Journal of Orofacial Orthopedics Fortschritte der Kieferorthopädie
Original article
In vitro studies on the cytotoxic potential of surface sealants In-vitro-Untersuchungen zum zytotoxischen Potenzial von Versiegelungsmaterialien für Glattflächen Sebastian Zingler1 · Byron Matthei1 · Annette Kohl1 · Daniel Saure2 · Björn Ludwig1, 3 · Katja Diercke1 · Christopher J. Lux1 · Ralf Erber1 Abstract
Zusammenfassung
Objective. The objective of this in vitro study was an initial screening of the cytotoxic potential of widely used smooth enamel surface sealants. Materials and methods. A total of 20 products were allocated to four groups based on their chemical composition: (1) filled resinbased sealants, (2) unfilled resin-based sealants, (3) a resin-modified, glass ionomer-based sealant, and (4) silicone-based sealants. All materials were applied to human enamel slices both in accordance with manufacturers’ instructions and in additional experiments applying 50% undercuring and 50% overcuring. An agar overlay assay was then used to test the specimens following ISO 10933. The cytotoxic potential of each material was interpreted based on a reaction index that summarized the decolorization and lysis scores obtained. Results. The cytotoxic potential decreased as follows: unfilled resin-based sealants > filled resin-based sealants > resin-modified, glass ionomer-based sealant > silicone-based sealants. In 75% of the resin-based products, deliberate undercuring was associated with more extensive decolorization zones, leading to higher rates of cytotoxic potential in two of those products. Overcuring, by contrast, was associated with a tendency for smaller decolorization zones in 50% of the resin-based products. Conclusion. Surface sealants derived from resin monomers exhibited cytotoxic potential in the agar overlay assay. There is also evidence of a possible association with curing, as undercuring can increase the cytotoxic potential, whereas normal curing (as per manufacturers’ instructions) or overcuring may help minimize such effects. More research into the biological implications of these materials is needed, especially with regard to their potential impact on the adjacent gingiva.
Ziel. Ziel dieser In-vitro-Studie war, das zytotoxische Potenzial gängiger Versiegelungsmaterialien für Glattflächen im Sinne eines „initialen Screenings“ zu untersuchen. Material und Methodik. Insgesamt 20 Produkte wurden nach ihren chemischen Eigenschaften in 4 Gruppen eingeteilt: 1) kompositbasiert, gefüllt; 2) kompositbasiert, ungefüllt, 3) kunststoffmodifiziert glasionomerbasiert und 4) silikonbasiert. Die Materialien wurden gemäß Herstellerangaben sowie mit 50% verkürzter und verlängerter Polymerisations- bzw. Trocknungszeit auf humane Schmelzscheiben aufgetragen und im Agar-Overlay-Assay in Anlehnung an ISO 10933 getestet. Für die Interpretation wurden Reaktionsindizes auf der Basis von Entfärbungs- und Lyseindizes erstellt. Ergebnisse. Das zytotoxische Potenzial nahm in der folgenden Reihenfolge der Untersuchungsgruppen ab: kompositbasiert, ungefüllt > kompositbasiert, gefüllt > kunststoffmodifiziert glasionomerbasiert > silikonbasiert. Bei verkürzter Polymerisationszeit zeigten 75% der kompositbasierten Produkte erhöhte Entfärbungszonen; bei 2 Produkten war dies mit einer erhöhten Einstufung des zytotoxischen Potenzials verbunden. Bei entsprechender Verlängerung der Polymerisationszeit konnte bei 50% der kompositbasierten Produkte eine tendenzielle Reduzierung der Entfärbungszonen beobachtet werden. Schlussfolgerungen. Versiegelungsmaterialien für Glattflächen auf Basis von Kunststoffmonomeren weisen im Agar-Overlay-Assay zytotoxisches Potenzial auf. Ferner zeichnet sich ein möglicher Zusammenhang zwischen Polymerisationszeit und zytotoxischem Potenzial ab. Reduzierte Polymerisationszeiten können das zytotoxische Potenzial erhöhen. Umgekehrt kann die Einhaltung bzw. Verlängerung der Polymerisationszeiten helfen, das zytotoxische Potenzial zu reduzieren. Weitere Studien, insbesondere zur möglichen Beeinflussung der benachbarten Gingiva, sind notwendig, um die biologischen Effekte dieser Materialien weiter bewerten zu können.
1
Department of Orthodontics, University of Heidelberg, Heidelberg Institute of Medical Biometry and Informatics, University of Heidelberg, Heidelberg 3 Private practice, Traben-Trarbach 2
Received: 19 December 2013; accepted: 23 March 2014; published online: 26 November 2014
66
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
J Orofac Orthop 2015; 76:66-78 DOI 10.1007/s00056-013-0269-x
Zingler et al. Cytotoxicity of enamel sealants
Keywords
Schlüsselwörter
Demineralization · Prevention · Sealing · Cytotoxicity
Demineralisation · Prävention · Versiegelung · Zytotoxizität
Introduction
Einleitung
Enamel demineralization due to inadequate plaque control is a relevant side effect of treatment with multibracket appliances [8]. The phenomenon becomes clinically visible as white-spot lesions, which have implications in terms of carious lesions but also constitute a major aesthetic problem, as they often appear on the labial surface of maxillary lateral incisors and canines [23]. In an effort to prevent these white-spot lesions, manufacturers are increasingly offering sealants applied prior to or after the orthodontic attachments are placed onto the enamel surfaces. Over 90% of orthodontic practices throughout Germany are currently using sealants made of filled or unfilled resin-based composites, as well as various varnishes and liners for compliance-independent prophylaxis [12]. Dental materials are known to undergo modification in the oral cavity [33], which can lead to the release of components or chemically altered reaction products that may trigger undesirable local or systemic biological responses [20]. In recent years, extensive research has been done to examine substance release from dental composites, revealing that these materials may elute (co)monomers like HEMA, TEGDMA, bisGMA, or UDMA [11]. Furthermore, there is evidence that a variety of additives like photoinitiators, inhibitors, or stabilizers are released from resin-based materials during intraoral use [39]. Specific (co)monomers, additives or degradation products from dental composites have been implicated in cytotoxic [18], genotoxic [35], and estrogenic [27] processes. In addition, the degradation of specific (co)monomers (e.g., TEGDMA) may give rise to toxic and highly reactive intermediate products known as “epoxy compounds”, which may have mutagenic potential [10, 31]. Substance release from a composite is known to depend on the extent and duration of curing [9, 14]. Caughman et al. [7] demonstrated that the cytotoxicity of composites was significantly higher in conjunction with curing for 15 rather than 30 or 60 s, and that their cytotoxic potential can vary according to the proportion of filler. Wataha et al. [40] reported that the cytotoxic effect of composites with a low filler content was signifi-
Schmelzdemineralisationen gehören als Folge einer unzureichenden Plaquekontrolle zu den relevanten Nebenwirkungen bei der Therapie mit Multibracketapparaturen [8]. Sie werden klinisch als White-Spot-Läsionen sichtbar und stellen, neben der kariologischen Problematik, auch aus ästhetischer Sicht ein großes Problem dar. Besonders häufig zeigt sich diese Komplikation auf den Labialflächen der seitlichen Schneideund Eckzähne des Oberkiefers [23]. Zur Prävention dieser Läsionen werden von verschiedenen Firmen zunehmend Versiegelungsmaterialien angeboten, die vor oder nach dem Kleben der Brackets auf die Zahnoberflächen aufgebracht werden. Insbesondere gefüllte und ungefüllte kompositbasierte Versiegelungsmaterialien, aber auch unterschiedliche Lacke und Liner werden heute bundesweit in über 90% der kieferorthopädischen Praxen als Compliance-unabhängige Präventionsmaßnahme angewendet [12]. Dentale Materialien unterliegen in der Mundhöhle Veränderungsprozessen [33]. Dabei kann es zur Freisetzung von Bestandteilen oder chemisch veränderten Reaktionsprodukten kommen, die unerwünschte lokale, möglicherweise auch systemische biologische Reaktionen auslösen können [20]. In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Untersuchungen über die Freisetzung von Bestandteilen aus dentalen Kompositmaterialien durchgeführt. Im Zuge dieser Untersuchungen konnte klar gezeigt werden, dass verschiedene (Ko-)Monomere, z. B. HEMA, TEGDMA, Bis-GMA oder UDMA, aus zahnärztlichen Kompositen herausgelöst werden können [11]. Wahrscheinlich ist auch, dass viele Additiva, z. B. Photoinitiatoren, Inhibitoren oder Stabilisatoren, aus kompositbasierten Materialien im Laufe der Tragezeit freigesetzt werden [39]. Einzelne (Ko-)Monomere, Additiva oder Degradationsprodukte dentaler Kompositmaterialien werden mit möglichen zytotoxischen [18], gentoxischen [35] oder östrogenen [27] Effekten in Verbindung gebracht. Zusätzlich können beim Abbau bestimmter (Ko-)Monomere (z. B. TEGDMA) toxische, hochreaktive Zwischenprodukte (sogenannte Epoxy-Verbindungen) entstehen, die mit einem möglichen mutagenen Potenzial assoziiert werden [10, 31]. Die Freisetzung von Bestandteilen aus Kompositen ist abhängig vom Polymerisationsgrad und der Polymerisationszeit [9, 14]. Caughman et al. [7] konnten zeigen, dass Komposite bei einer Polymerisationszeit von 15 s eine signifikant höhere Zytotoxizität verursachen, als nach 30 und 60 s. Zusätzlich kann der Fülleranteil der Materialien das zytotoxische Potenzial beeinflussen. So weisen Wataha et al. [40] darauf hin, dass Komposite mit niedrigem Fülleranteil eine signifikant höhere und auch länger andauernde zytotoxische Wirkung zeigen als ähnliche Materialien mit höherem Füllergehalt. Neben dem Polymerisa-
Abbreviations bis-GMA HEMA HPLC MTT TEGDMA UDMA
bisphenol-A diglycidyl dimethacrylate hydroxyethyl methacrylate high performance liquid chromatography 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide triethylene glycol dimethacrylate urethane dimethacrylate
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
67
Zingler et al. Zytotoxizität von Versieglungsmaterialien für Glattflächen
cantly greater than the effect of materials that are similar but contain a higher proportion of filler. In addition to curing parameters and the filler content, a recent meta-analysis showed that the release of substances from resin-based materials is significantly associated with the surface area [39]. It is common practice among orthodontists to apply surface sealants to the entire labial and buccal surface of teeth, which may result in extensive contact with the oral mucosa. What is more, the materials are applied in close proximity to the gingiva. Under unfavorable clinical conditions, this may cause the noncured sealant’s coming into direct contact with the gingiva or flowing into the gingival sulcus. All of the factors just outlined (i.e., extensive intraoral application, direct contact with oral mucosa, and close proximity to the gingiva) may lead to undesirable biological reactions. Despite the fact that these materials are widely used in orthodontic practice, their biocompatibility has rarely been tested. Various methods have been recommended for testing the biocompatibility of dental composites [26]. In vitro cytotoxicity assays are key to defining initial biocompatibility profiles (relevant methods are summarized in ISO 10993) that prepare the ground for in vivo studies and clinical test series. The present in vitro study is intended to shed light on the cytotoxic potential of widely used categories of surface sealants in preliminary experiments consistent with ISO 10993 by using an agar overlay assay.
Materials and methods Sealants and enamel slices
Twenty different sealants were tested. Pertinent details on these products and the experimental groups to which they were allocated are provided in Tab. 1. Human enamel slices were created from noncarious third molars or other teeth obtained from orthodontic extraction cases. Approval for this strategy was obtained from the local ethics board (ref. S-301/2011). All teeth had been cleared of tissue remnants and carefully cleaned after extraction. They were then stored in artificial saliva (16.1 mM KCl; 14.4 mM NaCl; 1.9 mM KH2PO4; 1.4 mM CaCl2; pH 6.8) [36] until glued with cyanoacrylate onto a specimen holder and processed with an inner-diameter saw featuring a diamond blade (Leica, Bensheim, Germany) to obtain enamel slices 200–300 μm thick from each lateral surface. These enamel slices were stored in artificial saliva at 4°C, then autoclaved and dried at 50°C for 30 min until use in the agar overlay assay.
Sealant application and variation of polymerization and drying times
In a sterile environment, 10 μl of each sealant was applied to enamel slices, etched when required, and then cured or dried in line with the manufacturers’ instructions. The curing lamp’s wavelength and luminescence (bluephase® G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein) were periodically checked. To investigate the influence of various conversion rates, we exceeded (overcuring) or reduced (undercuring) the curing
68
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
tionsgrad, der Polymerisationszeit und dem Fülleranteil konnte im Ergebnis einer aktuellen Meta-Analyse gezeigt werden, dass die Freisetzung von Bestandteilen aus kompositbasierten Materialien signifikant mit der Größe der exponierten Oberfläche zunimmt [39]. Versiegelungsmaterialien für Glattflächen werden in der kieferorthopädischen Praxis häufig auf die gesamte Labial- bzw. Bukkalfläche der Zähne aufgetragen und können großflächig mit den oralen Schleimhäuten in Kontakt treten. Zusätzlich werden Sie in unmittelbarer Nähe zur Gingiva appliziert. Unter ungünstigen klinischen Bedingungen besteht dabei das Risiko, dass unpolymerisiertes Versiegelungsmaterial in direkten Kontakt zur Gingiva kommt oder in den Sulkus einfließt. Die großflächige Anwendung der Versiegelungsmaterialien in der Mundhöhle, der direkte Kontakt mit den oralen Schleimhäuten und die räumliche Nähe zur Gingiva könnten zu unerwünschten biologischen Reaktionen führen. Die Biokompatibilität dieser in der kieferorthopädischen Praxis häufig eingesetzten Materialien wurde jedoch bisher kaum getestet. Verschiedene, mehrheitlich aufeinander aufbauende Testmethoden werden zur Prüfung der Biokompatibilität von zahnärztlichen Kompositen empfohlen [26]. Hierbei stellen Invitro-Testmethoden zur Zytotoxizität ein maßgebliches System zur Erstellung initialer Biokompatibilitätsprofile dar; entsprechende Methoden sind in der ISO 10993 zusammengefasst. Invivo-Studien und klinische Testreihen können folgen. In der vorliegenden Studie sollte eine erste biologische Beurteilung gängiger Versieglungsmaterialien für Glattflächen durch Prüfung der In-vitro-Zytotoxizität im Agar-Overlay-Assay angelehnt an ISO 10993 erfolgen.
Material und Methoden Versiegelungsmaterialien und Schmelzscheiben
Insgesamt 20 Versiegelungsmaterialien wurden untersucht. Die Einteilung in die Untersuchungsgruppen und Details zu den verwendeten Produkten sind in Tab. 1 zusammengestellt. Zur Herstellung von humanen Schmelzscheiben wurden kariesfreie Weisheitszähne oder kariesfreie Zähne von Patienten, die sich aus kieferorthopädischen Gründen einer Zahnextraktion unterziehen mussten, verwendet. Die Verwendung der Zähne zur Herstellung von humanen Schmelzscheibe aus extrahierten Zähnen wurde durch die lokale Ethikkommission genehmigt (Votum: S-301/2011). Die Zähne wurden nach Entnahme von Geweberesten befreit und vorsichtig gereinigt. Die Lagerung erfolgte bis zur Herstellung der Schmelzscheiben in künstlichem Speichel (16,1 mM KCl, 14,4 mM NaCl, 1,9 mM KH2PO4, 1,4 mM CaCl2, pH 6,8; [36]). Die Herstellung der Schmelzscheiben erfolgte mit einer Innenlochsäge mit diamantiertem Sägeblatt (Leica, Bensheim). Die Zähne wurden mit Cyanacrylat auf dem Probenhalter fixiert und die Schmelzscheiben mit Dicken von 200–300 μm von jeder Seitenfläche angefertigt. Bis zur Verwendung im Agar-Overlay-Assay wurden die Schmelzscheiben in künstlichem Speichel bei 4°C aufbewahrt.
Zingler et al. Cytotoxicity of enamel sealants
Tab. 1 Products used in this study Tab. 1 In der vorgestellten Studie verwendete Produkte
Tab. 2 Definition of decolorization index and lysis index Tab. 2 Entfärbungs- und Lyseindizes, Definitionen
Product
1124440
Decolorization index 0 1 2
1128416
3
1129146
4 5 Lysis index 0 1 2 3 4 5
Supplier
Composite-based sealants, filled Easy Glaze VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany Fissurit F VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany Fissurit FX VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany GrandioSeal VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany L.E.D. Pro Seal® Reliance Orthodontic Products, Itasca, IL, USA Light Bond™ Filled SealReliance Orthodontic ant Products, Itasca, IL, USA Maximum Cure® Filled Reliance Orthodontic Products, IL, Itasca, USA OrthoSolo™ Ormco, Glendora, CA, USA Pro Seal® Reliance Orthodontic Products, Itasca, IL, USA Seal&Protect® Dentsply DeTrey GmbH, Konstanz, Germany UltraSeal® XT plus™ Clear Ultradent Products, South Jourdan, UT, USA Composite-based sealants, unfilled Clinpro™ Sealant 3M ESPE, Seefeld, Germany Fissurit VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany Helioseal® Clear Ivoclar Vivadent AG, Schaan, Liechtenstein Light Bond™Sealant Reliance Orthodontic Products, Itasca, IL, USA Maximum Cure® Reliance Orthodontic Products, Itasca, IL, USA Silicon-based sealants Protecto® BonaDent GmbH, Frankfurt, Germany Protecto®F BonaDent GmbH, Frankfurt, Germany Protecto® CaF2Nano BonaDent GmbH, Frankfurt, Germany Composite-modified, glass ionomer-based sealants Clinpro™ XT Varnish 3M ESPE, Seefeld, Germany
Lot no. 1023315
11834 103113 1010907 3646804 111980
Definition No detectable zone around or under sample Zone limited to area under sample Zone not greater than 5 mm in extension from sample Zone not greater than 10 mm in extension from sample Zone greater than 10 mm in extension from sample Zone involving entire culture Definition No observable cell lysis Cell lysis ≤20% Cell lysis ≤40% Cell lysis ≤60% Cell lysis ≤80% Cell lysis >80%
1009001378 B6RBP
N210069
Fig. 1 8 Schematic representation of the agar overlay assay
Abb. 1 8 Schematische Darstellung des Agar-Overlay-Assay
1107462 N16280 11892 1011115
4102384 4104620 4102432
N178061
times by 50%. Products that had to be air-dried (Protecto®, Protecto® F, Protecto® CaF2 Nano) had their dry-times varied. The mixture ratios in those materials containing two components (Maximum Cure® Filled and Maximum Cure®) were altered by 25%.
Vor der Verwendung im Agar-Overlay-Assay wurden die Schmelzscheiben autoklaviert und 30 min bei 50°C getrocknet.
Applikation der Versiegelungsmaterialien und Variation der Polymerisations- und Trocknungszeiten
In steriler Umgebung wurden die Schmelzscheiben, wenn nach Herstellerangaben notwendig, geätzt und anschließend mit 10 μl des jeweiligen Versiegelungsmaterial behandelt und entsprechend den Herstelleranweisungen polymerisiert bzw. getrocknet. Die Wellenlänge und Lumineszenz der Polymerisationslampe (bluephase® G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein) wurde regelmäßig überprüft. Um den Einfluss unterschiedlicher Konversionsraten darzustellen, wurden die Lichthärtungszeiten um 50% unter- bzw. überschritten. Für Produkte, die eine Lufttrocknung erfordern (Protecto®, Protecto® F, Protecto® CaF2 Nano) wurde entsprechend die Trocknungszeit variiert. Bei den ZweikomponentenMaterialien Maximum Cure® Filled und Maximum Cure® wurden die Mischungsverhältnisse der beiden Komponenten um jeweils 25% verändert.
Agar-Overlay-Assay
Die Durchführung des Agar-Overlay-Assay erfolgte in Anlehnung an ISO 10993. Zur Durchführung wurden in je 60 mm Zellkulturschalen (Greiner, Frickenhausen) 1,1×106 Zellen
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
69
Zingler et al. Zytotoxizität von Versieglungsmaterialien für Glattflächen
Tab. 3 Cytotoxic potential of products used in this study Tab. 3 Zytotoxisches Potenzial der in der Studie verwendeten Produkte Product
Decolorization index
a. Composite-based sealants, filled Easy Glaze 2 Fissurit F 2 Fissurit FX 2 GrandioSeal 2 L.E.D. Pro Seal® 3 Light Bond™ Filled Sealant 3 Maximum Cure® Filled 2 OrthoSolo™ 3 Pro Seal® 2 Seal & Protect® 3 UltraSeal® XT plus™ Clear 2 b. Composite-based sealants, unfilled Clinpro™ Sealant 3 Fissurit 2 HelioSeal® Clear 3 Light Bond™ Sealant 4 Maximum Cure® 2 c. Silicon-based sealants Protecto® 0 Protecto® F 0 Protecto® CaF2 Nano 0 d. Composite-modified, glass ionomer-based sealants Clinpro™ XT Varnish 2
Agar overlay assay
Lysis index
Reaction index
Cytotoxic potential
2 2 1 2 4 4 3 4 2 4 3
2/2 2/2 2/1 2/2 3/4 3/4 2/3 3/4 2/2 3/4 2/3
Moderate Moderate Mild Moderate Moderate–strong Moderate–strong Moderate Moderate–strong Moderate Moderate–strong Moderate
4 3 3 4 2
3/4 2/3 3/3 4/4 2/2
Moderate–strong Moderate Moderate Strong Moderate
0 0 1
0/0 0/0 0/1
Negative Negative Negative–mild
3
2/3
Moderate
This assay was performed in accordance with ISO 10993. Murine L929 fibroblasts in passages 12–14 (item CCL-1™; American Type Culture Collection) were seeded on 60-mm culture dishes (Greiner, Frickenhausen, Germany) at 1.1×106 cells and were cultured overnight in fully supplemented Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM; Biochrom, Berlin, Germany) with 10% fetal calf serum, 100 μg/ml penicillin, and 100 IU/ml streptomycin at 37°C in 5% CO2. On the next day, the medium was replaced by 4.4 ml of fully supplemented DMEM with 1.5% agarose (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). Once the agarose had hardened at 37°C in 5% CO2, the cells were stained with neutral red (0.01% in PBS) for 30 min. Immediately after sealant application, the prepared enamel slices were placed onto the agar plates, with the sealant side facing downward, followed by incubation at 37°C in 5% CO2 for 24 h. Samples with methyl methacrylate (Sigma– Aldrich, Munich, Germany) served as positive controls and untreated enamel slices as negative controls. All experiments were performed in triplicate and repeated three times. An overview of the assay is provided in Fig. 1.
70
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
(murine L929-Fibroblasten in den Passagen 12–14 (bezogen von der American Type Culture Collection, Bestellnummer CCL-1™) ausgesät und über Nacht in voll supplementiertem Dulbeccos-Modified-Eagle-Medium (DMEM, Biochrom, Berlin, 10% fötales Kälberserum, 100 μg/ml Penicillin, 100 IU/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 kultiviert. Am folgenden Tag wurde das Medium abgenommen und durch 4,4 ml voll supplementiertes DMEM mit 1,5% Agarose (Becton Dickinson, Heidelberg) ersetzt. Nach dem Aushärten der Agarose bei 37°C, 5% CO2 wurden die Zellen mit Neutralrot (0,01% in PBS) für 30 min angefärbt. Die entsprechend vorbereiteten Schmelzscheiben wurden sofort nach dem Auftragen der Versiegelungsmaterialien mit der Schichtseite auf die Agarplatten aufgebracht und bei 37°C, 5% CO2 für 24 h inkubiert. Als Positivkontrolle wurde Methyl-Methacrylat (Sigma-Aldrich, München) verwendet. Unbehandelte Schmelzscheiben dienten als Negativkontrolle. Alle Untersuchungen wurden in dreifachen Triplikaten durchgeführt. In Abb. 1 ist der Aufbau des Agar-Overlay-Assay dargestellt.
Analyse der Proben
Die Auswertung erfolgte mit Hilfe eines inversen Mikroskops (Zeiss Axiovert, Carl Zeiss, Jena), das mit einer Digitalkamera (Nikon D70, Nikon, Düsseldorf) verbunden war. Die quantita-
Zingler et al. Cytotoxicity of enamel sealants
Fig. 2 8 Representative results obtained by the agar overlay assay concerning morphological characteristics of L-929 murine fibroblast cultures exposed to differently treated enamel slices. The dotted white lines indicate the margins of the enamel slices, the horizontal black bar a distance of 100 µm. Untreated enamel slices like that in a served as controls, characterized by intact confluent monolayers of cells retaining their neutral red dye indicating intact membranes. b Specimen treated with a filled resin-based sealant (L.E.D. Pro Seal®) which caused intracellular fading and morphological alterations and lysis in the area around the slice. c Specimen treated with another filled resin-based sealant (Pro Seal®) resulting in intracellular dye fading while not having a major impact on cell morphology. d Specimen treated with an unfilled resin-based sealant (Light Bond™) resulting in intracellular dye fading and pronounced morphological changes. e Specimen treated with a silicone-based sealant (Protecto®) which has left the cells virtually unaffected. f Specimen treated with the resin-modified, glass ionomer-based sealant (Clinpro™ XT Varnish) which has triggered dye fading and a moderate effect on cell morphology. Abb. 2 8 Repräsentative Ergebnisse des Agar-Overlay-Assay mit Bezug auf morphologische Charakteristika muriner L-929 Fibroblastenkulturen nach Konfrontation mit unterschiedlich behandelten Schmelzscheiben. Die punktierten weißen Linien zeigen die Ränder der Schmelzscheiben, die schwarzen Maßstabsbalken repräsentieren eine Länge von 100μm. Unbehandelte Schmelzscheiben wie in (a) dienten als Kontrolle, charakterisiert durch eine intakte konfluente Monolayer von Zellen, deren intrazelluläre Einfärbungen mit Neutralrot auf intakte Zellmembranen hindeuten. b Proben, behandelt mit einem gefüllten kompositbasierten Versiegler (L.E.D. ProSeal®), verursachten intrazelluläre Entfärbungen, morphologische Veränderungen und Zelllyse in der Umgebung der Schmelzscheiben. c Proben, behandelt mit einem weiteren gefüllten kompositbasierten Versiegler (Pro Seal®), führten ebenfalls zu intrazellulären Entfärbungen, der Einfluss auf die Zellmorphologie war jedoch weniger stark ausgeprägt. d Proben, behandelt mit einem ungefüllten Komposit-basierten Versiegler (Light Bond™), führten zu intrazellulären Entfärbungen und ausgeprägten morphologischen Veränderungen. e Proben, behandelt mit einem silikonbasierten Versiegler (Protecto®), zeigten nur geringe Effekte auf die Zellen. f Proben, behandelt mit einem Kunststoffmodifizierten glasionomerbasierten Versiegler (Clinpro™ XT), lösten Entfärbungen und mittelschwere zellmorphologische Effekte aus
Specimen analysis
We used an inverted microscope (Zeiss Axiovert; Carl Zeiss, Jena, Germany) connected to a digital camera (Nikon D70; Nikon, Düsseldorf, Germany). The quantitative part, namely measuring the decolorization zone, was done by interactively analyzing micrographs of the area surrounding the enamel slices using Image J software’s measurement function [30]. A stage micrometer was used for calibration. Cell lysis or destruction was independently rated by four investigators (S. Z., B. M., A. K., R. E.). The decolorization and lysis indices used to interpret these findings in accordance with ISO 10993 are listed in Tab. 2. The cytotoxic potential was assessed by calculating a reaction index (RI; RI = (decolorization index + lysis index)/2). The cytotoxic potential was classified as follows: negative: RI=0; mild: RI =0.5–1.5; moderate: RI =2–3; moderate/strong: RI =3.5, strong: RI =4–5.
tive Analyse (Messung der Entfärbungszone) erfolgte anhand der Mikrophotographien interaktiv mit Hilfe der Software Image J [30]. Dazu wurden Mikrophotographien der die Schmelzscheiben umgebenden Regionen mit der Messungsfunktion (Standardfunktion der Software Image J) interaktiv ausgewertet. Die Eichung erfolgte anhand eines Objektmikrometers. Zelllyse und Zellzerstörung wurden von vier Experimentatoren (S.Z., B.M., A.K. und R.E.) unabhängig beurteilt. Die Interpretation erfolgte in Anlehnung an ISO 10993 auf Basis der Entfärbungs- und Lyseindizes (Tab. 2). Die endgültige Bewertung des zytotoxischen Potenzials erfolgte schließlich anhand der Reaktionsindizes (RI) [RI = (Entfärbungsindex + Lyseindex)/2]. Die Einstufung des zytotoxischen Potenzials erfolgte anhand der Reaktionsindizes RI =0: negativ; RI =0,5–1,5: mild; RI =2–3: mäßig; RI =3,5: mäßig/stark; RI =4–5: stark.
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
71
Zingler et al. Zytotoxizität von Versieglungsmaterialien für Glattflächen
Statistical analysis
Due to our group sizes, the cytotoxic-potential analysis based on this reaction index was conducted nonparametrically, which comprised a Kruskal–Wallis test for intergroup comparison (not including the resin-modified glass ionomer cement) and a Mann–Whitney U-test for pairwise intergroup comparisons. All statistical calculations were done with SigmaStat software (IBM-SPSS, Ehningen, Germany). Descriptive p-values of ≤0.05 were considered statistically significant.
Results Filled resin-based sealants
All of these were associated with decolorization zones not exceeding 10 mm when used according to the manufacturers’ instructions. Their decolorization scores were generally 2 (
Original article
In vitro studies on the cytotoxic potential of surface sealants In-vitro-Untersuchungen zum zytotoxischen Potenzial von Versiegelungsmaterialien für Glattflächen Sebastian Zingler1 · Byron Matthei1 · Annette Kohl1 · Daniel Saure2 · Björn Ludwig1, 3 · Katja Diercke1 · Christopher J. Lux1 · Ralf Erber1 Abstract
Zusammenfassung
Objective. The objective of this in vitro study was an initial screening of the cytotoxic potential of widely used smooth enamel surface sealants. Materials and methods. A total of 20 products were allocated to four groups based on their chemical composition: (1) filled resinbased sealants, (2) unfilled resin-based sealants, (3) a resin-modified, glass ionomer-based sealant, and (4) silicone-based sealants. All materials were applied to human enamel slices both in accordance with manufacturers’ instructions and in additional experiments applying 50% undercuring and 50% overcuring. An agar overlay assay was then used to test the specimens following ISO 10933. The cytotoxic potential of each material was interpreted based on a reaction index that summarized the decolorization and lysis scores obtained. Results. The cytotoxic potential decreased as follows: unfilled resin-based sealants > filled resin-based sealants > resin-modified, glass ionomer-based sealant > silicone-based sealants. In 75% of the resin-based products, deliberate undercuring was associated with more extensive decolorization zones, leading to higher rates of cytotoxic potential in two of those products. Overcuring, by contrast, was associated with a tendency for smaller decolorization zones in 50% of the resin-based products. Conclusion. Surface sealants derived from resin monomers exhibited cytotoxic potential in the agar overlay assay. There is also evidence of a possible association with curing, as undercuring can increase the cytotoxic potential, whereas normal curing (as per manufacturers’ instructions) or overcuring may help minimize such effects. More research into the biological implications of these materials is needed, especially with regard to their potential impact on the adjacent gingiva.
Ziel. Ziel dieser In-vitro-Studie war, das zytotoxische Potenzial gängiger Versiegelungsmaterialien für Glattflächen im Sinne eines „initialen Screenings“ zu untersuchen. Material und Methodik. Insgesamt 20 Produkte wurden nach ihren chemischen Eigenschaften in 4 Gruppen eingeteilt: 1) kompositbasiert, gefüllt; 2) kompositbasiert, ungefüllt, 3) kunststoffmodifiziert glasionomerbasiert und 4) silikonbasiert. Die Materialien wurden gemäß Herstellerangaben sowie mit 50% verkürzter und verlängerter Polymerisations- bzw. Trocknungszeit auf humane Schmelzscheiben aufgetragen und im Agar-Overlay-Assay in Anlehnung an ISO 10933 getestet. Für die Interpretation wurden Reaktionsindizes auf der Basis von Entfärbungs- und Lyseindizes erstellt. Ergebnisse. Das zytotoxische Potenzial nahm in der folgenden Reihenfolge der Untersuchungsgruppen ab: kompositbasiert, ungefüllt > kompositbasiert, gefüllt > kunststoffmodifiziert glasionomerbasiert > silikonbasiert. Bei verkürzter Polymerisationszeit zeigten 75% der kompositbasierten Produkte erhöhte Entfärbungszonen; bei 2 Produkten war dies mit einer erhöhten Einstufung des zytotoxischen Potenzials verbunden. Bei entsprechender Verlängerung der Polymerisationszeit konnte bei 50% der kompositbasierten Produkte eine tendenzielle Reduzierung der Entfärbungszonen beobachtet werden. Schlussfolgerungen. Versiegelungsmaterialien für Glattflächen auf Basis von Kunststoffmonomeren weisen im Agar-Overlay-Assay zytotoxisches Potenzial auf. Ferner zeichnet sich ein möglicher Zusammenhang zwischen Polymerisationszeit und zytotoxischem Potenzial ab. Reduzierte Polymerisationszeiten können das zytotoxische Potenzial erhöhen. Umgekehrt kann die Einhaltung bzw. Verlängerung der Polymerisationszeiten helfen, das zytotoxische Potenzial zu reduzieren. Weitere Studien, insbesondere zur möglichen Beeinflussung der benachbarten Gingiva, sind notwendig, um die biologischen Effekte dieser Materialien weiter bewerten zu können.
1
Department of Orthodontics, University of Heidelberg, Heidelberg Institute of Medical Biometry and Informatics, University of Heidelberg, Heidelberg 3 Private practice, Traben-Trarbach 2
Received: 19 December 2013; accepted: 23 March 2014; published online: 26 November 2014
66
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
J Orofac Orthop 2015; 76:66-78 DOI 10.1007/s00056-013-0269-x
Zingler et al. Cytotoxicity of enamel sealants
Keywords
Schlüsselwörter
Demineralization · Prevention · Sealing · Cytotoxicity
Demineralisation · Prävention · Versiegelung · Zytotoxizität
Introduction
Einleitung
Enamel demineralization due to inadequate plaque control is a relevant side effect of treatment with multibracket appliances [8]. The phenomenon becomes clinically visible as white-spot lesions, which have implications in terms of carious lesions but also constitute a major aesthetic problem, as they often appear on the labial surface of maxillary lateral incisors and canines [23]. In an effort to prevent these white-spot lesions, manufacturers are increasingly offering sealants applied prior to or after the orthodontic attachments are placed onto the enamel surfaces. Over 90% of orthodontic practices throughout Germany are currently using sealants made of filled or unfilled resin-based composites, as well as various varnishes and liners for compliance-independent prophylaxis [12]. Dental materials are known to undergo modification in the oral cavity [33], which can lead to the release of components or chemically altered reaction products that may trigger undesirable local or systemic biological responses [20]. In recent years, extensive research has been done to examine substance release from dental composites, revealing that these materials may elute (co)monomers like HEMA, TEGDMA, bisGMA, or UDMA [11]. Furthermore, there is evidence that a variety of additives like photoinitiators, inhibitors, or stabilizers are released from resin-based materials during intraoral use [39]. Specific (co)monomers, additives or degradation products from dental composites have been implicated in cytotoxic [18], genotoxic [35], and estrogenic [27] processes. In addition, the degradation of specific (co)monomers (e.g., TEGDMA) may give rise to toxic and highly reactive intermediate products known as “epoxy compounds”, which may have mutagenic potential [10, 31]. Substance release from a composite is known to depend on the extent and duration of curing [9, 14]. Caughman et al. [7] demonstrated that the cytotoxicity of composites was significantly higher in conjunction with curing for 15 rather than 30 or 60 s, and that their cytotoxic potential can vary according to the proportion of filler. Wataha et al. [40] reported that the cytotoxic effect of composites with a low filler content was signifi-
Schmelzdemineralisationen gehören als Folge einer unzureichenden Plaquekontrolle zu den relevanten Nebenwirkungen bei der Therapie mit Multibracketapparaturen [8]. Sie werden klinisch als White-Spot-Läsionen sichtbar und stellen, neben der kariologischen Problematik, auch aus ästhetischer Sicht ein großes Problem dar. Besonders häufig zeigt sich diese Komplikation auf den Labialflächen der seitlichen Schneideund Eckzähne des Oberkiefers [23]. Zur Prävention dieser Läsionen werden von verschiedenen Firmen zunehmend Versiegelungsmaterialien angeboten, die vor oder nach dem Kleben der Brackets auf die Zahnoberflächen aufgebracht werden. Insbesondere gefüllte und ungefüllte kompositbasierte Versiegelungsmaterialien, aber auch unterschiedliche Lacke und Liner werden heute bundesweit in über 90% der kieferorthopädischen Praxen als Compliance-unabhängige Präventionsmaßnahme angewendet [12]. Dentale Materialien unterliegen in der Mundhöhle Veränderungsprozessen [33]. Dabei kann es zur Freisetzung von Bestandteilen oder chemisch veränderten Reaktionsprodukten kommen, die unerwünschte lokale, möglicherweise auch systemische biologische Reaktionen auslösen können [20]. In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Untersuchungen über die Freisetzung von Bestandteilen aus dentalen Kompositmaterialien durchgeführt. Im Zuge dieser Untersuchungen konnte klar gezeigt werden, dass verschiedene (Ko-)Monomere, z. B. HEMA, TEGDMA, Bis-GMA oder UDMA, aus zahnärztlichen Kompositen herausgelöst werden können [11]. Wahrscheinlich ist auch, dass viele Additiva, z. B. Photoinitiatoren, Inhibitoren oder Stabilisatoren, aus kompositbasierten Materialien im Laufe der Tragezeit freigesetzt werden [39]. Einzelne (Ko-)Monomere, Additiva oder Degradationsprodukte dentaler Kompositmaterialien werden mit möglichen zytotoxischen [18], gentoxischen [35] oder östrogenen [27] Effekten in Verbindung gebracht. Zusätzlich können beim Abbau bestimmter (Ko-)Monomere (z. B. TEGDMA) toxische, hochreaktive Zwischenprodukte (sogenannte Epoxy-Verbindungen) entstehen, die mit einem möglichen mutagenen Potenzial assoziiert werden [10, 31]. Die Freisetzung von Bestandteilen aus Kompositen ist abhängig vom Polymerisationsgrad und der Polymerisationszeit [9, 14]. Caughman et al. [7] konnten zeigen, dass Komposite bei einer Polymerisationszeit von 15 s eine signifikant höhere Zytotoxizität verursachen, als nach 30 und 60 s. Zusätzlich kann der Fülleranteil der Materialien das zytotoxische Potenzial beeinflussen. So weisen Wataha et al. [40] darauf hin, dass Komposite mit niedrigem Fülleranteil eine signifikant höhere und auch länger andauernde zytotoxische Wirkung zeigen als ähnliche Materialien mit höherem Füllergehalt. Neben dem Polymerisa-
Abbreviations bis-GMA HEMA HPLC MTT TEGDMA UDMA
bisphenol-A diglycidyl dimethacrylate hydroxyethyl methacrylate high performance liquid chromatography 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide triethylene glycol dimethacrylate urethane dimethacrylate
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
67
Zingler et al. Zytotoxizität von Versieglungsmaterialien für Glattflächen
cantly greater than the effect of materials that are similar but contain a higher proportion of filler. In addition to curing parameters and the filler content, a recent meta-analysis showed that the release of substances from resin-based materials is significantly associated with the surface area [39]. It is common practice among orthodontists to apply surface sealants to the entire labial and buccal surface of teeth, which may result in extensive contact with the oral mucosa. What is more, the materials are applied in close proximity to the gingiva. Under unfavorable clinical conditions, this may cause the noncured sealant’s coming into direct contact with the gingiva or flowing into the gingival sulcus. All of the factors just outlined (i.e., extensive intraoral application, direct contact with oral mucosa, and close proximity to the gingiva) may lead to undesirable biological reactions. Despite the fact that these materials are widely used in orthodontic practice, their biocompatibility has rarely been tested. Various methods have been recommended for testing the biocompatibility of dental composites [26]. In vitro cytotoxicity assays are key to defining initial biocompatibility profiles (relevant methods are summarized in ISO 10993) that prepare the ground for in vivo studies and clinical test series. The present in vitro study is intended to shed light on the cytotoxic potential of widely used categories of surface sealants in preliminary experiments consistent with ISO 10993 by using an agar overlay assay.
Materials and methods Sealants and enamel slices
Twenty different sealants were tested. Pertinent details on these products and the experimental groups to which they were allocated are provided in Tab. 1. Human enamel slices were created from noncarious third molars or other teeth obtained from orthodontic extraction cases. Approval for this strategy was obtained from the local ethics board (ref. S-301/2011). All teeth had been cleared of tissue remnants and carefully cleaned after extraction. They were then stored in artificial saliva (16.1 mM KCl; 14.4 mM NaCl; 1.9 mM KH2PO4; 1.4 mM CaCl2; pH 6.8) [36] until glued with cyanoacrylate onto a specimen holder and processed with an inner-diameter saw featuring a diamond blade (Leica, Bensheim, Germany) to obtain enamel slices 200–300 μm thick from each lateral surface. These enamel slices were stored in artificial saliva at 4°C, then autoclaved and dried at 50°C for 30 min until use in the agar overlay assay.
Sealant application and variation of polymerization and drying times
In a sterile environment, 10 μl of each sealant was applied to enamel slices, etched when required, and then cured or dried in line with the manufacturers’ instructions. The curing lamp’s wavelength and luminescence (bluephase® G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein) were periodically checked. To investigate the influence of various conversion rates, we exceeded (overcuring) or reduced (undercuring) the curing
68
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
tionsgrad, der Polymerisationszeit und dem Fülleranteil konnte im Ergebnis einer aktuellen Meta-Analyse gezeigt werden, dass die Freisetzung von Bestandteilen aus kompositbasierten Materialien signifikant mit der Größe der exponierten Oberfläche zunimmt [39]. Versiegelungsmaterialien für Glattflächen werden in der kieferorthopädischen Praxis häufig auf die gesamte Labial- bzw. Bukkalfläche der Zähne aufgetragen und können großflächig mit den oralen Schleimhäuten in Kontakt treten. Zusätzlich werden Sie in unmittelbarer Nähe zur Gingiva appliziert. Unter ungünstigen klinischen Bedingungen besteht dabei das Risiko, dass unpolymerisiertes Versiegelungsmaterial in direkten Kontakt zur Gingiva kommt oder in den Sulkus einfließt. Die großflächige Anwendung der Versiegelungsmaterialien in der Mundhöhle, der direkte Kontakt mit den oralen Schleimhäuten und die räumliche Nähe zur Gingiva könnten zu unerwünschten biologischen Reaktionen führen. Die Biokompatibilität dieser in der kieferorthopädischen Praxis häufig eingesetzten Materialien wurde jedoch bisher kaum getestet. Verschiedene, mehrheitlich aufeinander aufbauende Testmethoden werden zur Prüfung der Biokompatibilität von zahnärztlichen Kompositen empfohlen [26]. Hierbei stellen Invitro-Testmethoden zur Zytotoxizität ein maßgebliches System zur Erstellung initialer Biokompatibilitätsprofile dar; entsprechende Methoden sind in der ISO 10993 zusammengefasst. Invivo-Studien und klinische Testreihen können folgen. In der vorliegenden Studie sollte eine erste biologische Beurteilung gängiger Versieglungsmaterialien für Glattflächen durch Prüfung der In-vitro-Zytotoxizität im Agar-Overlay-Assay angelehnt an ISO 10993 erfolgen.
Material und Methoden Versiegelungsmaterialien und Schmelzscheiben
Insgesamt 20 Versiegelungsmaterialien wurden untersucht. Die Einteilung in die Untersuchungsgruppen und Details zu den verwendeten Produkten sind in Tab. 1 zusammengestellt. Zur Herstellung von humanen Schmelzscheiben wurden kariesfreie Weisheitszähne oder kariesfreie Zähne von Patienten, die sich aus kieferorthopädischen Gründen einer Zahnextraktion unterziehen mussten, verwendet. Die Verwendung der Zähne zur Herstellung von humanen Schmelzscheibe aus extrahierten Zähnen wurde durch die lokale Ethikkommission genehmigt (Votum: S-301/2011). Die Zähne wurden nach Entnahme von Geweberesten befreit und vorsichtig gereinigt. Die Lagerung erfolgte bis zur Herstellung der Schmelzscheiben in künstlichem Speichel (16,1 mM KCl, 14,4 mM NaCl, 1,9 mM KH2PO4, 1,4 mM CaCl2, pH 6,8; [36]). Die Herstellung der Schmelzscheiben erfolgte mit einer Innenlochsäge mit diamantiertem Sägeblatt (Leica, Bensheim). Die Zähne wurden mit Cyanacrylat auf dem Probenhalter fixiert und die Schmelzscheiben mit Dicken von 200–300 μm von jeder Seitenfläche angefertigt. Bis zur Verwendung im Agar-Overlay-Assay wurden die Schmelzscheiben in künstlichem Speichel bei 4°C aufbewahrt.
Zingler et al. Cytotoxicity of enamel sealants
Tab. 1 Products used in this study Tab. 1 In der vorgestellten Studie verwendete Produkte
Tab. 2 Definition of decolorization index and lysis index Tab. 2 Entfärbungs- und Lyseindizes, Definitionen
Product
1124440
Decolorization index 0 1 2
1128416
3
1129146
4 5 Lysis index 0 1 2 3 4 5
Supplier
Composite-based sealants, filled Easy Glaze VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany Fissurit F VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany Fissurit FX VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany GrandioSeal VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany L.E.D. Pro Seal® Reliance Orthodontic Products, Itasca, IL, USA Light Bond™ Filled SealReliance Orthodontic ant Products, Itasca, IL, USA Maximum Cure® Filled Reliance Orthodontic Products, IL, Itasca, USA OrthoSolo™ Ormco, Glendora, CA, USA Pro Seal® Reliance Orthodontic Products, Itasca, IL, USA Seal&Protect® Dentsply DeTrey GmbH, Konstanz, Germany UltraSeal® XT plus™ Clear Ultradent Products, South Jourdan, UT, USA Composite-based sealants, unfilled Clinpro™ Sealant 3M ESPE, Seefeld, Germany Fissurit VOCO GmbH, Cuxhaven, Germany Helioseal® Clear Ivoclar Vivadent AG, Schaan, Liechtenstein Light Bond™Sealant Reliance Orthodontic Products, Itasca, IL, USA Maximum Cure® Reliance Orthodontic Products, Itasca, IL, USA Silicon-based sealants Protecto® BonaDent GmbH, Frankfurt, Germany Protecto®F BonaDent GmbH, Frankfurt, Germany Protecto® CaF2Nano BonaDent GmbH, Frankfurt, Germany Composite-modified, glass ionomer-based sealants Clinpro™ XT Varnish 3M ESPE, Seefeld, Germany
Lot no. 1023315
11834 103113 1010907 3646804 111980
Definition No detectable zone around or under sample Zone limited to area under sample Zone not greater than 5 mm in extension from sample Zone not greater than 10 mm in extension from sample Zone greater than 10 mm in extension from sample Zone involving entire culture Definition No observable cell lysis Cell lysis ≤20% Cell lysis ≤40% Cell lysis ≤60% Cell lysis ≤80% Cell lysis >80%
1009001378 B6RBP
N210069
Fig. 1 8 Schematic representation of the agar overlay assay
Abb. 1 8 Schematische Darstellung des Agar-Overlay-Assay
1107462 N16280 11892 1011115
4102384 4104620 4102432
N178061
times by 50%. Products that had to be air-dried (Protecto®, Protecto® F, Protecto® CaF2 Nano) had their dry-times varied. The mixture ratios in those materials containing two components (Maximum Cure® Filled and Maximum Cure®) were altered by 25%.
Vor der Verwendung im Agar-Overlay-Assay wurden die Schmelzscheiben autoklaviert und 30 min bei 50°C getrocknet.
Applikation der Versiegelungsmaterialien und Variation der Polymerisations- und Trocknungszeiten
In steriler Umgebung wurden die Schmelzscheiben, wenn nach Herstellerangaben notwendig, geätzt und anschließend mit 10 μl des jeweiligen Versiegelungsmaterial behandelt und entsprechend den Herstelleranweisungen polymerisiert bzw. getrocknet. Die Wellenlänge und Lumineszenz der Polymerisationslampe (bluephase® G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein) wurde regelmäßig überprüft. Um den Einfluss unterschiedlicher Konversionsraten darzustellen, wurden die Lichthärtungszeiten um 50% unter- bzw. überschritten. Für Produkte, die eine Lufttrocknung erfordern (Protecto®, Protecto® F, Protecto® CaF2 Nano) wurde entsprechend die Trocknungszeit variiert. Bei den ZweikomponentenMaterialien Maximum Cure® Filled und Maximum Cure® wurden die Mischungsverhältnisse der beiden Komponenten um jeweils 25% verändert.
Agar-Overlay-Assay
Die Durchführung des Agar-Overlay-Assay erfolgte in Anlehnung an ISO 10993. Zur Durchführung wurden in je 60 mm Zellkulturschalen (Greiner, Frickenhausen) 1,1×106 Zellen
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
69
Zingler et al. Zytotoxizität von Versieglungsmaterialien für Glattflächen
Tab. 3 Cytotoxic potential of products used in this study Tab. 3 Zytotoxisches Potenzial der in der Studie verwendeten Produkte Product
Decolorization index
a. Composite-based sealants, filled Easy Glaze 2 Fissurit F 2 Fissurit FX 2 GrandioSeal 2 L.E.D. Pro Seal® 3 Light Bond™ Filled Sealant 3 Maximum Cure® Filled 2 OrthoSolo™ 3 Pro Seal® 2 Seal & Protect® 3 UltraSeal® XT plus™ Clear 2 b. Composite-based sealants, unfilled Clinpro™ Sealant 3 Fissurit 2 HelioSeal® Clear 3 Light Bond™ Sealant 4 Maximum Cure® 2 c. Silicon-based sealants Protecto® 0 Protecto® F 0 Protecto® CaF2 Nano 0 d. Composite-modified, glass ionomer-based sealants Clinpro™ XT Varnish 2
Agar overlay assay
Lysis index
Reaction index
Cytotoxic potential
2 2 1 2 4 4 3 4 2 4 3
2/2 2/2 2/1 2/2 3/4 3/4 2/3 3/4 2/2 3/4 2/3
Moderate Moderate Mild Moderate Moderate–strong Moderate–strong Moderate Moderate–strong Moderate Moderate–strong Moderate
4 3 3 4 2
3/4 2/3 3/3 4/4 2/2
Moderate–strong Moderate Moderate Strong Moderate
0 0 1
0/0 0/0 0/1
Negative Negative Negative–mild
3
2/3
Moderate
This assay was performed in accordance with ISO 10993. Murine L929 fibroblasts in passages 12–14 (item CCL-1™; American Type Culture Collection) were seeded on 60-mm culture dishes (Greiner, Frickenhausen, Germany) at 1.1×106 cells and were cultured overnight in fully supplemented Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM; Biochrom, Berlin, Germany) with 10% fetal calf serum, 100 μg/ml penicillin, and 100 IU/ml streptomycin at 37°C in 5% CO2. On the next day, the medium was replaced by 4.4 ml of fully supplemented DMEM with 1.5% agarose (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). Once the agarose had hardened at 37°C in 5% CO2, the cells were stained with neutral red (0.01% in PBS) for 30 min. Immediately after sealant application, the prepared enamel slices were placed onto the agar plates, with the sealant side facing downward, followed by incubation at 37°C in 5% CO2 for 24 h. Samples with methyl methacrylate (Sigma– Aldrich, Munich, Germany) served as positive controls and untreated enamel slices as negative controls. All experiments were performed in triplicate and repeated three times. An overview of the assay is provided in Fig. 1.
70
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
(murine L929-Fibroblasten in den Passagen 12–14 (bezogen von der American Type Culture Collection, Bestellnummer CCL-1™) ausgesät und über Nacht in voll supplementiertem Dulbeccos-Modified-Eagle-Medium (DMEM, Biochrom, Berlin, 10% fötales Kälberserum, 100 μg/ml Penicillin, 100 IU/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 kultiviert. Am folgenden Tag wurde das Medium abgenommen und durch 4,4 ml voll supplementiertes DMEM mit 1,5% Agarose (Becton Dickinson, Heidelberg) ersetzt. Nach dem Aushärten der Agarose bei 37°C, 5% CO2 wurden die Zellen mit Neutralrot (0,01% in PBS) für 30 min angefärbt. Die entsprechend vorbereiteten Schmelzscheiben wurden sofort nach dem Auftragen der Versiegelungsmaterialien mit der Schichtseite auf die Agarplatten aufgebracht und bei 37°C, 5% CO2 für 24 h inkubiert. Als Positivkontrolle wurde Methyl-Methacrylat (Sigma-Aldrich, München) verwendet. Unbehandelte Schmelzscheiben dienten als Negativkontrolle. Alle Untersuchungen wurden in dreifachen Triplikaten durchgeführt. In Abb. 1 ist der Aufbau des Agar-Overlay-Assay dargestellt.
Analyse der Proben
Die Auswertung erfolgte mit Hilfe eines inversen Mikroskops (Zeiss Axiovert, Carl Zeiss, Jena), das mit einer Digitalkamera (Nikon D70, Nikon, Düsseldorf) verbunden war. Die quantita-
Zingler et al. Cytotoxicity of enamel sealants
Fig. 2 8 Representative results obtained by the agar overlay assay concerning morphological characteristics of L-929 murine fibroblast cultures exposed to differently treated enamel slices. The dotted white lines indicate the margins of the enamel slices, the horizontal black bar a distance of 100 µm. Untreated enamel slices like that in a served as controls, characterized by intact confluent monolayers of cells retaining their neutral red dye indicating intact membranes. b Specimen treated with a filled resin-based sealant (L.E.D. Pro Seal®) which caused intracellular fading and morphological alterations and lysis in the area around the slice. c Specimen treated with another filled resin-based sealant (Pro Seal®) resulting in intracellular dye fading while not having a major impact on cell morphology. d Specimen treated with an unfilled resin-based sealant (Light Bond™) resulting in intracellular dye fading and pronounced morphological changes. e Specimen treated with a silicone-based sealant (Protecto®) which has left the cells virtually unaffected. f Specimen treated with the resin-modified, glass ionomer-based sealant (Clinpro™ XT Varnish) which has triggered dye fading and a moderate effect on cell morphology. Abb. 2 8 Repräsentative Ergebnisse des Agar-Overlay-Assay mit Bezug auf morphologische Charakteristika muriner L-929 Fibroblastenkulturen nach Konfrontation mit unterschiedlich behandelten Schmelzscheiben. Die punktierten weißen Linien zeigen die Ränder der Schmelzscheiben, die schwarzen Maßstabsbalken repräsentieren eine Länge von 100μm. Unbehandelte Schmelzscheiben wie in (a) dienten als Kontrolle, charakterisiert durch eine intakte konfluente Monolayer von Zellen, deren intrazelluläre Einfärbungen mit Neutralrot auf intakte Zellmembranen hindeuten. b Proben, behandelt mit einem gefüllten kompositbasierten Versiegler (L.E.D. ProSeal®), verursachten intrazelluläre Entfärbungen, morphologische Veränderungen und Zelllyse in der Umgebung der Schmelzscheiben. c Proben, behandelt mit einem weiteren gefüllten kompositbasierten Versiegler (Pro Seal®), führten ebenfalls zu intrazellulären Entfärbungen, der Einfluss auf die Zellmorphologie war jedoch weniger stark ausgeprägt. d Proben, behandelt mit einem ungefüllten Komposit-basierten Versiegler (Light Bond™), führten zu intrazellulären Entfärbungen und ausgeprägten morphologischen Veränderungen. e Proben, behandelt mit einem silikonbasierten Versiegler (Protecto®), zeigten nur geringe Effekte auf die Zellen. f Proben, behandelt mit einem Kunststoffmodifizierten glasionomerbasierten Versiegler (Clinpro™ XT), lösten Entfärbungen und mittelschwere zellmorphologische Effekte aus
Specimen analysis
We used an inverted microscope (Zeiss Axiovert; Carl Zeiss, Jena, Germany) connected to a digital camera (Nikon D70; Nikon, Düsseldorf, Germany). The quantitative part, namely measuring the decolorization zone, was done by interactively analyzing micrographs of the area surrounding the enamel slices using Image J software’s measurement function [30]. A stage micrometer was used for calibration. Cell lysis or destruction was independently rated by four investigators (S. Z., B. M., A. K., R. E.). The decolorization and lysis indices used to interpret these findings in accordance with ISO 10993 are listed in Tab. 2. The cytotoxic potential was assessed by calculating a reaction index (RI; RI = (decolorization index + lysis index)/2). The cytotoxic potential was classified as follows: negative: RI=0; mild: RI =0.5–1.5; moderate: RI =2–3; moderate/strong: RI =3.5, strong: RI =4–5.
tive Analyse (Messung der Entfärbungszone) erfolgte anhand der Mikrophotographien interaktiv mit Hilfe der Software Image J [30]. Dazu wurden Mikrophotographien der die Schmelzscheiben umgebenden Regionen mit der Messungsfunktion (Standardfunktion der Software Image J) interaktiv ausgewertet. Die Eichung erfolgte anhand eines Objektmikrometers. Zelllyse und Zellzerstörung wurden von vier Experimentatoren (S.Z., B.M., A.K. und R.E.) unabhängig beurteilt. Die Interpretation erfolgte in Anlehnung an ISO 10993 auf Basis der Entfärbungs- und Lyseindizes (Tab. 2). Die endgültige Bewertung des zytotoxischen Potenzials erfolgte schließlich anhand der Reaktionsindizes (RI) [RI = (Entfärbungsindex + Lyseindex)/2]. Die Einstufung des zytotoxischen Potenzials erfolgte anhand der Reaktionsindizes RI =0: negativ; RI =0,5–1,5: mild; RI =2–3: mäßig; RI =3,5: mäßig/stark; RI =4–5: stark.
J Orofac Orthop 2015 · No. 1 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg
71
Zingler et al. Zytotoxizität von Versieglungsmaterialien für Glattflächen
Statistical analysis
Due to our group sizes, the cytotoxic-potential analysis based on this reaction index was conducted nonparametrically, which comprised a Kruskal–Wallis test for intergroup comparison (not including the resin-modified glass ionomer cement) and a Mann–Whitney U-test for pairwise intergroup comparisons. All statistical calculations were done with SigmaStat software (IBM-SPSS, Ehningen, Germany). Descriptive p-values of ≤0.05 were considered statistically significant.
Results Filled resin-based sealants
All of these were associated with decolorization zones not exceeding 10 mm when used according to the manufacturers’ instructions. Their decolorization scores were generally 2 (
