Planta (Berl.) 72, 91--118 (1967)
ENZYMATISCHE CHAt~AKTERISIEI~UNG DEI~ LYSO SOMENA Q U I V A L E N T E ( S P H A R O S O M E N ) VON M A I S K E I M L I N G E N En~ESTO GIACOMO SEMADE~I Institut fiir allgemeine Botanik der E.T.H. Zfirich Eingegangen am 22. Juli 1966 ENZYMATIC CHARACTERIZATION OF LYSOSOME EQUIVALENTS (SPHEROSOMES) IN CORN SEEDLINGS Summary. 1. The following acid hydrolases are partially sedimentable from cell-free extracts of corn seedlings: protease (pH-optimum 4,2), phosphatase (pHoptimum 5,0 and 6,5), unspecific esterase (pH-optimum 5,2), RNase (pH-optimum 6,5), arylsulphatase-C (pH-optimum 5,0) and a- and fl-amylase (pH-optimum 7,0 and 5,0 respectively). 2. After differential centrifugation of cell.free extracts the sedimentable hydrolases are recovered mainly in the mitochondrial and microsomal fraction. 3. It could be demonstrated that the acid hydrolases protease, phosphatase, RNase, and esterase of the mitochondrial fraction are contained in membrane-bound particles. 4. Isopycnic centrifugation of cell-free extracts in sucrose gradients revealed the presence of three particulate fractions carrying hydrolases. The heaviest fraction has a relative density of 1,138 g. cm-3 and contains acid protease, -phosphatase, -RNase, and acid esterase. A lighter fraction (d = 1,105 g-cm -3) contains the same acid hydrolases. The specifically lightest cell fraction (d--l,070 g.cm -3) contains the acid hydrolases glucose-6-phosphatase, arylsulphatase-C and small amounts of ~- and fi-amylase activity. This fraction also contains NADH-diaphorase activity. 5. By means of enzymatic characterization and staining with fluorochromes the structures carrying hydrolases were identified as two kinds of spherosomes and as fragments of the endoplasmatic reticulum. From these results it is concluded that the spherosomes represent organelles equivalent to the lysosomes of animal cells. 6. /%Glucuronidase, phospholipase-C, lipase, and arylsulphatase A and-B, all of wich are typical enzymes of animal lysosomes, are completely absent in cell-free extracts of corn seedlings. 7. The isolated spherosomes do not exhibit indophenoloxydase activity; thus the histochemical demonstration of this enzyme in spherosomes must be considered to be an artifact. 8. Isolated lipid droplets, spherosomes, prospherosomes, and mitochondria incorporate H-3-acetate into lipids. Consequently they contain all the nessesary enzymes for lipid synthesis. The high activity of lipid synthesis in the spheroromes points to a possible conversion of these organelles into lipid bodies. 9. Two transaminases are partially bound to the mitochondria; the rest of the activity is probably bound to fragments of membranes less dense than an 18% sucrose solution.
I. Einleitung und Problemstellung HA~STEI~ (1880) bcschrieb stark lichtbrechende Partike] im pflanzlichen Cytoplasma, die er Mikrosomen n a n n t e . Da sich diese Bezeichnung slo/iter als vieldeutig erwies, sonderte DANG]~AnD (1919) die Sph~rosomen
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als optisch leicht erkennbare Zellbestandteile yon den Mikrosomen im weiteren Sinne ab. Bis in die neueste Zeit sind nur wenige Eigenschaften der Sph~rosomen bekanntgeworden. Einige Autoren betraehteten dis Sphs als msmbranlose LipidkSrperehen (DRAw~RT und Mix, 1962; ZIEGLE~, 1953), anders stellten in den Sph~rosomen einen hohen Proteingehalt fest (P~, 1952; JAROSCtt, 1961). Diesss Protein besitzt mindestens teflweiss Enzymcharakter: Indophenoloxydase (P~.nNE~, 1952), Phosphatase ( J ~ s E ~ , 1956; A v ~ s und KING, 1960; WALEK-CZEI~X~ECKA, 1962), nnspezifische Esterase (WALEK-CzEI~I~ECKA,1963) and andere hydrolytischs Enzyme (OLSZW~S~A und GAB~A, 1963, 1964; WALEKCZ~ECI~A, 1965) wurden cytoehemisch nachgewiesen. MATrLE et ah (1965) ist es gelnngen, Sph~rosomen aus Homogenaten von Keim]ingen mit Hilfe der Fraktionierung in Diehtsgradienten zu isolieren und versehisdens Hydrolassn naehzuweisen. Im elektronenmikroskopischen Bild erseheinen die Sph~rosomen als kugelige Gsbilds mit slektronendichtem Inhalt, die yon einer einfaehen Membran umschlossen sind (GRIESHABEI~, 1964). Diese Eigensehaften ksnnzeichnen die Sphgrosomen als Organelle, weishe wahrseheinlieh die Aquivalente der tierisehen Lysosomen darstellen. Die Existenz yon lysosomsnartigen Organeilen in Pflanzenzellen war bereits dureh HAI~RINGTO~ and ALTSC~IUL (i 963) wahrseheinlich gemaeht worden (Naehweis der Sedimentierbarkeit dsr sanren Phosphatase). Als Lysosomen wurden yon DE DUV:E (1959) ursprtinglieh Strukturen yon tierisehen Zellen bezeiehnet, in welehe sine l~eihe yon verschiedenen lytisehen Enzymen eingesehlossen sind. Diese Organe]ie, rssp. die in ihnen eingesehlossenen Enzyme, sind ma~gsblieh an der intracellul~ren Verdauung bstefligt (NovrKoFF, 1960; his DuvE und WATTIAVX, 1966). Das Zisl der vorliegenden Arbsit war sine Erweiterung der genanntsn Hinweise auf das Vorkommen yon Lysosomsn in Pflanzenzellen, wobei das Sehwergewieht auf die enzymatische Charakterisierung yon isolierten, hydrolasenhaltigen Zellstrukturen gelegt wurds. II. Material und Methoden
1. Objekt Zur Untersuchung gelangten Maiskeimlinge der V~riet~t Orl~ 266. Die Samen wurden w~hrend 48 Std in fliei~endemWassel" gequol]en, anschlieBend in 2%igem W~sserstoffperoxyd sterilisiert und in einer mit feuchter Watte und Filterpapier versehenen Glasschale im Dunkeln bei 27~ w~hrend 48 Std angekeimt. Die Keimlinge wurden vom Endosperm ~bgetrennt und ~uf 0 ~C abgekiihlt. 2. Homogenisation Die gekiihlten Keimlinge wurden mit gew~schenem Quarzsand in einem Medium, bestehend aus 20%iger S~ccharose (w/v, 1 mM EDTA und 0,1 M Tris-
Lysosomengquivalente yon Maiskeimlingen
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puffer pH 7,4) zerm6rsert. Pro 1 g Frischgewicht gelangte 1 ml 20% Saecharose und 500 mg Quarzsand zur Anwendung. 3. Zellfraktionierung
a) Di//erentialzentri/ugation Das l~ohhomogenat wurde durch ein Wattefilter genutseht, nachher vorzentrifugiert (10 rain 500 • g), wobei Zellkerne und St~rke sedimentierten und hierauf in einer Spinco-Ultrazentrifuge (Modell L, Rotor 40) einer fraktionierten Zentrifugation unterworfen: Eine erste Zentrifugation bei 6 • 105 g • rain ergab ein Sediment, das im folgenden Ms Mitochondrienfmktion bezeichnet wird. Die anschliefJende Zentrifugation bei 6,3 • 106 g • rain lieferte eine Mikrosomenfraktion und den partikelfreien ~berstand. Die Fraktionen wurden im Homogenisationsmediumresuspendiert und bis zur Bestimmung der hydrolytischen Enzym~ktivit~ten eingefroren. Arbeitstemperatur: 0--2 oC.
b) Zentrijugation in Dichtegradienten Homogenisation, Filtration und Vorzentrifugation wurden wie oben ausgeffihrt. Die Herstellung der linearen I)ichtegradienten yon Saceharose erfolgte naeh dem Zweikammerverfahren yon BI~ITTENund ROBERTS (1960). 1,5 ml vorzentrifugiertes Homogenat wurde auf Gradienten, welehe sieh fiber 50% his 20% resp. fiber 40% bis 20% Saeeharose (w/v) erstreekten, geschichte~ und 2~/2 resp. 41/2 Std in einem Spinco SW 39-1~otor bei 39000 upm zentrifugiert. In einigen Expel'imenten wurde der zellfreie Extrakt als Gradient mit folgendem Profil auf den Saeeharosegradienten gesehichtet: 18 % bis 15 % Saeeharose, 0 % bis 100 % I-Iomogen~t (Zentrifugationsdauer: 4x/2 Std). ZentripetMe Bewegung von leiehten Partikeln wnrde erreieht, indem fiber 1,5 ml vorzentrifugier~es Homogenat, dessert Diehte mit 76 % Urografin (girma Sehering AG, Berlin) auf 1,1413 g. em-3 eingestellt worden war, ein linearer Diehtegradient yon UrogrMin (1,1274 bis 1,0274 g.em -~) aufgebaut wurde; dieses System wurde w~hrend 12 Std in einem Spinco SW 39-Rotor bei 39 000 upm zentrifugiert. Naehher wurden die Zentrifugenrfhrehen am l~ande des Sedimentes angestoehen und der ausfliegende Inhalt mittels eines Fraktionensammlers in Fraktionen zu je 8 Tropfen aufgetrennt. Alle Saecharose- und UrografinlSsungen entbielten 1 mM EDTA. 4. B e s t i m m u n g der E n z y m a k t i v i t ~ t e n
Oxydoreductasen. Die Cytoehrom C-0xydaseaktivitgt wurde naeh NI~LS~ und LEg~INO~R (1955), die NADH-Diaphoraseaktivit~it naeh Eg~ST~ et al. (1962), die Chinonreduetase-Aktivit~t naeh M/igKI und MARTIVS (1960), die Glucose-6-Phosphatdehydrogenaseaktivit~t naeh Bioehemiea Boehringer (1961) bestimmt. Die Messung der Indophenoloxydaseakgivitgt erfolgte nach einer iKethode yon PERNER (1952), die spektralphotometrisch ausgewertet wurde. Aktivitiitseinheiten der Oxydoreduetasen: _4nderung der Extinktionen / Zeiteinheit bei Zimmertemperatur und folgenden Wellenlgngen : Cytoehrom C-Oxydase . . . . . . .
E 550 nm/min
NADH-Diaphorase ........ Chinonreduetase ......... Glucose-6-Phosphatdehydrogenase.. Indophenoloxydase ........
E E E E
600 366 366 580
nm/min nm/5 rain nm/5 rain nm/min
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Trans/erasen. Die Aktivit~ten der Glutamat-Pyruvat- und GlutamatMOxal~cetatTransaminasen wurden naeh Biochemica Boehringer (1962) bestimmt. Aktivit~tseinheit der Transaminasen: Abnahme der optischen Dichte pro 5 rain bei Zimmertemperatur und bei einer Wellenl~nge yon 366 nm. Hydrolasen. Saute Protease: Die Bestimmung erfolgte nach der Phenolmethode von GREENBERG (1961), modifizier~ nach MATILE (1964). Aktivit~tseinheit: mg verdautes Protein/60 min bei 37~ Saure Phosphatase: Saure Phosphataseaktivit~t wurde nach zwei Methoden bestimmt. a) Die Messung der ~-Naphthylphosphataseaktivit~t erfolgte nach einer modifizierten Methode yon SELIGMANet ul. (1951). Freies a-N~phthol wurde dutch Kupplung mit einem Diazoniumsalz (Diazoeehtbl~u B, Fu. Rohner AG, Pratteln, Sehweiz) in einen Azofarbstoff iibergefiihrt, weleher colorimetrisch bestimmt wurde. 0,1 ml Enzym wurde mit 0,2 ml gepuffertem ~-Naphthylphosphat (100 v/ml in 0,05 ~ Acetatpuffer) w~hrend 30 rain bei 370 C inkubiert. Die Reaktion wurde dutch Zugabe yon 0,3 ml 1,5% Na-Laurylsulfat, in 1 M Trispuffer p H 9,2, im Eisbad abgestoppt, sogleich mit 0,2 ml Diazoeehtblau B (2 mg/ml) versetzt und gut geschfittelt. Die LSsung wurde mit 3,7 ml Dimethylforamid verdiinnt und nach 40 mln deren Farbintensit~t bei 590 mn photometriert. Aktivit~tseinheit: [zM Pi/60 min bei 370 C. b) Messung der p-Nitrophenylphosph~taseaktiviti~t: 0,1 ml Enzym wurde mit 0,2 ml gepuffertem p-Nitrophenol (100 ~/ml) in 0,05 M Acet~tpuffer wiihrend 30 rain bei 37~ inkubiert. Durch Zugabe yon 0,3 m] 1 n Perchlors~ure wurde die Reaktion im Eisb~d ~bgestoppt, das pr~eipitierte Protein abzentrifugiert und die LSsung mit 3,0 ml 1 M Natriumcarbonut verdiinnt. Das freigesetzte p-Nitrophenol wurde bei 400 nm photometriseh bestimmt. Aktivit~tseinheit: [z~ Pi/60 rain bei 370 C. Glucose-6-Phosphataseaktivit~it. 0,1 ml Enzym wurde mit 0,3 ml Veronalpuffer 1/7 M und 0,1 ml Substrat 0,1 M w~hrend 30 rain bei 370 C inkubiert. Durch Zug~be yon 0,3 ml 1 n Perchlorsi~ure im Eisbad wurde die Reaktion ~bgestoppt und der Ansatz hierauf mit 1,2 ml Wasser verdiinnt. Mit 1,0 ml des klaren tJberstandes wurde d~s enzymatisch freigesetzte Pi n~ch FISKE-SuBB~_~OW (1925) bestimmt. Aktiviti~tseinheit: ~M abgespaltenes Pi/60 min bei 370 C. Die Esteraseaktivit~tsbestimmung erfolgte n~ch einer Modilikation yon SELIO~A~ et al. (1951) mit a-Naphthylacetat ~ls Substrat. Aktivit~tseinheit: ~zM Essigsi~ure/60 min bei 37~ Die Bestimmung der Lipaseaktiviti~t erfolgte nach einer Modifik~tion von S~HG~A~ et al. (1951). Als Substrat wurde fi-Naphthyllaurat verwendet. Die Bestimmung dos freigesetzten fi-Naphthol erfolgte analog der unspezifischen Esterase. Phospholipase C wurde nach der Methode yon KATES (1955) bestimmt, fi-Glucu~ ronidase nach der Methode yon F ~ s ~ A ~ (1948). Die Bestimmungen der Aktivit~ten von ~- und fi-Amyl~se erfolgte nach der Methode von BEI~'gFELD (1955). Aktivit~tseinheit" mg freigesetzte Maltose/60 min bei 37 oC. Arylsulfate A und B wurde nach der Methode yon 1~o~r (1953, 1958) und die Arylsulfatase C nach der Methode yon :DODGSON(1955) bestimmt. Aktivit~tseinheit: ~M SO~/60 min bei 37~ Bestimmung der Ribonuclease : 0,1 ml Enzym wurde mit 0,9 ml gereinigter Here t~NS (1% in 1/7 M Veronalacetat-Puffer) wi~hrend 30 min bei 370 C inkubiert. Die Re~ktion wurde durch Zug~be yon 1,0ml 2,5% Triehloressigsi~ure und 0,25% Uranylacetat im Eisbad ~bgestoppt und die pr~,cipitierte unverdaute I~NS abzentri-
Lysosomengquivalente yon Maiskeimlingen
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fugiert. 0,5 ml des klaren l~berstandes wurden mit 5,0 ml Wasser verdtinnt und dessen Extinktion bei 260 nm gemessen. Aktivitiitseinheit: Extinktionsdifferenz zwisehen inkubiertem und nichtinkubiertem Ansatz/60 rain bei 370 C. 5. A n a l y t i s e h e B e s t i m m u n g e n Protein wurde colorimetrisch nach Low~,z et al. (1951) bestimmt, t~NS: 0,1 ml der Suspension wurde in der KSJte mit 2,0 ml 10 % TrichloressigsS~ure gefS~llt, 30 rain stehengelassen und die pr~cipitierten Proteine abzentrifugiert. Das Sediment wurde wghrend 20 rain mit 3,0 ml 5 % Perehlorsgure bei 900 C digeriert und hierauf nach Erkalten erneut zentrifugiert. Als Mat des RNS-Gehaltes des Hydrolysates gilt die Extinktion bei 260 nm. Gesamt-Lipidgehalt: Zwei Bestimmungsmethoden kamen zur Anwendung: a) mit Sulfophosphovanilin nach der Methode yon ZOLLNER und yon K~Rsc~ (1962) ; b) fluorimetrisch: nach der Methode yon BERt (1951), die als spektrMfluorimetrische Bestimmung modifiziere wurde. 0,1 ml Enzymsuspension wurde mit 2,0 ml 10 % Triehloressigs~ure in der Kg,lte gefgllt, anschlieBend zentrifugiert; das Sediment in 2,0 ml Chloroform : Methanol 2:1 aufgenommen und die Lipide ersch5pfend extrahiert. 0,1 ml Extrakt wurde mit 0,1 ml Benzpyrenl6sung (7,5 y Benzpyren/ml) versetzt und mit Chloroform: Methanol 2 :l auf 3,0 ml verdiinnt. Die Fluoreseenzmessung geschah in einem Beckman-Ratio-Fluorometer Modell 772. Die Fluorescenzwerte wurden an Hand einer Eichkurve in 01s~ure~iquivalente umgerechnet. 6. F l u o r o e h r o m i e r u n g y o n Z e l l s t r u k t u r e n Die Sphgrosomen werden nach DRAW~T (1953) mi~ Berberinsulfat, das Endoplasmatische Reticulmn, die Golgi-Vesikel und die Mitochondrien naeh D~AWERr (1965) mit Tetraeyelin vital angefgrbt. Zum Zweeke der Lokalisation der entsprechenden Zellstrukturen im Dichtegradienten wurden dem vorzentrifugierten Homogenat Berberinsulfat und Tetracyelin (Endkonzentrationen: 0,01% resp. 0,1%) zugegeben. Die tluorescierenden Banden in den Dichtegradienten wurden im UV-Licht (Osram H QV UV-Lampe) beobaehtet. Zur Photographie der Gradienten wurde ein UV-Sperrfilter verwendet, als Filmmaterial diente Kodak-Panatomic X 17. 7. E i n b a u -con r a d i o a k t i v e m A c e t a t in L i p i d e Na-Aeetat-H ~ (The Radioehemieal Centre Amersham, Buckinghamshire, England) diente Ms Substrat. Maiskeimlinge wurden mit Na-Aeetat-H s (0,032 mc/ml) infiltriert und w~Lhrend 5, 10, 15 min bei 25~ inkubiert. Hierauf wurden die Keimlinge dreimal mit eiskaltem Wasser gewasehen, am Seutellum abgetrennt, homogenisiert und an Diehtegradienten fraktioniert. Die Fraktionen wurden mit 2,0 ml 10% Triehloressigs~Lure naehgewasehen. Die Lipide gelangten wghrend 10 Std bei Zimmertemperatur mit 2,0 ml abs. ~thanol zur Extraktion. Die Messung der Radioaktivitgt im Lipidextrakt erfolgte in einem Nuclear Chicago Liquid Scintillation Counter. Als Seintillator diente BBOT (4 gfl) Ciba AG, Basel, in Toluol. Einbau yon H~-Acetat in vitro.
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Verschiedene aus Dichtegradienten isolierte Zellfraktionen sowie verschiedene zellfreie Extrakte wurden mit folgender Reaktionsmischung w~hrend 60 rain bei 37~ nach YANO und STVMPF (1965) inkubiert: Reaktionsmisehung: Substrat: 0,12 ~IV[ tI3-Aeetat (6,6.107 Imp/rain) 0,15 ~M CoA, 30 ~M KHCO s, 10 ~M ATP, 2 ~ Mn ~+, 200 ~M Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,3), 0,15 ~M TPN, 0,5 ~M Glucose-6-Phosphat, 0,1 ml Enzymsuspension der isolierten Zellfraktionen. Total-Volumen: 1,0 ml. Die Weiterbehandlung der Zellfraktionen erfolgte wie oben. I I L Resultate A. Strukturgebundene H ydrolasen Auf der Suche nach lysosomen/~hnlichen P a r t i k e l n in Pflanzenzellen wurde zuni~chst der zellfreie E x t r a k t auf das V o r k o m m e n saurer I-Iydrolasen u n t e r s u c h t . N a c h erfolgter partieller C h a r a k t e r i s i e r u n g dieser im H o m o g e n a t vorliegenden E n z y m e erfolgte die A b k l ~ r u n g deren Sedim e n t i e r b a r k e i t m i t Hflfe der differentiellen Zentrifugation. 1. V o r k o m m e n u n d E i g e n s c h a f t e n y o n I-Iydrolasen i m zellfreien E x t r a k t
a) Saure Protease Die saure Protease spaltet denaturiertes HS~moglobin uncl entfaltet ihre maxim~le Aktivitat bei pH4,2 (Abb. 1). Kiinstliche Substrate fiir Peptidasen wie fi-Leucyl-, fl-Alanylnaphthyl-,N-~-Benzoyl-DL-Arginin-fi-naphthylamidund N-Acetyl-phenylalanin-fi-n~phtylester werden dutch die saure Protease bei p i t 4,2 nicht gespalten. Offenbar handelt es sich um eine Endopeptidase vom Kathepsintypus.
b) Saute Phosphatase Die saure Phosphatase spaltet e-Naphthylphosphat und p-Nitrophenyl- und fi-Glycerophosphat im sauren Bereich. Die optimale Einwirkung der Phosphatase auf ~-Naphthylphosphat in VeronalHCI-Puffer liegt bei pH 5,0 und pH 6,5 (Abb. 1). Sowohl bei pH 5,0 wie aueh bei pH 6,5 konnte enzymatische Spaltung yon e-Naphthylphosphat,/~-Glycerophosphat und p-Nitropheny]phosphat festgestellt werden. Wahrscheinlich liegen zwei verschiedene Enzyme vor.
c) Unspezi]ische Esterase Eine im zellfreien Extrakt vorkommende unspezifische Esterase spaltet c~-N~phthylacetat optimal bei pH 5,2 (Abb. 1).
d) Arylsul]atase Die optimale Einwirkung der Arylsulfatase auf p-Nitrophenylsulfat in Acetatpuffer liegt bei ptI 5,0. Weitere Substrate, wie Nitrocatecholsulfat und e-Naphthylsulfat, wurden bei den gewahlten pH-Werten (4,7; 5,0; 5,7 und 7,0) nicht gespalten.
e) Amylasen Die im zellfreien Extrakt vorliegende Amylase spaltet Stiirke optima] bei pH 5,0 und pH 7,0. Eine mit Jodkali versetzte StiirkelSsung wurde durch die Amylase nur bei pH 7,0 gespalten. Dies weist auf die Anwesenheit yon e-Amylase (pH 7,0) und fi-Amylase (pH 5,0) in Maiskeimlingen him
/) Saure Ribonuclease Aus Abb. 1 ist ersichtlich, dab die t~Nase gereinigte Hefe-RNS in Phosphatpuffer optimal bei ptI 6,5 und 5,0 spaltet. M5glicherweise ]iegen zwei verschiedene Enzyme vor.
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Abb. 1. Abh&ngigkei~der Enzymwirkung der saureil Itydrolasen vom pH. A Protease (AeetatPuffer); B Phosphatase (Veronal-Acetat-Puffer);C Esterase (Veronal-IlC1-Puffer);D 1{ibonuclease (Veronal-HCI-Puffer)
g) Lipase, Phospholipase C und fi-Glucuronidase Die Aktivit~ten der oben aufgefiihrten Enzyme sind im zellfreien Extrakt yon Maiskeimlingen nicht naehzuweisen. 2. Verteilung der Hydrolasen naeh differengieller Zentrifugation yon vorzentrifugiertem I-Iomogenat a) Saute Protease Total sedimentierbare Aktivit~t: 92 % ; 86 % liegen in der Mitochondrien- und 14 % in der Mikrosomenfraktion vor.
b) Saure Phoephatase Total sedimentierbare Aktivitgt: 82,5 % ; 62 % sind in der Mitochondrien- und 38 % in der Mikrosomenfraktion nachweisbar.
c) Esterase Total sedimentierbare Aktivitgt: 80%; 93,5% weist die Mitochondrien- und 6,5 % die Mikrosomenfraktion auf.
d) Arylsgl/atase Total sedimentierbare Aktivitgt: 72,5%; davon sind 17,5% in der Mitochondrien- und 82,5 % in der Mikrosomenfraktion enthalten.
e) fl-Amyla~e Total sedimentierbare Aktiviti~t: 35%; 31% liegen in der Mitochondrien- und 69 % in der Mikrosomenfraktion vor.
/) Saure R2Vase Nur ein kleiner Anteil der sauren lZNase-Aktivit~it kann nach einer stiindigen Zentrifugation bei 105000g im Sediment nachgewiesen werden. Der Anteil an gebundener zu 15slicher Aktivit~it verhiilt sich wie 1:7. Weglassen des EDTA im Homogenisationsmedium gnderte dieses Aktivitiitsverhi~]tnis nicht. Eine Reduktion 7 l~lanta (BerL), Bd. 72
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E . G . SEMADENI:
der Keimzeit der Maiskeimlinge yon 48 Std auf 24 Std bewirkte jedoeh, dab der Anteil a n gebundener Aktivit~t bedeutend anstieg; das Verh~ltnis yon gebundener Aktivit~t zu 15slicher Aktivit~t betrug in diesem Falle 1 : 3; 55 % der sedimentierbaren Aktivit~t waren in der Mitoehondrien-, 45% in der Mikrosomenfraktion nachzuweisen.
3. LSsliche Hemmfaktoren der Hydrolasen Eine zuverl~ssige Erfassung der wahren E n z y m a k t i v i t ~ t e n wird dadurch erschwert, dal] sieh in der 15slichen Fraktion (dem partikelfreien Uberstand) ein F a k t o r befindet, der die satire Protease und Phosphatase h e m m t ; die am Homogenat ermittelten Aktivit~ten yon Protease u n d Phosphatase sind aus diesem Grunde stets zu niecb.ig. Die 15slichen Hemmstoffe kSnnen nachgewiesen werden, indem die ]Ssliche Eraktion gegen die sedimentierten Enzyme ausgespielt werden: Die saure Proteaseaktivit~t des Mitoehondriensedimentes (0,1 ml) f~llt in Gegenwart der 16sliehen Eraktion (0,1 ml) auf 10% der effektiven E n z y m a k t i v i t ~ t ab. Einen ~hnliehen im partikelfreien U b e r s t a n d lokalisierten H e m m f a k t o r der sauren Protease stellte M-4TILE (1965) in Neurosporau n d FIIffKE~STAEDT (1957) in der Rattenleber lest.
4. Membranumschlossene Hydrolasen-Partikel Zum Beweis der Bindung der sedimentierbaren Enzyme an Strukturen wurde n u n die Mitochondrienfraktion einer Reihe yon Behandlungen unterworfen, welehe cytoplasmatisehe N e m b r a n e n zerst6ren, n~mlich: Behandlung mit oberfl~chen#Ill aktiven Stoffen (z. B. 0,1% Triton-X-100) und dreimaliges Einfrieren u n d Auftauen. O7O U m in den Kontrollansatzen die Integrit~t der Partikel so weitgehend als mSglich os zu bewahren, erfolgte die I n k u b a t i o n der o,oa Ans~tze n u r kurz (5--15 min bei 30~ zudem wurde eine konstante Saceharosekonzentration yon 20% eingehalten, u m eine osmotisehe Schockwirkung zu vermeiden. Aus Abb. 2 geht hervor, dab die h6chsten Aktivit~ten der freien Protease in jenen Pr~paraten vorliegen, deren cytoplasmatische Membranen kiinstlieh zerstSrt wurden: das Detergentium Triton-
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Abb. 2. Freisetzung yon partikelgebundener saurer Protease des Mitochondriensedimentes dutch Einfrieren und Auftauen sowie dutch Behandlung mit Triton-X-100. Inkubationsmischung: 0,1 ml Enzym, 0,3 ml gepuffertes H~moglobin in 20% Saccharose; Temperatur: 80~C. 1 unbehandeltes Pr~parat; 2 Pr~parat dreimal eingefroren und aufgetaut; 3 Inkubation in Gegenwart "~on Triton-X-100
X- 100 setzt am meisten Enzymaktivit~tfrei; weniger wirksam ist d~s Einfrieren. Die unbehandelte Suspension enth/ilt anf~nglieh wenig freies Enzym. Offenbar bewirkt die relativ hohe I n k u b a t i o n s t e m p e r a t u r in der Folge einen rasehen Zerfa]l der Membranen unter t~reisetzung der sauren Protease. Ahnliche Resultate erg~ben Phos-
Lysosomengquivalente yon Maiskeimlingen
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phatase, I~Nase und Esterase. Aus den bisher angefiihrten Ergebnissen kann man die folgenden wichtigen Punkte ableiten: 1. Die im Gewebe yon Maiskeimlingen vorhandenen sauren Hydrolasen: Protease, Phosphatase, Esterase, Amylase, Arylsulfatase und I~Nase kSnnen teilweise abzentrifugiert werden; d.h. sie sind strukturgebundem 2. Die sedimentierten Enzyme ]iegen sowohl in der Mitoehondrien- als aueh in der Mikrosomenfraktion vor. Daraus ist vorlgufig auf eine Heterogenit/~t der hydrolasentragenden Partikelpopulationen zu sehliegen. 3. Die kiinstliehe ZerstSrung der eytoplasmatischen Membranen beweist ferner, dag die im Mitoehondriensediment enthaltenen sauren Hydrolasen (Protease, Phos-
BafldenI :~~ ~
L/nearer
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Abb. 3. D i e h t e g r a d i e n t e n - Z e n t r i f u g a t i o n yon zellfreiea E x t r a k t e n y o n Keimlingen. Verteilung der sichtbaren B a n d e n in einem linearen Sacehurosegradienten naeh 4I/2 Std Zentrifugation. B B a n d e n
phatase, Esterase und RNase) in membranumsehlossenen Zellpartikeln enthalten sind.
B. Darstellung der Sphdrosomen Aus diesen Vorvers~chen ergab sich die Aufgabe, die Zellelemente welehe hydrolytisehe Enzyme enthalten, mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation zu isolieren und eingehender zu charakterisieren. Zur Lokalisation der versehiedenen Zellorganelle in Diehtegradienten wurden die Cytochromoxydaseaktivit/~t (Mitoehondrien), die sauren tIydrolasenaktivit/iten (Hydrolasenpartikel) und die RNS (gibosomentragende Strukturen) verwendet. Ferner wurden in den Fraktionen Lipid- und Proteingehalt bestimmt (Abb. 4--7). 1. Lokalisation der Hydrolasen in DichtegradienCen Abb. 3 zeigt das Bild eines mit tIomogenat besehiekten Gradienten naeh Zentrifugation in einem linearen Gradienten yon 50% bis 20% Saeeharose. Nun erkennt eine Anzahl Banden, die Zonen versehiedener diehger Zellpartikel darstellen. Naeh 21/2 Std sind die Zellpartikel mit Ansnahme der RNS im Gleiehgewieht. Eine Verli~ngerung der Zengrifugationszeit bewirkte eine sehgrfere Bandenzeiehnung; die Positionen der Banden blieben jedoeh, mit Ansnahme der RNS, nnver~ndert. 7*
100
E.G. SEMADENI:
I n Abb. 3 sind die Bandenscheiben in der Richtung abnehmender Dichte des Gradienten yon 1--6 numerierK l h r stofflicher Inhal~ verteilt sich wie folgt auf die 15 Fraktionen, in welche der Gradient zerlegt wird (Abb. 4 und 5). Bande 1: Die Verteilung der Cytochromoxydaseaktivit~t zeigt ein Maximum in der der 1. Bande entsprechenden Fraktion 1. Diese enths die Mitochondrien, welche somit in der untersten Bande angereichert sind (Abb. 4).
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F:u/:t/onen Abb. 4. F r a k t i o n i e r u n g Yon zellfreien E x t r a k t e n yon Keimlingen dareh Zentrifugation in Diehtegradienten yon 50-20 % (w/v) 8accharose. Yerteilung yon : ~ytoehrornoxydaseakti~it~t (A), P r o t e i n (B) und yon IZNS (O)
Bande 2 : Das Maximum der I~NS (Abb. 4) liegt in der der Bande 2 entsprechenden Fraktion 5, welche daher einen Grol~teil der gibosomen enth~lt. Da freie lZibosomen kein Streulicht erzeugen, sollte die Bande von bloBem Auge nieht siehtbar sein; es mug daher angenommen werden, dab es sich um membrangebundene Ribosomen handelt, l~berdies ist das Gleichgewicht der l~NS-Wanderung noch nicht erreicht. Durch Verls der Zentrifngationszeit yon 21]2 Std auf 41/2 Std bewegte sich (tie RNS zentrifugM von Fraktion 6 auf 5. Bande 3 : Alle drei untersuchten sauren Hydrolasen weisen in der der 3. Bande entsprechenden Fraktion 6 ein erstes Maximum (Abb. 5) auf. Die hier vorliegenden Partikel haben im Gravitationsfeld ihr Gieichgewieht erreicht; ihre relative Diehte in Saccharose betr~Lgt 1,138 g c m -3. Die Isolation einer ersten Gruppe hydrolasentragender Strukturen ist somit m6glich.
Lysosomengquivalente von Maiskeimlingen
101
Bande 4: In der dieser Bande entsprechenden Fraktion (7--8) ist saute Phosphataseaktivit~t festzustellen. Bande 5: Ein zweites Maximum der sauren Hydrolasen befindet sieh in der der Bande 5 entsprechenden Fraktion 9. Die Dichte des Gradienten betr~gt hier 1,105 g . e m -a. Somit ist im Cytoplasma das Vorkommen einer zweiten Gruppe hydrolasentragender Partikel bewiesen. LSslicher Oberstand: Die Fraktionen 11--15 enthalten den grSSten Tell der 16sliehen Proteine, unter anderem die freien Hydrolasen. ['N\
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Fraldi'onen Abb. 5. F r a k t i o n i e r u n g yon zellfreien ]~x~rakten yon Keimlingen durch Zen~rifugation in Dichtegradienten yon 5 0 - - 2 0 % (w/v) Saccharose. Verteilung yon: saurer Esterase- (A), saurer Pretense- (/7) u n d yon saurer P h o s p h a t a s e a k t i v i t ~ t (C)
Bande 6: Das im Gravitationsfeld aufrahmende Material enth/~lt vor allem Lipid, das im folgenden als Lipidfraktion bezeichnet wird. Die Lipidfraktion enth~lt auBerdem saure Esterase-, Phosphatase- nnd Proteaseaktivit~t. Eine feinere Trennung der versehiedenen Membrankomponenten des zellfreien Extraktes wurde dutch Anwendnng linearer Dichtegradienten yon 40% bis 20% resp. 40% bis 18% Saccharose angestrebt. Ferner wurde versncht, die Banden noch eingehender enzymatisch nnd chemiseh zu eharakterisieren. In Abb. 6 und 7 sind die Verteilungskurven der sanren l~Nase, Esterase des Proteins und der Lipide wiedergegeben. Bande l: Fraktion 0; enth~lt die Mitoehondrien. Sie sind relativ protein- und lipidreich. Bande 3: Die entsprechende Fraktion 7 enth~lt Esterase und l~Nase, zudem relativ grebe Mengen yon Protein und Lipid.
102
E.G. SEMADEbTI:
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0 z ~ 3 ~ 5 ~ 7 e S qoz~zgnzz/qszozyq8 Praktionen Abb. 6. 8ubcellul~re Verteilung yon ~ a s e in E x t r a k t e n yon Keimlingen. Bie Alter der K e i m l l n g e : 48 Std (A); 24 8 t d (B); 24 Std, jedoah n u t 1 c m lange Wurzelspitzen v e r a r b e i t e t (C). Gradiente~profil (D)
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ENZYMATISCHE CHAt~AKTERISIEI~UNG DEI~ LYSO SOMENA Q U I V A L E N T E ( S P H A R O S O M E N ) VON M A I S K E I M L I N G E N En~ESTO GIACOMO SEMADE~I Institut fiir allgemeine Botanik der E.T.H. Zfirich Eingegangen am 22. Juli 1966 ENZYMATIC CHARACTERIZATION OF LYSOSOME EQUIVALENTS (SPHEROSOMES) IN CORN SEEDLINGS Summary. 1. The following acid hydrolases are partially sedimentable from cell-free extracts of corn seedlings: protease (pH-optimum 4,2), phosphatase (pHoptimum 5,0 and 6,5), unspecific esterase (pH-optimum 5,2), RNase (pH-optimum 6,5), arylsulphatase-C (pH-optimum 5,0) and a- and fl-amylase (pH-optimum 7,0 and 5,0 respectively). 2. After differential centrifugation of cell.free extracts the sedimentable hydrolases are recovered mainly in the mitochondrial and microsomal fraction. 3. It could be demonstrated that the acid hydrolases protease, phosphatase, RNase, and esterase of the mitochondrial fraction are contained in membrane-bound particles. 4. Isopycnic centrifugation of cell-free extracts in sucrose gradients revealed the presence of three particulate fractions carrying hydrolases. The heaviest fraction has a relative density of 1,138 g. cm-3 and contains acid protease, -phosphatase, -RNase, and acid esterase. A lighter fraction (d = 1,105 g-cm -3) contains the same acid hydrolases. The specifically lightest cell fraction (d--l,070 g.cm -3) contains the acid hydrolases glucose-6-phosphatase, arylsulphatase-C and small amounts of ~- and fi-amylase activity. This fraction also contains NADH-diaphorase activity. 5. By means of enzymatic characterization and staining with fluorochromes the structures carrying hydrolases were identified as two kinds of spherosomes and as fragments of the endoplasmatic reticulum. From these results it is concluded that the spherosomes represent organelles equivalent to the lysosomes of animal cells. 6. /%Glucuronidase, phospholipase-C, lipase, and arylsulphatase A and-B, all of wich are typical enzymes of animal lysosomes, are completely absent in cell-free extracts of corn seedlings. 7. The isolated spherosomes do not exhibit indophenoloxydase activity; thus the histochemical demonstration of this enzyme in spherosomes must be considered to be an artifact. 8. Isolated lipid droplets, spherosomes, prospherosomes, and mitochondria incorporate H-3-acetate into lipids. Consequently they contain all the nessesary enzymes for lipid synthesis. The high activity of lipid synthesis in the spheroromes points to a possible conversion of these organelles into lipid bodies. 9. Two transaminases are partially bound to the mitochondria; the rest of the activity is probably bound to fragments of membranes less dense than an 18% sucrose solution.
I. Einleitung und Problemstellung HA~STEI~ (1880) bcschrieb stark lichtbrechende Partike] im pflanzlichen Cytoplasma, die er Mikrosomen n a n n t e . Da sich diese Bezeichnung slo/iter als vieldeutig erwies, sonderte DANG]~AnD (1919) die Sph~rosomen
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E.G. SEMADENI"
als optisch leicht erkennbare Zellbestandteile yon den Mikrosomen im weiteren Sinne ab. Bis in die neueste Zeit sind nur wenige Eigenschaften der Sph~rosomen bekanntgeworden. Einige Autoren betraehteten dis Sphs als msmbranlose LipidkSrperehen (DRAw~RT und Mix, 1962; ZIEGLE~, 1953), anders stellten in den Sph~rosomen einen hohen Proteingehalt fest (P~, 1952; JAROSCtt, 1961). Diesss Protein besitzt mindestens teflweiss Enzymcharakter: Indophenoloxydase (P~.nNE~, 1952), Phosphatase ( J ~ s E ~ , 1956; A v ~ s und KING, 1960; WALEK-CZEI~X~ECKA, 1962), nnspezifische Esterase (WALEK-CzEI~I~ECKA,1963) and andere hydrolytischs Enzyme (OLSZW~S~A und GAB~A, 1963, 1964; WALEKCZ~ECI~A, 1965) wurden cytoehemisch nachgewiesen. MATrLE et ah (1965) ist es gelnngen, Sph~rosomen aus Homogenaten von Keim]ingen mit Hilfe der Fraktionierung in Diehtsgradienten zu isolieren und versehisdens Hydrolassn naehzuweisen. Im elektronenmikroskopischen Bild erseheinen die Sph~rosomen als kugelige Gsbilds mit slektronendichtem Inhalt, die yon einer einfaehen Membran umschlossen sind (GRIESHABEI~, 1964). Diese Eigensehaften ksnnzeichnen die Sphgrosomen als Organelle, weishe wahrseheinlieh die Aquivalente der tierisehen Lysosomen darstellen. Die Existenz yon lysosomsnartigen Organeilen in Pflanzenzellen war bereits dureh HAI~RINGTO~ and ALTSC~IUL (i 963) wahrseheinlich gemaeht worden (Naehweis der Sedimentierbarkeit dsr sanren Phosphatase). Als Lysosomen wurden yon DE DUV:E (1959) ursprtinglieh Strukturen yon tierisehen Zellen bezeiehnet, in welehe sine l~eihe yon verschiedenen lytisehen Enzymen eingesehlossen sind. Diese Organe]ie, rssp. die in ihnen eingesehlossenen Enzyme, sind ma~gsblieh an der intracellul~ren Verdauung bstefligt (NovrKoFF, 1960; his DuvE und WATTIAVX, 1966). Das Zisl der vorliegenden Arbsit war sine Erweiterung der genanntsn Hinweise auf das Vorkommen yon Lysosomsn in Pflanzenzellen, wobei das Sehwergewieht auf die enzymatische Charakterisierung yon isolierten, hydrolasenhaltigen Zellstrukturen gelegt wurds. II. Material und Methoden
1. Objekt Zur Untersuchung gelangten Maiskeimlinge der V~riet~t Orl~ 266. Die Samen wurden w~hrend 48 Std in fliei~endemWassel" gequol]en, anschlieBend in 2%igem W~sserstoffperoxyd sterilisiert und in einer mit feuchter Watte und Filterpapier versehenen Glasschale im Dunkeln bei 27~ w~hrend 48 Std angekeimt. Die Keimlinge wurden vom Endosperm ~bgetrennt und ~uf 0 ~C abgekiihlt. 2. Homogenisation Die gekiihlten Keimlinge wurden mit gew~schenem Quarzsand in einem Medium, bestehend aus 20%iger S~ccharose (w/v, 1 mM EDTA und 0,1 M Tris-
Lysosomengquivalente yon Maiskeimlingen
93
puffer pH 7,4) zerm6rsert. Pro 1 g Frischgewicht gelangte 1 ml 20% Saecharose und 500 mg Quarzsand zur Anwendung. 3. Zellfraktionierung
a) Di//erentialzentri/ugation Das l~ohhomogenat wurde durch ein Wattefilter genutseht, nachher vorzentrifugiert (10 rain 500 • g), wobei Zellkerne und St~rke sedimentierten und hierauf in einer Spinco-Ultrazentrifuge (Modell L, Rotor 40) einer fraktionierten Zentrifugation unterworfen: Eine erste Zentrifugation bei 6 • 105 g • rain ergab ein Sediment, das im folgenden Ms Mitochondrienfmktion bezeichnet wird. Die anschliefJende Zentrifugation bei 6,3 • 106 g • rain lieferte eine Mikrosomenfraktion und den partikelfreien ~berstand. Die Fraktionen wurden im Homogenisationsmediumresuspendiert und bis zur Bestimmung der hydrolytischen Enzym~ktivit~ten eingefroren. Arbeitstemperatur: 0--2 oC.
b) Zentrijugation in Dichtegradienten Homogenisation, Filtration und Vorzentrifugation wurden wie oben ausgeffihrt. Die Herstellung der linearen I)ichtegradienten yon Saceharose erfolgte naeh dem Zweikammerverfahren yon BI~ITTENund ROBERTS (1960). 1,5 ml vorzentrifugiertes Homogenat wurde auf Gradienten, welehe sieh fiber 50% his 20% resp. fiber 40% bis 20% Saeeharose (w/v) erstreekten, geschichte~ und 2~/2 resp. 41/2 Std in einem Spinco SW 39-1~otor bei 39000 upm zentrifugiert. In einigen Expel'imenten wurde der zellfreie Extrakt als Gradient mit folgendem Profil auf den Saeeharosegradienten gesehichtet: 18 % bis 15 % Saeeharose, 0 % bis 100 % I-Iomogen~t (Zentrifugationsdauer: 4x/2 Std). ZentripetMe Bewegung von leiehten Partikeln wnrde erreieht, indem fiber 1,5 ml vorzentrifugier~es Homogenat, dessert Diehte mit 76 % Urografin (girma Sehering AG, Berlin) auf 1,1413 g. em-3 eingestellt worden war, ein linearer Diehtegradient yon UrogrMin (1,1274 bis 1,0274 g.em -~) aufgebaut wurde; dieses System wurde w~hrend 12 Std in einem Spinco SW 39-Rotor bei 39 000 upm zentrifugiert. Naehher wurden die Zentrifugenrfhrehen am l~ande des Sedimentes angestoehen und der ausfliegende Inhalt mittels eines Fraktionensammlers in Fraktionen zu je 8 Tropfen aufgetrennt. Alle Saecharose- und UrografinlSsungen entbielten 1 mM EDTA. 4. B e s t i m m u n g der E n z y m a k t i v i t ~ t e n
Oxydoreductasen. Die Cytoehrom C-0xydaseaktivitgt wurde naeh NI~LS~ und LEg~INO~R (1955), die NADH-Diaphoraseaktivit~it naeh Eg~ST~ et al. (1962), die Chinonreduetase-Aktivit~t naeh M/igKI und MARTIVS (1960), die Glucose-6-Phosphatdehydrogenaseaktivit~t naeh Bioehemiea Boehringer (1961) bestimmt. Die Messung der Indophenoloxydaseakgivitgt erfolgte nach einer iKethode yon PERNER (1952), die spektralphotometrisch ausgewertet wurde. Aktivitiitseinheiten der Oxydoreduetasen: _4nderung der Extinktionen / Zeiteinheit bei Zimmertemperatur und folgenden Wellenlgngen : Cytoehrom C-Oxydase . . . . . . .
E 550 nm/min
NADH-Diaphorase ........ Chinonreduetase ......... Glucose-6-Phosphatdehydrogenase.. Indophenoloxydase ........
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E . G . SEMAD~]NI:
Trans/erasen. Die Aktivit~ten der Glutamat-Pyruvat- und GlutamatMOxal~cetatTransaminasen wurden naeh Biochemica Boehringer (1962) bestimmt. Aktivit~tseinheit der Transaminasen: Abnahme der optischen Dichte pro 5 rain bei Zimmertemperatur und bei einer Wellenl~nge yon 366 nm. Hydrolasen. Saute Protease: Die Bestimmung erfolgte nach der Phenolmethode von GREENBERG (1961), modifizier~ nach MATILE (1964). Aktivit~tseinheit: mg verdautes Protein/60 min bei 37~ Saure Phosphatase: Saure Phosphataseaktivit~t wurde nach zwei Methoden bestimmt. a) Die Messung der ~-Naphthylphosphataseaktivit~t erfolgte nach einer modifizierten Methode yon SELIGMANet ul. (1951). Freies a-N~phthol wurde dutch Kupplung mit einem Diazoniumsalz (Diazoeehtbl~u B, Fu. Rohner AG, Pratteln, Sehweiz) in einen Azofarbstoff iibergefiihrt, weleher colorimetrisch bestimmt wurde. 0,1 ml Enzym wurde mit 0,2 ml gepuffertem ~-Naphthylphosphat (100 v/ml in 0,05 ~ Acetatpuffer) w~hrend 30 rain bei 370 C inkubiert. Die Reaktion wurde dutch Zugabe yon 0,3 ml 1,5% Na-Laurylsulfat, in 1 M Trispuffer p H 9,2, im Eisbad abgestoppt, sogleich mit 0,2 ml Diazoeehtblau B (2 mg/ml) versetzt und gut geschfittelt. Die LSsung wurde mit 3,7 ml Dimethylforamid verdiinnt und nach 40 mln deren Farbintensit~t bei 590 mn photometriert. Aktivit~tseinheit: [zM Pi/60 min bei 370 C. b) Messung der p-Nitrophenylphosph~taseaktiviti~t: 0,1 ml Enzym wurde mit 0,2 ml gepuffertem p-Nitrophenol (100 ~/ml) in 0,05 M Acet~tpuffer wiihrend 30 rain bei 37~ inkubiert. Durch Zugabe yon 0,3 m] 1 n Perchlors~ure wurde die Reaktion im Eisb~d ~bgestoppt, das pr~eipitierte Protein abzentrifugiert und die LSsung mit 3,0 ml 1 M Natriumcarbonut verdiinnt. Das freigesetzte p-Nitrophenol wurde bei 400 nm photometriseh bestimmt. Aktivit~tseinheit: [z~ Pi/60 rain bei 370 C. Glucose-6-Phosphataseaktivit~it. 0,1 ml Enzym wurde mit 0,3 ml Veronalpuffer 1/7 M und 0,1 ml Substrat 0,1 M w~hrend 30 rain bei 370 C inkubiert. Durch Zug~be yon 0,3 ml 1 n Perchlorsi~ure im Eisbad wurde die Reaktion ~bgestoppt und der Ansatz hierauf mit 1,2 ml Wasser verdiinnt. Mit 1,0 ml des klaren tJberstandes wurde d~s enzymatisch freigesetzte Pi n~ch FISKE-SuBB~_~OW (1925) bestimmt. Aktiviti~tseinheit: ~M abgespaltenes Pi/60 min bei 370 C. Die Esteraseaktivit~tsbestimmung erfolgte n~ch einer Modilikation yon SELIO~A~ et al. (1951) mit a-Naphthylacetat ~ls Substrat. Aktivit~tseinheit: ~zM Essigsi~ure/60 min bei 37~ Die Bestimmung der Lipaseaktiviti~t erfolgte nach einer Modifik~tion von S~HG~A~ et al. (1951). Als Substrat wurde fi-Naphthyllaurat verwendet. Die Bestimmung dos freigesetzten fi-Naphthol erfolgte analog der unspezifischen Esterase. Phospholipase C wurde nach der Methode yon KATES (1955) bestimmt, fi-Glucu~ ronidase nach der Methode yon F ~ s ~ A ~ (1948). Die Bestimmungen der Aktivit~ten von ~- und fi-Amyl~se erfolgte nach der Methode von BEI~'gFELD (1955). Aktivit~tseinheit" mg freigesetzte Maltose/60 min bei 37 oC. Arylsulfate A und B wurde nach der Methode yon 1~o~r (1953, 1958) und die Arylsulfatase C nach der Methode yon :DODGSON(1955) bestimmt. Aktivit~tseinheit: ~M SO~/60 min bei 37~ Bestimmung der Ribonuclease : 0,1 ml Enzym wurde mit 0,9 ml gereinigter Here t~NS (1% in 1/7 M Veronalacetat-Puffer) wi~hrend 30 min bei 370 C inkubiert. Die Re~ktion wurde durch Zug~be yon 1,0ml 2,5% Triehloressigsi~ure und 0,25% Uranylacetat im Eisbad ~bgestoppt und die pr~,cipitierte unverdaute I~NS abzentri-
Lysosomengquivalente yon Maiskeimlingen
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fugiert. 0,5 ml des klaren l~berstandes wurden mit 5,0 ml Wasser verdtinnt und dessen Extinktion bei 260 nm gemessen. Aktivitiitseinheit: Extinktionsdifferenz zwisehen inkubiertem und nichtinkubiertem Ansatz/60 rain bei 370 C. 5. A n a l y t i s e h e B e s t i m m u n g e n Protein wurde colorimetrisch nach Low~,z et al. (1951) bestimmt, t~NS: 0,1 ml der Suspension wurde in der KSJte mit 2,0 ml 10 % TrichloressigsS~ure gefS~llt, 30 rain stehengelassen und die pr~cipitierten Proteine abzentrifugiert. Das Sediment wurde wghrend 20 rain mit 3,0 ml 5 % Perehlorsgure bei 900 C digeriert und hierauf nach Erkalten erneut zentrifugiert. Als Mat des RNS-Gehaltes des Hydrolysates gilt die Extinktion bei 260 nm. Gesamt-Lipidgehalt: Zwei Bestimmungsmethoden kamen zur Anwendung: a) mit Sulfophosphovanilin nach der Methode yon ZOLLNER und yon K~Rsc~ (1962) ; b) fluorimetrisch: nach der Methode yon BERt (1951), die als spektrMfluorimetrische Bestimmung modifiziere wurde. 0,1 ml Enzymsuspension wurde mit 2,0 ml 10 % Triehloressigs~ure in der Kg,lte gefgllt, anschlieBend zentrifugiert; das Sediment in 2,0 ml Chloroform : Methanol 2:1 aufgenommen und die Lipide ersch5pfend extrahiert. 0,1 ml Extrakt wurde mit 0,1 ml Benzpyrenl6sung (7,5 y Benzpyren/ml) versetzt und mit Chloroform: Methanol 2 :l auf 3,0 ml verdiinnt. Die Fluoreseenzmessung geschah in einem Beckman-Ratio-Fluorometer Modell 772. Die Fluorescenzwerte wurden an Hand einer Eichkurve in 01s~ure~iquivalente umgerechnet. 6. F l u o r o e h r o m i e r u n g y o n Z e l l s t r u k t u r e n Die Sphgrosomen werden nach DRAW~T (1953) mi~ Berberinsulfat, das Endoplasmatische Reticulmn, die Golgi-Vesikel und die Mitochondrien naeh D~AWERr (1965) mit Tetraeyelin vital angefgrbt. Zum Zweeke der Lokalisation der entsprechenden Zellstrukturen im Dichtegradienten wurden dem vorzentrifugierten Homogenat Berberinsulfat und Tetracyelin (Endkonzentrationen: 0,01% resp. 0,1%) zugegeben. Die tluorescierenden Banden in den Dichtegradienten wurden im UV-Licht (Osram H QV UV-Lampe) beobaehtet. Zur Photographie der Gradienten wurde ein UV-Sperrfilter verwendet, als Filmmaterial diente Kodak-Panatomic X 17. 7. E i n b a u -con r a d i o a k t i v e m A c e t a t in L i p i d e Na-Aeetat-H ~ (The Radioehemieal Centre Amersham, Buckinghamshire, England) diente Ms Substrat. Maiskeimlinge wurden mit Na-Aeetat-H s (0,032 mc/ml) infiltriert und w~Lhrend 5, 10, 15 min bei 25~ inkubiert. Hierauf wurden die Keimlinge dreimal mit eiskaltem Wasser gewasehen, am Seutellum abgetrennt, homogenisiert und an Diehtegradienten fraktioniert. Die Fraktionen wurden mit 2,0 ml 10% Triehloressigs~Lure naehgewasehen. Die Lipide gelangten wghrend 10 Std bei Zimmertemperatur mit 2,0 ml abs. ~thanol zur Extraktion. Die Messung der Radioaktivitgt im Lipidextrakt erfolgte in einem Nuclear Chicago Liquid Scintillation Counter. Als Seintillator diente BBOT (4 gfl) Ciba AG, Basel, in Toluol. Einbau yon H~-Acetat in vitro.
96
E.G. SE~AnEm:
Verschiedene aus Dichtegradienten isolierte Zellfraktionen sowie verschiedene zellfreie Extrakte wurden mit folgender Reaktionsmischung w~hrend 60 rain bei 37~ nach YANO und STVMPF (1965) inkubiert: Reaktionsmisehung: Substrat: 0,12 ~IV[ tI3-Aeetat (6,6.107 Imp/rain) 0,15 ~M CoA, 30 ~M KHCO s, 10 ~M ATP, 2 ~ Mn ~+, 200 ~M Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,3), 0,15 ~M TPN, 0,5 ~M Glucose-6-Phosphat, 0,1 ml Enzymsuspension der isolierten Zellfraktionen. Total-Volumen: 1,0 ml. Die Weiterbehandlung der Zellfraktionen erfolgte wie oben. I I L Resultate A. Strukturgebundene H ydrolasen Auf der Suche nach lysosomen/~hnlichen P a r t i k e l n in Pflanzenzellen wurde zuni~chst der zellfreie E x t r a k t auf das V o r k o m m e n saurer I-Iydrolasen u n t e r s u c h t . N a c h erfolgter partieller C h a r a k t e r i s i e r u n g dieser im H o m o g e n a t vorliegenden E n z y m e erfolgte die A b k l ~ r u n g deren Sedim e n t i e r b a r k e i t m i t Hflfe der differentiellen Zentrifugation. 1. V o r k o m m e n u n d E i g e n s c h a f t e n y o n I-Iydrolasen i m zellfreien E x t r a k t
a) Saure Protease Die saure Protease spaltet denaturiertes HS~moglobin uncl entfaltet ihre maxim~le Aktivitat bei pH4,2 (Abb. 1). Kiinstliche Substrate fiir Peptidasen wie fi-Leucyl-, fl-Alanylnaphthyl-,N-~-Benzoyl-DL-Arginin-fi-naphthylamidund N-Acetyl-phenylalanin-fi-n~phtylester werden dutch die saure Protease bei p i t 4,2 nicht gespalten. Offenbar handelt es sich um eine Endopeptidase vom Kathepsintypus.
b) Saute Phosphatase Die saure Phosphatase spaltet e-Naphthylphosphat und p-Nitrophenyl- und fi-Glycerophosphat im sauren Bereich. Die optimale Einwirkung der Phosphatase auf ~-Naphthylphosphat in VeronalHCI-Puffer liegt bei pH 5,0 und pH 6,5 (Abb. 1). Sowohl bei pH 5,0 wie aueh bei pH 6,5 konnte enzymatische Spaltung yon e-Naphthylphosphat,/~-Glycerophosphat und p-Nitropheny]phosphat festgestellt werden. Wahrscheinlich liegen zwei verschiedene Enzyme vor.
c) Unspezi]ische Esterase Eine im zellfreien Extrakt vorkommende unspezifische Esterase spaltet c~-N~phthylacetat optimal bei pH 5,2 (Abb. 1).
d) Arylsul]atase Die optimale Einwirkung der Arylsulfatase auf p-Nitrophenylsulfat in Acetatpuffer liegt bei ptI 5,0. Weitere Substrate, wie Nitrocatecholsulfat und e-Naphthylsulfat, wurden bei den gewahlten pH-Werten (4,7; 5,0; 5,7 und 7,0) nicht gespalten.
e) Amylasen Die im zellfreien Extrakt vorliegende Amylase spaltet Stiirke optima] bei pH 5,0 und pH 7,0. Eine mit Jodkali versetzte StiirkelSsung wurde durch die Amylase nur bei pH 7,0 gespalten. Dies weist auf die Anwesenheit yon e-Amylase (pH 7,0) und fi-Amylase (pH 5,0) in Maiskeimlingen him
/) Saure Ribonuclease Aus Abb. 1 ist ersichtlich, dab die t~Nase gereinigte Hefe-RNS in Phosphatpuffer optimal bei ptI 6,5 und 5,0 spaltet. M5glicherweise ]iegen zwei verschiedene Enzyme vor.
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Abb. 1. Abh&ngigkei~der Enzymwirkung der saureil Itydrolasen vom pH. A Protease (AeetatPuffer); B Phosphatase (Veronal-Acetat-Puffer);C Esterase (Veronal-IlC1-Puffer);D 1{ibonuclease (Veronal-HCI-Puffer)
g) Lipase, Phospholipase C und fi-Glucuronidase Die Aktivit~ten der oben aufgefiihrten Enzyme sind im zellfreien Extrakt yon Maiskeimlingen nicht naehzuweisen. 2. Verteilung der Hydrolasen naeh differengieller Zentrifugation yon vorzentrifugiertem I-Iomogenat a) Saute Protease Total sedimentierbare Aktivit~t: 92 % ; 86 % liegen in der Mitochondrien- und 14 % in der Mikrosomenfraktion vor.
b) Saure Phoephatase Total sedimentierbare Aktivitgt: 82,5 % ; 62 % sind in der Mitochondrien- und 38 % in der Mikrosomenfraktion nachweisbar.
c) Esterase Total sedimentierbare Aktivitgt: 80%; 93,5% weist die Mitochondrien- und 6,5 % die Mikrosomenfraktion auf.
d) Arylsgl/atase Total sedimentierbare Aktivitgt: 72,5%; davon sind 17,5% in der Mitochondrien- und 82,5 % in der Mikrosomenfraktion enthalten.
e) fl-Amyla~e Total sedimentierbare Aktiviti~t: 35%; 31% liegen in der Mitochondrien- und 69 % in der Mikrosomenfraktion vor.
/) Saure R2Vase Nur ein kleiner Anteil der sauren lZNase-Aktivit~it kann nach einer stiindigen Zentrifugation bei 105000g im Sediment nachgewiesen werden. Der Anteil an gebundener zu 15slicher Aktivit~it verhiilt sich wie 1:7. Weglassen des EDTA im Homogenisationsmedium gnderte dieses Aktivitiitsverhi~]tnis nicht. Eine Reduktion 7 l~lanta (BerL), Bd. 72
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E . G . SEMADENI:
der Keimzeit der Maiskeimlinge yon 48 Std auf 24 Std bewirkte jedoeh, dab der Anteil a n gebundener Aktivit~t bedeutend anstieg; das Verh~ltnis yon gebundener Aktivit~t zu 15slicher Aktivit~t betrug in diesem Falle 1 : 3; 55 % der sedimentierbaren Aktivit~t waren in der Mitoehondrien-, 45% in der Mikrosomenfraktion nachzuweisen.
3. LSsliche Hemmfaktoren der Hydrolasen Eine zuverl~ssige Erfassung der wahren E n z y m a k t i v i t ~ t e n wird dadurch erschwert, dal] sieh in der 15slichen Fraktion (dem partikelfreien Uberstand) ein F a k t o r befindet, der die satire Protease und Phosphatase h e m m t ; die am Homogenat ermittelten Aktivit~ten yon Protease u n d Phosphatase sind aus diesem Grunde stets zu niecb.ig. Die 15slichen Hemmstoffe kSnnen nachgewiesen werden, indem die ]Ssliche Eraktion gegen die sedimentierten Enzyme ausgespielt werden: Die saure Proteaseaktivit~t des Mitoehondriensedimentes (0,1 ml) f~llt in Gegenwart der 16sliehen Eraktion (0,1 ml) auf 10% der effektiven E n z y m a k t i v i t ~ t ab. Einen ~hnliehen im partikelfreien U b e r s t a n d lokalisierten H e m m f a k t o r der sauren Protease stellte M-4TILE (1965) in Neurosporau n d FIIffKE~STAEDT (1957) in der Rattenleber lest.
4. Membranumschlossene Hydrolasen-Partikel Zum Beweis der Bindung der sedimentierbaren Enzyme an Strukturen wurde n u n die Mitochondrienfraktion einer Reihe yon Behandlungen unterworfen, welehe cytoplasmatisehe N e m b r a n e n zerst6ren, n~mlich: Behandlung mit oberfl~chen#Ill aktiven Stoffen (z. B. 0,1% Triton-X-100) und dreimaliges Einfrieren u n d Auftauen. O7O U m in den Kontrollansatzen die Integrit~t der Partikel so weitgehend als mSglich os zu bewahren, erfolgte die I n k u b a t i o n der o,oa Ans~tze n u r kurz (5--15 min bei 30~ zudem wurde eine konstante Saceharosekonzentration yon 20% eingehalten, u m eine osmotisehe Schockwirkung zu vermeiden. Aus Abb. 2 geht hervor, dab die h6chsten Aktivit~ten der freien Protease in jenen Pr~paraten vorliegen, deren cytoplasmatische Membranen kiinstlieh zerstSrt wurden: das Detergentium Triton-
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Abb. 2. Freisetzung yon partikelgebundener saurer Protease des Mitochondriensedimentes dutch Einfrieren und Auftauen sowie dutch Behandlung mit Triton-X-100. Inkubationsmischung: 0,1 ml Enzym, 0,3 ml gepuffertes H~moglobin in 20% Saccharose; Temperatur: 80~C. 1 unbehandeltes Pr~parat; 2 Pr~parat dreimal eingefroren und aufgetaut; 3 Inkubation in Gegenwart "~on Triton-X-100
X- 100 setzt am meisten Enzymaktivit~tfrei; weniger wirksam ist d~s Einfrieren. Die unbehandelte Suspension enth/ilt anf~nglieh wenig freies Enzym. Offenbar bewirkt die relativ hohe I n k u b a t i o n s t e m p e r a t u r in der Folge einen rasehen Zerfa]l der Membranen unter t~reisetzung der sauren Protease. Ahnliche Resultate erg~ben Phos-
Lysosomengquivalente yon Maiskeimlingen
99
phatase, I~Nase und Esterase. Aus den bisher angefiihrten Ergebnissen kann man die folgenden wichtigen Punkte ableiten: 1. Die im Gewebe yon Maiskeimlingen vorhandenen sauren Hydrolasen: Protease, Phosphatase, Esterase, Amylase, Arylsulfatase und I~Nase kSnnen teilweise abzentrifugiert werden; d.h. sie sind strukturgebundem 2. Die sedimentierten Enzyme ]iegen sowohl in der Mitoehondrien- als aueh in der Mikrosomenfraktion vor. Daraus ist vorlgufig auf eine Heterogenit/~t der hydrolasentragenden Partikelpopulationen zu sehliegen. 3. Die kiinstliehe ZerstSrung der eytoplasmatischen Membranen beweist ferner, dag die im Mitoehondriensediment enthaltenen sauren Hydrolasen (Protease, Phos-
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Abb. 3. D i e h t e g r a d i e n t e n - Z e n t r i f u g a t i o n yon zellfreiea E x t r a k t e n y o n Keimlingen. Verteilung der sichtbaren B a n d e n in einem linearen Sacehurosegradienten naeh 4I/2 Std Zentrifugation. B B a n d e n
phatase, Esterase und RNase) in membranumsehlossenen Zellpartikeln enthalten sind.
B. Darstellung der Sphdrosomen Aus diesen Vorvers~chen ergab sich die Aufgabe, die Zellelemente welehe hydrolytisehe Enzyme enthalten, mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation zu isolieren und eingehender zu charakterisieren. Zur Lokalisation der versehiedenen Zellorganelle in Diehtegradienten wurden die Cytochromoxydaseaktivit/~t (Mitoehondrien), die sauren tIydrolasenaktivit/iten (Hydrolasenpartikel) und die RNS (gibosomentragende Strukturen) verwendet. Ferner wurden in den Fraktionen Lipid- und Proteingehalt bestimmt (Abb. 4--7). 1. Lokalisation der Hydrolasen in DichtegradienCen Abb. 3 zeigt das Bild eines mit tIomogenat besehiekten Gradienten naeh Zentrifugation in einem linearen Gradienten yon 50% bis 20% Saeeharose. Nun erkennt eine Anzahl Banden, die Zonen versehiedener diehger Zellpartikel darstellen. Naeh 21/2 Std sind die Zellpartikel mit Ansnahme der RNS im Gleiehgewieht. Eine Verli~ngerung der Zengrifugationszeit bewirkte eine sehgrfere Bandenzeiehnung; die Positionen der Banden blieben jedoeh, mit Ansnahme der RNS, nnver~ndert. 7*
100
E.G. SEMADENI:
I n Abb. 3 sind die Bandenscheiben in der Richtung abnehmender Dichte des Gradienten yon 1--6 numerierK l h r stofflicher Inhal~ verteilt sich wie folgt auf die 15 Fraktionen, in welche der Gradient zerlegt wird (Abb. 4 und 5). Bande 1: Die Verteilung der Cytochromoxydaseaktivit~t zeigt ein Maximum in der der 1. Bande entsprechenden Fraktion 1. Diese enths die Mitochondrien, welche somit in der untersten Bande angereichert sind (Abb. 4).
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F:u/:t/onen Abb. 4. F r a k t i o n i e r u n g Yon zellfreien E x t r a k t e n yon Keimlingen dareh Zentrifugation in Diehtegradienten yon 50-20 % (w/v) 8accharose. Yerteilung yon : ~ytoehrornoxydaseakti~it~t (A), P r o t e i n (B) und yon IZNS (O)
Bande 2 : Das Maximum der I~NS (Abb. 4) liegt in der der Bande 2 entsprechenden Fraktion 5, welche daher einen Grol~teil der gibosomen enth~lt. Da freie lZibosomen kein Streulicht erzeugen, sollte die Bande von bloBem Auge nieht siehtbar sein; es mug daher angenommen werden, dab es sich um membrangebundene Ribosomen handelt, l~berdies ist das Gleichgewicht der l~NS-Wanderung noch nicht erreicht. Durch Verls der Zentrifngationszeit yon 21]2 Std auf 41/2 Std bewegte sich (tie RNS zentrifugM von Fraktion 6 auf 5. Bande 3 : Alle drei untersuchten sauren Hydrolasen weisen in der der 3. Bande entsprechenden Fraktion 6 ein erstes Maximum (Abb. 5) auf. Die hier vorliegenden Partikel haben im Gravitationsfeld ihr Gieichgewieht erreicht; ihre relative Diehte in Saccharose betr~Lgt 1,138 g c m -3. Die Isolation einer ersten Gruppe hydrolasentragender Strukturen ist somit m6glich.
Lysosomengquivalente von Maiskeimlingen
101
Bande 4: In der dieser Bande entsprechenden Fraktion (7--8) ist saute Phosphataseaktivit~t festzustellen. Bande 5: Ein zweites Maximum der sauren Hydrolasen befindet sieh in der der Bande 5 entsprechenden Fraktion 9. Die Dichte des Gradienten betr~gt hier 1,105 g . e m -a. Somit ist im Cytoplasma das Vorkommen einer zweiten Gruppe hydrolasentragender Partikel bewiesen. LSslicher Oberstand: Die Fraktionen 11--15 enthalten den grSSten Tell der 16sliehen Proteine, unter anderem die freien Hydrolasen. ['N\
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Fraldi'onen Abb. 5. F r a k t i o n i e r u n g yon zellfreien ]~x~rakten yon Keimlingen durch Zen~rifugation in Dichtegradienten yon 5 0 - - 2 0 % (w/v) Saccharose. Verteilung yon: saurer Esterase- (A), saurer Pretense- (/7) u n d yon saurer P h o s p h a t a s e a k t i v i t ~ t (C)
Bande 6: Das im Gravitationsfeld aufrahmende Material enth/~lt vor allem Lipid, das im folgenden als Lipidfraktion bezeichnet wird. Die Lipidfraktion enth~lt auBerdem saure Esterase-, Phosphatase- nnd Proteaseaktivit~t. Eine feinere Trennung der versehiedenen Membrankomponenten des zellfreien Extraktes wurde dutch Anwendnng linearer Dichtegradienten yon 40% bis 20% resp. 40% bis 18% Saccharose angestrebt. Ferner wurde versncht, die Banden noch eingehender enzymatisch nnd chemiseh zu eharakterisieren. In Abb. 6 und 7 sind die Verteilungskurven der sanren l~Nase, Esterase des Proteins und der Lipide wiedergegeben. Bande l: Fraktion 0; enth~lt die Mitoehondrien. Sie sind relativ protein- und lipidreich. Bande 3: Die entsprechende Fraktion 7 enth~lt Esterase und l~Nase, zudem relativ grebe Mengen yon Protein und Lipid.
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E.G. SEMADEbTI:
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