende der Dunkelphase kurz abzentrifugiert und in frischer N~ihrl6sung - bei Hemmstoffversuchen mit dem entsprechenden Giftzusatz - auf die relative Zellzahl 1800-2000 eingestellt. Anschliel3end blieben sie unter normaler Begasung ffir 30 minim Dunkeln. Die alteren Zellstadien wurden am Ende der Lichtphase ohne Wechsel der N/ihrl6sung vor der Zugabe der Aktivitfit fiir 30 rain verdunkelt. Zur Markierung der Nucleins~iuren wurden die radioaktiv markierten Nucleoside [8-3H] Guanosin (spez. Aktivit~it 15 Ci/mmol) bzw. [5-3H] Uridin (spez. Aktivit/it 30 Ci/mmol), beide bezogen yon Amersham Buchler GmbH & Co. KG in Braunschweig, in einer Endkonzentration von 0,1 mCi/60 ml

Suspension zugesetzt. Bei Nachffitterungs(,,chase")-Experimenten wurde die Aufnahme der Radioaktivit~it durch den Zusatz der mindestens tausendfachen Menge der unmarkierten Verbindung gestoppt; die Zellen blieben anschliel3end ffir ca. 60 rain unter unveranderten Bedingungen. Die Isolierung der Nucleinsfiuren erfolgte modifiziert nach Parish u. Kirby (1966) sowie Cattolico u. Jones (1972). Die Algen wurden durch Zusatz yon tiefgekfihltem )kthanol abget6tet, abzentrifugiert und mit eiskaltem Puffer (0,025 M Tris, 0,025 M KC1, 0,025 M MgC12, mit Difithylpyrocarbonat (Serva) auf pH 7,6 eingestellt) gewaschen. Dann wurden die Zellen, mit Glasperlen yon 0,25-0,3 mm Durchmesser und dem gleichen Puffer gemischt, in einer Zellmfihle (Fa. Bfihler, Tfibingen) unter stfindiger Kfihlung aufgeschlossen. F fir Autosporen betrug die AufschluBzeit 30-40 sec, ffir 5.ttere Zellen 1 min. Das Homogenat wurde zweimal mit dem gleichen Volumen einer Phenol-Kresol-Mischung (140 ml m-Kresol und 0,5 g 8-Hydroxychinolin pro 1000 ml puffergesfittigtes Phenol) extrahiert. AnschlieBend wurde die wiiBrige Phase abgehoben und der Rfickstand mit einem 0,1 M Tris/HC1-Puffer pH 9,0 mit einem Zusatz von 0,05 M MgSO4- durchmischt. Beide w/iBrigen fJberstfinde wurden vereinigt und aus ihnen die Nucleins~iuren mit tiefgekfihltem Athanol (2,5 m!./ml fSberstand) unter Zusatz yon 20 ~ Na-Acetat (0,1 ml/ml Uberstand) fiber Nacht bei - 20~C ausgeffillt. Die abzentrifugierten, mit tiefgekfihltem Athanol gewaschenen und anschlieBend getrockneten NucleinsS,uren wurden in einem 0,1 M Tris-Puffer pH 7,5, der 0,01 M NaC1, 2 mM EDTA-Na2 und Difithylpyrocarbonat enthfilt, gel6st. Die Auftrennung der Nucleins~iuren erfolgte durch Elektrophorese an 2,4~ Polyacrylamidgelen nach Loening (1967). Als Elektrophorese-Puffer wurde folgender Puffer verwendet: 36 mM Tris, 30 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA-Na 2 pH 7,6-7,8. Die Elektrophorese wurde zun~ichst ffir 30 min bei 2 mA/Gel und dann ffir etwa 3 Std bei 4 mA/Gel bei 0~ durchgeffihrt. Anschliegend wurde die Absorption der Gele bei 265 nm in einem Chromoscan (Joyce-Loebl Gerfitebautechnik GmbH) gemessen. Zur Radioaktivitfitsbestimmung wurden die Gele mit Trockeneis eingefroren und mit einem Gel-Slicer (ebenfalls Joyce-Loebl) in 1 mm dicke Scheiben zerschnitten, die mit 0,2 ml Perhydrol (Merck) bei 60~ fiber Nacht aufgel6st wurden. Nach Zugabe von Aquasot (NEN Chemicals) wurde die Radioaktivit/it im Packard-TricarbFlfissigkeitsszintillations-Spektrophotometer gemessen. Bei allen Versuchen wurden aliquote Teile einer Ausgangskultur nebeneinander mit Blau- und Rotlicht bestrahlt bzw. verdunkelt, so dab ein direkter Vergleich der Nucleinsfiuremarkierung zwischen den drei Versuchsansfitzen m6glich ist.

Ergebnisse Bei Chlorella-Autosporen, die kurzfristig - etwa fiir 12 rain - mit [8-3H] Guanosin inkubiert werden, ist der Einbau der Radioaktivit~it in die Nucleinsfiuren deutlich gesteigert, wenn die Algensuspension w/ihrend der Inkubation nicht verdunkelt, sondern belichtet wird. Dabei ist Blaulicht der Wellenl/inge um 457 nm erheblich wirksamer als quantengleiches Rotlicht im Bereich von 679 nm. Trennt man die hochmolekularen Nucleinsfiuren gelelektrophoretisch auf und vergleicht den Verlauf der UV-Absorption mit dem der Radioaktivitfit, s o lassen sich 2 Radioaktivit/itsgipfe! erkennen, deren

M. Steup: BlaulichtrRNA-Synthesein Chlorella

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Abb. Ia - c. ElektrophoretischeAuftrennungder hochmolekularen Nucleinsguren von Chlorella-Autosporen an 2,4 ~ Polyacrylamid-Gelennach 12 rain lnkubation mit [8-3H]Guanosin (0,1 mCi/60 ml Suspension) im Dunkeln bzw. bei Bestrahlung mit quantengleichemRotlicht (Zmax= 679 rim)und Blaulicht Maxima im Bereich der 25 bzw. 18s rRNA liegen. Diese Gipfel sind im Blau um das 4-8fache, im Rot um das 1,5-3fache h6her als die der Dunkelparallelen. Wie Abb. 1 zeigt, sind beide Radioaktivitfitsgipfel asymmetrisch; sie weisen einen flacheren Abfall oder eine Schulter auf der der plastid/iren 23 bzw. 16s rRNA zugewandten Seite auf. Bei diesen markierten rRNA-Molekfilen, die bei der Gelelektrophorese schneller als die 25 bzw. 18 s rRNA, abet langsamer als die 23 bzw. 16s rRNA wandern, handelt es sich offenbar um Vorlfiufer der plastid/iren 23 bzw. 16s rRNA (vgl. Galling, 1974; Miller und McMahon, 1974). Diese Deutung wird best/itigt durch ein ,,chase"Experiment: Stoppt man die Aufnahme von markiertern Guanosin nach 12 rain Inkubation durch Zugabe der mindestens tausendfachen Menge an nicht markiertem Guanosin, ohne die fibrigen Versuchsbedingungen zu/indern, und erntet die Algen erst 60 rain spfiter, so treten nach der Elektrophorese statt der Schulter zwischen der 25 und 23s bzw. 18 und 16s rRNA 2 weitere Radioaktivit/itsmaxima auf, die mit der 23 bzw. 16s rRNA zusammenfallen (Abb.2). Auffallend ist, dal3 der Einbau in die cytoplasmatischen rRNA-species im Blau merklich st/irker gegentiber Rot gesteigert ist als der in die plastidfiren rRNAMolektile. Ein Guanosineinbau in die DNA konnte bei Chlorella-Aurosporen auch nach lfingerer Inku-

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(2~ax = 457 rim, jeweils 5 910-1~ Einstein cm-2sec-1). Laufrichtung yon links nach rechts. Abszisse : Wanderung im Gel in mm; Ordinate: Radioaktivitfit in cpm (unterbrochene Linie) und Extinktion bei 265 nm in relativen Einheiten (durchgezogene Linie). (a) Dunkel; (b) Rot; (c) Blau bationszeit nicht festgestellt werden. Nach Wanka u. Mulders (1967) setzt bei Synchronkulturen yon Chlorella eine intensive DNA-Synthese erst in der 2. H/ilfte der Lichtphase ein. Aus der in Abb. 1 und 2 dargestellten Steigerung der rRNA-Markierung durch blaues Licht kann nicht sogleich auf eine gesteigerte rRNA-Synthese geschlossen werden. Dieser Markierungseffekt k6nnte auch auf einer farblichtabhfingigen Erh6hung der spezifischen Aktivitfit in den ,,pools" der RNA-Vorstufen beruhen, ohne dal3 die RNA-Synthese selbst beeinfluBt w~ire. Als Ursache f/ir einen Anstieg der spezifischen Aktivit/it kommt eine gesteigerte Aufnahme von aul3en angebotener markierter Vorstufen oder eine ,,pool"-Verkleinerung in Frage. Eine solche blaulichtabh/ingige ,,pool"-Abnahme ist allerdings schon wegen der durch diesen Spektralbereich ausgel6sten erheblichen Depolymerisation von Speicherkohlenhydrat (Laudenbach u. Pirson, 1969) wenig wahrscheinlich; sie kann zudem auch auf Grund des folgenden Versuchs ausgeschlossen werden: Setzt man der Algensuspension bereits im Dunkeln 10 min vor der 12minfitigen Farblichteinstrahlung markiertes Guanosin zu, so ist die spezifische Aktivitfit in den ,,pools" der rRNA-Vorstufen bei Farblichtbeginn erheblich h6her als bei dem in Abb. 1 wiedergegebenen Versuch, und dementsprechend sollte eine durch Blaulicht ausgel6ste

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Arch. Microbiol., Vol. 105, No. 2 (1975) 17000 J 5000

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Abb. 2 a - c. Elektrophoretische Au~rennung der hochmolekularen Nucleinsguren yon ChNrel~-Autosporenan 2,4 ~ Polyacrylamid-Gelen nach 12 rain Inkubation mit [8-3H] Guanosin (0,1 mCi/60 ml Suspension) und anschlieBender Nachinku-

bation mit der tausendfachen Menge an nichtmarkiertem Guanosin ffir 60 rain. Weitere Einzelheiten des Versuchs und der Darstellung wie in Abb. 1. (a) Dunkel; (b) Rot; (c) Blau

,,pool"-Verkleinerung eine geringere Steigerung der spezifischen Aktivit/it und damit eine schwfichere Zunahme der rRNA-Markierung bewirken. Dies ist jedoch nicht der Fall. In Tabelle 1 sind die Werte eines Einbauversuchs ohne (a) und mit (b) Vorinkubation im Dunkeln zusammengestellt. Die Einbauwerte der Dunkelparallelen wurden jeweils subtrahiert. Weil bei kurzfristigen Einbauversuchen nicht sicher zwischen markierten cytoplasmatischen rRNA-Molektilen und markierten plastidfiren rRNA-Vorl~iufern unterschieden werden kann, wurde die Aktivitfit im Bereich der 25 - 23 s bzw. 18 - 16 s rRNA gemeinsam aufgefiihrt. Wie Tabelle 1 zeigt, hat die Vorinkubation keinen Einflu6 auf die blaulichtabh~ngige Steigerung der rRNAMarkierung gegenfiber Rot. Diese kann deshalb nicht durch einen ,,pool"-Gr613eneffekt verursacht sein. In einer weiteren Versuchsreihe wurde start Guanosin [5-3H] Uridin verwendet. Nach Befunden von Galling u. Ssymank (1970) und Ssymank (1973) wird dieses Nucleosid von ChloreIla-Zellen unter bestimmten physiologischen Bedingungen bevorzugt in die plastidgre rRNA eingebaut. Als Erklfirung ffir diese Spezifit~it werden Unterschiede in der Gr66e der cytoplasmatischen und plastidiiren RNA-Vorstufen,,pools" diskutiert, in die das markierte Uridin eingeschleust wird (Ssymank, 1973). Chlorella-Autosporen bauen auch [5-3H] Uridin im blauen Licht deutlich stfirker in ribosomale RNA

Tabelle 1. Lichtabh~ngige Zunahme des Einbaus yon [8-3H] Guanosin in rRNA von Chlorella-Autosporen;Einbauwerte im Dunkeln subtrahiert. Inkubationszeit : a) 12 rain in quantengleichem Blau- und Rotlicht bzw. Dunkel; b) 10 minim Dunkeln und anschlieBend 12 min in quantengleichem Rotund Blaulicht bzw. 22 minim Dunkeln. B = Blau, R = Rot. Weitere Einzelheiten des Versuchs wie in Abb. 1 rRNA

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25-23s 18-16s

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4500 3380

4,4 4,3

diese 3 Charakteristika hin untersucht. In Tabelle 3 ist ein als in quantengleichem Rot|icht; der Unterschied im Einbau betr~igt hier rund den Faktor 2 (Abb. 3). Neben diesem quantitativen Effekt fNlt ein qualitativer auf: die beiden Radioaktivit/itsgipfel, die wie beim Guanosineinbau asymmetrisch sind, liegen bei der Rotlichtkultur, verglichen mit der Blauparallelen, merklich in Richtung auf die plastid/ire rRNA verschoben. Dies deutet auf einen relativ h6heren Anteil an markierten Vorl/iufern der plastidSren rRNA hin. Dementsprechend ist bei einem ,,chase"-Experiment der Unterschied zwischen Blau und Rot bei den cytoplasmatischen 25 und 18 s rRNA gr6Ber als bei den plastid/iren 23 und 16s rRNA (Abb.4). Addiert man

M. Steup: Blaulicht rRNA-Synthese in Chlorella

147

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Abb. 3 a - c. Elektrophoretische Auftrennung der hochmolekularen Nucleins/iuren von Chlorella-Autosporen an 2,4 ~o Polyacrylamid-Gelen nach 12 min Inkubation mit [5-3H] Uridin

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Abb. 4 a - c. Elektrophoretische Auftrennung der hochmolekularen Nucleinsfiuren von Chlorella-Autosporen an 2,4 ~ Polyacrylamid-Gelen nach 12 rain Inkubation mit [5-3H] Uridin (0,1 mCi/60 ml Suspension) und anschlie6ender Nachinkuba-

tion mit der tausendfachen Menge an nichtmarkiertem Uridin ftir 60 min. Weitere Einzelheiten des Versuchs und der Darstellung wie in Abb. 1. (a) Dunkel; (b) Rot; (c) Blau

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Tabelle 2. VerNiltnis des [8-3H] Guanosin-Einbaus in cytoplasmatische (25 + 18s) und plastid/ire (23 + 16s) rRNA im Blau (B) zu dem im Rot (R) bei Chlorella-Autosporen nach verschieden langer Dauer der [8-3H]Guanosin-Aufnahme, die durch Zusatz der tausendfachen Menge an nicht markiertem Guanosin gestoppt wurde; 60 min Nachinkubation. Weitere Einzelheiten wie in Abb. 1 min

25 + 18s B/R

23 + 16s B/R

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Inkubationszeiten durch Zugabe der tausendfachen Menge an unmarkiertem Guanosin gestoppt wurde. Zur vollst/indigen Reifung der markierten rRNA blieben die Algen ffir 60 min unter unver/inderten Bedingungen (Tabelle 2). Die Verteilung der Aktivit/it /indert sich innerhalb der untersuchten Zeitspanne nicht signifikant. Die zuvor ffir Autosporen beschriebene Farblichtabh/ingigkeit der rRNA-Markierung ist auch bei 5Jteren Zellstadien nachweisbar. Abb. 5 zeigt das Ergebnis eines Einbauversuches mit 14 Std alten Zellen. Bei der Elektrophorese dieser Nucleins/iurepr/iparation wandert der gr6gte Teil der Radioaktivit/it genau mit der DNA. Weil er auch nach 60minfitiger Nachinkubation der Algen mit unmarkiertem Guanosin in dieser Lage bleibt, handelt es sich dabei offenbar um markierte DNA. Der Guanosineinbau in die DNA ist im Blaulicht nicht gesteigert; eher scheint eine leichte Hemmung vorzuliegen. Dagegen nimmt die Markierung im Bereich der 25 und 18 s rRNA 5_hnlich wie bei Autosporen (Abb. 1) in der Reihenfolge Dunkel-RotBlau zu; die Unterschiede sind allerdings weniger ausgepr/igt als bei Versuchen mit jungen Zellen, Die 14 Std alten Zellen zeigen auch die relativ st~irkere Markierung der im Kern codierten rRNA; bei einem ,,chase"-Experiment (entsprechend Abb. 2) ist die blaulichtabMngige F6rderung des Einbaus gegenfiber Rot bei der cytoplasmatischen rRNA etwa doppelt so

den Einbau in die beiden plastid/iren und cytoplasmatischen rRNA-species, so ergibt sich ffir die cytoptasmatische rRNA ein VerhNtnis Blau/Rot von 3,0, ffir die plastid/ire von 1,6. Dieses Ergebnis gleicht dem mit Guanosin erhaltenen weitgehend. Wegen der h6heren Einbauraten wurden die weiteren Versuche mit [8-3H] Guanosin durchgeffihrt. Die relativ st/irkere Markierung der cytoplasmatischen rRNA gegenfiber der plastid/iren im blauen Licht tritt fiber eine lfingere Zeitspanne unabhfingig yon der Inkubationsdauer auf. Dies zeigten Versuche, bei denen die Aufnahme yon [8-3H] Guanosin nach unterschiedlichen

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Abb. 5a- c. Elektrophoretische Auftrennung der hochmolekularen Nucleinsfiuren yon 14 Std alten Chlorella-Zellen an 2,4 ~ Polyacrylamid-Gelen nach 15 rain Inkubation mit [8-3H]

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Guanosin (0,1 mCi/60 ml Suspension). Weitere Einzelheiten des Versuchs und der Darstellung wie in Abb. 1. (a) Dunkel; (b) Rot; (c) Blau

M. Steup: BlaulichtrRNA-Synthesein Chlorella

149

Tabelle 3. Spezifische Aktivitfit der rRNA bei ChlorellaAutosporen nach 12 min Inkubation mit [8-3H] Guanosin; Werte bezogen auf die DunkelparalMe. Versuchsbedingungen: 1) Kontrolle 5.10 -1~ Einstein cm-2sec-1; 2) 10-s M DCMU, 5 910-1~ Einstein cm-2sec-1; 3) 1 - 10-1~ Einstein cm-2sec-1; 4) Einbau im Dunkeln nach 30 min Belichtung mit Blau (B) bzw. Rot (R), jeweils 5 - 10-l~ Einstein cm -2 sec-1, bzw. 30 min Verdunklung (D) ohne RadioaktivitMszusatz. D = Dunkel, R = Rot, B = Blau rRNA

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3) 25 - 23 s 18 - 16s

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16s

25 - 23s 1 8 - 16s

grog wie bei der plastid/iren rRNA. Diese Versuche zeigen, dab die blaulichtabh/ingige Steigerung der rRNA-Markierung nicht auf ein bestimmtes Zellstadium beschr/inkt oder an besondere Vorbehandlungen wie mehrst/jndiges Verdunkeln gebunden ist. Augerdem ist auf Grund der Tatsache, dab der Einbau nur in die rRNA, nicht aber in die DNA blaulichtgef6rdert ist, eine Lichtwirkung auf die Guanosinbzw. Uridinaufnahme als Ursache f/Jr diesen Markierungseffekt auszuschliegen; vielmehr mul3 er auf einer intracellul/iren Regulation beruhen. Der Zusammenhang dieser Regulation mit anderen Blaulichteffekten, insbesondere der Atmungs- und Proteinsynthesesteigerung, mug noch untersucht werden. Diese Blaulichtwirkungen sind gekennzeichnet durch die hohe Wirksamkeit bereits sehr niedriger Lichtintensitfiten (Kowallik, 1969; Andersag u. Pirson, 1975), durch die Unempfindlichkeit gegentiber DCMU 1 (Laudenbach u. Pirson, 1969) mid - zumindest im Fall der Atmungssteigerung nachgewiesen - durch ein"mahaltendes Nachklingen der durch die Blaulichteinstrahlung ausgel6sten Reaktion fiber das Ende der Belichtung hinaus (Pickett u. French, /967; Kowallik u. Kowallik, /969). Die blaulichtabhfingige Steigerung der rRNA-Synthese wurde auf die spezifische Aktivit/it der rRNA-species, bezogen aufdie Dunkelparallele, angegeben. Die Einbaumuster bei den verschiedenen Versuchen glichen denen in Abb. 1. Aus den zuvor genannten Gr/jnden wurden 1 DCMU = 3-(3,4-Dichlorphenyl)-l,l-dimethylharnstoff.

die 25 und 23s bzw. die 18 und 16s rRNA jeweils zusammengefagt. Aus Tabelle 3 fotgt f/jr die blaulichtabh/ingige Steigerung der rRNA-Synthese eine weitgehende Unempfindlichkeit gegenfiber 10 -5 M DCMU; dagegen wird die rRNA-Markierung im Rot durch dieses Photosynthesegift auf ann/ihernd den Dunkelwert herabgesetzt. Ein ghnliches Resultat erh/ilt man, wenn die Algen ohne Zusatz der Radioaktivitgt fiir 30 min mit Rot oder Blau belichtet werden (die DunkelparalMe bleibt w/ihrend dieser Zeit unbelichtet) und der Zusatz yon markiertem Guanosin erst unmittelbar nach der Belichtung im Dunkeln erfolgt. Unter diesen Bedingungen unterscheidet sich die Markierung bei Vorbelichtung mit Rot kaum vonder bei Vorverdunklung. Dagegen h/ilt die durch Blaulicht ausgel6ste Steigerung der rRNA-Synthese deutlich im anschliel3enden Dunkel an. Schwaches Blaulicht (1.10 -l~ Einstein cm -2 sec-1) hat bereits einen ann/ihernd so deutlichen Effekt auf die rRNA-Synthese wie die 5fache Intensit/it, wfihrend qnantengleiches Rotlicht nur eine geringf/jgige Steigerung der rRNA-Markierung bewirkt" Diese Kennzeichen lassen erkennen, dab im roten und blauen Licht zwei verschiedene Mechanismen an der Regulierung der rRNA-Synthese beteiligt sind. Diskussion

Wie aus den oben dargestellten Markierungsexperimenten hervorgeht, steigert Blaulicht erheblich stfirker als quantengleiches Rotlicht gegen/jber der Dunkelparallelen den Einbau yon markiertem Uridin und Guanosin in ribosomale RNA. Auf Grund der in Tabelle 1 und Abb. 5 angegebenen Daten ist ein ,,pool"Gr613en- oder Aufnahmeeffekt ats Ursache ftir diese Lichtwirkung auszuschliegen; vielmehr m/issen die beobachteten Einbauunterschiede auf unterschiedlichen rRNA-Syntheseraten beruhen. Nach Ssymank (1971) besteht bei Chlorella die RNA zu etwa 80 ~ aus rRNA. Das Verhalten der fibrigen RNA-Fraktionen, insbesondere das der tRNA, bei kurzfristiger Farblichteinstrahlung ist noch zu pr/jfen. Im Gegensatz zum roten Licht bewirkt blaues Licht bereits bei sehr niedriger Intensit/it eine erhebliche Steigerung der rRNA-Synthese; weitere Unterschiede zur Wirkung des roten Lichts sind die Unempfindlichkeit gegenfiber DCMU sowie das deutliche Nachklingen der durch Blaulicht ausge16sten rRNA-Synthese (Tabelle 3). Wfihrend ffir die rotabh/ingige Steigerung der rRNASynthese offenbar eine enge Bindung an die intakte Photosynthese vorliegt, mug Blaulicht zumindest zusfitzlich fiber einen Photosynthese-unabhfingigen Mechanismus, der bereits auf sehr schwache Blaulichtintm)sitfiten anspricht, die rRNA-Synthese stimulieren. In Ubereinstimmung mit diesem Ergebnis fanden Sen-

150 ger u. Bishop (1968) bei 24stfindiger Anzucht eine blaulichtabh/ingige Gesamt-RNA-Zunahme bei einer chlorophyllfreien Mutante. Fiir diese Blaulichtwirkung liegt eine genaue Einbaukinetik noch nicht vor. Aus Tabelle 2 ist jedoch ersichtlich, dab die Steigerung der rRNA-Synthese gegenfiber Rot innerhalb weniger Minuten eintritt und sowohl die plastid/ire als auch die cytoplasmatische rRNA betrifft. Dabei ist die F6rderung gegenfiber Rot bei der cytoplasmatischen rRNA gr6Ber. Auf Grund dieser Versuche l~iBtsichjedoch nicht sicher entscheiden, ob Blaulicht prim~ir im Kern die rRNA-Synthese steigert und erst indirekt, m6glicherweise fiber im Cytoplasma gebildete Proteine, die Bildung der plastid~iren rRNA verstfirkt oder ob beide Systeme nebeneinander blaulichtstirnuliert sind. Nach noch unver6ffentlichten Ergebnissen ist die Steigerung der rRNA-Synthese im Kern jedenfalls unabh~ingig von der plastid~iren rRNA-Bildung. In Gegenwart yon Rifampicin, einem spezifischen Hemmstoff der Initiation der plastid~iren RNA-Polymerase (Surzycki, I969), fanden wit eine ann/ihernd vollst~indige Einbauhemrnung im Bereich der plastid/iren rRNA, ohne dab dadurch der Blaulichteffekt auf die rRNA-Synthese im Kern beeintrfichtigt wurde, Interessant ist in diesem Zusarnmenhang, dab auch bei Farngametophyten in Kurzzeitmarkierungsexperimenten der gr6Bte Unterschied in der spezifischen Aktivitfit zwischen Rot und Blau in der R N A der Kernfraktion gefunden wurde (Raghavan, 1968). Nach Schiff (1974) wird w~ihrend der lichtinduzierten Plastidendifferenzierung von Euglena die Bildung plastid/irer rRNA dutch rotes und blaues Licht, die der cytoplasmatischen rRNA dagegen nur durch blaues Licht reguliert. Ob ~ihnliche VerNiltnisse auch bei Chlorellen mit voll ausgebildeten Chloroplasten vorliegen, mfissen weitere Versuche zeigen. Betrachtet man die hier beschriebene Blaulichtwirkung auf die rRNA-Synthese im Zusammenhang der gesamten farblichtabhfingigen Stoffwechselregulation, so liegt es nahe, in ihr die Ursache ffir die mehrfach beschriebene Proteinzunahme im Blau zu sehen. Dabei mui3 noch offenbleiben, ob sich die fibrigen RNA-Fraktionen gleichsinnig mit der rRNA verhalten und zusammen die Steigerung der Proteinsynthese bewirken. Die alternative Vorstellung, eine F6rderung der Proteinsynthese fiber eine vermehrte Bildung von Aminos~iuren oder yon ATP, erscheint dagegen weniger wahrscheinlich. Der ATP-pool findert sich - zumindest bei Chlamydomonas - erst langsam im Farblicht und ist wfihrend der hier untersuchten Bestrahlungsdauer bei Rot- und Blaulichtkultur noch ann~ihernd gleich (Steup u. Pirson, 1974). Bei Farngametophyten sind die ,,pools" der freien Aminos~iuren im Rot gr6Ber als im Blau (v. Deimling u. Mohr, 1967).

Arch. Microbiol., Vol. 105, No. 2 (i975) Unklar bleibt noch der Mechanismus, fiber den Blaulicht die rRNA-Synthese reguliert. Genauere Aussagen fiber diese Regulation sind erst m6glich, wenn die primfire blaulichtabh/ingige Steigerung der rRNASynthese in der ZeUe lokalisiert werden kann. Herrn Dr. V. Ssymank bin ich ffir methodische Hinweise und hilfreiche Diskussionen sehr dankbar. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft sei fiit finanzielle Unterstiitzung gedankt.

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