YAKUGAKU ZASSHI 135(2) 205―212 (2015)  2015 The Pharmaceutical Society of Japan

205

―Symposium Review―

フルオラスケミストリーを駆使した生体関連物質の高選択的分析 巴山

忠

Highly Selective Analysis of Biogenic-related Compounds Utilizing Fluorous Chemistry Tadashi Hayama Faculty of Pharmaceutical Sciences, Fukuoka University; 8191 Nanakuma, Johnan-ku, Fukuoka 8140180, Japan. (Received August 11, 2014) Per‰uoroalkyl-containing compounds are highly ‰uorous, meaning that they have a remarkable a‹nity for one another and eŠectively exclude non-‰uorous species. Utilizing this unique property, we have developed a ‰uorous derivatization with a liquid chromatographic analysis method for highly selective analysis of target analytes. Although most previous methods focused on extremely sensitive detection-oriented derivatization, the ‰uorous derivatization method involves highly speciˆc separation for analytes. This method includes per‰uoroalkylation of analytes with a ‰uorous reagent, and separation of the derivatives using a per‰uoroalkyl-modiˆed stationary phase LC column. The derivatives can be selectively retained on the ‰uorous-phase LC column, whereas the non-‰uorous derivatives are poorly retained under the same separation conditions. The combination of this method with LC-tandem mass spectrometry (MS/MS) is very useful for complex biological sample analysis, because matrix-induced suppression eŠects, which are a common problem in LC-MS/MS analysis arising from components of a biological endogenous matrix, have not been observed. We have successfully applied this method to precise and accurate LC-MS/MS analysis of some biogenic compounds, such as sialic acids and biogenic amines, in complex biological samples. Key words―per‰uoroalkyl-containing compound; ‰uorous derivatization; biological sample; LC-MS/MS

1.

はじめに

の高選択的測定法に注目が集められている．710) 一

フルオラスとは，「親フルオロカーボン性の」と

般に，生体成分はパーフルオロアルキル基を有して

いう意味の造語であり，パーフルオロアルキル鎖同

いない．そのため，測定対象物質にパーフルオロア

士のみが示す極性に依存しない特異的な親和性のこ

ルキル基を導入（誘導体化）することで，それのみ

13) その詳細な原理についてはいまだ議 とを指す．

を F-SPE などにより極めて効果的かつ選択的に精

論の余地があるが，C-F 結合の低い分極率が，疎水

製することが可能となる．筆者らは，本手法を応用

性・疎油性に起因し，パーフルオロアルキル鎖同士

し，生体試料中における自然蛍光性カルボン酸11,12)

間でのみ“ like-dissolves-like”な現象を示すものと

やアミン類13)を対象とした高選択的 LC-蛍光分析法

考えられている．4) この「フルオラス」という親和

を開発してきた．本法は，対象のパーフルオロアル

性は ，パ ー フル オロ ア ルカ ン類 に よる 液液 分 配

キル誘導体を，パーフルオロアルキル基修飾（フル

（‰uorous biphasic separation)5)あるいはパーフルオ

オラス）LC カラムに極めて選択的に保持させると

ロ ア ル キ ル 基 修 飾 シ リ カ 型 固 相 抽 出 （ ‰uorous

いった手法であり，パーフルオロアルキル化されて

solid-phase extraction; F-SPE ）法6) により利用可能

いない試料夾雑成分（非フルオラス）は，フルオラ

であり，従来より有機合成分野などにおける生成物

ス LC カラムにほとんど保持されることなく溶出さ

の精製法として用いられてきた．一方，近年，フル

れることから，それらの妨害を受けることなく対象

オラスケミストリーの概念を導入した生体関連物質

を選択的に測定することを可能とする．さらに筆者 らは，本手法を， LC- エレクトロスプレーイオン

福岡大学薬学部(〒8140180 福岡市城南区七隈 8191） e-mail: thayama＠fukuoka-u.ac.jp 本総説は，日本薬学会第 134 年会シンポジウム S29 で 発表した内容を中心に記述したものである．

化 タンデム質量分析 ［electrospray ionization (ESI)14,15) LCMS/MS］法による測定にも応用している．

MS/MS は，対象物質の高感度かつ高選択的測定を

206

YAKUGAKU ZASSHI

Vol. 135 No. 2 (2015)

容易とするが，生体試料など夾雑物（マトリックス）

導体の MS / MS スペクトルから，いずれも目的の

を多く含む試料を対象とした場合，「マトリックス

構造を有していることを確認した．

効果」というイオン化干渉によって，正確な測定が

2-2.

LC-MS / MS 測定

フルオラス LC カラ

妨害されるという現象がみられることがある．16,17)

ムにおけるフルオラス誘導体の保持及び溶出は，親

同位体希釈法などを利用することで，マトリックス

フルオラス溶媒（アセトニトリル，メタノール，テ

効果による影響を補正することは可能であるが，測

トラヒドロフランなど） 及び疎フルオラス溶媒 （水，

定対象によっては同位体標識標準品の入手が困難で

ジメチルスルホキシド，ジメチルホルムアミドな

あったり，前処理や LC 分離の過程で非標識体とは

ど）を組み合せた移動相を用いることによりコント

異なる挙動を示したりするなど，かならずしも有用

ロールすることができる．本法では，フルオラス

な方法であるとは言えない．18)

そもそもマトリック

LC カラムに，Fluophase RP (100×2.1 mm ID，粒

ス効果とは， MS 側に問題があるのではなく， LC

径 5 mm, ThermoFisher Scientiˆc 製）を，移動相と

側において，測定対象物と実試料マトリックスとの

して， 0.1 ％トリフルオロ酢酸（ TFA ）及び 1 ％プ

分離が不十分であった場合に，ESI 源においてイオ

ロピオン酸を含む水，メタノール及びイソプロパ

ン化が競合する現象のことである．すなわちそれ

ノールの混液を用い，グラジエント溶離を行った．

は，上述のフルオラス誘導体化法が， LC-MS / MS

また， MS / MS 検出は， multiple reaction monitor-

分析におけるマトリックス効果の問題に対する有用

ing (MRM ）モードにて行った．3 種シアル酸標準

な解決手段になり得るということを示しており，こ

品（NANA, NGNA 及び KDN）及び内部標準（ N-

れまでにその効果を実証してきた．本誌上シンポジ

アセチルノイラミン酸メチルエステル， NANA-

ウムにてその成果を紹介する．

methyl ）を HFUA にて誘導体化し，本条件におい

2.

フルオラス誘導体化法によるシアル酸類の

LC-MS/MS 分析14)

て測定したときの MRM クロマトグラムを Fig. 2 に示す．本法によって得られた誘導体は，フルオラ

N- ア セ チ ル ノ イ ラ ミ ン 酸 （ N-acetylneuraminic

ス LC カラム上に良好なピーク形状をもって保持さ

acid; NANA ）， N- グ リ コ リ ル ノ イ ラ ミ ン 酸 （ N-

せることが可能であり，さらに MS / MS において

glycolylneuraminic acid; NGNA ） 及 び デ ア ミ ノ ノ

極めて高感度に検出された．本法におけるシアル酸

イ ラ ミ ン 酸 （ deaminated neuraminic acid; KDN ）

の検出限界 ［limit of detection (LOD), S/N＝3］ は，

に代表されるシアル酸は，生体内において，遊離型

注入量当たり 60750 amol であり，検量線の直線性

として，若しくは糖タンパク質や糖脂質の末端に存

（ r 2 ＝ 0.9992 以 上 ） 及 び 再 現 性 ［ 相 対 標 準 偏 差

在していることが知られている．それらは，生体内

（ R.S.D. ）として 8.6 ％以内］についても良好な結

において極微量で存在しているにもかかわらず，生 命現象に深く関与しているばかりか，シアル酸代謝

果が得られた． 2-3.

ヒト尿試料の測定

本法のマトリックス

異常症やがんなどの疾患との関連性も深いことか

効果対策に対する有用性を評価すべく，あらかじめ

ら，臨床的測定意義が極めて高い化合物である．そ

誘導体化を行った標準溶液に対し，ヒト尿をマト

こでわれわれは，生体試料中におけるシアル酸を高

リックスとして添加した試料（マトリックス試料）

感度かつ高精度に測定すべく， NANA, NGNA 及

と，同濃度となるよう水を添加した試料（非マト

び KDN を対象としたフルオラス誘導体化-LC-MS/

リックス試料）とを，本条件下にて測定した．それ

MS 分析法の開発を試みた．

ぞれの測定結果から得られた各誘導体のピーク強度

シアル酸のフルオラス誘

を比較したところ，いずれもマトリックス試料及び

導体化には，縮合剤［4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-

非マトリックス試料の間におけるピーク強度に差は

2-yl ) -4-methyl-morpholinium chloride; DMT-MM ］

みら れ なか っ た． 一方 ， 同様 の試 料 を， 汎用 の

の存在下，フルオラスアミン試薬（4,4,5,5,6,6,7,7,

ODS カラムを用いて本条件にて測定したところ，

8, 8, 9, 9, 10, 10, 11, 11, 11-heptadeaca‰uoroundecyl-

両試料間におけるピーク強度には明らかな差が確認

amine; HFUA ） に よ る ア ミ ド 化 反 応 を 採 用 し た

された．以上の結果より，本フルオラス誘導体化法

（Fig. 1）．反応は室温で容易に進行し，得られた誘

が，LC-MS/ MS 測定時におけるマトリックス効果

2-1.

誘導体化反応

Vol. 135 No. 2 (2015)

YAKUGAKU ZASSHI

Fig. 1.

207

Derivatization Reaction of Sialic Acids via Amidation with HFUA

Reprinted with permission from Ref. 14)  John Wiley & Sons.

Fig. 2. Typical MRM Chromatograms of the Standard Solutions of Sialic Acids Derivatized with HFUA (0.5 mM Each Except the Internal Standard) (a) NANA, (b) NGNA, (c) KDN, and (d) NANA-methyl (internal standard, 1 mM). Reprinted with permission from Ref. 14)  John Wiley & Sons.

208

YAKUGAKU ZASSHI

Fig. 3.

Vol. 135 No. 2 (2015)

Derivatization Reaction of Primary Amines via Reductive Amination with PFUA and 2-PB

Reprinted with permission from Ref. 15)  American Chemical Society.

を回避できる有用な手段となり得るということが示

amine (Trp), 5-methoxytryptamine (5-MT), hista-

唆された．さらに本法を，標準添加（ NANA: 10 

mine ］を対象とした．誘導体化反応は，フルオラ

50 nmol / mL urine, NGNA 及 び KDN: 1 5 nmol /

ス ア ル デ ヒ ド 試 薬 （ 2H,2H,3H,3H-per‰uoroun-

mL urine ）ヒト尿試料分析に適用したところ，そ

decyl-1-al; PFUA ）及び還元剤（ 2-picoline borane;

の Accuracy は 98106％の範囲であり，標準未添加

2-PB ）による還元的アルキル化反応により行い

ヒト尿試料からは， ND 95.6 nmol / mL urine のシ

（ Fig. 3 ）， 1 級アミンに対して， 2 つのパーフルオ

アル酸類を検出することが可能であった． 3.

フルオラス誘導体化法による生理活性アミン

ロアルキル基を導入した（バイナリーフルオラス誘 導体）．フルオラスの親和性は，パーフルオロアル キル鎖の増大あるいは伸長に伴って増加することが

類の LC-MS/MS 分析15) カテコールアミンやインドールアミンなど生理活

知られている．本法では，2 級アミン類も同様の反

性アミン類は，生体内において極微量で存在してい

応により，パーフルオロアルキル基を 1 つ導入する

るにもかかわらず，種々の疾病と密接に係わってお

ことが可能ではあるが，フルオラスの効果をより明

り，臨床診断や生体機能解明などを目的とする分析

確に示すため，1 級アミンのみを対象とすることと

の対象としてしばしば挙げられる．従来より，それ

した．反応は室温で容易に進行し，得られた誘導体

らの測定には，LC-蛍光検出法あるいは電気化学検

の構造は，MS/MS スペクトルにより確認した．

出法などが用いられてきたが，最近では，LC-MS/

3-2.

LC-MS / MS 測定

本法によって得られ

MS による測定法が主に利用されるようになってき

たアミン類のバイナリーフルオラス誘導体は，フル

た．しかしながら，測定感度や選択性などといった

オラス LC カラムに極めて強力に保持され，一般的

点でかならずしも満足できない場合があり，より有

に使用される水，メタノール及びアセトニトリルか

用な方法論の開発が求められている．そこで筆者ら

ら構成される移動相では溶出させることが困難で

は，それら生体内アミン類の高感度かつ高選択的な

あった．フルオラス誘導体のフルオラス固定相から

LC-MS/MS 分析法を開発すべく，フルオラス誘導

の溶出は，フルオラス溶媒を用いることで容易に行

体化法の適用を試みた．

うことができるものと想像できるが，疎水性・疎油 本研究では，生体内 1 級

性のフルオラス溶媒を LC-ESI-MS/MS 測定におけ

アミン類［dopamine (DA), norepinephrine (NE),

る移動相として利用することはできない．そこで本

3-1.

誘導体化反応

normetanephrine

法では，フルオラス性の溶媒でありながら水，メタ

(NM), tyramine (Tyr), serotonin (5-HT), trypt-

ノ ー ル な ど と 容 易 に 混 合 可 能 な 2,2,2-tri‰uoro-

3-methoxytyramine

( 3-MT ) ,

Vol. 135 No. 2 (2015)

Fig. 4.

YAKUGAKU ZASSHI

209

Typical MRM Chromatograms of the Binary Fluorous-labeled Standard Amines (0.5 nM Each)

(a) DA, (b) NE, (c) 3-MT, (d) NM, (e) Tyr, (f) 5-HT, (g) Trp, (h) 5-MT, and (i) histamine. Reprinted with permission from Ref. 15)  American Chemical Society.

ethanol ( TFE ）を移動相として利用することとし

が付加されたアミン類の MS / MS における測定感

た．すなわち，初期移動相を 0.05％TFA を含む 90

度は極めて向上し， S / N ＝ 3 における LOD は，注

％ メ タ ノ ー ル と し ， フ ル オ ラ ス LC カ ラ ム

入量当たり 7.826 amol であった．さらに，対象ア

［ FluoroSep-RP Propyl ( 100 × 2.1 mm ID ， 粒 径 5

ミン類 0.011 nM の範囲における検量線の直線性は

mm, ES Industries 製）］に誘導体を選択的に保持さ

相関係数 r ＝ 0.9978 以上であり， 0.01, 0.1 及び 1

せた後， TFE によるグラジエント溶出を行った．

nM における繰り返し再現性（ n ＝ 6 ）は R.S.D. と

その結果，適度な保持及び良好なピーク形状をもっ

して 7.4％以内と良好であり，本法が，生体試料中

てアミン類のバイナリーフルオラス誘導体を測定す

における内在性アミン類を定量するのに十分な感度

ることが可能であった（Fig. 4）．また，ESI-MS に

と再現性を有していることが確認された．

おいて，疎水基が導入された対象物質は，液相中で

3-3.

ヒト血漿試料の測定

本法の実試料測定

生成されたイオンが気相へと移行し易くなり，MS/

に対する有用性を確認すべく，ヒト血漿試料を対象

MS における検出感度を向上させることが知られて

とした測定を行った．まずは，マトリックス効果の

いる．19)

有無を検証した．ヒト血漿試料には，マトリックス

本法においても，パーフルオロアルキル基

210

Fig. 5.

YAKUGAKU ZASSHI

Vol. 135 No. 2 (2015)

Chromatograms Obtained from the Analysis Human Plasma Sample

(a) DA (0.10 pmol/mL plasma), (b) NE (1.1 pmol/mL plasma), (c) 3-MT (0.28 pmol/mL plasma), (d) NM (0.43 pmol/mL plasma), (e) Tyr (0.81 pmol/ mL plasma), (f) 5-HT (20 pmol/mL plasma), (g) Trp (1.9 pmol/mL plasma), (h) 5-MT (0.04 pmol/mL plasma), (i) histamine (20 pmol/mL plasma), and (j) phospholipids. The derivatized amines and the phospholipids were monitored in MRM mode and precursor ion scan mode using the product ion of m/z 184, respectively. Reprinted with permission from Ref. 15)  American Chemical Society.

効果の主要因とされるリン脂質20,21)が存在している

おける極微量のアミン類の検出（ DA:

が，本測定条件下においてリン脂質はフルオラス

NE: 0.10 1.1, 3-MT: 0.02 0.50, NM: 0.02 4.3, Tyr:

LC カラム上にほとんど保持されることなく溶出し

0.42 4.2, 5-HT: 8.9 57, Trp: 1.2 3.2, 5-MT:

ており，アミン類のバイナリーフルオラス誘導体と

＜LOD0.04, histamine: 0.79 28 pmol/mL plasma）

明確に分離することが可能であった（ Fig. 5 ）．実

が可能であり，その濃度は既報2224)によるものとよ

際に，アミン類を同濃度となるよう調製したヒト血

く一致していた．

0.10 0.95,

漿マトリックス存在下及び非存在下試料間における

4.

各誘導体のピーク強度を比較したところ，それらに

以上のように筆者らは，フルオラスと呼ばれる

差はほとんどみられておらず，本法がマトリックス

パーフルオロアルキル鎖同士が持つ特異的な親和性

効果を回避し得る有用な方法であるということを証

を利用した誘導体化法により，シアル酸や生理活性

明することができた．さらに，数名の健常人より採

アミン類といった生体関連物質の新規 LC-MS/ MS

取したヒト血漿試料を測定した結果，ヒト血漿中に

分析法を開発した．本法により，パーフルオロアル

おわりに

Vol. 135 No. 2 (2015)

YAKUGAKU ZASSHI

キル基が導入された測定対象物質は，フルオラス LC カラムにて特異的に保持され，試料夾雑成分と

極めて良好に分離される．そのため本法は， LCMS/MS 測定時におけるマトリックス効果の問題を

回避することが可能であり，生体試料中における極

8) 9) 10)

微量の対象物質を，十分な精度・正確性をもって測 定することができた．今後，本法の適用拡大を図 り，様々に応用していくとともに，開発した分析方

11)

法が，医薬品開発や臨床現場のみならず，幅広い分 野へ大きく貢献できることを期待する． 12)

謝辞

本研究を遂行するにあたり，終始懇切な

るご指導を賜りました福岡大学薬学部 山口政俊教 授に謹んで感謝致します．本研究に際し，終始有益

13)

なご助言とご指導を頂きました福岡大学薬学部 能 田

均教授に深く感謝申し上げます．また，本研究

にご協力・ご支援を頂きました福岡大学薬学部 吉 田秀幸准教授，静岡県立大学薬学部 轟木堅一郎准

14)

教授，福岡大学薬学部薬品分析学教室の皆様に心よ り深謝致します．本研究は，JSPS 科研費 23750092 及び 24619009 ，並びに福岡大学総合科学研究チー

15)

ム 122505 の助成を賜ることにより行ったもので す．併せて感謝の意を表します． 16)

利益相反

開示すべき利益相反はない． REFERENCES

1)

2) 3) 4)

5)

6) 7)

``Handbook of Fluorous Chemistry,'' ed. by Gladysz J. A., Curran D. P., Horv áath I. T., Wiley-VCH, Weinheim, 2004. Uneyama K., ``Organo‰uorine Chemistry,'' Blackwell Publishing, Oxford, 2006. Curran D. P., Science, 321, 1645 1646 (2008). Marchand D. H., Croes K., Dolan J. W., Snyder L. R., Henry R. A., Kallury K. M. R., Waite S., Carr P. W., J. Chromatogr. A, 78 (2005). 1062, 65 Studer A., Hadida S., Ferritto R., Kim S.-Y., Jeger P., Wipf P., Curran D. P., Science, 275, 826 (1997). 823 Zhang W., Curran D. P., Tetrahedron, 62, 11865 (2006). 11837 Todoroki K., Yoshida H., Hayama T., Itoyama M., Nohta H., Yamaguchi M., J. Chro-

17)

18)

19)

20)

21)

22)

23)

211

1337 (2011). matogr. B, 879, 1325 Fusstero S., Ace ãna J. L., Catal áan S., Top. Curr. Chem., 308, 45 67 (2012). Cametti M., Crousse B., Metrangolo P., Res42 (2012). nati G., Chem. Soc. Rev., 41, 31 Hayama T., Yoshida H., Yamaguchi M., Nohta H., J. Pharm. Biomed. Anal., 101, 160 (2014). 151 Sakaguchi Y., Yoshida H., Todoroki K., Nohta H., Yamaguchi M., Anal. Chem., 81, 5039 5045 (2009). Sakaguchi Y., Yoshida H., Hayama T., Yoshitake M., Itoyama M., Todoroki K., Yamaguchi M., Nohta H., J. Pharm. Biomed. Anal., 55, 176 180 (2011). Sakaguchi Y., Yoshida H., Hayama T., Itoyama M., Todoroki K., Yamaguchi M., Nohta 5586 H., J. Chromatogr. A, 1218, 5581 (2011). Hayama T., Sakaguchi Y., Yoshida H., Itoyama M., Todoroki K., Yamaguchi M., Nohta H., Rapid Commun. Mass Spectrom., 24, 2874 (2010). 2868 Hayama T., Sakaguchi Y., Yoshida H., Itoyama M., Todoroki K., Yamaguchi M., Nohta 8414 (2012). H., Anal. Chem., 84, 8407 Matuszawski B. K., Constanzer M. L., Chavez-Eng C. M., Anal. Chem., 75, 3019 3030 (2003). van Eeckhaut A., Lanckmans K., Sarre S., Smolders I., Michotte Y., J. Chromatogr. B, 2207 (2009). 877, 2198 Stokvis E., Rosing H., Beijnen J. H., Rapid Commun. Mass Spectrom., 19, 401 407 (2005). Ji C., Li W., Ren X., EI-Kattan A. F., Kozak R., Fountain S., Lepsy C., Anal. Chem., 80, 9203 (2008). 9195 Ismaiel O. A., Halquist M. S., Elmamly M. Y., Shalaby A., Karnes H. T., J. Chromatogr. B, 859, 84 93 (2007). Pucci V., Di Palma S., Alˆeri A., Bonelli F., Monteagudo E., J. Pharm. Biomed. Anal., 871 (2009). 50, 867 de John W. H. A., Graham K. S., van der Molen J. C., Links T. P., Morris M. R., Ross H. A., de Vries E. G. E., Kema I. P., Clin. Chem., 53, 1684 1693 (2007). Mao H. M., Chen B. G., Qian X. M., Liu Z.,

212

24)

YAKUGAKU ZASSHI

Microchem. J., 91, 176 180 (2009). Cai H. L., Zhu R. H., Li H. D., Anal.

Vol. 135 No. 2 (2015)

111 (2010). Biochem., 396, 103