TRICHINOSE EXPERIMENTALE-I. CINETIQUE PHENOMENES D’HYPERSENSTBILITE RETARDEE LA SOURIS CBA ET LE RAT WISTAR”

DES CHEZ

A. VERNES, F. FLOC’H, J. BIGUET et R. TalLLIEZt

Dept. de Biologie AppliquCe, Inst. Univ. de Technologie Citt Scientifique, Villeneuve D’Ascq, France (Requ le

I4 jltin 1973;

corrigi

Ie

30 tna~s 1974)

R&ume-Verses A., FLOC’H F., BIGUET J. et T~ILLIEZ R. 1975. Trichinose experimentale-I. CinCtique des phtnomknes d’hyp_rsensibilitC retard&e chez la souris CBA et le rat Wistar. International Journal ftir Parasitology 5: 63-70. L’hypers-nsibilitt retardCe (H.S.R.) a Ctt CtudiCe de faGon cinCtique au tours de la trichinose expirimentale chez des souris CBA et des rats Wistar E.O.P.S., par le test d’inhibition de l’etalement des macrophages. L’H.S.R. a CtC apprCciCe en relation avec la dose infestante, les modifications quantitatives des cellules pCritonCales, les antigtnes h8te-parasite, et sous I’angle de I’adaptation parasitaire. II est dCmontr6: (I) que 1’H.S.R. apparait d& le 7&me jour chez la souris; (2) qu’elle est fortement deprim&e au 14eme jour; (3) qu’elle diminue progressivement pour disparaitre au 4eme mois; (4) que la dose infestante peut influer sur son intensitC dans de faibles proportions et au debut de son apparition; (5) qu’elle nc semble pas affectee par les antigknes communs hate-parasite; (6) qu’elle parait inversement proportionnelle B l’adaptation parasitaire. Tr& vraisemblablement dCclenchCe par les mties larvaires 1’H.S.R. doit jouer un r8le important dans I’immunite envers T. spiralis. MOTS CLEFS:

adaptation

T.

souris CBA; rat Wistar; hypersensibilitt

spiralis;

retardCe; immunitC cellulaire;

parasitaire.

Abstract-VERNES A., FLOC’H F., BIGUETJ. and TAILLIEZR. 1975. Experimental trichinosis-l. The course of delayed hypersensitivity in the CBA mouse and Wistar rat. International Journal for Purasitology 5: 63-70. The dynamics of the development of delayed hyp:rs-nsitivity (D.H.) in the CBA mouse and the Wistar rat experimentally infected with trichinosis was studied by means of macrophage inhibition in relation to the following, the level of infestation, variations in the numbers of peritoneal cells, host¶site antigens, and the level of adaptation of the parasite. The study demonstrated that: (I) D.H. appeared by the seventh day following introduction of the parasites; (2) it was depressed by the 14th day; (3) it decreased progressively and disappeared by the fourth month; (4) it was influenced to a certain extent by the level of infestation, but only at the beginning of the experimental disease; (5) it did not seem to be affected by host-parasite antigens; (6) it seemed inversely proportional to the level of the parasitic adaptation. D.H. is probably related to the release of antigens by the first moults of the larvae and it might play an important role in the establishment of immunity against T. spiralis. INDEX

immunity;

KEY WORDS:

T.

spiralis;

CBA mouse;

Wistar rat; delayed

hypersensitivity;

cellular

parasitic adaptation.

INTRODUCTION

*Travail de I’UnitC INSERM U 42 d’Immunochimie parasitaire (Directeur: Professeur Jean Biguet). Ce travail fait I-objet d’un contrat libre de I’INSERM accordi en 1972. TAvec la collaboration technique d’Annick Wattez et de Jest Barrois. Correspondance: Professeur AgrCgC Alain Vernes, Dtpartement de Biologie AppliquCe, lnstitut Universitaire de Technologie CitC Scientifique - Sac Postal N’ 5, 59650, Villeneuve d’Ascq, France.

DANS une premiere

Ctude rCalisCe chez le cobaye par intradermo r&action (I.D.R.) et inhibition de la migration des macrophages (I.M.M.) et chez la souris CBA par le test d’inhibition de I’Ctalement des macrophages (T.I.E.M.), nous avions montrC que I’hypersensibilitk retardCe (H.S.R.) Ctait prCsente 60 jours aprts I’infestation expkrimentale, moment 63

A. VERNES, F. FLOC’H, J. BIGUET et R. TAILLIEZ

64

qui avait ktk choisi pour sa recherche (Vernes et al., 1972~). Ces rksultats prkliminaires semblaient pour le moins contradictoires avec ceux de la littkrature et en particulier avec ceux rapport& par Kim (I 965) et Catty (1969). Pour ces auteurs l’H.S.R. n’est dktectable que pendant une t&s b&e pkriode dkbutant au plus t8t le 4kme jour suivant I’infestation, qui se termine au plus tard vers le IO&me jour de la maladie expkrimentale. L’Ctude cinktique de 1’H.S.R. chez des animaux difftkemment susceptibles a Schistosoma matwoni nous apprenait que celle-ci, varie dans le temps, en fonction du cycle biologique du parasite et de son adaptation B l’hate (Vernes et al., 1972a, b). Ces differents rCsultats now ont conduit g entreprendre une Ctude cinCtique de 1’H.S.R. chez le rat Wistar et la souris CBA, que nous rapportons ici.

MATERIELS 1. Souche de Trichinella

ET METHODES spiralis

La souche de T. spiralis est entretenue par passages successifs sur des rats miles de souche Wistar. Les animaux sont sacrifits apr&s un mois ou plus d’Cvolution et les larves enkystCes r&cup&es dans les muscles servent d’une part B l’infestation des animaux expCrimentaux et d’autre part g la prtparation de I’extrait antigknique utilisC dans nos tests. Paralltllement cette mCme souche a et6 entretenue plusieurs mois par passages sur souris CBA afin de permettre I’Ctude du r61e Cventuel des antigknes communs hBte-parasite (Capron et al., 1968). 2. Animaux Nous avons utilisC pour cette ttude 241 souris ‘pathogenfree’ de souche CBA (C.S.E.A.L.-C.N.R.S., 45Orleans la Source, France) pesant de 20 k 25 g et 47 rats Wistar (C.E.S.A.L., 55-Vigneul sous Montmedy, France) pesant de 100 g 120 g. Ces animaux se rkpartissent de la faGon suivante: 40 souris ttmoins ont permis de dkterminer le nombre total de macrophages et de lymphocytes pkritontaux: 15 d’entre elles ont permis de fixer I’index tCmoin d’ttalement des macrophages en prtsence de IO pgN d’antigkne T. spiralis. 76 souris ont CtC infest&es chacune par 30 larves de T. spiralis provenant du cycle entretenu sur rat et sent regroup&es dans les series A, B, C, D, E, et F sacrifiCes et test&es respectivement aux 4tme, 7*me, 14tme, 28tme, 6O&me et 12O&me jour de la maladie expCrimentale. 44 souris ont CtC infestCes chacune par 30 larves de T. spiralis provenant du cycle entretenu sur souris CBA et sont regroup&es en trois skies G, H et I CtudiCes respectivement aux 7tme, 146me et 288me jours de la maladie exptrimentale. Ces animaux Ctaient plus particulitrement destinCs B I’Ctude du rBle +entuel sur 1’H.S.R. des antigenes communs hbte-parasite. 15 souris ont Cte infestCes chacune par 10 iarves de T. spiralis provenant du cycle entretenu sur souris et sacrifiCes le 7cme jour suivant l’infestation (s&ie J). 15 souris ont reCu chacune 100 larves de T. spiralis provenant du cycle entretenu sur souris et sacrifiCes le 7&me jour suivant l’infestation (s6rie K).

I.J.P. VOL. 5. 1975

21 souris infesttes chacune par 30 larves de T. spiralis provenant du cycle entretenu sur souris et sacrifiCes le 28tme jour suivant I’infestation (sCrie L). 3 1 souris infesttes chacune par 250 larves de T. spiralis provenant du cycle entretenu sur souris et sacrifiCes le 28tme jour suivant l’infestation (sCrie M). Ces quatre dernitres sCries Ctaient plus particulierement destinCes h I’Ctude du r8le Cventuel de la dose infestante sur 1’H.S.R. IO rats tCmoins ont pzrmis de dCterminer les donntes numtriques concernant les lymphocytes et macrophages pCritonCaux, ainsi que l’index tBmoin d’ktalement des macrophages en prCsence de IO figN d’antigkne de T. spiralis. 37 rats infest& chacun par 100 larves de T. spiralis provcnant du cycle entretenu sur rat, rCpartis en 4 stries A, B, C et D CtudiCes respectivement aux 7&me, 14&me, 28eme et 6&m: jour suivant l’infestation. 3. Infestations Toutes les infestations ont CtC rkalistes par canulation stomacale B partir de larves vivantes obtenues par digestion chlorhydropeptique de donneurs parasitks depuis un mois ou plus, salon la technique d&rite par Larsh & Kent (1949). 4. &fruit

anti&ique

L’extrait larvaire de T. spiralis est prCpar& a partir de rats Wistar massivement infest&. Apr& depecage, les animaux soat broyCs puis soumis g digestion artificielle dans un pilieu de pepsine chlorhydrique durant 18 h B 40°C. Apt& digestion, les larves subisscnt plusieurs filtrations actives sur des filtres de nylon dont la dimension des pores est de 60~. Plusieurs lavages par dkcantation en milieu physiologique tampon&, g 37”C, sont nCcessaires pour eliminer les dCbris tissulaires de l’hate. La prCparation de l’extrait a lieu soit directement sur le matCrie1 vivant soit sur le mattriel conservC B --40°C. L’extraction s’opere en milieu physiologique tamponnC g pH 7 aprks homogtneisation des vers (1 volume de larves pour 5 volumes de tampon) dans un broyeur de Thomas. Apres centrifugation, le surnageant est soit concent& par sous pression et conservk B I’Ctat congelk ti dialyse 30°C jusqu’8 son utilisation, soit dialyst contre de l’eau distill&e puis lyophilist. L’extrait lyophilisk est avant usage titrt en azote total selon la methode de Dumas et test6 par immuno~lectrophorkse vis B vis d’un hyperimmunskrum de reference prkpart sur lapin. 5. Test d’inhibition de I’Ptalement des macrophages (T.I.E.M.) La technique employCe ici, directement inspike de celled&rite par Fauve & Dekaris (1968), est la mCme que nous avons utilisCe dans nos p&&dents travaux (Vernes et al., 1972a). L’index d’ktalement des macrophages (I.E.M.) a CtB calcult pour la dose de IOpgN ml d’antigene T. spiralis, dose dkterminte par une Ctude prkalable. Chacun des animaux de I’expkrimentation a BtC Ctudik individuellement. 6. Numkations

cellulaire&

Elles ont CtC effectuees selon des crit&-es pr&Cdemment d&finis (Vernes et al., 1972~). II n’a iti tenu compte que des lymphocytes et des macrophages. Les chiffres rapport& ici ne concernent done pas les auk-es types

I.J.P. VOL. 5. 1975

Cinetique

des phknomtnes TABLEAU

I-TRICHINOSE

Nb SCrie Temoins TCmoins A B c D E F G H

Nb d’animaux

Nb de jours

25 15 14 13 15 15 13 6 15 I4 15

Ag

I

d’hypersensibilitk

retardke

EXPERIMENTALE

total de cellules pCrito&ales I06

chez la souris CBA et le rat Wistar

DE LA SOURIS CBA

Lymphocytes

Index d’ktalement des macrophages

Macrophages

\~’106

106

3.60

-

I .52

2.08

4 7 14 28 60 120 I I4 28

i.79NS

2.83 3.24 7.40 .6.58 5.12 5.57 3.10 6, I9 7.57

65

98.7 96. INS 47.2+++ 82,4+ + 68.3+++

\,04NS I .07

2.17~~ 5.58+++ 5,11+++ 3.94+ + 4.17++ 1.87~~ 4.19+++ 5.32+++

I ,82~~

1.47tYs 1.18~~

69,2+++ 108.1~~ 50.5+++ 86.4+ + 65,5+++

1.40NS 1.23~s 2.00+ 2.25++

Rtsultats globaux obtenus chez la souris CBA en fonction-de la duke de I’infesta?ionxpCrimentale, concernant les variations du nombre des lymphocytes et macrophages pkritonkaux et de l’index d’ktalement des macrophages. Tous les animaux, hormis les tkmoins, ont ttt infest& chacun par 30 larves infestantes de T. spiralis. NS: non significatif. + 0.01 < P < 0.05. ++ 0.001 / P c 0.01. +++ P ‘1 owl.

I25

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100 --,

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+___ I' -__-______ 25 -~'\\\__,"

_________....----

Nombre

CinCtique

de I’index

de jours

FIG. 1. Trichinose expkrimentale de la souris CBA. d’etalement des macrophages (I.E.M.) et du nombre de lymphocytes macrophages pkritorkaux. - Jours d’Ctude des diffkrents paramttres. - ~ Index d’ktalement des macrophages. - - - - - - Nombre de macrophages p&ritonkaux y 106. 106. Nombre de lymphocytes pCritonCaux

cellulaires tels que polynuclCaires philes, ou les cellules basophiles.

tosinophiles

et neutro-

et de

les 4kme, 7tme, 14eme, 28&me, 6Okme et 120kme jours suivant I’infestation expkrimentale des animaux.

7. Tests sratistiques

Tous les resultats rapport& dans cette Ctude ont &Z soumis g I’analyse statistique. Les comparaisons entre groupes ont et6 effect&es par analyse de variance et le test de Student. Des tests de normalitt ont kte rCalisCes pour vtrifier la distribution gausienne des r&ultats. 8. Avertissement Par souci de simpliciti: et pour ne pas alourdir le texte, nous nommerons J,, J,, J,,, J,,, J,,, .I,,,, respectivement

RESULTATS A. Tricfritlosr

expPritnerltale

I. CinPtiyue de 1’H.S.R.

de la souris CBA

(Tableau

1, Fig. I)

Les rksultats obtenus sur les skies A B F et par rapport aux tkmoins sont synthCtisCs par le Tableau 1 et la Fig. I.

66

A. VERNES,

F. FLOC'H,

L’1.E.M. est significativement abaisse chez les animaux infest& d&s le 7eme jour suivant I’infestation (P e: l.lO-“). A J,, 1’I.E.M. remonte sensiblement mais differe cependant de celui des temoins de facon significative (P ‘.c I x IO-?). L’index diminue a nouveau au J?* (P -I 1 v 10eR), au J,, (P .._ I ‘: iOw7) pour retourner a la nortnale h J,,,,, date a laquelle il ne differe plus significativement de celui des temoins. La remontee importante du l4eme jour a ete retrouvee a plusieurs reprises: chez les animaux de la serie H, et dans d’autres experimentations faisant l’objet d’un autre travail (non pubiie). C’est B J, que 1’H.S.R. exploree par ic T.I.E.M. est la plus importante: l’index moyen observe a cette date differe significativement de ceux des groupes C, D et E a un risque tres faible (P compris entre I h IO-’ et

I \ 10-q. De m&me les index observes aux Jix et J,;,, sont significativement differents de celui de J,.$ (P c. 0.02).

J. BIGU~Tet R.

1.J.P. VOL. 5. 1975

TAILLIEX

A J,,: aucune difference significative n’est retrouvee entre les deux series d’animaux infest& par 30 ou 250 larves. (b) Eu ce qw’ comwm Ies i.vmphocytes. A J i : les animaux infest&s par IO iarves presentent un nombre de lymphocytes peritoneaux legerement supitrieur a celui des temoins ou des animaux infest& par 30 ou 100 larves (P compris entre 0.05 et 0.02). A J,,: les animaux infest& par 250 larves presentent un nombre de lymphocytes peritoneaux tres significativement superieur a celui des animaux infest& par 30 iarves (P ‘. I )~ IO’ “). (c) E/z w qui co~rcmw les i}i~~c~opJ?o~f,~.A J,: aucune difference n’est relevee entre les temoins et les differentes series infestees. A J,,: le nombre des macrophages peritoneaux des souris infestees par 250 larves est tres significativement superieur a ceiui des souris infestees par 30 larves (P .. 1 > IO-*).

2. Mod$icatiotu quarrtitatives des cell~rlc~spPritokalcs (Tabkealc I rt F&. 1)

(u) Lymphocytes. Le nombre de lymphocytes peritoneaux des animaux infest& augmente signifi~ativement a partir de J,, et reste augment& durant tome le duke de i’exp~rin~entation (P compris entre 1 x IO-’ et 1 Y IO-“). Les chiffres observes pour les differents groupes (Ca F) ne different pas significativement entre eux. (b) Macrophagrs. Le nombre de macrophages peritoneaux est rest& non signiticativement different de ceiui des temoins pendant toute la duree de I’experimentation.

L’etude a 6te me&e aux JTr J,Z et J,, chez dcs souris CBA infestee par 30 iarves chacune, ~rovenant d’un cycle entretenu depuis plus de trois mois par passages successifs sur souris CBA. La comparaison des I.E.M. de ces trois groupes avec les I.E.M. correspondants des skies B, C et D infest&es dans les memes conditions mais par des iarves provenant du cycle entretenu sur rat ne permet pas de mettre en evidence de difference significative. Les chiffres obtenus aux ditferents moments sont extremement voisins.

Cette etude a et& faite a deux moments de la cinetique: Jj et J,,. (a) Etr cc qui co~rcc~m~1’H.S. R., O/I wmal’que. A J: : un index plus faible chez les animaux infest& par IO larves (P cc I r 10-j). II n’y a pas de difference entre les souris infestees par 30 ou 100 larves.

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2.

Trichinose exptrimentale du rat Cinetiquc de l-index d’ktalement dcs macrophages (I. E.M.) et du nomhre des lymphocytes et d:: mlcrophagcs pCritonCaux. + Jours d’etude des differents pwrmetres.

_ ---Index d’ttalm:nt des macrophages. - - - - - - Nombrc de macrophag:s ptritoneaux --.

Nombrc

d3 lymphocytes

pCriton&aux

IO”.

10”.

L’1.E.M. n’est signitkativement abaissk que I4 jours apres I’infestation (P --‘_I x lo-“). A .I,,, ii remonte mais reste signi~~ativen~el~t plus has que celui des temoins (P c. f x IO“). A J,$,,, il est revenu a la normale. La difference entre les deux index des J14 et J,, est significative (P X: I I. IO- ‘). 2. Modf,‘ic.atiotls quutrtitutiws (N) L~wrph0cyte.s. Ceux-ci

des cellr~lcs pc%touiales sont

significativement

I.J.P. VOL. 5. 1975

Cinttique

des phCnomenes TABLEAU

Strie

Nb d’animaux

RCsultats globaux variations du nombre les animaux, hormis NS: non significatif. + 0.01 < P < ++ 0.001 C’ P c +++ P