Synthèse General review
Volume 101 • N◦ 10 • octobre 2014 John Libbey Eurotext
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Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites Immunohistochemistry and personalised medicine in lung oncology: advantages and limitations Véronique Hofman, Marius Ilie, Elodie Long, Sandra Lassalle, Catherine Butori, Coraline Bence, Kevin Washetine, Salomé Lalvee, Paul Hofman Article rec¸u le 09 janvier 2014, accepté le 31 mars 2014 Tirés à part : V. Hofman
Hôpital Pasteur, Centre Hospitalo-universitaire, Université de Nice Sophia-Antipolis, Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale et biobanque du CHUN, Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale, 30, avenue de la Voie-romaine, 06001 Nice cedex 01, France Pour citer cet article : Hofman V, Ilie M, Long E, Lassalle S, Butori C, Bence C, Washetine K, Lalvee S, Hofman P. Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites. Bull Cancer 2014 ; 101 : 958-65. doi : 10.1684/bdc.2014.2041.
Résumé. La médecine « personnalisée » ou « stratifiée » en oncologie pulmonaire impose le développement de tests « compagnons » dans les laboratoires pour mettre en évidence des altérations génomiques accessibles à des thérapies ciblées. La réalisation de ces tests « compagnons » doit être encadrée par une démarche de qualité optimale afin d’administrer aux patients les molécules d’intérêt en se basant sur des résultats robustes. La grande majorité de ces tests utilise une approche par biologie moléculaire. Toutefois, grâce à la commercialisation d’anticorps à visée théranostique utilisables sur des tissus fixés, l’approche immunohistochimique (IHC) peut être une alternative à la biologie moléculaire. Certains de ces anticorps sont ou seront probablement rapidement utilisés en routine (comme les anticorps anti-ALK ou anti-MET), alors que d’autres sont utilisés de fac¸on plus restreinte à ce jour (comme les anticorps anti-BRAF V600E, anti-ROS1, et anti-EGFR mutés). Nous décrivons dans cette revue les avantages et les limites de l’approche IHC (notamment par rapport aux techniques de biologie moléculaire) dans le cadre de la médecine personnalisée en oncologie pulmonaire. Nous discutons également l’opportunité de faire accréditer les tests d’IHC dans ce contexte.
Introduction Le cancer du poumon est la première cause de décès par cancer dans le monde, notamment en France, et son incidence dans la population féminine est croissante dans notre
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Key words: lung cancer, targeted therapy, personalized medicine, immunohistochemistry, molecular biology, accreditation
pays malgré les campagnes d’information et de prévention. En Chine par exemple, le nombre de décès avoisine les 600 000 cas par an et ce nombre devrait encore augmenter dans le futur [1]. Hormis les facteurs de risque « classiques » Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
doi : 10.1684/bdc.2014.2041
Mots clés : cancer du poumon, thérapie ciblée, médecine personnalisée, immunohistochimie, biologie moléculaire, accréditation
Abstract. The concept of personalized or stratified medicine in thoracic oncology have led to the development of companion diagnostic testing in the laboratories in order to detect genomic alterations which can be targeted by therapeutic molecules. The use of these companion tests has to be associated with an optimized quality control with the aim of getting solid results before treatment administration to the patients. The great majority of these tests is based on molecular biology approach. However, since the commercial availability of different antibodies targeting genomic alterations which can be used in formalin fixed paraffin sections, an alternative method to the molecular approach is the immunohistochemistry (IHC). Some of these antibodies are or will be probably soon used in a daily routine practice (such as anti-ALK or anti-MET antibodies). Other antibodies have currently a more restricted use in thoracic oncology (such as anti-BRAF V600E, anti-ROS1 and mutation-specific anti-EGFR antibodies). In this review, we aim to detail the advantages and the limits of IHC method in thoracic oncology field for personalized medicine, in particular comparatively to the molecular biology technology. Moreover, we discuss the opportunity to provide accredited IHC tests in the context of stratified medicine for lung cancer patients.
Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites (exposition tabagique ou professionnelle), la pollution atmosphérique est maintenant responsable d’environ 9 % des cancers pulmonaires à travers le monde [2]. Cinq ans après le diagnostic, le pourcentage de décès lié au cancer du poumon est très élevé (15 %, tous les stades cTNM ou pTNM confondus) [3]. Certaines thérapies ciblées sur des sous-populations de tumeurs présentant des altérations génomiques spécifiques ont amélioré de quelques mois la survie de patients dans les stades avancés de la maladie. Cependant, le pronostic de ces cancers est dépendant essentiellement d’une résection chirurgicale complète aux stades précoces, les thérapies ciblées n’ayant pas encore d’indication dans ces stades. La récidive est alors toutefois fréquente, un décès survenant dans 25 % des stades I, cinq ans après une résection complète. C’est dans ce contexte que l’industrie pharmaceutique développe de nombreuses molécules ciblant des altérations génomiques présentes dans les cellules carcinomateuses pulmonaires. En France, certaines molécules ont obtenu une autorisation de mise sur le marché (AMM). En 2013, seules les molécules ciblant les mutations activatrices de l’EGFR ou un réarrangement d’EML4-ALK sont utilisées par les oncologues pulmonaires dans le cadre d’une AMM. D’autres molécules déjà utilisées aujourd’hui dans le cadre d’essai clinique obtiendront certainement une AMM dans les prochains mois. Cette médecine personnalisée (de plus en plus appelée médecine « stratifiée » ou médecine de « précision ») va donc certainement s’accroître de fac¸on spectaculaire dans les mois à venir ou dans un futur proche. Dans ce contexte, la sollicitation des oncologues vis-à-vis des laboratoires (de pathologie et de biologie) va donc considérablement augmenter. L’administration des nouvelles thérapies ciblées dépend de la mise en évidence au sein de la tumeur, de mutation, d’amplification génique, de réarrangement chromosomique ou d’une surexpression protéique. La plupart de ces altérations génomiques sont actuellement recherchées par des techniques de biologie moléculaire. Ainsi, une grande majorité de ces analyses sont réalisées sur les plateformes de génétique moléculaires labellisées par l’Institut national du cancer (INCa). Une alternative récente (ou une approche complémentaire) est apparue replac¸ant en première ligne l’anatomo-pathologiste (et donc l’analyse morphologique) dans l’évaluation théranostique des cancers pulmonaires : il s’agit d’évaluer le niveau d’expression des molécules cibles par immunohistochimie (IHC). Dans ce cadre, plusieurs anticorps sont commercialisés ou sont en cours de développement et le pathologiste doit maintenant faire face à de nouvelles demandes de la part de l’oncologue. Cette revue a pour objectif d’analyser les principaux anticorps disponibles pour la mise en évidence par IHC de cibles thérapeutiques en oncologie pulmonaire. Nous évaluerons les avantages et les limites de cette approche morphologique par rapport aux méthodes de biologie moléculaire. Nous aborderons ensuite l’avenir possible de ce domaine de l’anatomopathologie, notamment dans le cadre de la démarche d’accréditation des laboratoires et de l’arrivée à court terme des nouvelles techniques de séquenc¸age. Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
Principaux anticorps utilisés en immunohistochimie (et en immunocytochimie) dans le cadre de la médecine personnalisée des cancers du poumon Plusieurs anticorps sont commercialisés dans le but de mettre en évidence sur des coupes tissulaires déparaffinées (ou des préparations cytologiques) des biomarqueurs associés à l’administration de thérapies ciblées en oncologie pulmonaire (figure 1). Certains de ces anticorps (anticorps anti-ALK et anti-ROS1) peuvent être employés en complément de la technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH), même si l’objectif est certainement de pouvoir se substituer à cette dernière méthode. D’autres anticorps représentent une alternative au séquenc¸age (anticorps anti-EGFR mutés, anti-BRAF V600E et anti-NRAS). Enfin, certains de ces anticorps visent à mettre en évidence une surexpression protéique (anticorps anti-MET par exemple). On peut arbitrairement classer ces anticorps selon leur application en pratique quotidienne, leur utilisation étant variable actuellement en routine dans les laboratoires de pathologie. Ainsi, il est probable que les anticorps anti-ALK soient maintenant utilisés dans la plupart des laboratoires, notamment ceux prenant en charge des prélèvements tumoraux d’origine pulmonaire. Plusieurs algorithmes d’utilisation sont alors proposés [4, 5]. Un de ceux les plus utilisés dans le cadre des adénocarcinomes broncho-pulmonaires chez des patients au stade IIIB/IV, consiste à demander d’emblée une analyse IHC anti-ALK et de compléter l’analyse par technique FISH dans un deuxième temps si la tumeur ne possède pas les mutations de KRAS et de l’EGFR et/ou si l’IHC est fortement positive. Il existe plusieurs clones d’anticorps anti-ALK et la sensibilité de ces anticorps est variable selon les séries. Pour un même clone, cette sensibilité est également variable selon les publications [6-9]. Un des points les plus difficiles est d’apprécier l’intensité du marquage obtenu en intégrant le pourcentage de cellules tumorales marquées avant d’affirmer un résultat « positif ». Le deuxième anticorps qui pourrait être utilisé assez vite en routine est l’anticorps anti-MET [10, 11]. Pour cette cible moléculaire, la technique FISH met en évidence une amplification génique et le séquenc¸age une mutation, mais seule l’IHC permet la détection d’une surpression protéique indiquant l’administration de la thérapie ciblée sur cette molécule [10, 11]. L’anticorps anti-MET devrait donc être systématiquement utilisé sur tous les carcinomes pulmonaires non à petites cellules de stade IIIB/IV [11]. Ainsi, les anticorps anti-ALK et anti-MET seront probablement utilisés en 2014 dans tous les laboratoires de pathologie. Une deuxième « catégorie » d’anticorps sont ou seront probablement moins utilisés compte tenu de la rareté des altérations génomiques qu’ils peuvent détecter. Il s’agit de l’anticorps anti-ROS-1 et de l’anticorps anti-BRAF V600E [12-14]. Les carcinomes ROS1 positifs doivent bénéficier d’un traitement par le crizotinib disponible dans la plupart des centres de soin. À l’inverse, les carcinomes mutés BRAF V600E sont inclus dans des essais cliniques permettant
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Figure 1. Immunohistochimie utilisant les anticorps anti-ALK (A), anti-MET (B), anti-ROS1 (C), anti-BRAF V600E (D), et anti-EGFR muté (E) dans différents cas d’adénocarcinome pulmonaire. A) clone D5F3. B) clone SP44. C) clone D4D6. D) clone VE1. E) clone 43B2 (A-E : immunoperoxydase, × 100 ; A-E encart immunoperoxydase, × 400). l’administration d’inhibiteur de BRAF, essais réalisés dans un nombre limité de centres de soin. De fac¸on plus exceptionnelle, certains anticorps (comme les anticorps anti-NRAS mutés, anti-PTEN, anti-AKT, etc.) peuvent être utilisés, mais l’administration d’un traitement consécutivement au résultat d’IHC est actuellement réservée à de très rares centres ou bien est inexistante. La dernière « catégorie » d’anticorps est représentée par des anticorps dirigés spécifiquement contre certaines mutations activatrices de l’EGFR [15-20]. Ces anticorps sont en fait de moins en moins employés. Une des indications peut être de les utiliser si la recherche des mutations de l’EFGR par séquenc¸age n’a pu être effectuée pour des raisons « techniques » (ADN non amplifiable et/ou dégradé) [4, 21, 22]. Par ailleurs, l’hétérogénéité moléculaire des cancers pulmonaires pour les mutations de l’EGFR est encore discutée [22, 23, 24]. Ainsi, il pourrait exister une discordance des résultats obtenus par biologie moléculaire (parfois
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négatifs) et une analyse en IHC positive sur certains territoires tumoraux. L’emploi des anticorps pourrait alors être discuté en cas de résultat négatif en biologie moléculaire et dans un contexte épidémiologique particulier. La principale limite à l’utilisation de ces anticorps est liée au fait qu’ils ne reconnaissent que certaines mutations de l’EGFR (délétion de l’exon 19 ou mutation activatrice L858R). Même si ces dernières mutations sont les plus fréquentes, il existe également plusieurs dizaines de mutations sur ce gène, potentiellement accessibles à une thérapie ciblée, rendant incontournable l’approche par biologie moléculaire. Une des limites supplémentaires à l’emploi de ces anticorps (cela étant une règle globale pour l’IHC utilisant les anticorps à visée théranostique) est la définition du seuil d’intensité du signal et du pourcentage de cellules tumorales positives à considérer. Ainsi affirmer un résultat « positif » repose sur un critère semi-quantitatif. Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites Enfin, en marge de ces anticorps, le développement récent de nouvelles immunothérapies en oncologie thoracique a fait apparaître de nouvelles cibles moléculaires à détecter par IHC [25, 26]. Ainsi les anticorps anti-PD1 et anti-PDL-1 devront être testés dans les laboratoires d’ACP [25, 26].
Quels sont les points forts de l’immunohistochimie dans le cadre des tests à visée théranostique ? « L’histologie moléculaire » permet d’associer une évaluation morphologique (appréciation du type histologique, du pourcentage de cellules tumorales, de la richesse de la composante inflammatoire, et de l’importance de la nécrose) à une évaluation portant sur la cible moléculaire d’intérêt (compartiment tissulaire et cellulaire reconnu par l’anticorps, intensité d’expression du signal, pourcentage de cellules tumorales reconnues par l’anticorps). Ainsi, l’ensemble des informations recueillies pour rendre le résultat se fait en un seul temps. Il est de plus facile d’inclure des contrôles témoins positifs et négatifs (internes ou externes). À l’inverse, la réalisation d’un test de biologie moléculaire est associé à des données morphologiques transmises par le pathologiste et ce test de génétique somatique est donc « désolidarisé physiquement » du test d’ACP. L’évaluation du résultat est donc toujours donnée « sous réserve » de l’appréciation du pathologiste et une confrontation des deux informations (pathologie et biologie moléculaire) est alors incontournable pour valider le résultat final de biologie moléculaire. L’IHC est un test rapidement réalisable (en théorie sur une journée). Le délai entre la réception d’une biopsie fixée dans le formol, la réalisation du test d’IHC et la transmission du résultat au clinicien peut être de 72 heures si l’on intègre l’inclusion en paraffine de la biopsie fixée à j1, les coupes tissulaires avec une première évaluation morphologique à j2 sur une coloration standard puis une demande du test d’IHC le même jour, et l’évaluation du test et une validation du compte rendu à j3. Selon les pratiques, ces résultats peuvent être transmis plus rapidement ou dans un délai plus long. Comparativement, un test de biologie moléculaire va se réaliser après l’étape à j1 et j2, sachant qu’il faut dès j2 (ce qui est rarement le cas) faire des copeaux des tissus inclus en paraffine ou des lames blanches pour l’extraction de l’ADN, étape souvent précédée d’une macrodissection de la zone la plus riche en cellules tumorales sélectionnée sur la section tissulaire par le pathologiste. Il faut aussi intégrer la transmission de l’échantillon au secteur de génétique moléculaire et son enregistrement (soit ce secteur se trouve dans le même laboratoire et à proximité ; soit il se trouve à distance), l’extraction d’ADN (puis l’évaluation quantitative et éventuellement qualitative de l’ADN extrait), l’étape d’amplification par PCR et au final, l’analyse des séquences. Une confrontation des résultats entre le biologiste (ou pathologiste) moléculaire et le pathologiste « morphologiste » doit en principe conduire à la réalisation du compte rendu final (bien qu’en pratique, cela soit assez rarement mis en place de fac¸on systématique). Ainsi entre la réception au laboratoire de pathologie de la biopsie fixée Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
dans le formol et le résultat validé de pathologie moléculaire, on peut estimer qu’il existe un délai moyen de sept à dix jours. Les techniques d’IHC sont standardisées et réalisées sur des automates contrôlant les différentes étapes analytiques. La plupart de ces automates sont marqués CE-IVD. Après une période de formation et d’habilitation, le personnel technique dédié au secteur d’IHC est assez vite autonome. Ainsi, l’expertise technique semble moins difficile à acquérir et à maintenir dans le secteur d’IHC que celle requise dans le secteur de biologie moléculaire. En effet, dans ce dernier secteur, les équipements nécessaires aux analyses de séquences deviennent complexes et le workflow doit intégrer actuellement des étapes plus nombreuses que celles présentes dans un secteur d’IHC [22, 27]. Les risques d’erreur liés à une « contamination » (conduisant à des résultats faussement positifs ou faussement négatifs) sont exceptionnels en IHC. En effet, le fait que le pathologiste gère l’analyse morphologique avant de demander une étude par IHC, que l’identification sur la lame est identique et que des contrôles externes soient associés, rend le risque pratiquement nul. À l’inverse, la contamination interéchantillon est toujours possible en génétique somatique du fait de l’absence de contrôle morphologique réalisé dans le même temps analytique. L’amplification d’un ADN appartenant à un autre patient et présent par exemple sur un rasoir de microtome mal ou non nettoyés ou non changé systématiquement entre chaque bloc de tumeur, une contamination lors des étapes de PCR ou de purification de l’ADN, sont des sources potentielles d’erreur [4, 22]. Même si des faux négatifs peuvent être présents en IHC (par hypo ou hyperfixation), ceux-ci sont probablement plus fréquents en biologie moléculaire (absence d’amplification de l’ADN due à sa dégradation et/ou à une quantité trop faible) [4]. Concernant le coût, l’IHC est le plus souvent peu onéreuse pour chaque test et en principe moins chère qu’une analyse réalisée en biologie moléculaire (recherche d’une mutation par séquenc¸age ou par technique FISH) (tableau 1). Cela est particulièrement vrai lorsqu’on utilise pour la biologie moléculaire, des kits d’amplification et des tests analytiques avec des produits marqués CE-IVD. Cela peut parfois se discuter pour certains anticorps dont le prix semble augmenter rapidement et si l’on considère que des examens de biologie moléculaire peuvent être effectués avec des techniques et des sondes développées en interne (technique home made). À cela il faut intégrer le temps dédié de personnel technique et médical certainement plus important en biologie moléculaire qu’en IHC selon la méthode utilisée (tableau 1). Lorsque l’ADN n’est pas amplifiable (peu d’ADN disponible, ADN très fragmenté par la fixation et/ou la nécrose), l’IHC à visée théranostique peut toujours être effectuée sur le même fragment tissulaire (à condition d’avoir pu préserver le matériel inclus en paraffine en économisant le nombre de coupes tissulaires réalisées pour la coloration standard et les premiers tests d’IHC). Cela est particulièrement vrai pour les échantillons de très petite taille et pour les échantillons tissulaires nécrosés [28, 29].
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V. Hofman, et al. Tableau 1. Évaluation comparative de l’estimation des coûts d’un test de mise en évidence de la mutation BRAF V600E par biologie moléculaire (pyroséquenc¸age) et par immunohistochimie. A) Estimation des coûts réels en tenant compte du temps horaire technique et médical et des différents réactifs et consommables. Ces coûts sont ici estimés selon les méthodes effectuées au laboratoire de pathologie clinique et expérimentale du CHU de Nice (le test de pyroséquenc¸age utilise des réactifs commercialisés marqués CE-IVD). Ces coûts ne tiennent pas compte ici du temps de secrétariat, légèrement plus long pour les examens de biologie moléculaire que pour les tests d’immunohistochimie intégrés dans le compte rendu d’anatomo-cytopathologie. B) Estimation des coûts selon la cotation de la CCAM. A) Évaluation du coût « réel » d’un test BRAF V600E (en D , HT) Test de pyroséquenc¸age sur des coupes de paraffine
Test d’immunohistochimie
KIT d’extraction Étape de PCR KIT de pyroséquenc¸age Temps technique pré-analytique (1 h) Temps technique analytique (2 h 30 min)
4,50 3 45 40 100
AC anti-BRAF V600E (VE1) Kit de détection Optiview DAB KIT d’amplification Optiview Temps technique (1 h) Temps médical (10 min)
50 4,65 2 40 8
Temps médical/lecture de séquences (30 min)
40
TOTAL pour un test BRAF V600E
104,65 D HT
TOTAL pour un test BRAF V600E 232,5 D HT B) Évaluation du coût selon la cotation des actes de la CCAM et des actes hors nomenclatures (PHN) d’un test BRAF V600E (en D , HT) Test de pyroséquenc¸age sur des coupes de paraffine
Test d’immunohistochimie
Enregistrement sur la base de données Extraction de l’ADN Conservation de l’ADN
PHN 50 PHN 320 PHN 50
Désarchivage du bloc : PHN 100 ZZQP140 Lame blanche : PHN10
28 56 2,80
Étape de PCR Recherche d’une mutation TOTAL des PHN
PHN 90 PHN260 PHN 770
TOTAL pour un test BRAF V600E
86,80 D HT
TOTAL pour un test BRAF V600E
215,60 D HT
Quels sont les points faibles de l’immunohistochimie dans le cadre des tests à visée théranostique ? Les analyses d’IHC nécessitent une maîtrise optimale de la phase pré-analytique : gestion du temps d’ischémie froide (en particulier pour les pièces opératoires), du temps de fixation (et ainsi des délais d’acheminement des échantillons depuis le bloc opératoire ou d’endoscopie jusqu’au laboratoire), de la nature du fixateur (les substituts du formol et les fixateurs
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contenant de l’acide acétique peuvent grandement influencer la qualité du signal obtenu), et des étapes d’inclusion et de déplissage des coupes sur une platine chauffante (dont il est nécessaire de contrôler la température) (figure 2) [28-33]. La sensibilité des différents épitopes aux différentes étapes de la phase pré-analytique est variable. Ainsi, il est important pour chaque test d’IHC à visée théranostique, de faire un dossier de validation des méthodes et d’évaluer les différents risques liés à la méthode [34]. Même si l’ADN utilisé dans le cadre de la recherche de mutations est susceptible d’être modifié
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Figure 2. Influence du temps de fixation par la formaldéhyde sur l’expression immunohistochimique de ALK d’un adénocarcinome pulmonaire (résection chirurgicale d’un lobe pulmonaire). A) Temps de fixation : 10 heures. B) Temps de fixation : 48 heures. C) Temps de fixation : 72 heures (A-C : anticorps anti-ALK, clone 5A4 ; immunoperoxydase, × 100).
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Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites par certaines étapes de la phase pré-analytique, celui-ci est en principe moins sensible à la dégradation que les épitopes antigéniques. Pour la détection d’une même molécule en IHC, il peut exister plusieurs clones d’anticorps. La spécificité de ces clones peut être variable, entraînant lors de l’utilisation de certains anticorps des résultats différents pour un même prélèvement [35]. De la même fac¸on, la sensibilité de ces anticorps peut varier d’un clone à l’autre, d’où la possibilité de faux négatifs. Il est aussi parfois étonnant de voir que pour un même clone, cette sensibilité varie selon les séries publiées et selon l’industriel commercialisant cet anticorps [35]. Un point critique est l’établissement du seuil de positivité du signal obtenu en IHC selon l’anticorps utilisé. En effet, la qualité et l’intensité du signal sont définies de fac¸on subjective par le pathologiste et peut donc varier d’un pathologiste à l’autre. Le système de cotation par le score H intègre le pourcentage de cellules marquées et l’intensité de ces marquages (de 0 à 3+), ce qui peut rendre la méthode semi quantitative [36]. Il s’en suit des algorithmes souvent établis assez théoriquement par les industriels dans un laboratoire centralisé et dont l’application est parfois incomprise ou difficile pour les pathologistes, notamment sur des échantillons de petite taille ou bien largement nécrosés. Des contrôles inter observateurs présents dans un même laboratoire ou dans plusieurs laboratoires doivent aussi s’assurer de la reproductibilité et de la concordance des résultats [37]. Finalement, le seuil d’intensité du signal obtenu en IHC doit être interprété selon la bonne gestion des phases pré-analytiques et en intégrant certains paramètres dans l’interprétation (en particulier la durée de fixation au formol ou la nature du fixateur) (figure 2). De nombreuses mutations peuvent survenir sur un même gène, même si certaines d’entre elles sont plus fréquentes selon le gène considéré. Les anticorps développés pour les analyses d’IHC à visée théranostique ciblent une mutation précise et ne peuvent donc pas détecter l’ensemble des mutations d’intérêt potentiellement présentes sur un même gène [12, 18]. À l’inverse les techniques de séquenc¸age (dite « sans a priori ») peuvent parfaitement couvrir plusieurs dizaines de mutations présentes sur un même gène [12]. La nécessité de devoir détecter plusieurs altérations génomiques dans un même échantillon (même de petite taille) est maintenant établie en oncologie pulmonaire, du fait de la mise à disposition ou de l’arrivée de plusieurs thérapies ciblées. Le besoin futur d’analyser rapidement et en un seul temps des centaines d’altérations génomiques conduit les laboratoires de pathologie ou de génétique moléculaire d’envisager à court terme l’implantation des techniques nouvelles de séquenc¸age [38]. Ces approches doivent être validées et confrontées aux méthodes de séquenc¸age actuel. Dans ce contexte, on peut se demander quelle sera donc la place de l’IHC à visée théranostique dans les années à venir ? Devant des échantillons de petite taille, la stratégie d’optimisation de l’approche IHC devient de plus en plus difficile à établir [28]. En effet, selon le tableau clinique et Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
histologique, plusieurs anticorps peuvent entrer en concurrence au même moment et les immunomarquages doivent être alors « priorisés ». Il est donc nécessaire d’optimiser la prise en charge initiale des coupes tissulaires réalisées à partir du bloc inclus en paraffine, en effectuant d’emblée plusieurs coupes (ou « lames blanches ») pour faire une première série d’immunomarquage, puis selon les résultats obtenus, faire une nouvelle série d’IHC sur ces coupes mises en réserve, sans avoir à recouper une nouvelle fois le bloc tissulaire inclus en résine paraffine. Cela a pour avantage de mieux préserver le matériel tissulaire initialement inclus dans la résine paraffine (matériel qui sera nécessaire en parallèle pour réaliser les approches de biologie moléculaire), et d’accélérer aussi probablement les délais de transmission des résultats aux cliniciens. Il est important dans ce cadre-là de bien préserver les structures protéiques (pour les études en IHC) et nucléiques (pour les analyses par FISH) présentes sur ces « lames blanches » mis en réserve, en les conservant à l’abri de la lumière et de la poussière et à 4 ◦ C et jusqu’à leur utilisation. La démarche d’accréditation est non obligatoire pour les laboratoires d’ACP, alors que les laboratoires de biologie moléculaire devront être accrédités selon la norme ISO 15189 pour pouvoir donner des résultats dès 2016 [39]. Cela entraînera une concurrence évidente des approches réalisées dans les laboratoires d’ACP et de génétique somatique pour la détection d’une même altération génomique. Ce point est détaillé dans le chapitre suivant.
Quelle place pour l’accréditation selon la norme ISO 15189 pour les tests d’immunohistochimie à visée théranostique ? Les bonnes pratiques des laboratoires de pathologie se font dans le cadre d’une réglementation et d’exigences qui varient d’un pays à l’autre. Ainsi aux États-Unis, l’accréditation effectuée par le Collège américain des pathologistes (« CAP ») est un élément incontournable pour réaliser des actes de pathologie. De la même fac¸on, dans certain pays européens comme la Belgique, l’accréditation selon la norme ISO 15189 permet aux laboratoires d’ACP de rendre des résultats. En France, le guide des bonnes pratiques établit une « feuille de route » à respecter afin de réaliser dans les meilleures conditions l’ensemble des examens d’ACP, en particulier les tests d’immunohistochimie. Les laboratoires de biologie médicale, notamment les laboratoires de génétique somatique, sont soumis en France à une réglementation différente, avec une obligation d’être accrédité selon la norme ISO 15189 d’ici 2016, faute de quoi ces laboratoires ne pourront plus donner des résultats pour les patients [27, 34, 39]. Dans ce contexte, alors qu’une incertitude planait quant à la nécessité pour les laboratoires d’ACP d’être accrédités selon cette norme avec la même échéance, une loi parue au mois de juin 2013 ne rend plus obligatoire cette accréditation en France pour pouvoir réaliser les tests d’IHC [39]. De ce fait, la
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V. Hofman, et al. démarche d’accréditation est obligatoire en France pour les actes de biologie moléculaire, alors qu’elle est volontariste pour les actes d’IHC. Quelles peuvent être les conséquences de cette réglementation récente ? L’accréditation selon la norme ISO 15189 permet de maîtriser deux volets, le système de management de la qualité (chapitre 4 de la norme) et les « exigences métiers et les compétences techniques » (chapitre 5 de la norme) [33]. L’accréditation permet ainsi d’avoir une reconnaissance et de donner une excellente visibilité vis-à-vis des prescripteurs, puisqu’elle garantie la réalisation de tests de qualité et des résultats maîtrisés. Une réglementation différente pour les pratiques réalisées dans les laboratoires de génétique et d’ACP peut conduire les prescripteurs à faire des choix. Par exemple, la réalisation de tests « compagnons » ne pourrait avoir lieu que dans des laboratoires accrédités. Étant donné que la totalité des laboratoires de génétique devront être accrédité en 2016, ces tests ne pourraient donc plus se faire dans des laboratoires d’ACP non accrédités. Ainsi, les tests d’IHC associée aux thérapies ciblées n’auraient de « reconnaissance » que s’ils étaient réalisés dans un laboratoire accrédité. La prise en charge et le remboursement des tests (de biologie moléculaire et d’IHC) réalisés dans le domaine de la médecine personnalisée ne pourraient se faire que si ces tests étaient réalisés dans un laboratoire accrédité. Potentiellement, la reconnaissance par l’INCa de ces tests réalisés par les laboratoires d’ACP pourrait être associée à leur accréditation. En pratique, si l’on regarde par exemple la réglementation européenne, l’administration du crizotinib aux patients atteints d’un cancer du poumon présentant un réarrangement de EML4-ALK, nécessite l’utilisation d’un test « validé ». Ainsi, si le gold standard est ici la méthode de FISH rien n’interdit d’associer l’administration du crizotinib à un test d’IHC positif. Il est certain que seuls les laboratoires accrédités pourraient rendre des résultats permettant ou non l’administration du traitement.
Quelles perspectives pour les tests d’immunohistochimie ou d’immunocytochimie à visée théranostique ? Les différents anticorps cités plus haut peuvent être utilisés sur du matériel cytologique, en particulier isolé à partir de « biopsies liquides », c’est-à-dire à partir de prélèvements sanguins. Ainsi, certaines études ont mis en évidence par immunocytochimie l’expression de ALK ou de BRAF V600E sur des cellules tumorales circulantes [40, 41]. Ces résultats étaient concordants avec ceux obtenus par les approches de FISH et/ou de séquenc¸age. On peut donc envisager, si l’approche par biopsie liquide et l’analyse cytopathologique se développe dans le secteur de soin, que l’ICC à but théranostique occupe une place intéressante. Compte tenu de l’arrivée des techniques de biologie moléculaire de multiplexage ou de nouvelles générations, peut-on entrevoir à moyen terme la disparition de ces tests d’IHC ? La demande des oncologues pulmonaires s’est élargie
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à la recherche de nombreuses mutations potentiellement accessibles à une thérapie ciblée. Dans ce contexte, les pathologistes moléculaires doivent donner les résultats sur plusieurs cibles et dans un court délai. Cela impose de plus en plus une recherche de ces altérations génomiques en un seul temps et non pas de fac¸on séquentielle. L’approche par les techniques nouvelles de séquenc¸age ou « NGS » est donc une méthode séduisante pour répondre à ce besoin [38, 42, 43]. Le frein actuel à l’utilisation en routine du « NGS » est l’absence de recul suffisant dans le cadre de l’offre de soin. Des dossiers de validation de méthode doivent être réalisés, incluant des évaluations externes de la qualité. Toutefois, il est certain que cette approche pourra probablement être implantée en routine dans les laboratoires et être utilisée aussi à partir d’échantillons cytologiques [42]. Ainsi, l’IHC pourrait ne plus être utilisée à moyen terme, sauf si des techniques de multiplexage en IHC ciblant en un seul temps trois ou quatre molécules sont rapidement accessibles sur le marché. Il faut aussi garder à l’esprit que seule l’IHC/ICC permet une confrontation morpho-moléculaire en un seul temps et qu’elle est la méthode alternative si les autres approches ne sont pas disponibles ou utilisables (notamment en cas d’ADN non amplifiable).
Conclusion Dans le domaine de l’oncologie pulmonaire, l’IHC à visée théranostique est une approche rapide, simple, peu couteuse. Cette méthode doit toutefois être encadrée de bonnes pratiques, et notamment d’une gestion optimale de la phase pré-analytique. La concurrence de cette approche avec les différentes techniques de biologie moléculaire se discute, en particulier si l’on envisage l’IHC comme le test compagnon d’une thérapie ciblée. Une accréditation de l’IHC selon la norme ISO 15189 doit conforter cette approche. Malgré le développement des nouvelles technologies de biologie moléculaire, l’IHC peut rester une méthode complémentaire qui permets de visualiser en un seul temps le tissu tumoral (et les cellules) et le signal recherché, limitant ainsi certains pièges liés à la biologie moléculaire [4]. Liens d’intérêts : Les auteurs déclarent ne pas avoir de lien d’intérêt en rapport avec cet article.
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Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites Immunohistochemistry and personalised medicine in lung oncology: advantages and limitations Véronique Hofman, Marius Ilie, Elodie Long, Sandra Lassalle, Catherine Butori, Coraline Bence, Kevin Washetine, Salomé Lalvee, Paul Hofman Article rec¸u le 09 janvier 2014, accepté le 31 mars 2014 Tirés à part : V. Hofman
Hôpital Pasteur, Centre Hospitalo-universitaire, Université de Nice Sophia-Antipolis, Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale et biobanque du CHUN, Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale, 30, avenue de la Voie-romaine, 06001 Nice cedex 01, France Pour citer cet article : Hofman V, Ilie M, Long E, Lassalle S, Butori C, Bence C, Washetine K, Lalvee S, Hofman P. Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites. Bull Cancer 2014 ; 101 : 958-65. doi : 10.1684/bdc.2014.2041.
Résumé. La médecine « personnalisée » ou « stratifiée » en oncologie pulmonaire impose le développement de tests « compagnons » dans les laboratoires pour mettre en évidence des altérations génomiques accessibles à des thérapies ciblées. La réalisation de ces tests « compagnons » doit être encadrée par une démarche de qualité optimale afin d’administrer aux patients les molécules d’intérêt en se basant sur des résultats robustes. La grande majorité de ces tests utilise une approche par biologie moléculaire. Toutefois, grâce à la commercialisation d’anticorps à visée théranostique utilisables sur des tissus fixés, l’approche immunohistochimique (IHC) peut être une alternative à la biologie moléculaire. Certains de ces anticorps sont ou seront probablement rapidement utilisés en routine (comme les anticorps anti-ALK ou anti-MET), alors que d’autres sont utilisés de fac¸on plus restreinte à ce jour (comme les anticorps anti-BRAF V600E, anti-ROS1, et anti-EGFR mutés). Nous décrivons dans cette revue les avantages et les limites de l’approche IHC (notamment par rapport aux techniques de biologie moléculaire) dans le cadre de la médecine personnalisée en oncologie pulmonaire. Nous discutons également l’opportunité de faire accréditer les tests d’IHC dans ce contexte.
Introduction Le cancer du poumon est la première cause de décès par cancer dans le monde, notamment en France, et son incidence dans la population féminine est croissante dans notre
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Key words: lung cancer, targeted therapy, personalized medicine, immunohistochemistry, molecular biology, accreditation
pays malgré les campagnes d’information et de prévention. En Chine par exemple, le nombre de décès avoisine les 600 000 cas par an et ce nombre devrait encore augmenter dans le futur [1]. Hormis les facteurs de risque « classiques » Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
doi : 10.1684/bdc.2014.2041
Mots clés : cancer du poumon, thérapie ciblée, médecine personnalisée, immunohistochimie, biologie moléculaire, accréditation
Abstract. The concept of personalized or stratified medicine in thoracic oncology have led to the development of companion diagnostic testing in the laboratories in order to detect genomic alterations which can be targeted by therapeutic molecules. The use of these companion tests has to be associated with an optimized quality control with the aim of getting solid results before treatment administration to the patients. The great majority of these tests is based on molecular biology approach. However, since the commercial availability of different antibodies targeting genomic alterations which can be used in formalin fixed paraffin sections, an alternative method to the molecular approach is the immunohistochemistry (IHC). Some of these antibodies are or will be probably soon used in a daily routine practice (such as anti-ALK or anti-MET antibodies). Other antibodies have currently a more restricted use in thoracic oncology (such as anti-BRAF V600E, anti-ROS1 and mutation-specific anti-EGFR antibodies). In this review, we aim to detail the advantages and the limits of IHC method in thoracic oncology field for personalized medicine, in particular comparatively to the molecular biology technology. Moreover, we discuss the opportunity to provide accredited IHC tests in the context of stratified medicine for lung cancer patients.
Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites (exposition tabagique ou professionnelle), la pollution atmosphérique est maintenant responsable d’environ 9 % des cancers pulmonaires à travers le monde [2]. Cinq ans après le diagnostic, le pourcentage de décès lié au cancer du poumon est très élevé (15 %, tous les stades cTNM ou pTNM confondus) [3]. Certaines thérapies ciblées sur des sous-populations de tumeurs présentant des altérations génomiques spécifiques ont amélioré de quelques mois la survie de patients dans les stades avancés de la maladie. Cependant, le pronostic de ces cancers est dépendant essentiellement d’une résection chirurgicale complète aux stades précoces, les thérapies ciblées n’ayant pas encore d’indication dans ces stades. La récidive est alors toutefois fréquente, un décès survenant dans 25 % des stades I, cinq ans après une résection complète. C’est dans ce contexte que l’industrie pharmaceutique développe de nombreuses molécules ciblant des altérations génomiques présentes dans les cellules carcinomateuses pulmonaires. En France, certaines molécules ont obtenu une autorisation de mise sur le marché (AMM). En 2013, seules les molécules ciblant les mutations activatrices de l’EGFR ou un réarrangement d’EML4-ALK sont utilisées par les oncologues pulmonaires dans le cadre d’une AMM. D’autres molécules déjà utilisées aujourd’hui dans le cadre d’essai clinique obtiendront certainement une AMM dans les prochains mois. Cette médecine personnalisée (de plus en plus appelée médecine « stratifiée » ou médecine de « précision ») va donc certainement s’accroître de fac¸on spectaculaire dans les mois à venir ou dans un futur proche. Dans ce contexte, la sollicitation des oncologues vis-à-vis des laboratoires (de pathologie et de biologie) va donc considérablement augmenter. L’administration des nouvelles thérapies ciblées dépend de la mise en évidence au sein de la tumeur, de mutation, d’amplification génique, de réarrangement chromosomique ou d’une surexpression protéique. La plupart de ces altérations génomiques sont actuellement recherchées par des techniques de biologie moléculaire. Ainsi, une grande majorité de ces analyses sont réalisées sur les plateformes de génétique moléculaires labellisées par l’Institut national du cancer (INCa). Une alternative récente (ou une approche complémentaire) est apparue replac¸ant en première ligne l’anatomo-pathologiste (et donc l’analyse morphologique) dans l’évaluation théranostique des cancers pulmonaires : il s’agit d’évaluer le niveau d’expression des molécules cibles par immunohistochimie (IHC). Dans ce cadre, plusieurs anticorps sont commercialisés ou sont en cours de développement et le pathologiste doit maintenant faire face à de nouvelles demandes de la part de l’oncologue. Cette revue a pour objectif d’analyser les principaux anticorps disponibles pour la mise en évidence par IHC de cibles thérapeutiques en oncologie pulmonaire. Nous évaluerons les avantages et les limites de cette approche morphologique par rapport aux méthodes de biologie moléculaire. Nous aborderons ensuite l’avenir possible de ce domaine de l’anatomopathologie, notamment dans le cadre de la démarche d’accréditation des laboratoires et de l’arrivée à court terme des nouvelles techniques de séquenc¸age. Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
Principaux anticorps utilisés en immunohistochimie (et en immunocytochimie) dans le cadre de la médecine personnalisée des cancers du poumon Plusieurs anticorps sont commercialisés dans le but de mettre en évidence sur des coupes tissulaires déparaffinées (ou des préparations cytologiques) des biomarqueurs associés à l’administration de thérapies ciblées en oncologie pulmonaire (figure 1). Certains de ces anticorps (anticorps anti-ALK et anti-ROS1) peuvent être employés en complément de la technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH), même si l’objectif est certainement de pouvoir se substituer à cette dernière méthode. D’autres anticorps représentent une alternative au séquenc¸age (anticorps anti-EGFR mutés, anti-BRAF V600E et anti-NRAS). Enfin, certains de ces anticorps visent à mettre en évidence une surexpression protéique (anticorps anti-MET par exemple). On peut arbitrairement classer ces anticorps selon leur application en pratique quotidienne, leur utilisation étant variable actuellement en routine dans les laboratoires de pathologie. Ainsi, il est probable que les anticorps anti-ALK soient maintenant utilisés dans la plupart des laboratoires, notamment ceux prenant en charge des prélèvements tumoraux d’origine pulmonaire. Plusieurs algorithmes d’utilisation sont alors proposés [4, 5]. Un de ceux les plus utilisés dans le cadre des adénocarcinomes broncho-pulmonaires chez des patients au stade IIIB/IV, consiste à demander d’emblée une analyse IHC anti-ALK et de compléter l’analyse par technique FISH dans un deuxième temps si la tumeur ne possède pas les mutations de KRAS et de l’EGFR et/ou si l’IHC est fortement positive. Il existe plusieurs clones d’anticorps anti-ALK et la sensibilité de ces anticorps est variable selon les séries. Pour un même clone, cette sensibilité est également variable selon les publications [6-9]. Un des points les plus difficiles est d’apprécier l’intensité du marquage obtenu en intégrant le pourcentage de cellules tumorales marquées avant d’affirmer un résultat « positif ». Le deuxième anticorps qui pourrait être utilisé assez vite en routine est l’anticorps anti-MET [10, 11]. Pour cette cible moléculaire, la technique FISH met en évidence une amplification génique et le séquenc¸age une mutation, mais seule l’IHC permet la détection d’une surpression protéique indiquant l’administration de la thérapie ciblée sur cette molécule [10, 11]. L’anticorps anti-MET devrait donc être systématiquement utilisé sur tous les carcinomes pulmonaires non à petites cellules de stade IIIB/IV [11]. Ainsi, les anticorps anti-ALK et anti-MET seront probablement utilisés en 2014 dans tous les laboratoires de pathologie. Une deuxième « catégorie » d’anticorps sont ou seront probablement moins utilisés compte tenu de la rareté des altérations génomiques qu’ils peuvent détecter. Il s’agit de l’anticorps anti-ROS-1 et de l’anticorps anti-BRAF V600E [12-14]. Les carcinomes ROS1 positifs doivent bénéficier d’un traitement par le crizotinib disponible dans la plupart des centres de soin. À l’inverse, les carcinomes mutés BRAF V600E sont inclus dans des essais cliniques permettant
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V. Hofman, et al.
A
B
C
D
E
Figure 1. Immunohistochimie utilisant les anticorps anti-ALK (A), anti-MET (B), anti-ROS1 (C), anti-BRAF V600E (D), et anti-EGFR muté (E) dans différents cas d’adénocarcinome pulmonaire. A) clone D5F3. B) clone SP44. C) clone D4D6. D) clone VE1. E) clone 43B2 (A-E : immunoperoxydase, × 100 ; A-E encart immunoperoxydase, × 400). l’administration d’inhibiteur de BRAF, essais réalisés dans un nombre limité de centres de soin. De fac¸on plus exceptionnelle, certains anticorps (comme les anticorps anti-NRAS mutés, anti-PTEN, anti-AKT, etc.) peuvent être utilisés, mais l’administration d’un traitement consécutivement au résultat d’IHC est actuellement réservée à de très rares centres ou bien est inexistante. La dernière « catégorie » d’anticorps est représentée par des anticorps dirigés spécifiquement contre certaines mutations activatrices de l’EGFR [15-20]. Ces anticorps sont en fait de moins en moins employés. Une des indications peut être de les utiliser si la recherche des mutations de l’EFGR par séquenc¸age n’a pu être effectuée pour des raisons « techniques » (ADN non amplifiable et/ou dégradé) [4, 21, 22]. Par ailleurs, l’hétérogénéité moléculaire des cancers pulmonaires pour les mutations de l’EGFR est encore discutée [22, 23, 24]. Ainsi, il pourrait exister une discordance des résultats obtenus par biologie moléculaire (parfois
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négatifs) et une analyse en IHC positive sur certains territoires tumoraux. L’emploi des anticorps pourrait alors être discuté en cas de résultat négatif en biologie moléculaire et dans un contexte épidémiologique particulier. La principale limite à l’utilisation de ces anticorps est liée au fait qu’ils ne reconnaissent que certaines mutations de l’EGFR (délétion de l’exon 19 ou mutation activatrice L858R). Même si ces dernières mutations sont les plus fréquentes, il existe également plusieurs dizaines de mutations sur ce gène, potentiellement accessibles à une thérapie ciblée, rendant incontournable l’approche par biologie moléculaire. Une des limites supplémentaires à l’emploi de ces anticorps (cela étant une règle globale pour l’IHC utilisant les anticorps à visée théranostique) est la définition du seuil d’intensité du signal et du pourcentage de cellules tumorales positives à considérer. Ainsi affirmer un résultat « positif » repose sur un critère semi-quantitatif. Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites Enfin, en marge de ces anticorps, le développement récent de nouvelles immunothérapies en oncologie thoracique a fait apparaître de nouvelles cibles moléculaires à détecter par IHC [25, 26]. Ainsi les anticorps anti-PD1 et anti-PDL-1 devront être testés dans les laboratoires d’ACP [25, 26].
Quels sont les points forts de l’immunohistochimie dans le cadre des tests à visée théranostique ? « L’histologie moléculaire » permet d’associer une évaluation morphologique (appréciation du type histologique, du pourcentage de cellules tumorales, de la richesse de la composante inflammatoire, et de l’importance de la nécrose) à une évaluation portant sur la cible moléculaire d’intérêt (compartiment tissulaire et cellulaire reconnu par l’anticorps, intensité d’expression du signal, pourcentage de cellules tumorales reconnues par l’anticorps). Ainsi, l’ensemble des informations recueillies pour rendre le résultat se fait en un seul temps. Il est de plus facile d’inclure des contrôles témoins positifs et négatifs (internes ou externes). À l’inverse, la réalisation d’un test de biologie moléculaire est associé à des données morphologiques transmises par le pathologiste et ce test de génétique somatique est donc « désolidarisé physiquement » du test d’ACP. L’évaluation du résultat est donc toujours donnée « sous réserve » de l’appréciation du pathologiste et une confrontation des deux informations (pathologie et biologie moléculaire) est alors incontournable pour valider le résultat final de biologie moléculaire. L’IHC est un test rapidement réalisable (en théorie sur une journée). Le délai entre la réception d’une biopsie fixée dans le formol, la réalisation du test d’IHC et la transmission du résultat au clinicien peut être de 72 heures si l’on intègre l’inclusion en paraffine de la biopsie fixée à j1, les coupes tissulaires avec une première évaluation morphologique à j2 sur une coloration standard puis une demande du test d’IHC le même jour, et l’évaluation du test et une validation du compte rendu à j3. Selon les pratiques, ces résultats peuvent être transmis plus rapidement ou dans un délai plus long. Comparativement, un test de biologie moléculaire va se réaliser après l’étape à j1 et j2, sachant qu’il faut dès j2 (ce qui est rarement le cas) faire des copeaux des tissus inclus en paraffine ou des lames blanches pour l’extraction de l’ADN, étape souvent précédée d’une macrodissection de la zone la plus riche en cellules tumorales sélectionnée sur la section tissulaire par le pathologiste. Il faut aussi intégrer la transmission de l’échantillon au secteur de génétique moléculaire et son enregistrement (soit ce secteur se trouve dans le même laboratoire et à proximité ; soit il se trouve à distance), l’extraction d’ADN (puis l’évaluation quantitative et éventuellement qualitative de l’ADN extrait), l’étape d’amplification par PCR et au final, l’analyse des séquences. Une confrontation des résultats entre le biologiste (ou pathologiste) moléculaire et le pathologiste « morphologiste » doit en principe conduire à la réalisation du compte rendu final (bien qu’en pratique, cela soit assez rarement mis en place de fac¸on systématique). Ainsi entre la réception au laboratoire de pathologie de la biopsie fixée Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
dans le formol et le résultat validé de pathologie moléculaire, on peut estimer qu’il existe un délai moyen de sept à dix jours. Les techniques d’IHC sont standardisées et réalisées sur des automates contrôlant les différentes étapes analytiques. La plupart de ces automates sont marqués CE-IVD. Après une période de formation et d’habilitation, le personnel technique dédié au secteur d’IHC est assez vite autonome. Ainsi, l’expertise technique semble moins difficile à acquérir et à maintenir dans le secteur d’IHC que celle requise dans le secteur de biologie moléculaire. En effet, dans ce dernier secteur, les équipements nécessaires aux analyses de séquences deviennent complexes et le workflow doit intégrer actuellement des étapes plus nombreuses que celles présentes dans un secteur d’IHC [22, 27]. Les risques d’erreur liés à une « contamination » (conduisant à des résultats faussement positifs ou faussement négatifs) sont exceptionnels en IHC. En effet, le fait que le pathologiste gère l’analyse morphologique avant de demander une étude par IHC, que l’identification sur la lame est identique et que des contrôles externes soient associés, rend le risque pratiquement nul. À l’inverse, la contamination interéchantillon est toujours possible en génétique somatique du fait de l’absence de contrôle morphologique réalisé dans le même temps analytique. L’amplification d’un ADN appartenant à un autre patient et présent par exemple sur un rasoir de microtome mal ou non nettoyés ou non changé systématiquement entre chaque bloc de tumeur, une contamination lors des étapes de PCR ou de purification de l’ADN, sont des sources potentielles d’erreur [4, 22]. Même si des faux négatifs peuvent être présents en IHC (par hypo ou hyperfixation), ceux-ci sont probablement plus fréquents en biologie moléculaire (absence d’amplification de l’ADN due à sa dégradation et/ou à une quantité trop faible) [4]. Concernant le coût, l’IHC est le plus souvent peu onéreuse pour chaque test et en principe moins chère qu’une analyse réalisée en biologie moléculaire (recherche d’une mutation par séquenc¸age ou par technique FISH) (tableau 1). Cela est particulièrement vrai lorsqu’on utilise pour la biologie moléculaire, des kits d’amplification et des tests analytiques avec des produits marqués CE-IVD. Cela peut parfois se discuter pour certains anticorps dont le prix semble augmenter rapidement et si l’on considère que des examens de biologie moléculaire peuvent être effectués avec des techniques et des sondes développées en interne (technique home made). À cela il faut intégrer le temps dédié de personnel technique et médical certainement plus important en biologie moléculaire qu’en IHC selon la méthode utilisée (tableau 1). Lorsque l’ADN n’est pas amplifiable (peu d’ADN disponible, ADN très fragmenté par la fixation et/ou la nécrose), l’IHC à visée théranostique peut toujours être effectuée sur le même fragment tissulaire (à condition d’avoir pu préserver le matériel inclus en paraffine en économisant le nombre de coupes tissulaires réalisées pour la coloration standard et les premiers tests d’IHC). Cela est particulièrement vrai pour les échantillons de très petite taille et pour les échantillons tissulaires nécrosés [28, 29].
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V. Hofman, et al. Tableau 1. Évaluation comparative de l’estimation des coûts d’un test de mise en évidence de la mutation BRAF V600E par biologie moléculaire (pyroséquenc¸age) et par immunohistochimie. A) Estimation des coûts réels en tenant compte du temps horaire technique et médical et des différents réactifs et consommables. Ces coûts sont ici estimés selon les méthodes effectuées au laboratoire de pathologie clinique et expérimentale du CHU de Nice (le test de pyroséquenc¸age utilise des réactifs commercialisés marqués CE-IVD). Ces coûts ne tiennent pas compte ici du temps de secrétariat, légèrement plus long pour les examens de biologie moléculaire que pour les tests d’immunohistochimie intégrés dans le compte rendu d’anatomo-cytopathologie. B) Estimation des coûts selon la cotation de la CCAM. A) Évaluation du coût « réel » d’un test BRAF V600E (en D , HT) Test de pyroséquenc¸age sur des coupes de paraffine
Test d’immunohistochimie
KIT d’extraction Étape de PCR KIT de pyroséquenc¸age Temps technique pré-analytique (1 h) Temps technique analytique (2 h 30 min)
4,50 3 45 40 100
AC anti-BRAF V600E (VE1) Kit de détection Optiview DAB KIT d’amplification Optiview Temps technique (1 h) Temps médical (10 min)
50 4,65 2 40 8
Temps médical/lecture de séquences (30 min)
40
TOTAL pour un test BRAF V600E
104,65 D HT
TOTAL pour un test BRAF V600E 232,5 D HT B) Évaluation du coût selon la cotation des actes de la CCAM et des actes hors nomenclatures (PHN) d’un test BRAF V600E (en D , HT) Test de pyroséquenc¸age sur des coupes de paraffine
Test d’immunohistochimie
Enregistrement sur la base de données Extraction de l’ADN Conservation de l’ADN
PHN 50 PHN 320 PHN 50
Désarchivage du bloc : PHN 100 ZZQP140 Lame blanche : PHN10
28 56 2,80
Étape de PCR Recherche d’une mutation TOTAL des PHN
PHN 90 PHN260 PHN 770
TOTAL pour un test BRAF V600E
86,80 D HT
TOTAL pour un test BRAF V600E
215,60 D HT
Quels sont les points faibles de l’immunohistochimie dans le cadre des tests à visée théranostique ? Les analyses d’IHC nécessitent une maîtrise optimale de la phase pré-analytique : gestion du temps d’ischémie froide (en particulier pour les pièces opératoires), du temps de fixation (et ainsi des délais d’acheminement des échantillons depuis le bloc opératoire ou d’endoscopie jusqu’au laboratoire), de la nature du fixateur (les substituts du formol et les fixateurs
A
B
contenant de l’acide acétique peuvent grandement influencer la qualité du signal obtenu), et des étapes d’inclusion et de déplissage des coupes sur une platine chauffante (dont il est nécessaire de contrôler la température) (figure 2) [28-33]. La sensibilité des différents épitopes aux différentes étapes de la phase pré-analytique est variable. Ainsi, il est important pour chaque test d’IHC à visée théranostique, de faire un dossier de validation des méthodes et d’évaluer les différents risques liés à la méthode [34]. Même si l’ADN utilisé dans le cadre de la recherche de mutations est susceptible d’être modifié
C
Figure 2. Influence du temps de fixation par la formaldéhyde sur l’expression immunohistochimique de ALK d’un adénocarcinome pulmonaire (résection chirurgicale d’un lobe pulmonaire). A) Temps de fixation : 10 heures. B) Temps de fixation : 48 heures. C) Temps de fixation : 72 heures (A-C : anticorps anti-ALK, clone 5A4 ; immunoperoxydase, × 100).
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Immunohistochimie et médecine personnalisée en oncologie pulmonaire : potentialités et limites par certaines étapes de la phase pré-analytique, celui-ci est en principe moins sensible à la dégradation que les épitopes antigéniques. Pour la détection d’une même molécule en IHC, il peut exister plusieurs clones d’anticorps. La spécificité de ces clones peut être variable, entraînant lors de l’utilisation de certains anticorps des résultats différents pour un même prélèvement [35]. De la même fac¸on, la sensibilité de ces anticorps peut varier d’un clone à l’autre, d’où la possibilité de faux négatifs. Il est aussi parfois étonnant de voir que pour un même clone, cette sensibilité varie selon les séries publiées et selon l’industriel commercialisant cet anticorps [35]. Un point critique est l’établissement du seuil de positivité du signal obtenu en IHC selon l’anticorps utilisé. En effet, la qualité et l’intensité du signal sont définies de fac¸on subjective par le pathologiste et peut donc varier d’un pathologiste à l’autre. Le système de cotation par le score H intègre le pourcentage de cellules marquées et l’intensité de ces marquages (de 0 à 3+), ce qui peut rendre la méthode semi quantitative [36]. Il s’en suit des algorithmes souvent établis assez théoriquement par les industriels dans un laboratoire centralisé et dont l’application est parfois incomprise ou difficile pour les pathologistes, notamment sur des échantillons de petite taille ou bien largement nécrosés. Des contrôles inter observateurs présents dans un même laboratoire ou dans plusieurs laboratoires doivent aussi s’assurer de la reproductibilité et de la concordance des résultats [37]. Finalement, le seuil d’intensité du signal obtenu en IHC doit être interprété selon la bonne gestion des phases pré-analytiques et en intégrant certains paramètres dans l’interprétation (en particulier la durée de fixation au formol ou la nature du fixateur) (figure 2). De nombreuses mutations peuvent survenir sur un même gène, même si certaines d’entre elles sont plus fréquentes selon le gène considéré. Les anticorps développés pour les analyses d’IHC à visée théranostique ciblent une mutation précise et ne peuvent donc pas détecter l’ensemble des mutations d’intérêt potentiellement présentes sur un même gène [12, 18]. À l’inverse les techniques de séquenc¸age (dite « sans a priori ») peuvent parfaitement couvrir plusieurs dizaines de mutations présentes sur un même gène [12]. La nécessité de devoir détecter plusieurs altérations génomiques dans un même échantillon (même de petite taille) est maintenant établie en oncologie pulmonaire, du fait de la mise à disposition ou de l’arrivée de plusieurs thérapies ciblées. Le besoin futur d’analyser rapidement et en un seul temps des centaines d’altérations génomiques conduit les laboratoires de pathologie ou de génétique moléculaire d’envisager à court terme l’implantation des techniques nouvelles de séquenc¸age [38]. Ces approches doivent être validées et confrontées aux méthodes de séquenc¸age actuel. Dans ce contexte, on peut se demander quelle sera donc la place de l’IHC à visée théranostique dans les années à venir ? Devant des échantillons de petite taille, la stratégie d’optimisation de l’approche IHC devient de plus en plus difficile à établir [28]. En effet, selon le tableau clinique et Bull Cancer vol. 101 • N◦ 10 • octobre 2014
histologique, plusieurs anticorps peuvent entrer en concurrence au même moment et les immunomarquages doivent être alors « priorisés ». Il est donc nécessaire d’optimiser la prise en charge initiale des coupes tissulaires réalisées à partir du bloc inclus en paraffine, en effectuant d’emblée plusieurs coupes (ou « lames blanches ») pour faire une première série d’immunomarquage, puis selon les résultats obtenus, faire une nouvelle série d’IHC sur ces coupes mises en réserve, sans avoir à recouper une nouvelle fois le bloc tissulaire inclus en résine paraffine. Cela a pour avantage de mieux préserver le matériel tissulaire initialement inclus dans la résine paraffine (matériel qui sera nécessaire en parallèle pour réaliser les approches de biologie moléculaire), et d’accélérer aussi probablement les délais de transmission des résultats aux cliniciens. Il est important dans ce cadre-là de bien préserver les structures protéiques (pour les études en IHC) et nucléiques (pour les analyses par FISH) présentes sur ces « lames blanches » mis en réserve, en les conservant à l’abri de la lumière et de la poussière et à 4 ◦ C et jusqu’à leur utilisation. La démarche d’accréditation est non obligatoire pour les laboratoires d’ACP, alors que les laboratoires de biologie moléculaire devront être accrédités selon la norme ISO 15189 pour pouvoir donner des résultats dès 2016 [39]. Cela entraînera une concurrence évidente des approches réalisées dans les laboratoires d’ACP et de génétique somatique pour la détection d’une même altération génomique. Ce point est détaillé dans le chapitre suivant.
Quelle place pour l’accréditation selon la norme ISO 15189 pour les tests d’immunohistochimie à visée théranostique ? Les bonnes pratiques des laboratoires de pathologie se font dans le cadre d’une réglementation et d’exigences qui varient d’un pays à l’autre. Ainsi aux États-Unis, l’accréditation effectuée par le Collège américain des pathologistes (« CAP ») est un élément incontournable pour réaliser des actes de pathologie. De la même fac¸on, dans certain pays européens comme la Belgique, l’accréditation selon la norme ISO 15189 permet aux laboratoires d’ACP de rendre des résultats. En France, le guide des bonnes pratiques établit une « feuille de route » à respecter afin de réaliser dans les meilleures conditions l’ensemble des examens d’ACP, en particulier les tests d’immunohistochimie. Les laboratoires de biologie médicale, notamment les laboratoires de génétique somatique, sont soumis en France à une réglementation différente, avec une obligation d’être accrédité selon la norme ISO 15189 d’ici 2016, faute de quoi ces laboratoires ne pourront plus donner des résultats pour les patients [27, 34, 39]. Dans ce contexte, alors qu’une incertitude planait quant à la nécessité pour les laboratoires d’ACP d’être accrédités selon cette norme avec la même échéance, une loi parue au mois de juin 2013 ne rend plus obligatoire cette accréditation en France pour pouvoir réaliser les tests d’IHC [39]. De ce fait, la
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V. Hofman, et al. démarche d’accréditation est obligatoire en France pour les actes de biologie moléculaire, alors qu’elle est volontariste pour les actes d’IHC. Quelles peuvent être les conséquences de cette réglementation récente ? L’accréditation selon la norme ISO 15189 permet de maîtriser deux volets, le système de management de la qualité (chapitre 4 de la norme) et les « exigences métiers et les compétences techniques » (chapitre 5 de la norme) [33]. L’accréditation permet ainsi d’avoir une reconnaissance et de donner une excellente visibilité vis-à-vis des prescripteurs, puisqu’elle garantie la réalisation de tests de qualité et des résultats maîtrisés. Une réglementation différente pour les pratiques réalisées dans les laboratoires de génétique et d’ACP peut conduire les prescripteurs à faire des choix. Par exemple, la réalisation de tests « compagnons » ne pourrait avoir lieu que dans des laboratoires accrédités. Étant donné que la totalité des laboratoires de génétique devront être accrédité en 2016, ces tests ne pourraient donc plus se faire dans des laboratoires d’ACP non accrédités. Ainsi, les tests d’IHC associée aux thérapies ciblées n’auraient de « reconnaissance » que s’ils étaient réalisés dans un laboratoire accrédité. La prise en charge et le remboursement des tests (de biologie moléculaire et d’IHC) réalisés dans le domaine de la médecine personnalisée ne pourraient se faire que si ces tests étaient réalisés dans un laboratoire accrédité. Potentiellement, la reconnaissance par l’INCa de ces tests réalisés par les laboratoires d’ACP pourrait être associée à leur accréditation. En pratique, si l’on regarde par exemple la réglementation européenne, l’administration du crizotinib aux patients atteints d’un cancer du poumon présentant un réarrangement de EML4-ALK, nécessite l’utilisation d’un test « validé ». Ainsi, si le gold standard est ici la méthode de FISH rien n’interdit d’associer l’administration du crizotinib à un test d’IHC positif. Il est certain que seuls les laboratoires accrédités pourraient rendre des résultats permettant ou non l’administration du traitement.
Quelles perspectives pour les tests d’immunohistochimie ou d’immunocytochimie à visée théranostique ? Les différents anticorps cités plus haut peuvent être utilisés sur du matériel cytologique, en particulier isolé à partir de « biopsies liquides », c’est-à-dire à partir de prélèvements sanguins. Ainsi, certaines études ont mis en évidence par immunocytochimie l’expression de ALK ou de BRAF V600E sur des cellules tumorales circulantes [40, 41]. Ces résultats étaient concordants avec ceux obtenus par les approches de FISH et/ou de séquenc¸age. On peut donc envisager, si l’approche par biopsie liquide et l’analyse cytopathologique se développe dans le secteur de soin, que l’ICC à but théranostique occupe une place intéressante. Compte tenu de l’arrivée des techniques de biologie moléculaire de multiplexage ou de nouvelles générations, peut-on entrevoir à moyen terme la disparition de ces tests d’IHC ? La demande des oncologues pulmonaires s’est élargie
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à la recherche de nombreuses mutations potentiellement accessibles à une thérapie ciblée. Dans ce contexte, les pathologistes moléculaires doivent donner les résultats sur plusieurs cibles et dans un court délai. Cela impose de plus en plus une recherche de ces altérations génomiques en un seul temps et non pas de fac¸on séquentielle. L’approche par les techniques nouvelles de séquenc¸age ou « NGS » est donc une méthode séduisante pour répondre à ce besoin [38, 42, 43]. Le frein actuel à l’utilisation en routine du « NGS » est l’absence de recul suffisant dans le cadre de l’offre de soin. Des dossiers de validation de méthode doivent être réalisés, incluant des évaluations externes de la qualité. Toutefois, il est certain que cette approche pourra probablement être implantée en routine dans les laboratoires et être utilisée aussi à partir d’échantillons cytologiques [42]. Ainsi, l’IHC pourrait ne plus être utilisée à moyen terme, sauf si des techniques de multiplexage en IHC ciblant en un seul temps trois ou quatre molécules sont rapidement accessibles sur le marché. Il faut aussi garder à l’esprit que seule l’IHC/ICC permet une confrontation morpho-moléculaire en un seul temps et qu’elle est la méthode alternative si les autres approches ne sont pas disponibles ou utilisables (notamment en cas d’ADN non amplifiable).
Conclusion Dans le domaine de l’oncologie pulmonaire, l’IHC à visée théranostique est une approche rapide, simple, peu couteuse. Cette méthode doit toutefois être encadrée de bonnes pratiques, et notamment d’une gestion optimale de la phase pré-analytique. La concurrence de cette approche avec les différentes techniques de biologie moléculaire se discute, en particulier si l’on envisage l’IHC comme le test compagnon d’une thérapie ciblée. Une accréditation de l’IHC selon la norme ISO 15189 doit conforter cette approche. Malgré le développement des nouvelles technologies de biologie moléculaire, l’IHC peut rester une méthode complémentaire qui permets de visualiser en un seul temps le tissu tumoral (et les cellules) et le signal recherché, limitant ainsi certains pièges liés à la biologie moléculaire [4]. Liens d’intérêts : Les auteurs déclarent ne pas avoir de lien d’intérêt en rapport avec cet article.
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