Planta Med. 57 (1991) 371
Allicin-Freisetzung aus getrocknetem Knoblauch (A ilium sativum): Eine einfach durchzuführende HPTLC-Simultanbestimmung von Allicin und Ajoen in Knoblauchpulver und daraus hergesteliten Fertigarzneimitteln Formation of Allicin from Dried Garlic (A ilium sativum): A Simple HPTLC Method for Simultaneous Determination of Allicin and Ajoene
Gabriele Blania1 und Bernd Spangenberg"2 1 2
E. Scheurich Pharmwerk GmbH, D-7604 Appenweier, Federal Republic of Germany Address for correspondence: Dr. Bernd Spangenberg, Am Rittweg 10, D-7600 Offenburg, Federal Republic of Germany
Received: April 2, 1990
Abstract In garlic (Allium sativum L.) the enzyme alum lyase catalyzes the cleavage of alliin into allicin which reacts further to furnish ajoene. A simultaneous determination of allicin and ajoene is introduced which, in contrast to the determination of alliin only, allows for the testing of the activity of alum lyase. It can be demonstrated that at a pH value of less than 3 the enzyme produces only small amounts of allicin. For this reason preparations from garlic should be administered only as enteric-coated formulations.
0 NH2 H2C_'LCO0H ALlinase
2
H2C
NH2
H2CS
-._,S0H
H2C
+
H2C''COOH
,_SS—.CH2 +
H20
AlLicin
o II
H0
2 H 2cs,.CH2
—
H2C__SOH
Key words
SCH2
Alliurn sativurn, allicin formation, ajoene
formation, simultaneous determination of allicin and
I
I
SCH2
S.._CH2
ajoene.
Einleitung
+
-CH2
-H0
OH
Als ,,Arzneipflanze des Jahres 1989" ist
Knoblauch in den Mittelpunkt des allgemeinen Interesses gerUckt. Das hat sich auch in der Fachliteratur niedergeschlagen. Eine gute Ubersicht geben (1) und (2). Als Qualitätskriterium für das aus der Droge bereitete ,,KnoblauchTrockenpulver" und letztlich auch für die daraus hergestellten Fertigarzneimittel ist nach derzeitigem Wissensstand in erster Linie der Allicin-Gehalt maBgebend.
+
I
r_SS_12
SCH2 (E)- 1 trans - Ajoen
0 (Z) -1 c/s -Ajoen
Abb. 1 Formelschema für die Bildung von Allicin und Ajoen in
Allicin ist nicht genuin in Knoblauch vorhanden, sondern wird durch das Enzym Alliinase aus Alliin gebildet (Abb. 1). Daraus ergibt sich, daB eine reine Alumbestimmung ohne Funktionsuberprufung des Enzyms Allii-
Knoblauchpulver (14).
Heruntergeladen von: National University of Singapore. Urheberrechtlich geschützt.
in Dried Garlic and Garlic Preparations
372 Planta Med. 57(1991)
Die Versuche einer Wertebestimmung von Knoblauch gehen his ins Ende des vergangenen Jahrhunderts zurUck (2). Eine direkte quantitative photometrische Bestimmungsmethode für Dialkyithiosulfinate wurde zuerst von Nakata beschrieben (5), und von Sekine verbessert
(6). Beide Methoden haben jedoch eine gemeinsame Schwäche: Es werden alle vorhandenen Thiosulfinate erfafit.
Vergleichslösungen Entsprechende LOsungen von Allicin (11) und Ajoen (14): Der Gehalt der gereinigten Referenzsubstanzen berechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des Substanzsignals und der Summe aller Peaks his zur Ldsungsmittelfront.
Versuchsbedingungen Stationare Phase: HPTLC-Fertigplatten. Kieselgel 60 F254 der Fa. Merck Darmstadt.
Mobile Phase: Dichiormethan : Methanol 99: 1, V/V.
Auftragemenge: Die Auftragemengen können ausAbb. 3 ermitteitwerden. Aufgetragenwird strichformig, 7mm. Methode: aufsteigend, Doppeltrogkammer. LaufzeitlLaufstrecke: Ca. 20 Minutenlca. 7 cm.
Die Verfahren wurden deshaib von Michahelles uberarbeitet (7). Er stelite der unselektiven photome-
Die Auswertung erfolgt am Densitometer (Camag TLC-Scanner II) bei 245 nm. Die Gehaltswerte werden Uber einen Peakflachenvergleich ermittelt. Für n = 6 ergaben sich folgende Daten (Dragee mit 235mg Pulver): Mittelwert: 1377,5 .tg Allicin/
trischen Bestimmung eine dUnnschichtchromatographische Abtrennung des Ailicins voran. Obwohl es ihm nicht
Dragee; Standardabweichung: 107,424; Variationskoeffizient: 7,8%.
gelang, Allicin sauber von Methyl-propyl-thiosulfinat abzu-
trennen, kann der sich daraus ergebende Fehier vernachlassigt werden (7).
In der letzten Zeit wurden nun mehrere gaschromatographische Bestimmungsmethoden von Knoblauchpraparaten publiziert (8—10), die jedoch bei allem apparativen Aufwand einen RUckschritt hinter das von Michahelles beschriebene Verfahren darstellen, da in alien Fallen nicht Allicin direkt, sondern verschiedene Abbauprodukte des Allicins bestimmt werden.
Zur HPLC-Bestimmung nach (11) wurde 1 ml der
überstehenden Ethylacetatlosung im Vakuum abgezogen und der RUckstand mit 1 ml Methanol aufgenommen. Die Auswertung erfolgte an einem HP 1090 M mit Photodiodenarraydetektor über die Peakhohe.
Für n = 6 wurden folgende Daten ermittelt: Mittelwert: 1442,5 ig AllicirilDragee; Standardabweichung: 91,044; Variationskoeffizient: 6,3%.
Methodenvergleich: Mitteiwert T-Test: Prüfgrofie 1,131 (Grenze für f 10 mit P = 0,95 2,23). Varianzen F:
Allicin kann jedoch durch neuere HPLCVerfahren in Knoblauch direkt erfaBt werden (11, 12), Auch eine Ajoen-Analytik mittels HPLC wurde publiziert (13). Bei diesen Verfahren wird mit Allicin bzw. Ajoen kali-
briert. Trotz des relativ groBen apparativen Aufwands ist eine Gehaltsvalidierung nicht beschrieben. Auch werden Zweifel an der Reinheit der eingesetzten Standards geäuBert (8).
Test: PrüfgroBe 1,392 (Grenze fürfl = l'2 = 5 mit p = 0,95:5,05).
Untersuchungen zur Freisetzung
von Allicin
MeBreihe A Verschiedene Mengen Knoblauchpu!ver wurden
mit jeweils 1 ml Wasser versetzt, wie beschrieben aufgearbeitet und der Allicingehalt mittels HPTLC bestimmt.
Die präparative Herstellung von Allicin (11) und Ajoen (14) bereitet keine groBen Probleme. So entwikkelten wir — aufbauend auf den schon publizierten DC-Allicinbestimmungen (15, 16)— eine HPTLC-Bestimmungsmethode von Allicin und Ajoen. Es können so his zu 18 Allicin-
und Ajoenbestimmungen auf einer Platte gleichzeitig durchgefuhrt werden. Bei Laufzeiten in der HPLC von Ca. 10mm (11) his über 20mm (12, 13) stelit dies bei Routineuntersuchungen schon eine gewisse Zeitersparnis dar.
Material und Methoden Probenvorbereitung Etwa 100mg Knoblauchpulver werden genau
eingewogen, mit 1 ml Wasser versetzt und nach 15 Minuten (bei 20 C) mit 2 ml Essigsaureethylester Ca. 1 Minute gut geschuttelt. AnschlieBend wird die Probe zentrifugiert, bis eine kiare Losung übersteht.
MeBreihe B Verschiedene Mengen Knoblauchpu!ver wurden mit jeweils 1 ml Darmsaft DAB 9 (pH-Wert = 6.8) versetzt. Aufarbeitung wie unter A.
MeBreihe C Verschiedene Mengen Knoblauchpulver wurden mit jeweils 1 ml HC1 (0,1 N) versetzt. Aufarbeitung wie unter A.
MeBreihe D Freisetzung von A!licin in Salzsäure mit anschlie-
Bendem Wechsel des pH-Wertes. Verschiedene Mengen Knoblauchpulver wurden mit jeweils 1 ml HG! (0.1 N) versetzt. Nach 15 Minuten werden 23,5mg Na3PO4' 1 2H20 zugegeben. Der pH-Wert
stel!t sich auf 6,9 em. Nach 15 Minuten wurde wie unter A: beschrieben aufgearbeitet und der Allicingehalt gemessen.
Heruntergeladen von: National University of Singapore. Urheberrechtlich geschützt.
nase em Knohlauchpraparat nur unzureichend charakterisiert. So kommt für eine einfache Wertebestimmung von Knoblauchformulierungen nur die direkte Allicinbestimmung im Produkt in Frage. Oft ist auch eine Ajoenbestimmung wUnschenswert, denn Allicin reagiert relativ schnell weiter zu Ajoen, dem Lipoxygenase-hemmende und antitumorale Aktivität zugeschrieben wird (3, 4). Wir möchten hier über eine validierte Gehaltsbestimmung von Allicin und Ajoen berichten, die unserer Meinung nach eine ideale Wertebestimmungsmethode von Knoblauchformulierungen ermoglicht.
Gabriele Blania and Bernd Spangenberg
Planta Med. 57(1991) 373
Allicin-Freisetzung aus getrocknetem Knoblauch (Allium sativum)
MeBreihe E Verschiedene Mengen Knoblauchpulver wurden mit jeweils 1 ml HG! (0,1 N) 15 Minuten gerilhrt. AnschlieBend wurde der pH-Wert gemessen.
251 1
2
3
MeJ3ergebnisse Es wurden folgende Werte aus den MeBreihen A
his E erhalten:
100 125 150 175
200 225 250 275 300
Mel3reihen A:{ig]
B:Fig]
C:[g]
D:[tgl
928 1071 1265 1439 1555 1760 1946 2110 2246
903 1096 1292 1506 1734 1910
n.n.
102 196 158 235 573
——
——
268 340 660 1280 2109 2497
2177 2397 2630
672
1752 1925 2106
Ens]
E:[pHl Peak 1: Ajoen Peak 2: Diphenylsulfoxid Peak 3: Allicin
1,78
2.06 2,38 2,64 2,84
0
H2CSS2
2,99 3,18
(1)
3,24 3,40
(2)
(3)
Abb. 2 Kalibrationschromatogramm von Ajoen (1), Diphenylsulfoxid (2) und AIlicin (3).
Damit ergeben sich folgende Arbeitsbereiche:
Diskussion Linearität undArbeitsbereich der Bestiminung
Es wurden bekannte Konzentrationen an Ajoen (0,5694.tg4d), Diphenylsulfoxid (0,1248 .tg4tl) und Allicin (0,5096 .tg/i1) in unterschiedlichen Mengen gemeinsam auf eine HPTLC-Platte aufgetragen und vermessen. In Abb. 2 ist em typisches unkorrigiertes Chromatogramm zu sehen. Die gemessenen Flächen der drei Substanzen wur-
den gegen die aufgetragenen .t1 graphisch dargesteilt (Abb. 3).
0,5694 g bis 4,5552 g Ajoen: 0,1248 tg his 0,8736 tg Diphenylsulfoxid: Allicin: 0,5096 ig bis 4,0768 .tg. In diesem Bereich kann Diphenylsulfoxid als Interner oder Externer Standard verwendet werden.
Auf eine direkte Kalibrierung mit Allicin
kanu verzichtet werden, wenn der zu untersuchenden Knoblauchprobe definierte Mengen von reinem (stabilen) S-Allyl-L-cystein-snlfoxid (= Alum) zugesetzt werden, das quantitativ zu Allicin weiterreagiert (17).
Ar'e/ 00
A
Abb. 3 Linearitätsnachweis im Arbeitsbereich von Allicin, Diphenylsulfoxid (DiPhSO) und Ajoen.
45— 40 —
30
H2CS2
All ic
—
Dl Rti0 -
20 —
7
V
10
Q—
-
00
00
I
I 1
2
I
3
I
I .4
5
S Lii
7
8
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Knoblauchpu!ver[mg]
374 Planta Med. 57 (1991)
Gabriele Blania and Bernd Spangenberg
Präzision und Rich tigkeit der Bestimmung
In Abb. 4 sind die gemessenen Spektren einer Probe Ubereinander gelegt. Alle drei Spektren sind je-
Urn die Richtigkeit der Bestimmung zu uberprufen, wurden von den Ajoen- und Allicinsignalen des
Knoblauchpraparates die Remissionsspektren jeweils im Peakmaxirnurn und an den Wendepunkten der Signale aufgenornmen.
weils identisch und belegen damit die Peakreinheit des Ajoen- bzw. Allicinsignals.
Bei der Zulassung von Arzneimitteln wird von der Gesundheitsbehörde zum Nachweis der Richtigkeit einer Bestirnrnung in der Regel eine zweite, von der ersten Messung unabhängige MeBmethode verlangt. Der Allicingehalt des oben genannten Knoblauchpraparates wurde in Arilehnung an (11) mit einer HPLC-Methode uberpruft. Für n = 6 ergibt sich em Variationskoeffizient von 6,3 %. Die Gleichwertigkeit beider Ergebnisse wurde durch einen Fund T-Test uberprUft und belegt. Allicinfreisetzung von Knoblauchpraparaten
Wie oben beschrieben, ist in KnoblauchPulverpräparaten Allicin (und Ajoen) als Substanz rneist nicht enthalten. Erst bei Kontakt mit Wasser wird Allicin enzymatisch aus Alum gebildet. Diese Reaktion ist erfahrungsgemaB nach 10 his 15 Minuten abgeschlossen. Die dazu erforderlichen Arbeitsbedingungen für das Enzym Alliinase wurden erst kUrzlich bestirnmt (18).
Urn die Abhangigkeit des Enzyms vom pH-
Wert der Losung zu untersuchen, ermittelten wir in einer MeBreihe die aus verschiedenen Knoblauchmengen gebildete Allicinmenge nach jeweils 15 Minuten Rekationsdauer
in den Medien Wasser, Darmsaft DAB 9 und Magensaft En m) U.' Cd
CU
tli
U,
UJ
Ci
Ajoen (1)
DAB 9. Das meiste Allicin entsteht in dem Medium Darmsaft. Die Werte für Wasser liegen etwas schlechter.
In Magensaft wird die Reaktion hier his zu Knoblauchmengen Von Ca. 200mg stark unterdrückt, erreicht bei groBerem Pulvereinsatz jedoch die in Wasser bzw. Darmsaft gemessene GröBe. Offensichtlich behindert em saures Medium die Bildung von Allicin! Urn zu überprüfen, ob die Alliinase in Magensaft (DAB 9) reversibel oder ir-
reversibel gehemmt wird, wiederholten wir die MeBreihe in Magensaft, setzten jedoch nach 15 Minuten eine definierte Menge Natriumphosphat zu, urn den pH-Wert des Magensaftes auf einen Wert von pH 7 (entsprechendDarmsaft DAB 9) zu bringen (MeBreihe D:). Eine graphische Darstellung dieser gemessenen Werte im Vergleich zu den Daten der Freisetzung in Wasser (MeBreihe A:) und Darmsaft (Mefireihe B:) zeigtAhb. 5.
Da die Verlaufskurve der Freisetzung in Salzsäure (MeBreihe C:) fast identisch ist mit der Kurve aus MeBreihe D:, kann nur von einer irreversiblen Schadigung durch Magensaft (DAB 9) gesprochen werden. In einer wei-
Cd
teren MeBreihe wurde die pH-Anderung von Magensaft Enm] DAB 9 (pH = 1) nach Zusatz verschiedener Mengen Knob-
I LI.' CU
U,
CI
lauchpulver bestimmt (MeBreihe E:). Der pH-Wert in der Suspension steigt inAb-
Allicin
hängigkeit mit der zugesetzten Knoblauchmenge. Die (3)
Abb. 4 Remissionsspektren von Ajoen (1) und Atlicin (3).
Furiktionsfahigkeit der Alliinase bei groBeren eingesetzten Knoblauchmengen läBt sich damit durch diese beobachtete pH-Wert-Anderung (Denaturierungen im Knoblauch!) hin
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Der Allicingehalt eines Knoblauchpraparates mit 235mg Knoblauchpulverwurde wie im Experimentellen Teil beschrieben bestimmt. Für n = 6 liegt der Variationskoeffizient (ohne inneren Standard) unter 8 %. Dieser Wert ist erstaunlich niedrig, da ja auch Schwankungen der Alliinasetatigkeit erfaBt werden.
Planta Med. 57(1997) _•_
Allicin-Freisetzung aus getrocknetem Knoblauch (A Ilium sativum)
Abb. 5 Freisetzungsuntersuchungen mit verschiedenen Mengen Knoblauchpulver
/ . 1'
MeBreihe A: (—*—*—), Freisetzung in Wasser MeBreihe B: (—0—0—), Freisetzung in Darmsaft
A: vassar-
(DAB 9) Mereihe D: (—X—X—), Freisetzung in 0,1 N HCI. Nach 15 Minuten Wechsel auf Darmsaft.
V
. Oar-ms.
0:
-—
1/7
'3
0 0 100 10 200 20 300 30 400 I
I
I
I
I
rnQ
zu höheren Werten erklären. Eine Anderung des pH-Wertes im menschlichen Magen ist dagegen auch bei Einnahmen von mehreren Grarnm Knoblauchpulver nicht zu erwarten.
Literatur 2
Zusammenfassend zeigt sich, daB die Alliinasa nur oberhaib eines pH-Wertes von etwa 3 optimal arbeiten kann (siehe MeBreihe C: und D: im Vergleich zu MeBreihe A: und B:).
SchluBbetrachtung Urn eine moglichst groBe Wirksamkeit bei Knoblauchpraparaten zu erreichen, ergibt sich in logischer Folge, daB die Verabreichung des Trockenpulvers in Form von Dragees mit magensaftresistentem Uberzug oder die Abfiillung in gehartete Gelatinekapsein die derzeit beste Darreichungsform für die Droge darsteilt. Nur so ist die Al-
liinase vor einer moglichen Denaturieriing durch den menschlichen Magensaft geschutzt. Damit unterbleibt auch
eine eventuelle Reizung der Magenschleimhaut, und die Geruchsbelastigung wird auf em Minimum reduziert. Das im Dünndarm freigesetzte Allicin soilte sofort resorbiert werden und semen Wirkort in hoher Konzentration erreichen (19). Es mufi jedoch unbedingt vermieden werden, daB das ungeschutzte Knoblauchpulver euler Umgebung ausgesetzt wird, deren pH-Wert unter 3 liegt.
Knoblauch (1989) Symposium über die Chemie, Pharmakologie und medizinische Anwendung. Dtsch. Apoth. Ztg. Suppl. 15. Koch, H. P., Hahn, G. (1988) Knoblauch. Urban & Schwarzenberg, München, Wien, Baltimore. Block, E., Iyer, R., Grisoni, S., Saha, C., Belman, S., Lossing, F. P. (1988)J. Am. Chem. Soc. 110,7813—7827.
Reuter, H. D. (1988) Arzneimitteltherapie heute, Phytopharmaka
6
8
10 12 13 14
15 16 17 18 19
Band 1, SpektrumAllium satwum L., Aesopus Verlag. Nakata, C., Nakata, T., Hishikawa, A. (1970)Anal. Biochem. 37,92— 97. Sekine,
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Allicin-Freisetzung aus getrocknetem Knoblauch (A ilium sativum): Eine einfach durchzuführende HPTLC-Simultanbestimmung von Allicin und Ajoen in Knoblauchpulver und daraus hergesteliten Fertigarzneimitteln Formation of Allicin from Dried Garlic (A ilium sativum): A Simple HPTLC Method for Simultaneous Determination of Allicin and Ajoene
Gabriele Blania1 und Bernd Spangenberg"2 1 2
E. Scheurich Pharmwerk GmbH, D-7604 Appenweier, Federal Republic of Germany Address for correspondence: Dr. Bernd Spangenberg, Am Rittweg 10, D-7600 Offenburg, Federal Republic of Germany
Received: April 2, 1990
Abstract In garlic (Allium sativum L.) the enzyme alum lyase catalyzes the cleavage of alliin into allicin which reacts further to furnish ajoene. A simultaneous determination of allicin and ajoene is introduced which, in contrast to the determination of alliin only, allows for the testing of the activity of alum lyase. It can be demonstrated that at a pH value of less than 3 the enzyme produces only small amounts of allicin. For this reason preparations from garlic should be administered only as enteric-coated formulations.
0 NH2 H2C_'LCO0H ALlinase
2
H2C
NH2
H2CS
-._,S0H
H2C
+
H2C''COOH
,_SS—.CH2 +
H20
AlLicin
o II
H0
2 H 2cs,.CH2
—
H2C__SOH
Key words
SCH2
Alliurn sativurn, allicin formation, ajoene
formation, simultaneous determination of allicin and
I
I
SCH2
S.._CH2
ajoene.
Einleitung
+
-CH2
-H0
OH
Als ,,Arzneipflanze des Jahres 1989" ist
Knoblauch in den Mittelpunkt des allgemeinen Interesses gerUckt. Das hat sich auch in der Fachliteratur niedergeschlagen. Eine gute Ubersicht geben (1) und (2). Als Qualitätskriterium für das aus der Droge bereitete ,,KnoblauchTrockenpulver" und letztlich auch für die daraus hergestellten Fertigarzneimittel ist nach derzeitigem Wissensstand in erster Linie der Allicin-Gehalt maBgebend.
+
I
r_SS_12
SCH2 (E)- 1 trans - Ajoen
0 (Z) -1 c/s -Ajoen
Abb. 1 Formelschema für die Bildung von Allicin und Ajoen in
Allicin ist nicht genuin in Knoblauch vorhanden, sondern wird durch das Enzym Alliinase aus Alliin gebildet (Abb. 1). Daraus ergibt sich, daB eine reine Alumbestimmung ohne Funktionsuberprufung des Enzyms Allii-
Knoblauchpulver (14).
Heruntergeladen von: National University of Singapore. Urheberrechtlich geschützt.
in Dried Garlic and Garlic Preparations
372 Planta Med. 57(1991)
Die Versuche einer Wertebestimmung von Knoblauch gehen his ins Ende des vergangenen Jahrhunderts zurUck (2). Eine direkte quantitative photometrische Bestimmungsmethode für Dialkyithiosulfinate wurde zuerst von Nakata beschrieben (5), und von Sekine verbessert
(6). Beide Methoden haben jedoch eine gemeinsame Schwäche: Es werden alle vorhandenen Thiosulfinate erfafit.
Vergleichslösungen Entsprechende LOsungen von Allicin (11) und Ajoen (14): Der Gehalt der gereinigten Referenzsubstanzen berechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des Substanzsignals und der Summe aller Peaks his zur Ldsungsmittelfront.
Versuchsbedingungen Stationare Phase: HPTLC-Fertigplatten. Kieselgel 60 F254 der Fa. Merck Darmstadt.
Mobile Phase: Dichiormethan : Methanol 99: 1, V/V.
Auftragemenge: Die Auftragemengen können ausAbb. 3 ermitteitwerden. Aufgetragenwird strichformig, 7mm. Methode: aufsteigend, Doppeltrogkammer. LaufzeitlLaufstrecke: Ca. 20 Minutenlca. 7 cm.
Die Verfahren wurden deshaib von Michahelles uberarbeitet (7). Er stelite der unselektiven photome-
Die Auswertung erfolgt am Densitometer (Camag TLC-Scanner II) bei 245 nm. Die Gehaltswerte werden Uber einen Peakflachenvergleich ermittelt. Für n = 6 ergaben sich folgende Daten (Dragee mit 235mg Pulver): Mittelwert: 1377,5 .tg Allicin/
trischen Bestimmung eine dUnnschichtchromatographische Abtrennung des Ailicins voran. Obwohl es ihm nicht
Dragee; Standardabweichung: 107,424; Variationskoeffizient: 7,8%.
gelang, Allicin sauber von Methyl-propyl-thiosulfinat abzu-
trennen, kann der sich daraus ergebende Fehier vernachlassigt werden (7).
In der letzten Zeit wurden nun mehrere gaschromatographische Bestimmungsmethoden von Knoblauchpraparaten publiziert (8—10), die jedoch bei allem apparativen Aufwand einen RUckschritt hinter das von Michahelles beschriebene Verfahren darstellen, da in alien Fallen nicht Allicin direkt, sondern verschiedene Abbauprodukte des Allicins bestimmt werden.
Zur HPLC-Bestimmung nach (11) wurde 1 ml der
überstehenden Ethylacetatlosung im Vakuum abgezogen und der RUckstand mit 1 ml Methanol aufgenommen. Die Auswertung erfolgte an einem HP 1090 M mit Photodiodenarraydetektor über die Peakhohe.
Für n = 6 wurden folgende Daten ermittelt: Mittelwert: 1442,5 ig AllicirilDragee; Standardabweichung: 91,044; Variationskoeffizient: 6,3%.
Methodenvergleich: Mitteiwert T-Test: Prüfgrofie 1,131 (Grenze für f 10 mit P = 0,95 2,23). Varianzen F:
Allicin kann jedoch durch neuere HPLCVerfahren in Knoblauch direkt erfaBt werden (11, 12), Auch eine Ajoen-Analytik mittels HPLC wurde publiziert (13). Bei diesen Verfahren wird mit Allicin bzw. Ajoen kali-
briert. Trotz des relativ groBen apparativen Aufwands ist eine Gehaltsvalidierung nicht beschrieben. Auch werden Zweifel an der Reinheit der eingesetzten Standards geäuBert (8).
Test: PrüfgroBe 1,392 (Grenze fürfl = l'2 = 5 mit p = 0,95:5,05).
Untersuchungen zur Freisetzung
von Allicin
MeBreihe A Verschiedene Mengen Knoblauchpu!ver wurden
mit jeweils 1 ml Wasser versetzt, wie beschrieben aufgearbeitet und der Allicingehalt mittels HPTLC bestimmt.
Die präparative Herstellung von Allicin (11) und Ajoen (14) bereitet keine groBen Probleme. So entwikkelten wir — aufbauend auf den schon publizierten DC-Allicinbestimmungen (15, 16)— eine HPTLC-Bestimmungsmethode von Allicin und Ajoen. Es können so his zu 18 Allicin-
und Ajoenbestimmungen auf einer Platte gleichzeitig durchgefuhrt werden. Bei Laufzeiten in der HPLC von Ca. 10mm (11) his über 20mm (12, 13) stelit dies bei Routineuntersuchungen schon eine gewisse Zeitersparnis dar.
Material und Methoden Probenvorbereitung Etwa 100mg Knoblauchpulver werden genau
eingewogen, mit 1 ml Wasser versetzt und nach 15 Minuten (bei 20 C) mit 2 ml Essigsaureethylester Ca. 1 Minute gut geschuttelt. AnschlieBend wird die Probe zentrifugiert, bis eine kiare Losung übersteht.
MeBreihe B Verschiedene Mengen Knoblauchpu!ver wurden mit jeweils 1 ml Darmsaft DAB 9 (pH-Wert = 6.8) versetzt. Aufarbeitung wie unter A.
MeBreihe C Verschiedene Mengen Knoblauchpulver wurden mit jeweils 1 ml HC1 (0,1 N) versetzt. Aufarbeitung wie unter A.
MeBreihe D Freisetzung von A!licin in Salzsäure mit anschlie-
Bendem Wechsel des pH-Wertes. Verschiedene Mengen Knoblauchpulver wurden mit jeweils 1 ml HG! (0.1 N) versetzt. Nach 15 Minuten werden 23,5mg Na3PO4' 1 2H20 zugegeben. Der pH-Wert
stel!t sich auf 6,9 em. Nach 15 Minuten wurde wie unter A: beschrieben aufgearbeitet und der Allicingehalt gemessen.
Heruntergeladen von: National University of Singapore. Urheberrechtlich geschützt.
nase em Knohlauchpraparat nur unzureichend charakterisiert. So kommt für eine einfache Wertebestimmung von Knoblauchformulierungen nur die direkte Allicinbestimmung im Produkt in Frage. Oft ist auch eine Ajoenbestimmung wUnschenswert, denn Allicin reagiert relativ schnell weiter zu Ajoen, dem Lipoxygenase-hemmende und antitumorale Aktivität zugeschrieben wird (3, 4). Wir möchten hier über eine validierte Gehaltsbestimmung von Allicin und Ajoen berichten, die unserer Meinung nach eine ideale Wertebestimmungsmethode von Knoblauchformulierungen ermoglicht.
Gabriele Blania and Bernd Spangenberg
Planta Med. 57(1991) 373
Allicin-Freisetzung aus getrocknetem Knoblauch (Allium sativum)
MeBreihe E Verschiedene Mengen Knoblauchpulver wurden mit jeweils 1 ml HG! (0,1 N) 15 Minuten gerilhrt. AnschlieBend wurde der pH-Wert gemessen.
251 1
2
3
MeJ3ergebnisse Es wurden folgende Werte aus den MeBreihen A
his E erhalten:
100 125 150 175
200 225 250 275 300
Mel3reihen A:{ig]
B:Fig]
C:[g]
D:[tgl
928 1071 1265 1439 1555 1760 1946 2110 2246
903 1096 1292 1506 1734 1910
n.n.
102 196 158 235 573
——
——
268 340 660 1280 2109 2497
2177 2397 2630
672
1752 1925 2106
Ens]
E:[pHl Peak 1: Ajoen Peak 2: Diphenylsulfoxid Peak 3: Allicin
1,78
2.06 2,38 2,64 2,84
0
H2CSS2
2,99 3,18
(1)
3,24 3,40
(2)
(3)
Abb. 2 Kalibrationschromatogramm von Ajoen (1), Diphenylsulfoxid (2) und AIlicin (3).
Damit ergeben sich folgende Arbeitsbereiche:
Diskussion Linearität undArbeitsbereich der Bestiminung
Es wurden bekannte Konzentrationen an Ajoen (0,5694.tg4d), Diphenylsulfoxid (0,1248 .tg4tl) und Allicin (0,5096 .tg/i1) in unterschiedlichen Mengen gemeinsam auf eine HPTLC-Platte aufgetragen und vermessen. In Abb. 2 ist em typisches unkorrigiertes Chromatogramm zu sehen. Die gemessenen Flächen der drei Substanzen wur-
den gegen die aufgetragenen .t1 graphisch dargesteilt (Abb. 3).
0,5694 g bis 4,5552 g Ajoen: 0,1248 tg his 0,8736 tg Diphenylsulfoxid: Allicin: 0,5096 ig bis 4,0768 .tg. In diesem Bereich kann Diphenylsulfoxid als Interner oder Externer Standard verwendet werden.
Auf eine direkte Kalibrierung mit Allicin
kanu verzichtet werden, wenn der zu untersuchenden Knoblauchprobe definierte Mengen von reinem (stabilen) S-Allyl-L-cystein-snlfoxid (= Alum) zugesetzt werden, das quantitativ zu Allicin weiterreagiert (17).
Ar'e/ 00
A
Abb. 3 Linearitätsnachweis im Arbeitsbereich von Allicin, Diphenylsulfoxid (DiPhSO) und Ajoen.
45— 40 —
30
H2CS2
All ic
—
Dl Rti0 -
20 —
7
V
10
Q—
-
00
00
I
I 1
2
I
3
I
I .4
5
S Lii
7
8
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Knoblauchpu!ver[mg]
374 Planta Med. 57 (1991)
Gabriele Blania and Bernd Spangenberg
Präzision und Rich tigkeit der Bestimmung
In Abb. 4 sind die gemessenen Spektren einer Probe Ubereinander gelegt. Alle drei Spektren sind je-
Urn die Richtigkeit der Bestimmung zu uberprufen, wurden von den Ajoen- und Allicinsignalen des
Knoblauchpraparates die Remissionsspektren jeweils im Peakmaxirnurn und an den Wendepunkten der Signale aufgenornmen.
weils identisch und belegen damit die Peakreinheit des Ajoen- bzw. Allicinsignals.
Bei der Zulassung von Arzneimitteln wird von der Gesundheitsbehörde zum Nachweis der Richtigkeit einer Bestirnrnung in der Regel eine zweite, von der ersten Messung unabhängige MeBmethode verlangt. Der Allicingehalt des oben genannten Knoblauchpraparates wurde in Arilehnung an (11) mit einer HPLC-Methode uberpruft. Für n = 6 ergibt sich em Variationskoeffizient von 6,3 %. Die Gleichwertigkeit beider Ergebnisse wurde durch einen Fund T-Test uberprUft und belegt. Allicinfreisetzung von Knoblauchpraparaten
Wie oben beschrieben, ist in KnoblauchPulverpräparaten Allicin (und Ajoen) als Substanz rneist nicht enthalten. Erst bei Kontakt mit Wasser wird Allicin enzymatisch aus Alum gebildet. Diese Reaktion ist erfahrungsgemaB nach 10 his 15 Minuten abgeschlossen. Die dazu erforderlichen Arbeitsbedingungen für das Enzym Alliinase wurden erst kUrzlich bestirnmt (18).
Urn die Abhangigkeit des Enzyms vom pH-
Wert der Losung zu untersuchen, ermittelten wir in einer MeBreihe die aus verschiedenen Knoblauchmengen gebildete Allicinmenge nach jeweils 15 Minuten Rekationsdauer
in den Medien Wasser, Darmsaft DAB 9 und Magensaft En m) U.' Cd
CU
tli
U,
UJ
Ci
Ajoen (1)
DAB 9. Das meiste Allicin entsteht in dem Medium Darmsaft. Die Werte für Wasser liegen etwas schlechter.
In Magensaft wird die Reaktion hier his zu Knoblauchmengen Von Ca. 200mg stark unterdrückt, erreicht bei groBerem Pulvereinsatz jedoch die in Wasser bzw. Darmsaft gemessene GröBe. Offensichtlich behindert em saures Medium die Bildung von Allicin! Urn zu überprüfen, ob die Alliinase in Magensaft (DAB 9) reversibel oder ir-
reversibel gehemmt wird, wiederholten wir die MeBreihe in Magensaft, setzten jedoch nach 15 Minuten eine definierte Menge Natriumphosphat zu, urn den pH-Wert des Magensaftes auf einen Wert von pH 7 (entsprechendDarmsaft DAB 9) zu bringen (MeBreihe D:). Eine graphische Darstellung dieser gemessenen Werte im Vergleich zu den Daten der Freisetzung in Wasser (MeBreihe A:) und Darmsaft (Mefireihe B:) zeigtAhb. 5.
Da die Verlaufskurve der Freisetzung in Salzsäure (MeBreihe C:) fast identisch ist mit der Kurve aus MeBreihe D:, kann nur von einer irreversiblen Schadigung durch Magensaft (DAB 9) gesprochen werden. In einer wei-
Cd
teren MeBreihe wurde die pH-Anderung von Magensaft Enm] DAB 9 (pH = 1) nach Zusatz verschiedener Mengen Knob-
I LI.' CU
U,
CI
lauchpulver bestimmt (MeBreihe E:). Der pH-Wert in der Suspension steigt inAb-
Allicin
hängigkeit mit der zugesetzten Knoblauchmenge. Die (3)
Abb. 4 Remissionsspektren von Ajoen (1) und Atlicin (3).
Furiktionsfahigkeit der Alliinase bei groBeren eingesetzten Knoblauchmengen läBt sich damit durch diese beobachtete pH-Wert-Anderung (Denaturierungen im Knoblauch!) hin
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Der Allicingehalt eines Knoblauchpraparates mit 235mg Knoblauchpulverwurde wie im Experimentellen Teil beschrieben bestimmt. Für n = 6 liegt der Variationskoeffizient (ohne inneren Standard) unter 8 %. Dieser Wert ist erstaunlich niedrig, da ja auch Schwankungen der Alliinasetatigkeit erfaBt werden.
Planta Med. 57(1997) _•_
Allicin-Freisetzung aus getrocknetem Knoblauch (A Ilium sativum)
Abb. 5 Freisetzungsuntersuchungen mit verschiedenen Mengen Knoblauchpulver
/ . 1'
MeBreihe A: (—*—*—), Freisetzung in Wasser MeBreihe B: (—0—0—), Freisetzung in Darmsaft
A: vassar-
(DAB 9) Mereihe D: (—X—X—), Freisetzung in 0,1 N HCI. Nach 15 Minuten Wechsel auf Darmsaft.
V
. Oar-ms.
0:
-—
1/7
'3
0 0 100 10 200 20 300 30 400 I
I
I
I
I
rnQ
zu höheren Werten erklären. Eine Anderung des pH-Wertes im menschlichen Magen ist dagegen auch bei Einnahmen von mehreren Grarnm Knoblauchpulver nicht zu erwarten.
Literatur 2
Zusammenfassend zeigt sich, daB die Alliinasa nur oberhaib eines pH-Wertes von etwa 3 optimal arbeiten kann (siehe MeBreihe C: und D: im Vergleich zu MeBreihe A: und B:).
SchluBbetrachtung Urn eine moglichst groBe Wirksamkeit bei Knoblauchpraparaten zu erreichen, ergibt sich in logischer Folge, daB die Verabreichung des Trockenpulvers in Form von Dragees mit magensaftresistentem Uberzug oder die Abfiillung in gehartete Gelatinekapsein die derzeit beste Darreichungsform für die Droge darsteilt. Nur so ist die Al-
liinase vor einer moglichen Denaturieriing durch den menschlichen Magensaft geschutzt. Damit unterbleibt auch
eine eventuelle Reizung der Magenschleimhaut, und die Geruchsbelastigung wird auf em Minimum reduziert. Das im Dünndarm freigesetzte Allicin soilte sofort resorbiert werden und semen Wirkort in hoher Konzentration erreichen (19). Es mufi jedoch unbedingt vermieden werden, daB das ungeschutzte Knoblauchpulver euler Umgebung ausgesetzt wird, deren pH-Wert unter 3 liegt.
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