日本細 菌 学 雑誌

● 速

(Tumor

L-formの

necrosis

factorα:

育 子1) 和 暢2)

桑野 山本

松浦 天児

1)久 留 米 大 学

TNFα)の

剛 一1) 康 道1)

医学部

梅 田 荒井

腫 瘍 壊 死 因 子(Tumor

necrosis

factorα:TNFα)は

〒812

toxinやlipopolysaccharideで

一 つ で あ る が3),最 近 わ れ わ れ やGallilyら

は

他 の 細 菌 と同様 に

を 産 生 す る こ と を 報 告 し た1,7,15)。 と ころ で 種 々の

細 菌 を 細 胞 壁 合 成 阻 害 剤 で あ る β-lactam系 在 下 で 培 養 す る と,形

で は,こ

態 的 ま た,生

類 似 性 の 高 いL-formが

抗生物質存

誘 導 さ れ る12)。本 研 究 産 生

本 実 験 で 用 い たL-formは たStaphylococcus

臨 床 材 料 か ら分 離 同定 さ れ

aureusをcloxacillin

(MCIPC)存

在下

以 前 報 告 し た ご と く,腹

よ う に5%

し,浮

養 し たS.

aureusを5%

NaClを

ン ラ ー ジ 棒 で 接 種 し,そ ん だDISCを に よ るS.

置 き,48時 aureusの

含 むBHI寒

の 中 央 にMCIPC 間37Cで

天培 地 に コ 1000μgを

含

培 養 した 。MCIPC

コ ロ ニ ーの 阻 止 円 の 周辺 部 に認 め ら

れ る 典 型 的 なL-formの 500μg/mlのMCIPCと5% 代 継 代 後,500μg/mlのMCIPC,

コ ロ ニ ー を 寒 天 ご と 切 り 出 し, NaClを

含 む 寒 天 培 地 で数 10%NaClお

よ び5

後 に腹腔浸 出

fetal calf serum加RPMI

なる

1640で

調 整 し, 間培養

着 細 胞 を 得 た1)。2mM

ED-

付 着 細 胞 を 剥 離 し,myeloperoxidase染

色 で は

ク ロ フ ァ ー ジ と 同 定 さ れ た1)。 マ ク ロ フ

ァ ー ジ 培 養 上 清 の 細 胞 傷 害 活 性 の 測 定 法 は,マ ス ト プ レ ー トにL細

24時

間培

用

腔 マ ク ロ フ ァ ー ジ はOK432

遠 心 洗 浄 後,5×105/0.1mlに

遊 細 胞 を 除 去 し,付

TAで

nomycin

水 製 薬)で18時

誘 導 され

マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー トに 添 加 し て3時

で 培 養 し 誘 導 し た も の を 使 用 し た 。 な す わ ち,brain 体 培 地(BHI,日

か らL-formが

ウ ス に 投 与 し,3日

細 胞 を 採 取 し,3回

heart

infusion液

中14株

の う ち 代 表 的 な 株 で あ るL-70を

(1KE)をBALB/cマ

70∼80%マ

能 に つ い て 検 討 した の で 報 告 す る 。

23株

い た。

96穴

化 学 的 に もmyco-

の よ う な 細 胞 壁 を 欠 くL-formのTNFα

aureus

た 。 本 実 験 で は,そ

刺 激 す る と産 生 さ れ る

細 胞 壁 を 持 た な いmycoplasmaも

〕

な お,S.

れ た マ ク ロ フ ァ ー ジ を,endo-

昭 子2) 澄 夫1)

〒830 細 菌学 教 室

〔 受 付:8月3日,1990年

種 々 の 菌 体 でprimeさ

誘 起 能

細 菌学 教 室

福 岡市 東 区馬 出3-1-1

plasmaと

1990

腫 瘍 壊 死 因 子

久留 米 市 旭 町67 2) 九 州 大 学 医 学 部

TNFα

(5),

報

Staphylococcus

cytokineの

45

D

間 後,プ

violetで

胞(3×104/well)を

(1μg/ml)存

在 下 で,そ

の培 養 上 清 を添 加 し

レ ー トに 付 着 し て い るL細

染 色 し,そ

イ ク ロテ

接 種 し ,acti-

胞 を,crystal

の吸光 度で細 胞傷害 活性 を測 定 し

た1)。 図1にS.

aureusのL-formの

急速凍結置 換固定法に

よ る電子 顕 微 鏡 写 真 を 示 した。 そ の形 態 は大 小 不 同 で あ り明 ら か な 細 胞 壁 は 認 め ら れ な か つ た 。 ま た,こ formは

等 張 液 中 で は 急 速 に そ のviabilityは

こ の 事 実 か ら わ れ わ れ が 誘 導 し たL-formは

のL-

失 活 した 。 通 常 の菌 体

%馬

血 清 を 添 加 し た 液 体 培 地 で 培 養 し,3×104rpm,

が 保 有 す る 細 胞 壁 を 欠 い て い る こ と が 推 定 さ れ た 。 表1

30分

の 遠 心 で 菌 体 を 集 め 使 用 ま で-80Cに

にL-form存

保 存 した。

在 下 で の マ ク ロフ ァー ジ の培 養 上 清 の細 胞

845

図1.

S. aureus

L-formの

L-form固

コ ロ ニ ー の 電 顕 像(×104)

形 培 地

上 で3日

培 養 後 のL-formの

コ ロ ニ ー を 試 料

と し て 用 い た 。

表1

S. aureus

L-form存

培 養 上 清 中 のL細

在 下 で のマ クロフ ァー ジ

傷 害 活 性 を 示 し た 。 細 胞 傷 害 活 性 は 添 加 し たL-formの 量 に よ り増 加 し た 。 ま た,こ

胞 に 対 す る細 胞 傷 害 活性

1.5時

の 細 胞 傷 害 活 性 は,培

aureusを

添 加 し た 系 で もL-formと

同程 度 か や や 高 い 細

胞 傷 害 活 性 値 を 示 し た 。L-formを60C

30分,100C

分 間 の 加 熱 で も 細 胞 傷 害 活 性 因 子,TNF誘 わ りが な か つ た0し

か し,L-formの

次 に こ の 細 胞 傷 害 活 性 がTNFα , 30分 の 遠 心 で 集 菌 後,凍

し た 。 蒸 留 水 に 溶 解 し,菌 て用 い た。 b) 5%牛 胎 児 血 清 加RPMI1640培 ロ フ ァ ー ジ(25×104/well)に

体 を 破 壊 後,培

結 乾燥

地 で希 釈 し

地 を 使 用 し ,精 製マ ク 種 々 の 濃 度 のL-formを

添 加 し24時 間 培 養 後,培 養 上 清 を 採 取 し た 。Actinomycin D (1μg/ml>存 在 下 で,L細 胞3×104/wellに 2段 階 希 釈 した 培 養i上清 を 添 加 し37Cで24時 crvstalvioletで 染 色 し 吸 光 度 を 測 定 し た 。

培養上 清添 加 ウエ ルのOD ×100(ODは3ウ

/コ ン トロ ー ル ウ エ ル のOD 50%

cytotoxicityを

と し た 。

846

間培 養 後

エ ル の 平 均)

示 す 最 大 希 釈 倍 数 の 逆 数 を1

を 検 討 す る た め に,抗TNFα の 中 和 試 験 を 行 つ た 。 図2に の 添 加 に よ つ て98%以

ー タ 未 掲 載)

に よ る も の か ど うか

抗 体 に よ る細 胞 傷 害 活 性 示 す ご ど と く,α-TNFα

上 の 細胞 傷害 活 性 の 消失 が認 め

ら れ た 。 こ れ に 対 し て α-IFNa+β

ま た は α-IFNγ の 添

加 で は 細胞 傷 害 活 性 に対 す る影響 は認 め られ な か つ た。 こ の こ と か らL-form存

在 下 での マ ク ロ フ ァー ジの培 養

上 清 に 認 め ら れ る 細 胞 傷 害 活 性 はTNFα

に よる もの が

大 部 分 を 占 め る こ とが 明 らか に な つ た。 次 に,L-formのTNFα unlts

5

起 能 に は変

み の培 養 上 清 に は

細 胞 傷 害 活 性 は 認 め ら れ な か つ た 。(デ

a) L-formは3×104rpm

養

間 後 に 明 ら か に 認 め ら れ た 。 ま た 親 株 で あ るS.

す る か ど うか をEngelmanら

の誘 起 因 子 が 細 胞 膜 に 局 在 の 方 法13)に

よつ て 検 討 し

日本 細 菌 学 雑誌 た 。3×104rpm,

30分

て お り,こ の分 画 はteichoic

遠 心 で 集 め た 菌 体 をhypotonic

処 理 に よ り破 壊 し,2×104rpm,

45分

の遠心で可溶画

分 と不 溶 画 分 に 分 け,不

溶 画 分 をsucrose密

法 で 分 画 し た 。TNF活

性 は,大

度 勾 配 遠心

部 分2×104rpmの

不

のTNF誘

45

(5),

1990

acidを 欠 くmycoplasma

起 物 質 と類 似 の も の と考 え られ る(data未 掲

載)。 細 菌 か ら誘 導 され るL-formの

病 原 性 につ い て は不 明

溶 画 分 に 集 ま り さ ら に 比 重 遠 心 法 で は,membrane分

な 点 が 多 い。 β-lactam系 抗 生 物 質 の 化 学療 法 後 に 臨 床

画 で あ る35%と50%

材 料 か らL-formが

sucroseのinterfaceに

大部分が

わ ち,Mattmanら13)は,H.

集 ま る こ とが 明 らか に な つ た。 TNF

α は,菌

体 の 細 胞 壁 の 構 成 成 分 で あ るlipopoly-

saccharideやteichoic

acidで

と 産 生 さ れ るcytokineの

がTNFを

マ ク ロフ ァー ジを 刺 激 す る

一 つ で あ る 。 本 研 究 で は,通

常 の 細 胞 壁 を 保 有 し な いS.

aureusか

ら 誘 導 したL-form

起 能 はcell

membraneに

influenzaeやStaphylo-

coccusに よ る髄 膜 炎 で 化 学 療 法 後,髄 液 か ら これ ら細 菌 のL-formを

検 出 した 。Gutmanら8)や

そ の 他 の報 告 で

は9,10),実 験 的 腎 孟 腎 炎 の 化 学 療 法 後 持 続 的 にL-form が分 離 され る こ とを 報 告 して い る。 これ ら一連 の報 告 は 細 菌 の 感 染 が 化 学 療 法 に よ り治 癒 し た 後 も,な

産 生 す る こ と を 明 ら か に し た 。L-formの

TNF誘

証 明 され た と い う報 告 が あ る。 す な

formの

存 在 し,cytoplasma

おL-

感 染 が 持 続 す る 可 能 性 を 示 唆 して い る 。 しか し

で は そ の 活 性 は ほ と ん ど 認 め ら れ な か つ た 。L-formの

こ の よ うな 細 菌 感 染 後 に 存 続 す るL-formの

細 胞 膜 の 構 成 成 分 は 親 の 細 菌 に 比 べ てglicolipidが

係 につ い て 明 らか に され て い な い。 と ころ でTNFは

し,phospholipidが teichoic

acid

減 少 す る が4),一

(intracellular

し え な い16)。teichoic が,わ

teichoic

teichoic

acid以

方 そ の細 胞膜 に

acid)の

acidはTNFの

れ わ れ の 実 験 で は,L-formの

増 大

存 在 も否 定

誘 起物 質 であ る 細 胞 膜 に存 在 す る

外 の 脂 質 分 画 に もTNF誘

起能を見出 し

宿 主 との 関

瘍 細 胞 傷 害 活 性 を 有 し,ま た 同 時 にlipoprotein

腫

lipase

活 性 の 阻 害 物 質 と して見 出 され た11)。そ の後,TNFは 正 常 細 胞 に も多 彩 な生 物 活 性 を示 し好 中 球 の脱 顆 粒 に 伴 う活 性 酸 素 の 放 出,白 血 球 の 内皮 細 胞 へ の 吸着 能 の 亢進 な どを 来 す14)。in vivoで も多 核 白血 球 が 関与 す る内 皮 細 胞 の 血 液 凝 固機 能 の低 下 に起 因 す る出 血 性 壊 死 を 惹 起 し5),い わ ゆ るendotoxin

shockの 本 態 を考 え られ て い

る2,17)。 こ の よ うな こ とか ら,細 菌 感 染 後 に 誘 導 され た L-formがTNFの

産 生 を 介 して,細 菌 感 染 後 の 局 所 ま

た は 全 身 の病 理 学 的 所 見 に深 く関 わ つ て い る こ とが 示 唆 され る。 今 後 は 実 際 の生 体 の感 染 の 場 で のTNFの

作用

に つ い て 検討 す る必 要 が あ ろ う。

表2

図2.

抗TNFα,抗IFNα+β,抗IFNγ

抗 体 の マ クロフ

ァ ー ジ 培 養 上 清 の 細 胞 傷 害 活 性 に 対 す る抑 制 効 果 。 マ ク ロ フ ァ ー ジ+L-formの 培 養 上 清 に 各TNF IFNα+β,

IFNγ

の100単 位 中 和 量 の 抗 体 を 添 加 し,

37C, 30分 培 養 後,L細 害 活性 を測 定 した。

胞 に 添 加 し て,そ

の細 胞 傷

L-formの

a) 3×104rpm 菌 体1gに

菌体 成 分 分 画 とTNFα の誘 起 能

, 30分 遠 心 集 菌 し たL-formを 凍 結 乾 燥 し, 対 しIOmlの 蒸 留 水 を 添 加 し でL-formを 溶

菌 させ た 。9×103rpm, 用いた。 b) 乾 燥 重 量

5分 遠 心 し た 上 清 を 試 料 と して

。

847

文

9)

献

Guze,

L.B.

sistence 1)

Arai,

S.,

Inoue, of

Furukawa,

H.,

of

Role

B.,

of

Old,

and

in-induced

229,

Proc.

factor

Nat.

that

Acad.

11)

lethal

causes

Sci.

S.,

of

72,

366613)

Cohen,

M.

and

composition form. 5)

Panos,

Dayer,

J.-M.,

5,

pyogenes

B.,

and cells

and

and

Cerami,

factor

prostaglandin

derived

A.

fibroblasts.

J.

14)

(1985):

by

human

Exp.

Med.,

Terry,

T.M.,

and

(1967):

brane sulfate 7)

Characterization

of

J.

(1989):

R.,

Gutman,

bacteriuria.

848

Ben-Av,

necrosis

Cell. L.T.,

15)

in

urine J.

Clin.

135,

and as

Immunol., M.,

(1965): of Invest.,

121,

patients 44,

16)

a mediator

of

lysis

Baltimore,

Mattman,

with 1945-1952.

J.

L.H.

G.M. on

Biol.

the infec-

Med.,

(1968): In

&

33,

K.,

&

Guze,

L.B. L-

Willkins. isolated

L.B.

(ed.)

from

infec-

Microbial

L-forms.

Stern, cell

factor.

J.

Kuwano,

T.,

K.,

Arai, and

a

cultivation

In

spheroplastsand

and

and

necrosis

in

and

L-forms

endothelial

Sugam,

of lipase

631-639.

212-220,

Guze,

Studies

lipoprotein

pro-

Baltimore,

Willkins.

P.P.

of

(1981):

in

Production

spheroplasts

Nawroth,

A.

Williams

472-483.

S.

D.M.

(1986): properties

Exp.

163,

Med.,

Furukawa,

(1990):

cell

Modula-

hemostatic

M.,

of tumor line,

by

740-745. Himeno,

Mycoplasma

production

monocytic

Y.,

induces necrosis

THP-1,

by

a

facprotein

C-independent

Toon,

P.,

Brown,

lipid-Teichoic

membrane

by

and

bacterial chronic

17)

pathway.

Infect.

Immun.,

press).

of

Biochem.

R.G., of

Kalmanson,

Yale

154,

protoplasts,

The

146-153.

Significance

Med., (1969):

Microbial

kinase

Loewenstein,

Petersdorf,

143,

enterococcal

Cerami,

(ed.)

(in

cell

ap-

Science,

memdodecyl-

381-390.

P.,

Exp.

transcription

H.

plasma

and

L-forms.

tumor

Morowitz,

Sodium

tumor

Turck, R.J.

I.

factor

orale-induced

Wedgwood, variants

T.,

Tumor

macrophages. 8)

BBA.

Sher,

Mycoplasma

the

laidlawii.

solubilization.

Gallily,

of

Mycoplasma

Per-

after

Observations

rat.

of Staphylococcal

tor J.

of the

J.H.

Satoh,

D.M.,

and

decrease

J.

Marston,

tion

col-

2163-2168.

Engelman,

rats.

non-obstructed

M.

toplasts,

L-

stimulates

B.H., I.

kidney

Kawakami,

tions.

lipid

F2 production

dermal

the

Williams

and

necrosis

synovial

Membrane

2385-2392.

Beutler,

lagenase

162,

(1966):

of Streptococcus

Biochemistry,

Cachectin/tumor

6)

C.

in

forms.

3670. 4)

12)

endotox-

necrosis

U.S.A.,

Goldner,

of chronic

activity.

An

in

Pyelonephrtis.

endotoxin-induced

ef-

Green,

(1975):

(1964): form

372-385.

cachectin/

R.L.,

G.M.

in •gprotoplast•h

of pyelonephritis

L.B.,

tion

869-871.

B.

Guze,

course

A.C.

from

Kassel,

Williamson,

serum

tumors.

against

cure

(1961):

macro-

Cerami,

mice

L.J.,

in

Kalmanson,

bacteria

1340-1341. 10)

myco-

231-243.

and

Science,

E.A., N.,

34,

immunization

endotoxin.

Firore,

by

induction

I.W.,

factorprotects

parent

K.,

Enhancement

(TNF-ƒ¿)

Immunol.,

Milsark,

necrosis

Carswell,

(1990):

Kuwano,

macrophages

factor-ƒ¿

Passive

tumor

T.,

mycoplasma-associated

Microbiol.

(1985):

fect

of

T.

active

necrosis

Beutler,

Munakata,

Miyazaki, of

tumor

phages.

3)

and

cytotoxicity

plasma:

2)

M.,

and

of

Waage,

J., A.,

Association and disease.

fatal

P.E.,

Lancet,

in

faecalis

J.

the

(1972):

cytoplasmic

N.C.I.B.

8191.

399-409.

Halstensen,

outcome

Baddiley,

complex

Streptococcus 127,

A.,

between

The

and

acid

tumor in

and

patients I,

Espevik,

necrosis

355-357.

with

factor

T.

(1987): in serum

meningococcal

日本 細 菌 学 雑 誌

Induction tumor

by

Staphylococcus

necrosis

factor-alpha

aureus from

L-form

45

(5),

1990

of

macrophages

Ikuko MATSU-URA1), Koichi KUWANO1), Akiko UMEDA2), Kazunobu AMAKO2), Yasumichi YAMAMOTO1) and Sumio ARAI1) 1) Department

of Microbiology

, Kurume of Microbiology

2) Department

Induction tigated. cytotoxic activity

of

investigate were

of

The

soluble

of

to

the

supernatant,

localization

layered

on The

of

necrosis

activity

respectively. activity

tumor

supernatant

TNF-ƒ¿

a

L cells.

factor-ƒ¿

a

macrophage Addition

of

indicating of

membranes production

of Medicine,

University

School

(TNF-ƒ¿)

by

culture

mixed

anti

TNF-ƒ¿ the

were

banded the

at

membrane

an the

interface fraction

and

aureus

inhibited

might

membranes

upper

aureus

S.

antibody

the of

with

Kurume 830,

of

hypotonicity

of

layers 35%

mostly

of and

was

showed

completely

due

was 10-times

L-form

L-form

be

lower

Japan

of Medicine

Staphylococcus

activity

production, composed

of

School

, Kyushu

that

TNF-ƒ¿

step-gradient

University

the to

cytotoxic

TNF-ƒ¿.

treated 35%

50% higher

and of than

inves-

a potent

50%

To L-form sucrose,

sucrose. that

The of

fraction.

849

the