Planta (Berl.) 71,326--355 (1966)

ENZYMBILDUNG IN ROGGENKEIMLINGEN W A H R E N D D E R U M S T E L L U N G VON t I E T E R O T R O P H E M AUF AUTOTROPHES WACHSTUM J. FEIERABEND Pflanzenphysiologisches Institut der Universitiit GSttingen Eingegangen am 22. Juli 1966 ENZYME FORMATION IN RYE SEEDLINGS DURING THE CHANGE FROM HETEROTROPttIC TO AUTOTROPHIC GROWTH Summary. 1. The formation of enzymes of the oxidative and reductive pentose phosphate cycle was followed in developing rye seedlings. Ribulose diphosphate carboxylase and transketolase are absent in dry seeds; ribose phosphate isomerase is found only in trace amounts. In light as well as in the dark transketolase and ribose phosphate isomerase increase immediately after the onset of germination, whereas ribulose diphosphate earboxylase appears later. Remarkably the latter enzyme is also formed in completely dark-grown seedlings. At this stage isolated thylakoids are already present in the proplastids. The formation of these enzymes of the Calvincycle is promoted by light. 2. The formation of ribulose diphosphate carboxylase and transketolase is strongly suppressed by low temperature or ehloramphenicol. Chloramphenieol also inhibits the growth of proplastids and prevents the formation of thylakoids but not of prolamellar bodies. 3. Glucose-6-phosphate dehydrogenase, phosphogluconate dehydrogenase, and shikimate dehydrogenase are already present in the dry embryo. At the beginningof seedling development there is a rapid increase in ghicose-6-phosphate dehydrogenase. I n the shoots the rate of this increase levels off at the moment when ribulose diphosphate carboxylase appears. This decrease in the rate of formation of glucose-6phosphate dehydrogenase is not due to a lack of nutrients, but must be caused by a specific regulation. 4. When the formation of ribulose diphosphate carboxylase is prevented by low temperature or chloramphenieol, the increase of glucose-6-phosphate dchydrogenase continues at a constant rate. It is concluded that the formation of glucose-6-phosphate dehydrogenase is suppressed by factors which appear when enzymes of the Calvin-cycle are formed. This effect of low temperature is not directly connected with vernalisation phenomena. 5. The results suggest that the oxidative pentose phosphate cycle plays a special role in heterotrophic growth.

Einleitung Differenzierungsvorg~nge i m Bereich der E n z y m e w u r d e n bereits mehrfaeh w~ihrend der E n t w i e k l u n g y o n Keiralingen u n t e r s u c h t (OoTA et al., 1953; GOKSYSI~ et al., 1953; tlASKI~S, 1955; BAI~TELS, 1960; KOTZ~. u. LATZKO, 1965; a n K e i m w u r z e l n : Ro]3I~SO~ u. BRow~, 1952). Charakteristisch ffir d e n B e g i n n der K e i m u n g ist z.B. eine besondere Aktiviti~t y o n G s (Alkoholdehydrogenase u n d L a e t a t -

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

327

Dehydrogenase), die w~hrend der Entwicklung meist sehnell wieder abgebaut werden. Unsere Kenntnisse fiber die Faktoren, die Bildung oder Rfickgang eines Enzyms steuern, oder fiber das Ineinandergreifen verschiedener Regulationsvorg~nge w/~hrend der Entwicklung sind bei h6heren Pflanzen allerdings noch recht gering. Eine genauere Analyse konnten HOTTA U. STERN, 1961 ffir das Auftreten der Thymidinkinase in Phasen der DNS-Synthese liefern (vgl. WA~KA, VASrL, STE~S, ]964). Bekannt ist aueh die Induktion der Nitratreduktase dureh Nitrat (ttAGEmAX u. FLASHER, 1960; B~EV~S u. HAG]~MAN, 1963) und der Alkoholdehydrogenase dureh Anaerobiose (HAGEMAN U. FLESItER, 1960). Besonders eingehend wurde der EinfluB der Gibberellins/ture auf die Bildung der ~-Amylase im Getreideendosperm untersueht (PALEG, 1960, 1965 ; VAR~E~ U. CHA~DRA, 1964). Das Waehstum yon Keimlingen verl/~uft zun/~chst heterotroph; erst die Entwicklung ffihrt normalerweise zum photoautotrophen Zustand der jungen Pflanze. Eine so]ehe grundlegende Umstellung des Stoffweehseltyps l~6t en~sprechende Ver/~nderungen in der enzymatischen Ausstattung der Keimlinge erwarten. Einige Regulationsvorgange, die sieh w/ihrend dieses Wechsels der Ern~hrungsweise bei der Synthese in diesem Zusammenhang wesentlieher Enzyme in t~oggenkeimlingen abspielen, versueht die vorliegende Arbeit aufzuzeigen und n/~her zu charakterisieren. Als typisch ftir den autotrophen Zustand kann selbstverst~ndlich das Enzymsystem der Photosynthese angesehen werden, z.B. die Fermente des Calvin-Zyklus ( = reduktiver Pentosephosphat-Zyklns). An ihnen bzw. ihren Reaktionsprodukten wurde das Auftreten des Photosyntheseapparates w~hrend der Entwicklung sehon verschiedent]ieh verfolgt und insbesondere seine Abh/~ngigkeit yon der Beliehtung gepriift. I-IAG~AN U. A~NO~r, 1955 konnten die NADP-Triosephosphat-Dehydrogenase in Erbsensamen noeh nicht nachweisen und finden sie erst nach zehnt~giger Anzueht der Keimlinge im Licht, speziell im SproB loka.lisiert. TOLBERTU. GAILEu 1955 verfolgten das Auftreten markierter 3-Phosphoglyzerins~ure nach Fixierung yon ~4COs durch Weizenkeimlinge. Sie wird in etiolierten Keimlingen nicht gebildet und ist erst nach 4~5stiindiger Betiehtung der Pflanzen nach dem Einsetzen der Chlorophyllsynthese naehweisbar. HALLet al., 1959 untersuchten eine ltCO2-Pixierung mit rohen Homogenaten der Blgtter yon Gerstekeimlingen in vitro mit Ribose-5-phosphat und Fructose-6-phosphat als Substraten und beobachteten dabei ailerdings eine gewisse Unabh~ngigkeit vonder Chlorophyllbildung. Fiir einzelne Enzyme, I~ibulosediphosphat-Carboxylase und Ribosephosphat-Isomerase geben dann HUFFAKER et al., 1964 an, dab deren Aktivit~t nach ~bertragen etiolierter Keimlinge ins Licht ansteigt. DaB das Licht fiber das Phytochromsystem einen EinfluB auf die Bildung yon Enzymen des Calvin-Zyklus ausiibt, konnte mehrfach und fiir verschiedene Enzyme nachgewiesen werden (MAnOrs, 1960; MA~aVLI~S,1965; FE~ERABE~D U. Praso~, 1966). Spezifische enzymatisehe Aspekte heterotropher Ern/ihrungszust/~nde liegen weniger deutlieh zutage. Die Folge dec Reaktionen des reduktiven

328

J. FEIERABEND :

P e n t o s e p h o s p h a t - Z y k l u s (CMvin-Zyklus) k a n n z u m Teil auch in an d er er R i c h t u n g o x y d a t i v fiber die G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e gespeist w e r d e n u n d so zu gleichen I n t e r m e d i i ~ r p r o d u k t e n fiihren. E n z y m e dieses o x y d a t i v e n P e n t o s e p h o s p h a t - Z y k l u s scheinen, wie i m folgenden d ar g el eg t w e r d e n sol], k e n n z e i c h n e n d ffir die h e t e r o t r o p h e P h a s e der K e i m u n g zu sein.

Material und Methodik a) Materia~ und Anzucht. Die Versuche wurden an Keimlingen yon Petkuser Winterroggen (Normal 908 der F~. F. v. Lochow-Petkus, Hasselhorst) der Ernte 1963 durchgeffihrt, l~ur in einem Vergleichsversuch wurde Sommerroggen (Ernte 1964) verwendet. Das Saatgut wurde bei 10o trocken gelagert. Fiir die Versuche wurden gesunde Karyopsen etwa einheit]icher GrS~e aussortiert. Zu Beginn eines Versuehes wurden die Samen zur oberfl~chlichen Sterilisierung in einem Erlenmeyerkolben mit 3% iger ChlorkalklSsung kurz evakuiert und ca. 1 Std darin belassen. Anschliel~end wurde mit Austauscherwasser mehrfach gewaschen. Die Samen wurden dann in Petrischalen auf Filtrierpapier (Sehleicher & Schfill Nr. 598) ausgelegt, die mit Austauscherwasser bzw. den angegebenen L6sungen besehickt waren. Fiir die Versuche bei tiefer Temperatur bzw. mit Hemmstoffen wurden Schalen und Wasser bzw. die entsprechenden L6sungen vor dem Versuch sterilisiert. Die Anzucht wurde bei 22o im Thermostaten bzw. bei den Versuchen mit Dauerlicht in einer Klimakammer durchgeffihrt. In den Versuchen mit tiefer Temperatur wurden die Keimlinge im K~lteraum bei ca. 2o aufgezogen. Weil~es Dauerlicht wurde mit Leuchtstoffr6hren (Osram Hl~I - - do Luxe 202, 40 W und HNW 202, 40 W) erzeugt. Die Beleuchtungsst~rke betrug ca. 1000 Lux. b) Herstellung der Extra]cte. Bei der Aufarbeitung wurden in den dargestellten Versuchen nur die Embryonen verwendet, yon denen das Endosperm entfernt wordon war. I)er Einfachheit wegen wurde die Bezeichnung ,,Embryo" auch in den fortgeschrittenen Keimungsstadien ffir die endospermfreie junge Pflanze beibehalten. In einigen F~llen wurde nur der ,,Spro~" untersucht. Er umfaBt den Komplex aus gestauchter Achse ~- Vegetationskegel -~ BlOtter -~ Coleoptile. Die Aufarbeitung wurde bei 2o durchgeffihrt. Das zu untersuchende Material wurde mit Anstauscherwasser gewaschen und mit etwas Pufierl6sung (0,05 M Tris, pH 7,5) in einem vorgekfihlten M6rser zerrieben. AnschlieBend wurde mit Puffer auf ein bestimmtes Volumen aufgefiillt. Diese rohen Homogenate wurden durch eine Glasfritte (3 G 1 der Fa. Schott & Gen.) gesaugt und anschliel3end 20 rain auf der Kiihlzentrifuge yon M. Christ ,,Universal Rapid" bei ca. 35000 g zentrifugiert. Der ldare ~Tberstand wurde im Eisbad gehalten und diente zur Bestimmung der Enzymaktivit~ten und des 16slichen Proteins. Zun~chst war ein AufschluB der Gewebe mit dem Zellhomogenisator UltraTurrax versueht worden. Jedoch werden bei dieser Behandlung schon in kurzer Zeit einige Enzyme sehr stark (z. B. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase) oder sogar v61lig denaturiert (Shikimis~ure-Dehydrogenase), w~hrend z.B. die 6-Phosphoglucons~ure-Dehydrogenase nur geringfiigig vermindert wird. In Extrakten des Endosperms wurde die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase Mlerdings nicht beeintr~chtigt. Parallel mit der Inaktivierung einiger Enzyme wird bei Behandiung mit dem UltraTurrax fast ein Viertel des nach Aufschlul3 im M6rser erhaltenen 16slichen Proteins ausgef~llt. c) Enzymbestimmungen. Die Enzymaktivit~ten wurden (aui3er RibosephosphatIsomerase) ira optischen Test nach Warburg bei 366 mEz im Photometer ,,Eppen-

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

329

dorf" gemessen. Die Aktivit/~ten werden als m~M umgesetztes Substrat pro min angegeben und auf die Stiiekzahl, z.B. einen Embryo bzw. einen Sprol3 (,,absolute Aktivit~t") oder auf das Extraktprotein (,,spezifische Aktivit~t") bezogen. Da die Aktivit/~t unter stets gleichen Testbedingungen bestimmt wurde, diirlten die gemessehen absoluten Aktivit~iten die Enzymmengen wiedergeben. Die speziellen I~r diese Arbeit abgewandelten Testzusammensetzungen sind im einzelnen bei FEIERABEND, 1965 angegeben. d) Protein. Das 16sliehe Protein wurde aus den Extrakten naeh Fiillung mit Trichloressigs~ure (25% Endkonzentration) als Proteinstickstoff mit der Mikro-Kjeldahl-Methode bestimmt. e) Chlorophyll. Ges~mteh]orophyNwurde nach MAC~INSr~Y,194I nach den Angaben von B6oEI~, 1964 bestimmt.

Ergebnisse I. Enzyme des redulctiven und des oxydativen Pentosephosphat-Zy]clus bei normaler Keimung 1. Enzyme des Calvin-Zyklus I m Rahmen dieser Arbeit wnrde die Aktivit/tt der Enzyme Ribulosediphosphat Carboxylase, Transketolase und Ribosephosphat-Isomerase w/~hrend der Keimlingsentwicklung gemessen. Transketolase und Ribosephosphat-Isomerase werden auch im oxydativen Pentosephosphat-Zyklus ben6tigt. Nut die Ribu]osediphosphat-Carboxylase diirfte allein bei der Photosynthese ben6tigt werden und ist spezifsieh fiir den Calvin-Zyklus; daher wird sie hierftir im folgenden als Indikatorenzym betrachtet. Sie ist wie die NADP-Triosephosphat-Dehydrogenase in den Chloroplasten lokalisiert ( H ] ~ eta]., 1963). In den Embryonen troekener Samen sind gibulosediphosphat-Carboxylase und Transketolase nieht, Ribosephosphat-Isomerase nur in Spuren nachweisbar. Das Fehlen yon Transketolase Iindet eine passende Ergiinzung in den Angaben yon S ~ u. ROBINSOn, 1963, dab in Getreidesamen das Thiamin nicht in Form yon Phosphaten vorhanden ist; in den trockenen Samen fehlt somit aueh noch der Cofaktor der Transketolase, das Thiaminpyrophosphat. W~hrend der Keimung nehmen Transketolase und Ribosephosphat-Isomerase in der in Abb. 1 dargestellten Weise zu; Aufzueht der Keimlinge im Dauerlieht erh6ht den Anstieg der Transketolase betr/tchtlich. Ribulosediphosphat-Carboxylase ist in den Keimlingen bei Anzucht im Dunkeln bis zu einem Alter yon 72 Std nicht naehweisbar, trill dann abet auch in etiolierten Keimlingen ohne jegliche Beliehtung auf und nimmt mit tier weiteren Entwieklung zu (Abb. 1). Auf das Vorhendensein yon Carboxylierungsenzym in etiolierten Keimlingen sehlieBen bereits tIALLet al., 1959; denn die yon ihnen beobachtete 14COe-Fixierung mit Ribose-5-phosphat in den ttomogenaten etiolierter Gerstekeimlinge betri~gt bereits 1/2 bis 1/3 der nach Beliehtung der Pflanzen maxima] erreichbaren Fixierungsrate in vitro. Aueh HVFFaKE~et al., 1964 finden das Enzym RibulosediphosphatCarboxylase in Dunke]keimlingen der Gerste in geringen Mengen. Nach M~GVLI~S,

330

J. FEIEKABEND:

1965 ist die NADP-3-Phosphoglycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase ebenfalls in etiolierten Bohnenbliittern in geringer Aktivits vorhanden. Bei Anzucht der Keimlinge ira Licht tritt die l~ibulosediphosphatCarboxylase in der Entwicklung 24 Std eher als im Dunkeln auf, und die gemessene Ak~ivit~t iibertrifft dig entspreehenden Dunkelwerte um

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Abb. 1. ~ n d e r u n g der absoluten ( ) bzw. spezifischen Akfiviti~t (-- -- --) y o n E n z y m e n des Calvim Zyclus (RuDPCO Ribulosediphosphat-Carboxylase; R P 1 l%ibosephosphat-Isomerase; Transketolase) u n d des Chlorophyllgehalts in E m b r y o n e n w a h r e n d der K e i m u n g bei 22 o a u f W a s s e r i m D u n k e l n ( 9 ), a u f W a s s e r i m Dauerlicht ( 9 a u f K n o p s c h e r NahrlSsung i m Dauerlicht ( V )

50--100% (Abb. 1). Unter dem EinfluB des Dauerlichts erfolgen die Bildung der 1%ibulosediphosphat-Carboxylase und die Chlorophyllsynthese ann/ihernd parallel (Abb. 1). Die l~ibulosediphosphat-Carboxylase wurde nut im SproB, aber nieht in Wurzel und Scutellum gefunden. Ein weiterer st~trkerer Anstieg der Enzyme des Calvin-Zyklus wird bei der

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

331

Anzucht der Keimlinge mit dest. Wasser nach 120 Std durch das allm~hliche Erlahmen der Proteinsynthese infolge des Verbrauchs der Reservestoffe verhindert (vgl. Abb. 2). Die Tatsache, dab auch beim Wachstum im Dunkeln reine Photosyntheseenzyme wie Ribulosediphosphat-Carboxylase gebfldet werden, wirft die Frage auf, wie welt dabei der strukturelle Aufbau der Plastiden fortgeschritten ist. Es wurden daher B l ~ t e r 120 Std alter Keimlinge, in denen auch ohne Belichtung schon erhebliehe Mengen l~ibulosediphosphatCarboxylase vorhanden sind, elektronenmikroskopiseh untersucht. Die j v .v/v

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Abb. 2. l~ufferlOslichesProtein der Embryonen. Anzucht auf Wasser im Dunkeln ( 9 ) bzw. im Dauerlicht (9 und auf Knopscher Nithrl6sung im Dauerlicht (V)

Proben wurden jeweils, - - von der Spitze her gerechnet, - - dem zweiten Viertel der BlOtter entnommen. Nach Anzucht im Dauerlicht bietet sich das Bild normaler Chloroplast.en mit Granastruk~uren. Die Proplastiden entsprechender etiolierter Keimlinge zeigen bereits ein bemerkenswertes MM] an struktureller Differenzierung (Abb. 3). I n ihrem ausgedehnten Stromabereich enthalten sie eine Anzahl yon Thylakoiden, die yon einem ProlamellarkSrper ausgehen. Assoziationen der Thylakoide nach Art der Grana sind nicht zu beobachten. Die Bildung derartiger Thylakoide ohne Chlorophyll in etiolierten Keimlingen wurde bereits yon v . W]ETTSTEIN, 1958 und yon MAI~SC~ISEI~U. G~3NTHEI~, 1966 beobachtet. 2. Enzyme des oxydativen Pentosephosphat-Zyklus Neben dem photosynthetisehen reduktiven (Calvin-Zyklus) gibt es in Pflanzen auch den oxydativen Pentosephosphat-Zyklus. Seine charakteristischen Enzyme Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (GIBBs, 1952; ANDERSON et al., 1952) und

332

J. FEIERABEND:

6-Phosphoglucons~ure-Dehydrogenase (AxELROD 11. BANDURSKI, 1952; BARNETT et al., 1953) sind mehrfach in Geweben hSherer Pflanzen nachgewiesen worden und zeigen dort weite Verbreitung. An 48 Std ulten Keimlingen yon Phaseolus radiatus konnten ~HAKRAu U. BURMA, 1959 das Vorhandensein s~mtlicher Enzyme des Pentosephosph~t~Zyklus feststellen. Beim Vergleich des Verhaltens einer Reihe yon Enzymen versehiedener Stoffweehselwege w~hrend der Keimung (FEIERABE~TD, 1965) zeigten die Fermente des oxydativen Pentosephosphat-Zyklus gewisse besondere Beziehungen zum Aktivit~tsverlauf yon Enzymes des Calvin-Zyklus; daher

Abb. 3. Proplastid aus Blattgewebe eines 120 Std alten Keimlingsnach Au~zucht auf Wasser im Dunkeln. Fixierung: Glutaraldehyd-Osmiums~ure sollen sie im folgenden n~her betr~chtet werden. Daneben wird hier such die Shikimis~ure-Dehydrogenase behandelt; denn die Synthese der Shikimis~ure bezieht einen Vorliiufer, Erythrose-4-phosphat, aus dem (oxyd~tiven oder reduktiven) Pentosephosphat-Zyklus, und die Shikimis~ure-Dehydi-ogenase wird au~erdem bei den sp~teren Versuehen als geeignetes Vergleichsenzym dienen. G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e u n d 6-Phosphoglueonsi~ure-Deh y d r o g e n a s e sind in d e n E m b r y o n e n t r o e k e n e r S a m e n bereits v o r h a n d e n u n d n e h m e n w ~ h r e n d d e r K e i m u n g zuni~chst intensiv zu (Abb. 4 u. 5). Die G l u e o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e zeigt d a n n iedoeh gegeniiber a n d e r e n b e t r a c h t e t e n E n z y m e n (vg]. S h i k i m i s ~ u r e - D e h y d r o g e n a s e ) ein ungewShnliches V e r h a l t e n . N a c h 96 S t d steigt ihre a b s o l u t e A k t i v i t s n i e h t m e h r in n e n n e n s w e r t e m MaLe an, obgleich die l~eservestoffe in d i e s e m S t a d i u m noeh n i e h t v e r b r a u e h t sind u n d die P r o t e i n s y n t h e s e d u r c h a u s im Gange ist (vgl. A b b . 2). D e m e n t s p r e c h e n d s i n k t die spezifische A k t i v i t ~ t n a c h einem s t a r k e n Anstieg in d e n ersten 48 S t d be-

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

333

trgchtlich ab. Die Bildungsrate der 6-Phosphoglucons/~ure-Dehydrogenase sehwgcht sich nur Mlmghlich mit der Verlangsamung der Proteinsynthese ab; daher ist der Abfall der spezifischen Aktivit/~t weniger ausgepr~gt. Wghrend bis 96 Std Keimung die Aktivitgt der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase jewefls hShere Werte erreicht als die 6-PhosphogluconsgureDehydrogenase, wird sie danach yon der 6-Phosphogluconsgure-Dehydrogen~se iibertroffen.

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Belichtung der Keimlinge hat keinen EinfluB auf den Verlauf der Aktivitg~ der 6-Phosphoglueonsgure-Dehydrogenase (Abb. 5a). Das Verhalten der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase wird durch Lieht ebenfalls nioht grundsgtzlich vergndert; allerdings nimmt bei der Keimung im Lieht ihre Aktivit~t sehon naeh 72 Std nieht mehr weiter zu, wenngleich dieser Untersehied quantitativ nicht sehr betrgchtlich ist. Das Absinken der spezifisehen Aktivitgt wird entsprechend m~rkanter (Abb. 4). CHAKRAVORTYU. BURMA, 1959 nehmen bereits an, dab dem PentosephosphatZyklus zu Beginn der Keimung eine besondere Bedeutung zukommt, weft Glucose6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphoglueonsgure-Dehydrogenase bei Phaseolus radiatu, n~ch 48 Std Keimung rasch abnehmen. Da sie offenbar ganze Keimlinge verwandten, kSnnte dieses Verhalten aber weitgehend yon den Kotyledonen und weniger yon den wachsenden Geweben bestlmmt worden sein. AuBerdemkann bei ihren

334

J. F]~IERA:BEND:

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Abb. 5. a 6-PhosDhoglucons~ure-Dehydrogenase und b Shikimis~ure-Dehydrogen~se in Embryonen wahrend der Xeimung bei 22% Zeichenerkl~rung wie Abb. 1 Messungen die E n z y m ~ k t i v i t E t s ~ r k d a d u r c h b e e i n t r g c h t i g t w o r d e n sein, dab sie ihre E x t r a k t e d u r e h I-Iomogenisieren m i t d e m W a r i n g Blendor herstellten (vgl. Me-

Enzymbildung in l~oggenkeimlingen

335

thodik). Dem Verhalten der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bei den I~oggenkeimlingen entsprechen die Befunde yon LATZKOU. KOTZ~,1965 an keimender Sommergerste. Aueh in diesem Falle kommt der Aktivi~tsanstieg der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase m hier aueh der 6-Phosphoglucons~ure-Dehydrogenase - - im Gegensatz zu anderen Enzymen zu einem plStzlichen Stillstand. Die absolute Aktivit~t der Shikimis/iure-Dehydrogenase steigt yon einem geringen Ausgangswert in den Embryonen trockener Samen naeh Art einer Waehstumskurve an. Der Anstieg folgt sehlieglieh so eng der Proteinsynthese, dub die spezifische Aktivitgt in einem konstanten Bereich bleibt. Lieht fibt keine Wirkung auf das Verhalten der Shikimis/iureDehydrogenase aus (Abb. 5). 3. Verhalten der Enzyme bei Anzueht der Keimlinge auf Nghrl6sung im Dauerlieht Es erhebt sich die Frage, aus welchen Ursaehen die weitere Bildung yon Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase so ungew6hnlieh friih in der Entwieklung eingestcllt wird. Die Reservestoffe sind zu diesem Zeitpunkt noch nieht aufgezehrt. Trotzdem k6nnte die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, auch ohne eine spezifische tIemmung zu erfahren, aufgrund noch nicht zu iibersehender Eigenschaften (z.B. Gesehwindigkeit oder spezielle Substratbediirfrrisse ihrer Synthese) in der Konkurrenz der Enzymsynthesen besonders benaehteiligt sein. Der Stop der Synthese yon Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase k6nnte somit rein erniihrungsphysiologiseh erkl/irbar und nut Symptom eines sich selektiv besonders fr/ihzeitig auswirkenden Stiekstoffmangels sein. Um einen m6glichen N/s auszusehalten, wurden daher die Keimlinge im Dauerlicht auf Knopscher N~hrl6sung angezogen. Unter diesen Bedingungen wird mehr Protein gebildet und seine Synthese kommt nicht zum Stillstand (Abb. 2). Dementsprechend steigt die Aktivitgt der Photosyntheseenzyme Ribulosediphosphat-Carboxylase (Abb. 6) und Transketolase (Abb. 1) gegenfiber den Kontrollen auf dest. Wasser erheblich sehneller an; aueh ihre spezifisehe Aktivit/~t ist dabei betr/ichtlieh erh6ht. 6-Phosphoglueonsgure-Dehydrogenase und Shikimisgure-Dehydrogenase (Abb. 5) nehmen unter diesen Bedingungen ebenfalls st/irker zu. Jedoeh wird ihre Bildung nur in gleichem MaBe wie die Proteinsynthese gef6rdert; ihre spezifisehen Aktivit~ten bleiben somit im gleichen Bereieh wie ohne N/thrl6sung. Im Gegensatz zu den anderen Enzymen nimmt die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aueh unter diesen Bedingungen naeh 72 Std nieht welter zu, ihre spezifisehe Aktivit/~t fgllt dementsprechend stark ab (Abb. 6). Das Verhalten der Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase 1/~l~tsieh somit nicht als Ausdruck eines einfachen Stiekstoffmangels betrachten, sondern muB durch eine andersartige spezifisehe Regulation verursaeht

336

J. FEIER•

:

werden. Zwischen 120 und 168 Std Keimung auf NahrlSsung im Licht wird der Anstieg der 6-Phosphoglueons~ure-Dehydrogenase such zunehmend verringert und dfirfte schliefilich ebenf~lls zum StiUstand kommen. Bemerkenswerter ist ]edoeh, da~ sie zunaehst nicht das ungewShnliehe Verhalten der Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase zeigt, obgleich sic demselben Zyklus angehSrt.

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Abb. 6, Absolute ( ) bzw. spezifische Aktivit&t ( - - - - - - ) der P~ibulosediphospbat-Carboxylase (RuDPCO) und Glucose-6-phosphut-Dehydrogenase (G-6-PDH) nach Anzucht der Keimlinge bei 220 ira Dauerlicht ~uf Wasser (O) bzw. auf Knopscher l~&hrlSsung (V)

II. Zusammenhi~nge zwisehen dem Verhalten tier Glucose-6-phosphatDehydrogenase und tier Enzyme de8 Calvin-Zylslus (Ribulosed@hosphatCarboxylase ) Bei der Untersuchung des gesehilderten besonderen Verhaltens der Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase ffihrte ein Vergleich mit dem Verlauf der Ribulosediphosphat-Carboxylase welter. Es zeigt sich, dag der Anstieg der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gerade immer dann abbricht, wenn die l~ibulosediphosphat-Carboxylase zum ersten Male meBbar ist: in etiolierten Keimlingen nach 96 Std, im Dauerlieht entsprechend 24 Std eher. Ein Sinn einer derartigen Beziehung in der Bildung der beiden Enzyme lieBe sich darin sehen, dab beide Pentosephosphat-Zyklen die Aufgaben haben, bestimmte gleiehe Intermedigrprodukte zu liefern. Wghrend zu Beginn der Keimung nur der oxydative Reaktionsweg fiber die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu diesen Produkten ffihrt, kann er nach dem Aufbau eines funktionsf&higen Photosyntheseapparats dutch den reduktiven Pentosephosphat-Zyklus abgel5st werden, der yon der l~ibulosediphosphat-Carboxylase gespeist wird. Daher kSnnte die weitere Bildung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase eingestellt oder verlangsamt werden. Bei dieser Betrachtung stellt sieh die Frage, ob die soweit nut formale Korrelation ]In Verhalten der Enzyme auch einen kausalen ttintergrund hat. D~nn miiBte sich ein weiterer Anstieg der Glucose-6-

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

337

p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e e r r e i c h e n lassen, w e n n es g e l i n g t , die P h o t o s y n t h e s e e n z y m e s e l e k t i v z u u n t e r d r / i c k e n , t t i e r f / i r h a b e n sich t a t s ~ c h l i c h g e e i g n e t e B e d i n g u n g e n l i n d e n lassen: d a s W a c h s t u m bei t i e f e r T e m p e r a t u r u n d die E i n w i r k u n g y o n C h l o r a m p h e n i c o l . 1. U n t e r s c h i e d l i c h e r Einflul3 t i e f e r T e m p e r a t u r a u f die E n z y m b i l d u n g a) Verhalten der Enzyme in ganzen Embryonen wiihrend des Waehstums bei 2~ Die Keimlinge wurden in diesen Versuehen 24 Std bei 220 (diese Zeit ist in den Angaben fiber die Aufentha]tszeit bei 2 ~ immer inbegriffen) angekeimt und dann in eine Temperatur yon ca. 2~ umgesetzt, we die weitere Entwieklung stattfand. Nach a)

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Abb. 7. a PufferIfsliches Protein, b Gesamtchlorophyllin Embryonen nach Anzucht bei 2o. Zeichenerkl~rung wie Abb. 2. Gepunktete ]Kttrve in b: Chlorophyllgehaltyon Embryonen jeweils gleichen Proteingehalts nach Anzucht bei 22~ Senkrechte Linien: Stadien, die Keimlingennach 72 bzw. 96 Std bei 22~ entsprechen. Abszisse: Zeit in Wochen 7 Woehen Waehstum bei 20 haben die Keimlinge den ohne N~hrstoffzufuhr etwa maximalen Entwicklungszustand erreieht. Sie enthalten dann mehr lfsliches Protein, als sie (auf dest. Wasser) bei 220 zu bilden verm6gen (Abb. 7a). Als gemeinsame Vergleiehsbasis und somit als ~aB ifir den Entwieklungszustand der~rt unterschiedlieh schnell waehsender Pflanzen wurde ihr Gehalt an 15sliehem Protein gew~h]t; denn er wurde ohnehin tinter beiden Bedingungen bestimmt (Abb. 2 u. Abb. 7 a) und diiffte als repr~sentativ fiir den Fortschritt des Enzymsystems anzusehen sein. Stadien bei 22 o bzw. 20 werden in bezug auf ihren Entwieklungszustand als gleichartig betrachtet, wenn sie gleich viel Protein enthalten. Nach diesem Prinzip sind in den graphischen Darstellungen zu den EnzymaktivitEten der Keimlinge naeh Aufzucht bei 20 die Werte entsprechender bei 220 gewachsener Keimpflanzen (unter Berfieksiehtigung yon Licht- bzw. Dunkelanzucht) jeweils gleichen Proteingehalts als gepunktete Vergleiehskurven eingetragen; ~uBerdem sind die Entwicklungszeiten bei 2 e, die den wiehtigen Stadien yon 72 bzw. 96 Std bei 220 entsprechen, besonders markiert. W i e aus d e r A b b . 8 e r s i c h t l i c h ist, urird die B i l d u n g d e r R i b u l o s e d i p h o s p h a t - C a r b o x y l a s e in d e r E n t w i c k l u n g d e r K e i m l i n g e d u r c h die tiefe T e m p e r a t u r g e g e n / i b e r d e n K o n t r o l l e n bei 22 ~ s t a r k v e r z f g e r t . 23a Planta (BerL), Bd. 71

338

J. ~EIER-~_B~END-"

Unter der Wirkung der K/~lte tritt sie im Dunkeln wie im Licht erst nach 4 Wochen mef3bar auf. Bei normaler Temperatur hat sie in dem entsprechenden Entwicklungsstadium 1/~ngst betr/~chtliche Aktivit/~t erreicht. Ebenso wird der Anstieg der Transketolase durch die K/ilte vergleichsweise unterdrfickt (Abb. 8). Wenn die Keimlinge bei der tiefen Temperatur belichtet werden, wird Chlorophyll gebildet ; aber auch seine 300l

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Abb. 8. l~ibulosediphosphat-Carboxylase (RuDPCO), Transketolase 6-Phosphoglucons~ure-Dehydrogenase (6-PGSDH) u n d Shikimis~ure-Dehydrogenase (SSR) in E m b r y o n e n w~hrend der Keimung bei 2~ Gepunktete Kurven: Absolute Aktivit~ten yon Embryonen jeweils gleichen Proteingehalts n a c h Anzucht bei 220. Senkrechte Linien: Stadien, die ~eimlingen nach 72 bzw. 96 Std bei 22 o entsprechen. Zeichenerkl~rung sonst wie Abb. 1

Synthese ist in bezug auf den Entwicklungszustand der Keimlinge erheblich verz5gert (Abb. 7 b). Es ergibt sich somit das Bild, dab offenbar der Aufbau des gesamten Photosyntheseapparats durch die tiefe Temperatur in der Entwicklung der Keimlinge stark hinausgeschoben wird. Zugleich fibt die Temperatur einen st~rkeren EinfluB auf die Ausbfldung der Enzyme des Calvin-Zyklus aus als die Belichtung; denn das Licht vermag zwar die Bildungsrate dieser Fermente in fortgeschrittenem Stadium auch bei 20 erheblich zu erh5hen, ist aber nicht in der Lage, das Auftreten der Ribulosediphosphat-Carboxylase wesentlich vorzuverlegen.

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

339

Neben der gesehilderten Unterdrfickung der Enzyme des CalvinZyklus bewirkt die tiefe Temperatur auf der anderen Seite tatsiichlieh, da~ die Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase unter diesen Bedingungen nieht wie bei 220 in frfihem Stadium seine Neubfldung einstellt, sondern unbehindert welter ansteigt (Abb. 9). Infolgedessen betr~gt die absolute Aktivit~t nach 7 Wochen Wachstum im Dunkeln nahezu das Doppelte

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Abb. O, Glucose-O-phosphat-nehydrogenase in Embryonen w~hrend der Keimung bei 2 ~ Zeichenerkl$irung wie Abb. 8. Waagerechte Linie: mit~lere absolute Aktivit&t in Embryonen zwisellen 96 und 168 Std bei 22 ~ im Dunkeln

des bei 220 erreichten Wertes. Nach 5 Woehen wird die Zunahme der Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase aueh bei 20 allmiihlich verringert. Das steht zwar wieder in Paral]ele zu dem Auftreten der Ribulosediphosphat-Carboxylase, jedoeh sind jetzt aueh die Reservestoffe bereits weitgehend aufgezehrt. Entsprechend dem Verlauf der absoluten Aktivitat f~llt unter dem Einflul3 der Kalte die spezifisehe Aktivit~t der Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase nieht ab, sondern bleibt auf dem hohen Niveau, das bei 22 o naeh 48 S6d erreicht war. Wie bei der Ribulosediphosphat-Carboxylase vermag Beliehtung der Keimlinge auch bei der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase die Wirkung der tiefen Temperatur nicht wesentlieh zu ver~ndern. Nur die nach 7 Wochen vorhandene maximale Aktivit~t f~llt niedriger als bei den zugehSrigen Dunkelkeimlingen aus. 23*

340

J. FEIER•

:

Ein Vergleich des Verlaufs der Aktivit/~ten yon 6-Phosphoglucons/~ure-Dehydrogenase und Shikimis/s w/~hrend des Wachstums bei 20 und entsprechender Keimlinge gleichen Proteingehalts bei 220 zeigt deutlich, dab das Verhalten dieser Enzyme in bezug auf die Gesamtentwicklung dureh die Temperatur nieht beeinflul~t wird (Abb. 8). Die entspreehenden K u r v e n stimmen gut fiberein. Die absolute Aktivit/s erreicht zwar in beiden F/~llen etwas hShere Werte als naeh 168 Std bei 22 ~ was jedoch im wesentliehen auf den ebenfalls hSheren Proteingehalt zurfickzufiihren ist. Die Versuche bei tiefer Temperatur best/~tigen somit die Annahme, dab zwisehen dem Erseheinen des Enzymapparats des Calvin-Zyklus und dem Abbruch der weiteren Synthese von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase ein urs/~chlieher Zusammenhang zu bestehen scheint. Der EinfluB der K/ilte verzSgert die Bildung der Photosyntheseenzyme wahrend der Entwieklung und ffihrt zugleieh - - im Gegensatz zu den Verh/~ltnissen bei 22 ~ - - zu einer Fortsetzung des Anstiegs der Glueose-6-phosphatDehydrogenase, w/~hrend andere Vergleichsenzyme unbeeinflugt bleiben. b) Vergleichende Untersuchungen an Sommerroggen. Da alle bisherigen Versuche an Winterroggen ausgefiihrt wurden, besteht die M6glichkeit, dab die kgltebedingte Vermehrung der Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase gegeniiber den Kontrollen bei 220 Ausdruck des Vernalisabionsprozesses ist; denn die Einwirkung tiefer Temperafur versetzt diese Pflanzen in einen bltihbereiten Zustand. In diesem Falle sollte die Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase beim Sommerroggen aber keinem TemperatureinfluB unterliegen, da dieser zum Bliihen keine Ki~ltebehandlung ben6tigt. Die fraglichen Enzyme Glucose-6-phospha~-Dehydrogenase und Ribulosediphosphat-Carboxylase zeigten jedoch beim Sommerrogen prinzipiell das gleiche Verhalten wie beim Winterroggen; die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase wird bier durch Anzucht dcr Keimlinge bei tiefer TemperaSur ebenfalls betr~chtlich vermehrt. Xhr Verhalten dfirfte daher in keinem direkten Zusammenhang mit der Vemalisation stehen (vgl. ~']~IERABV,~D,1965). C) Vergleich yon Wurzel und Sprofl. Es stellt sich weiterhin die Frage, ob das am Gesamtembryo beschriebene Verhalten der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase sieh ebenso in den Einzelorganen beobachten 1/~$t oder welches Organ daffir verantwortlich ist. Ribulosediphosphat-Carboxylase ist nur im SproB nachweisbar. Die Zuwachsrate der Glueose-6phosphat-Dehydrogenase nimmt im SproB nach 96 Std Keimung bei 220 deutlich ab, und dementsprechend sinkt auch die spezifische Aktiviti~t (Abb. 13). Naeh 7 Wochen Wachstum bei 20 enth/~lt ein Spro$ fast das Zweifaehe an Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase, wit er bei normaler Temperatur erreicht. Die spezifische Aktivit~t ist ebenfalls deutlich allerdings nieht in gleiehem N[al~e erhSht, da aueh der Proteingehalt der Sprosse gesteigert ist. An den Wurzeln, die keine RibulosediphosphatCarboxylase enthalten, konnte auch keine Temperaturabh/ingigkeit der Synthese der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase festgestellt werden (vgl. FrI~gABEND, 1965). Die bei diesem Enzym am Gesamtembryo

Enzymbildung in l~oggenkeimlingen

341

e r h a l t e n e n Befunde dfirften d a h e r vorwiegend auf die Verh/tltnisse in den Sprossen zurfiekzufiihren sein. Eine Diskrepanz seheint sich zun/iehst daraus zu ergeben, dab der Anstieg der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (absolute Aktivit~t) bei 220 im Gesamtembryo naeh 96 Std. zum Stillstand kommt, wi~hrend er sieh beim SproB Mlein nur stark verringert. Der fiir den Embryo besehriebene Kurvenverlauf d/irfte auf einer ~berlagerung versehiedener Vorg/inge beruhen: er ergibt sieh aus der Verlangsamung der Bildung yon Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase im SproB naeh 96 Std und einer gleiehzeitigen Abnahme dieses Enzyms im Scutellum. 2. C h a r a k t e r i s i e r u n g der K ~ l t e w i r k u n g d u r c h T e m p e r a t u r w e c h s e l in verschiedenen E n t w i c k l u n g s s t a d i e n U m zu prfifen, ob die W i r k u n g der tiefen T e m p e r a t u r in den Pflanzen zu einem v e r ~ n d e r t e n physiologischen Z u s t a n d ffihrt, der d a n n auch u n t e r N o r m a l b e d i n g u n g e n l e s t b e i b e h a l t e n wird, w u r d e n die K e i m l i n g e in der ersten V e r s u c h s g r u p p e nach einem b e s t i m m t e n A u f e n t h a l t in der K ~ l t e wieder in normMe T e m p e r a t u r zurfickgesetzt. I n der zweiten Versuchsgruppe w u r d e n sie nicht, wie sonst fib]ich, nach 24 Std, sondern nach verschieden langer V o r a n z u c h t bei 22 o in die tiefe T e m p e r a t u r u m g e s e t z t ; auf diese Weise lieB sich prfifen, ob die W i r k s a m k e i t d e r K ~ l t e yore E n t w i c k l u n g s z u s t a n d der K e i m l i n g e abh~ngig ist. Die Pflanzen blieben bei der Temperatur, in die sie umgesetzt worden waren, noch eine genfigend lange Zeit, dab sie einen maximalen Entwicklungszustand erreichen konnten. Ein Embryo enthielt dann 1,4--1,6 mg 16sliches Protein. Da die Aktivit~t der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in den ganzen Embryonen jeweiIs auf ein maximales Niveau ansteigt, das dann anniihernd konstant eingehalten wird, konnten die nach volIst~ndiger Entwicklung erreichten Endaktivitiiten verglichen werden. a ) Umsetzungen yon 2 o in 22 ~ W i e Abb. 10 zeigt, f5rdert die tiefe T e m p e r a t u r die B i l d u n g y o n G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e nut, solange sie tatsiichlich einwirkt, u n d hinterl~Bt i m allgemeinen keine N a c h w i r k u n g auf die weitere E n t w i c k l u n g bei 22 ~ Eine Woche tiefe Temperatur hat gar keinen EinfluB, und die nach 4 ~ 5 Wochen bei 2o erreichte Aktivit~t wird bei anschlieBendem AufenthMt bei 22o eher wieder reduziert. Nut wenn die Keimlinge nach zwei oder drei Wochen wieder in normMe Temperatur gebracht werden, ist eine Mlerdings geringe Nachwirkung zu verzeichhen. Die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase steigt noch welter an und fiberschreitet ihre normalerweise bei 22 o erreichbare mittlere Aktivit~t. Das steht aber in Einklang damit, dab zu diesem Zeitpunkt die I~ibulosediphosphat-Carboxylase bei 20 noch v6llig unterdrfickt ist (Abb. 8). Bis zur Aktivierung der Enzyme des CalvinZyklus nach der ~bertragung in 22oist offenbar noch die MSglichkeit zur Fortsetzung der Synthese yon Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gegeben. b) Umsetzungen yon 22 o in 2 ~ W e n n die K e i m l i n g e nach verschiedener W a c h s t u m s d a u e r bei 220 in die tiefe T e m p e r a t u r fibertragen werden, so zeigt sich, da~ der Einflu6 der K/~lte n i c h t wiihrend d e r g a n z e n E n t wicklung die gleiche W i r k s a m k e i t behalf. N u t wenn die K e i m l i n g e bis 23b l~lanta(Berl.), Bd. 71

342

J. ~EIEt~ABE~D."

zu einem A l t e r y o n 72 S t d der tiefen T e m p e r a t u r ausgesetzt werden, steigt die G l u e o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e auf die hohe A k t i v i t g t wie bei einer U m s e t z u n g nach 24 S t d an (Abb. 11). N a c h 72 S t d f~llt die f6rdernde Wirkung der Ks plStz]ich sehr s t a r k ab, u n d sehlieBlich ist kein d e u t l i c h e r Einflul~ m e h r festzustellen. Das s t e h t w i e d e r u m in auff~lliger Parallelit~t zum Verhalten der Ribulosediphosphat-Carboxylase; denn dieses E n z y m t r i t t bei 22 ~ gerade zwisehen 72 u n d 96 S t d z u e r s t auI. Die spezifisehen Aktiviti~ten d e r G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e folgen g e n a u d e m Gang d e r a b s o l u t e n A k t i v i t ~ t e n .

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Abb. 10. S~ulen: Glueose-6-pbosphat-Dehydrogenase(absoluteAktivit~t) in Embryonen, 4ie nach verschiedenlangemWaehstumbei 2~im Dunkeln (Wochenin oberer Zeileder Abszisse)bis zu maximaler Entwickhmg(untere Zeile)in 22~ zurfickgebrachtwurden. Kurve: zum Zeitpunkt der Umsetzung bei 2~erreichteAktivitfit Z u m Vergleich ist auch die spezifische A k t i v i t s ganzcr E m b r y o n e n a n 6-Phosphoglucons/i, u r e - D e h y d r o g e n a s e (Abb. 11) aus d e m s e l b e n Vetsuch dargestellt. N u r n a c h friihem U m s e t z e n d e r K e i m l i n g e in die tiefe T e m p e r a t u r w i r d sie geringffigig e r h 6 h t ; i m fibrigen refit die 6-Phosphogluconsi~ure-Dehydrogenase a b e r n i c h t das bei d e r Glucose-6-phosphatD e h y d r o g e n a s e zu b e o b a c h t e n d e m a r k a n t e VerhMten. 3. I t e m m u n g

d e r S y n t h e s e y o n E n z y m e n des CMvin-Zyklus d u r c h Chloramphenicol

E i n H e m m s t o f f der P r o t e i n s y n t h e s e , Chloramphenicol, ]ieferte eine zweite MSglichkeit, die E n z y m e des CMvin-Zyklus sehr w i r k u n g s v o l l u n d zugleich selektiv zu unterdrficken. ~ber eine Hemmung der Pl~stidenentwicklung und der Chlorophyllbildung naeh der Einwirkung yon Chloramphenicol wurde bereits mehrY~ch berichtet (D6]~L,

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

343

1963 bei Lycopersicum; MOLOTSKOVSKY U. MORIA:KOVA,1963 bei Vicia [aba; I-II3DOOK et al., 1964 bei Chlamydomonas). MAI~GULIES, 1964 konnte ebenfMls die Zunahme der Ribulosediphoslohat-Carboxylase, die bei Belichtung yon Bohnenkeimlingen eintritt, dureh Behandlung mit diesem ttemmstoff unterbinden. FOr die Anzucht der Keimlinge wurden die Sehalen in diesen Versuchen mit einer entsprechenden L6sung von Chlor~mphenicol in dest. W~sser besehickt. Wie bereits ein nur orienfierender Versuch an ganzen Embryonen ergab, lieI] sich durch

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Abb. 11. Absolute (--O--) bzw. spezifische Aktivitiit (-----) der Glucos~-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-P.DH) und 6-Phosphoglueonsgure-Dehydrogenase(6-PGSDH) in etioliertell Keimlingen (Embryonen), die nach versehiedenlanger u bei 220 (obere Zeile der Abszisse)bis zu maximaler Entwicklung (Woehender unteren Zeile) in 2~umgesetzt wurden. WaagerechteLinie: mittlere absolute Aktivitgt zwisehen96 und 168 Std w&hrendder Keimuug bei 22~ diese Behandlung neben einer kompletten Unterdrfickung der RibulosediphosphagCarboxylase auch n~ch 96 Std ein geringer wei~erer Anstieg der Glueose-6-phosphatDehydrogenase erzielen (Abb. 4). Dieser Effekt lieB sich aber deutlicher darstellen, wenn nur das Verhalten der Sprosse untersucht wurde, das im folgenden beschrieben wird. Naeh Anzucht der Keimlinge auf einer Chloramphenicoll6sung (1 m g / m l ) i s t d e r G e h a l t i h r e r S p r o s s e a n p u f f e r l S s l i e h e m P r o t e i n d u r e h s c h n i t t ] i c h n i e h t m e h r als 2 0 % g e r i n g e r als bei d e n K o n t r o l l e n ( A b b . 12).

344

J. FEIERABE~D:

Eine Verminderung etwa gleichen Ausmul~es weist auch die Shikimiss Dehydrogenuse uuf; d~her ist die HShe ihrer spezifischen Aktivits gegenfiber auf Wasser gekeimten Pfianzen nicht grundsis ver~ndert (Abb. 12). I m Gegensutz hierzu verh~Iten sieh die getesteten Fermente des C~lvin-Zyklus und die Glucose-6-phosph~t-Dehydrogenase bei der Behandlung mit dem Hemmstoff vSllig anders als das 15sliche Bezugsprotein. Die Bildung der Ribuloscdiphosph~t-C~rboxyluse wird durch 1oo

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Abb. 12. P r o t e i n g e h a l t u n d absolute ( - - ) bzw. spezifische A k t i v i t a t ( - - - - - - ) der Transketolase, 6-Phosphoglucons~ure-Dehydrogenase (6-PGSDH) u n d Shikimis~ure-Dehydrogenase (SSR) in etiolierten Sprossen n a c h A u f z u c h t bei 22 ~ a u f W a s s e r : 9 bzw. Chloramphenicol ( I m g / m l ) : D

Chloramphenicol v511ig gehemmt; sie wird erst nach 144 Std in Spuren nachweisbar (Abb. 13). Die Aktivit~t der Transketolase erreicht ebenfalls nur weniger als die Itglfte ihrer normalen Werte (Abb. 12). Diese ,,kestaktivit~t" dfirfte haupts~chlich auf die dem System des oxydativen Pentosephosphat-Zyklus angehSrende plasmatische Transketolase zuriickgehen; denn es wird vorwiegend der starke nach 72 Std einsetzende Anstieg unterdriickt, der parallel mit dem Auftreten der Ribulosediphosphat-Carboxylase erfolgt. An dem Verhalten der 6-Phosphogluconsaure-Dehydrogenase ist kein deutlicher EinfluB der Behandlung der Keimlinge mit dem H e m m stoff zu erkennen (Abb. 12). Die Bildung der Glucose-6-phosphat-De-

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

345

hydrogenase wird ebenfalls nieht gehemmt, sondern unter der Einwirkung des Chloramphenieols n i m m t sie sogar im Gegensatz zu dem Verhalten bei normaler Anzueht aueh naeh 96 Std noeh bis 144 Std weiter linear zu und erreieht so eine deutlich hShere Aktivitgt als die Kontrollen. Ihre spezifische Aktivit~t liegt dementspreehend ebenfalls betrgehtlieh h6her als bei normaler Keimung auf Wasser (Abb. 13). Die Versuehe mit Chloramphenicol best~tigen somit das bereits dureh die tiefe Temperatur erzielte Ph&nomen, dag die Glueose-6-phosphatDehydrogenase unvermindert weiter ansteigt, wenn das Auftreten der Ribulosediphosphat-Carboxylase unterdrfiekt wird.

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Abb. 13. Ribulosediphosphat-Carboxylase (RuDPCO) und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH) in Sprossen etiolierter Keimlinge. Zeichenerkl~rung wie Abb. 12

I m Zusammenhang mit der so selektiven und drastischen Wirksamkeit des Chloramphenicols gegeniiber den untersuchten Photosyntheseenzymen ist bemerkenswert, dab nach elektronenmikroskopischen Befunden die Prop]astiden von der Chloramphenieolbehandlung ebenfalls besonders betroffen werden (Abb. 14), wie es aueh in ~hnlicher Weise yon R o s s i n i , 1960 bei den Plastiden yon Sinapis naeh Einwirkung yon Streptomycin gefunden wurde. Sie sind wesentlich kleiner als die Proplastiden gleiehaltriger normaler Pflanzen (vgl. Abb. 3), und sie lassen keine deutliehe Thylakoidbildung erkennen. Dagegen ist ihr Prolamellark6rper yon faBt normaler Gr56e und nimmt daher nahezu den ganzen R a u m der klein gebliebenen Plastiden ein. Da in diesem Zustand keine Ribulosediphosphat-Carboxylase gefunden wird, ist anzunehmen, da6 sie in den Proplastiden nicht im Bereich des ProlamellarkSrpers lokalisiert ist.

346

J. FEIEI~ABEND : 4. P r i i f u n g w e i t e r e r H e m m s t o f f e d e r P r o t e i n s y n t h e s e

Eine Reihe weiterer Ilemmstoffe der Protein- bzw. RNS-Synthese, die in Tabelle I aufgefiihrt sind, wurde daraufhin untersueht, ob sieh mit ihnen ein iihnlieher EinfluB auf die Bildung yon Ribulosediphosphat-Carboxylase u n d Glueose-6-phosphatDehydrogenase erzielen l~Bt wie durch Chloramphenieol. Die Konzentrationen sind so gewiihlt, dab die Synthese yon Protein bzw. I~ibulosediI0hosphat-Carboxylase deutlieh gehemmt wird, die Keimlinge dabei abet nieht zu stark geseh~idigt werden. Es werden die E n z y m a k t i v i t g t e n in Sprossen 144 Std Mter etiolierter Keimlinge vergliehen; denn in diesem Stadium waren naeh Abb. 13 die Untersehiede am gr6Bten. D i e w i e d e r als V e r g l e i e h s e n z y m a u f g e f f i h r t e S h i k i m i s / t u r e - D e h y d r o genase zeigt bereits eine reeht untersehiedliehe Empfindlichkeit gegen-

Abb. 14. Proplastid aus dera Blattgewebe eines 120 Std alten Keimlings nach Aufzueht auf Chloramphenicoll6sung (1 mg/ml) bei 22~ im Dunkeln. Fixierung: Glutaraldehyd-Osmiums~m'e Tabelle 1. Vergleich der Wirkung verschiedener Hemmsto//e der RNS- bzw. Proteinsynthese au] die AktivitSten der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH), Ribulosediphosphat-Carboxylase (RuDPCO) und Shikimisiiure-Dehydrogenase (SSDH) in Sprossen 144 Std alter Keimlinge nach Anzucht bei 220 im DunIceln: Chloramphenicol (CA P), Actinomycin D (Act.), 2-Thiouracil ( T U), p-Fluorophenylalanin (FPhe) Enzym

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Act. (0,1mg/ml)

TU (4 • 10-'M)

FPhe (6 • 10-~ M)

G-6-PDH (m~M/min. Sprog) G-6-PDtt (m~t~CI/min. mg Prot.)

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155--5,7

120~2,8

99•

111~=4,0

116~3,0

201 ~:9,1

162•

RuDPCO (m~M/min. Spro$) SSDH (mbtM/min- mg Prot.) Verminderung des 16slichen Proteins

123~7,0

134•

32,5

0,0

23,6

11,1

10,3

85,5

89,5

96,0

73,6

66,5

17%

12%

13%

5%

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

347

fiber den verschiedenen Inhibitoren. Die Bildung der RibulosediphosphatCarboxylase wird nach Tabelle l zwar yon allen aufgef/ihrten Hemmstoffen starker unterdriickt als die Synthese des Bezugsproteins, aber die Hemmung ist weder so vollst~ndig noeh so selektiv wie nach Behandlung mit Chloramphenicol. Dementsprechend ist aueh die absolute Aktivit~t der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in keinem Fall in vergleichbarer Weise erh6ht. Ihr Anstieg verlangsamt sieh z.B. bei Einwirkung yon Thiouracil zwar erst sp~ter als bei den Kontrollen, aber ihre Synthese wird ebenso vermindert wie das 16sliehe Protein; in dem betraehteten Stadium wird daher gerade der Wert der Kontrollen erreieht (vgl. Fmm~A~E~D, 1965). Die spezifisehen Aktivit/iten der Glucose-6-phosphatDehydrogenase erreiehen dagegen schon wegen der meist st/~rkeren Beeintrgehtigung des Bezugsproteins etwas h6here Werte. 5. Zusammenfassender Vergleieh der Einflfisse yon tiefer Temperatur, Chloramphenicol und Licht auf die Bildung der Glucose-6-phosphatDehydrogenase In den dargestellten Untersuchungen lieg sich durch die Temperatur, die Einwirkung yon Chloramphenicol und Belichtung besonderer EinfluB auf die Bildung der Ribulosediphosphat-Carboxylase aus/iben, und hiermit lieg sieh wiederum das Verhalten der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in Zusammenhang bringen. In Tabelle 2 ist daher abschlieBend zusammengestellt, wie welt sieh diese Faktoren bei kombinierter Anwendung in ihrer Wirkung verst~rken oder aufheben kOnnen und wie sie sich dabei darauf auswirken, welchcn Weft die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase erreichen kann. Um die Spezifit/it im Verhalten der fraglichen anderen beiden Enzyme zu unterstreichen, ist die ShikimisiiureDehydrogenase wieder als Vergleichsenzym aufgefiihrt. Ihre spezifische Aktivit~t zeigt naeh der unterschiedhehen Aufzueht der Keimlinge nur sehr geringe Sehwankungen; dabei sei betont, dag alle drei aufgeffihrten Enzyme jeweils an denselben Extrakten getestet wurden. Die Ribulosediphosphat-Carboxylase wird in etioherten Keimlingen bei 2o durch Chloramphenieol ebenso effektiv unterdriiekt wie bei 22o; bei gleiehzeitiger Beliehtung der Keimlinge erreicht sie nut einen Bruchteil der ohne Hemmstoffeinwirkung unter diesen Bedingungen mSglichen Aktivit/~t. Die dutch die tiefe Temperatur bedingte Verz6gerung der Bildung yon Ribulosediphosphat-Carboxylase ist an den dargestellten auf Wasser angezogenen Endstadien nicht mehr ablesbar (vgl. Abb. 8). Beachtenswert ist das Verhalten der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase unter den versehiedenen Bedingungen. Durch Behandlung der Keimlinge mit Chloramphenicol kann sie nieht so stark vermehrt werden wie bei tiefer Temperatur. Wenn abet neben tier tiefen Temperatur noch

~.~

N

i

N

G-6-PDIt (m~M/min. SproB) G-6-PDIt (m~xM/min.mg Prof.) RuDPCO (m~xM/min. Sprol3) SSDI-I (m~/min. mg Prof.) L6sliches Protein (mg/Sprol~)

Enzym

0,727

0,875

0,0

32,5 89,5

201•

116•

85,5

155~ 5,7

1014-3,7

1,288

104

25,5•

1574-6,1

201~6,8

Dunkel

H~O

CAP

7 Wocher~ 2 o

144 8 t d 22 o Dunkel

1,352

98,5

62,14-5,8

142•

191•

Licht

Licht

0,996

100,6

0,5

0,962

103

10,84-2,3

253=f=17,5224~ 18,9

251:2_10,1 212•

Dunkel

9 Wochen 2 ~ CAP

Tabelle 2. Ein/li~sse von Temperatur, Chloramphenicol (CAP; bei 220:1 mg/ml; bei 2o: 0,5 mg/ml) und Dauerlicht au/ die Aktivitgt der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH), RibulosediphosphatCarboxylase (RuDPCO), ShikimisSure-Dehydrogenase (SSDH) und den Proteingehalt in Sprossen, die etwa das ]eweil8 md~fliche Maxi~ um ihrer Entwic]~lung erreicht haben

Enzymbildungin Roggenkeimlingen

349

amphenieol immer mit einem verringerten Proteingehalt einhergeht, wird ihre spezifisehe Aktiviti~t durch den IIemmstoff sehr drastiseh erhSht. Das Licht vermag nicht die yon der K~lte ausgefibte VerzSgerung der Bildung yon Ribulosediphosphat-Carboxylase aufzuheben, allerdings wird ihr Anstieg such bei tiefer Temperatur durch Belichtung vermehrt. Dementsprechend liegt aueh die Aktivit~t der Glueose-6-phosphatDehydrogenase nach Aufzueht bei 20 im Licht zwar knapp unter der entsprechenden Dunkelkontrolle, die Differenz bleibt jedoch nahezu vernachl~ssigenswert gering. Sehon eher pri~gt sich ein geringer Unterschied zwischen Licht- und Dunkelanzueht bei Keimlingen aus, die bei der tiefen Temperatur aueh noch mit Chlorsmpbenieol behandelt wurden. Diskussion Die Embryonen trockener Samen sind in den bisher untersuchten F~llen (z. B. BART~LS,1960; KOTZ~u. LATZKO,1965; F]~IWRAB]~D,1965) bereits in betr/iehtlichem Umfang mit Enzymen des Grundstoffwechsels ausgestattet. I~eine Photosyntheseenzyme werden in dem frfihen embryonalen Zustand abet noch nicht gefunden, und dss Wachstum erfolgt rein heterotroph unter Verwertung gespeieherter oder aus N~hrgeweben bezogener Reservestoffe. Erst im Laufe der Keimlingsentwicklung wird mit der Ausbildung photosynthetischer Enzyme, unter denen auch die hier untersuchten Fermente des Cslvin-Zyklus yon Bedeutung sind, der Ubergang zur Autotrophie eingeleitet. Zu den Bedingungen, die Einflu~ auf die Bildung dieser Enzyme haben, geh6rt natfirlieh die unmittelbsre Beliehtung der Pflsnzen. Fiir die Induktion der Fermente des Cslvin-Zyklus ist eine Lichteinwirkung - - im Gegensstz zur Chlorophyllsynthese und Granabfldung bei diesen Keimlingen - - jedoch nicht notwendig; denn selbst die Ribulosediphosphat-Carboxylase, die als spezifisch ffir den Calvin-Zyklus anzusehen ist, tritt such bei der Keimung im Dunkeln nur wenig spgter sls bei Belichtung suf. Das sehlieBt allerdings nieht sus, dal~ das frfihere Auftreten der Ribulosediphosphst-Csrboxylsse bei Anzucht im Lieht darauf beruht, dab das Licht unter diesen Bedingungen die Genaktivierung ffir diese Enzyme bewirkt, wiihrend sie im Dunkeln in etwss welter fortgesehrittenem Stadium such durch andere Faktoren ausgelSst werden kann. Jedoeh wird die Bfldung der Photosyntheseenzyme dureh tiefe Temperatur selbst trotz Belichtung unterdriiekt. Ffir die Kontrolle der Synthese der betrachteten Enzyme des CslvinZyklus sind somit in diesem Falle vor dem Lieht noch andere Faktoren ma/]geblieh, die dessen f6rderndes Eingreifen erst gestatten miissen. Seine f6rdernde Wfl'kung dfirfte das Licht fiber eine selektive Besehleunigung der gesamten Chloroplastenentwieklung susfiben (vgl. Diskussion bei FEIERABENDU. 1)IRSON, 1966).

350

J. FEIEI~ABE~D :

Das Vorhandensein typiseher Photosyntheseenzyme wie Ribulosediphosphat-Carboxylase in etiolierten Keimlingen finder eine Parallele darin, dab in diesem Zustand in den Proplastiden bereits ohne Belichtung Thylakoide ausgebildet sind. Die Beobachtung, da~ dureh Chloramphenicol die Synthese yon Enzymen des Calvin-Zyklus nnd die Thylakoidbildung gleicherma~en stark und selektiv gehemmt werden, sprieht zus~tzlich daffir, dab sich diese lSslichen Photosyntheseenzyme nieht im Bereieh des ProlamellarkSrpers befinden, sondern im fibrigen Stromabereich gebildet werden oder sogar mit der Thylakoidbfldung in einer gewissen Korrelation stehen, lqach I~UDOCKet al., 1964 wird bei Chlamydomonas ebenfalls die Bfldung von Thylakoiden und yon Photosyntheseenzymen (aueh Ribulosediphosphat-Carboxylase) in gleicher Weise unterdrfiekt. MiL dem Auftreten der Ribulosediphosphat-Carboxylase w~hrend der Keimung lie~ sich das besondere Verhalten der Glucose-6-phosphatDehydrogenase in Zusammenhang bringen. Es konnte eine Reihe von Argumenten daffir beigebracht werden, dab ein urs~ehlicher Zusammenhang zwisehen dem Auftreten der Ribulosediphosphat-Carboxylase bzw. des yon ihr reprgsentierten Enzymsystems des Calvin-Zyklus und einer Verminderung in der Bildung yon Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase besteht: 1. In der Normalentwicklung ~ r d der Ans~ieg der Glueose-6phosphat-Dehydrogenase immer dann verringert, wenn die Ribulosediphosphat-Carboxylase auftdtt, bei Belichtung entsprechend 24 Std eher als im Dunkeln. 2. Das Naehlassen der Synthese der Glucose-6phosphat-Dehydrogenase kann nicht durch N~hrstoffmangel verursaeht sein, sondern die Hemmung is~ spezifisch nur gegen dieses Ferment ge. richter. Andere nicht an der Photosynthese betefligte Enzyme sind nicht betroffen; nieht einmal die 6-Phosphoglucons~ure-Dehydrogenase zeigt das gleiehe Verhalten. 3. Wenn die Bildung der RibulosediphosphatCarboxylase z.B. durch Wachstum bei tiefer Temperatur oder Behandlung mit Chloramphenicol selektiv unterdrfiekt oder hinausgezSgert wird, vermag die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase durchaus unbehindert fiber ihren normalen Wert anzusteigen. Sie kann die hShere Aktivits aber nur erreiehen, wenn die K~lte vor dem Auftreten der Ribulosediphosphat-Carboxylase einwirkt. 4. Andere Hemmstoffe der I~NS- und Proteinsynthese, welche die Ribulosediphosphat-Carboxylase nicht so komplett und selektiv unterdrficken wie das Chloramphenicol, lassen auch die Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase nieht in vergleiehbarer Weise fiber ihr normales Niveau ansteigen. Eine Fortdauer der intensiven Synthese von Glueose-6-phosphatDehydrogenase wird somit immer dann mSglieh, wenn die Bildung der Ribulosediphosphat-Carboxylase verhindert wird. Das legt die Sehlufifolgerung nahe, da6 im Zuge oder als Folge des Auftretens des Enzym-

Enzymbildung in Roggenkeimlingen

351

systems des Calvin-Zyklus Faktoren wirksam werden, die eine weitere Synthese von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase hemmen. In den Mechanismus, wie die tiefe Temperatur so bevorzugt in die Bfldung yon Photosyntheseenzymen eingreift, ist noeh wenig Einsieht m5glieh. KLEIN, 1960 berichtet, daB die normale Thylakoidanordnung und Granabildung bei Beliehtung etiolierter Keimlinge dureh tiefe Temperatur gestSrt wird. Das kSnnte in diesem Zusammenhang for eine spezielle Beeintr/~ehtigung der Plastidenentwicklung im Vergleieh zum iibrigen Waehstum sprechen, das ja keineswegs durch die K/fire verhindert wird. Sehon mehr Einbliek ergibt sich in die spezifisehe Wirkungsweise des Chloramphenicols. Aueh bei Bakterien f i b t e s reeht untersehiedliche Hemmwirkungen gegen/iber verschiedenen Enzymen aus. Bei E. coli werden neu induzierte Enzymsynthesen gegeniiber bereits ablaufenden bevorzugt herabgesetzt (SYPHEI~D et al., 1962; PAIO]~N, 1963); auch bier bleibt z.B. die Aktivit/~t der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase unbeeinflul~t. F/ir pflanzliche Zellen gibt es eine Reihe yon Hinweisen, dub das System der Proteinsynthese in den Plastiden dem Hemmstoff gegenfiber empfindlicher ist als im Cytoplasma. Dafiir sprieht schon die im vorangehenden dargestellte starke Beeintr/~chtigung der Plastidenentwicklung, wor/iber in vergleichbarer Weise bereits yon ROSSNER, 1960 U. D6~EL, 1963 nach Behandlung mit Streptomycin bzw. Chloramphenicol yon hSheren Pflanzen berichtet wird. Bemerkenswer~ ist, dab auch bei Euglena photosynthetische Enzyme der Chloroplasten aber nieht Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in ihrer Synthese gehemmt werden und das Wachstum nur bei autotropher Kultur durch Chloramphenicol vermindert wird (S~f~LLI~et al., 1963). Welter ffihrt ferner die Angabe yon PX~TmER, 1965, dab der Aminosiiureeinbau in beliehtete Chloroplasten wesentlich stiirker durch Chloramphenicol gehemmt wird als tier Einbau in Cytoplasmafraktionen. Eine besonders starke Stfitze findet die obige Annahme aber in der Beobaehtung yon EISENSTADT U. B~AW~I~MAN, 1964, dab der Amhms/~ureeinbau an Chloroplastenribosomen yon Euglena durch Chloramphenicol deutlieh gehemmt wird, wahrend die cytoplasmatischen Ribosomen bei den verwendeten Konzentrationen gegeniiber dem Hemmstoff unempfindlieh sind. Unstimmig bleibt dann allerdings, warum die NADPTriosephosphat-Dehydrogenase nach MARGULI~S, 1964 dureh Chloramphenicol nieht beeinfluBt wird, obgleieh sie naeh H~BER et al., 1963 wie die Ribulosediphosphat-Carboxylase in den Chloroplasten lokalisiert ist. Naeh den Befunden der vorliegenden Arbeit gibt es in der Entwieklung der Roggenkeimlinge offenbar einen Regulationsmeehanismus, durch den beim Auftreten der Enzyme des Calvin-Zyklus die weitere Synthese des Eingangsenzyms des oxydativen Pentosephosphat-Zyklus unterdriiekt wird. Ffir den biologischen Sinn einer derartigen Regulation bietet sieh die im folgenden dargestellte Deutung an. Gerade in Phasen starken

352

J. FEIERABEND :

Wachstums benStigte Intermedis wie Ribose-5-phosphat (Nukleinsi~uren, Cofaktoren) oder Erythrose-4-phosphat (aromatische Aminosi~uren, Lignin, Anthocyan) lassen sich sowohl aus dem reduktiven wie aus dem oxydativen Pentosephosphat-Zyklus ableiten. Neben einer laufenden und produktionsfiihigen Photosynthese kann daher in dieser Hinsicht ein zus~tzlieher oxydativer Pentosephosphat-Zyklus als nieht unbedingt notwendig angesehen werden. Dabei w~ren zwei Voraussetzungen zu efffillen, deren Nachweis erst noeh zu erbringen ist: a) Die betreffenden Produkte m/issen sich in ausreichendem M a ~ aus dem Ablauf der Photosynthese abziehen lassen, b) Dabei m/issen die entspreehenden pools kommunizieren; denn die Chloroplastenmembran ist nieht fiir alle Metabolite gleich durchl/issig. So erweist sie sich nach HV.BEI~u. SANTAI~IUS,1965als eine PermeabilitEtsschranke fiir das bei der Photosynthese gebildete NADPH~. Daher sollte dem oxydativen Pentosephosphat-Zyklus eine wesent]iche Rolle bei der Lieferung yon reduziertem NADP im cytoplasmatischen Bereich bleiben, die nicht yon der Photosynthese fibernommen werden kann. Da aber der Calvin-Zyklus keine Alternative bei der Produktion yon I~ADPH~ bietet, steht diese im Zusammenhang mit der betrachteten Vermindertmg des oxydativen zugunsten des reduktiven Pentosephosphat-Zyklus nicht zur Diskussion. Unter diesen Gesichtspunkten ist der oxydative PentosephosphatZyklus vorwiegend in heterotrophen Ern~hrungszust/inden unentbehrlieh als ein,,Ersatz" der Photosynthese zur Lieferung der fraglichen Zwisehenprodukte und kSnnte in autotrophen Phasen wieder reduziert werden, da er dutch den reduktiven Pentosephosphat-Zyklus abgelSst wird, Eine derartige Deutung wird bestiirkt dureh Befunde yon HUT~, 1965, dab die Aktivit~t der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bei Chlorella unter heterotrophen Kulturbedingungen betri~chtlich zunimmt, wghrend sie bei der obligat autotrophen Chlamydomonas eugametos nur /iuBerst gering ist. Die Fermente des oxydativen Pentosephosphat-Zyldus diirften zu der spezifischen enzymatisehen Ausrfistung gehSren, die eine Pflanze erst zu heterotrophem Wachstum befiihigt. Da das Auftreten des Enzymsystems des Calvin-Zyklus, ohne schon seine Funktion ausfiben zu kSnnen, auch in den etiolierten Roggenkeimlingen zu der beobachteten Unterdrfickung der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase ffihrt, wird der Ubergang zur Autotrophie obligat efforderlieh. Offen bleibt die Frage naeh dem Meehanismus der aufgezeigten Regulation. Dabei w/~re zu pr/ifen, wie weit sich die an Mikroorganismen gewonnenen Vorstellungen aueh auf die Regulation der Enzymbildung bei hSheren Pflanzen anwenden ]assen. In diesem Falle sind sehon deshalb kompliziertere Verh/iltnisse zu erwarten, weft in der Pflanzenzelle mindestens mit zwei genetisehen Systemen yon gewisser Selbstgndigkeit zu rechnen ist: der DNS des Kerns und der Plastiden (vgl. GIBOl~u. GRANICK, 1964; STUBBE, 1966). Ebenfalls noch ungekl~rt ist, ob das beobachtete

Enzymbildung in Rogge~keimlingen

353

R e g u l a t i o n s s y s t e m eine Eigenheit der u n t e r s u c h t e n Keimlinge ist oder bei h6heren P f l a n z e n weitere Verbreitung zeigt. Meinem hochverehrten Lehrer, Herrn Professor Dr. A. Pmso~, danke ich ffir die Anregung zu dieser Arbeit und die Anteilnahme an ihrem Fortgang. Fraulein Dr. CItR. BERGER sei fiir die Anfertigung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen gedankt. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft und der Akademie der Wissenschaften zu G6ttingen verdanke ich apparative Beihilfen.

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