Planta (Berl.) 107, 33--42 (1972) 9 by Springer-Verlag 1972

Untersuchung des Einflusses der Temperatur auf die Photosynthese-Induktion bei Chlorella vulgaris mit radioaktivem CO2 G. D6hler Botanisehes Institut der Universitiit Frankfurt a.M. Eingegangen am 3. April 1972 I n v e s t i g a t i o n of P h o t o s y n t h e t i c T r a n s i e n t s i n Chlorella vulgaris a t Different T e m p e r a t u r e s Using R a d i o a c t i v e C02

Summary. C02 exchange, 1~C02 fixation and radioactive products of Chlorella vulgaris (strain 211--11f) were examined during tile induction period at temperatures of +10 ~ and @35~ The algae were grown under low CO2 concentration (0.03vol.-%) at a temperature of +27~ The formation of transients in CO2 uptake in Chlorella, measured with an infrared gas analyser, is highly dependent on the temperature used during the measurements. At higher temperatures ( + 15~ and above) a maximum in C02 uptake exists at the begilming of the illumination period followed by a minimum before a steady rate of photosynthesis is reached. At a temperature of + l0 ~C, on the other hand, a long lag phase without a minimum in C02 uptake could be observed which also occurs in the time course of 14COz fixation. The autoradiographie studies of the kinetics of the appearance of labelled products at a temperature of -t-10~ showed that at the beginning of the light period nearly all of the radioactivity was incorporated into malate and aspartate. Under these conditions intermediates of the Calvin cycle were labelled after an illumination time of 2 minutes. At a temperature of ~-35~ radioactivity appeared in 3-phosphoglycerate as well as in malate and aspartate after a photosynthetic period of 10 see. At this temperature 3-phosphoglyeerate not only appeared earlier than at -~10~ but it was also more strongly labelled. Moreover the intermediates of the Calvin cycle were labelled after 20 or 30 sec of photosynthesis. These results show that a carboxylation of phosphoenolpyruvate and the Calvin cycle are involved in the formation of the transients of COs uptake in Chlorella vulgaris. The possible role of the control of photosynthetic carbon metabolism during the induction period is discussed. Seit d e n ersten Messungen der p h o t o s y n t h e t i s c h e n CO2-Aufnahme w/s der I n d u k t i o n s p h a s e (~cAlister, 1937; A u f d e m g a r t e n , 1939) w u r d e n u m f a n g r e i c h e U n t e r s u c h u n g e n m i t d e n verschiedensten Methoden a n zahlreiehen O b j e k t e n durchgefiihrt (vgl. v. d. Veen, 1960 ; Vejlby, 1961; Egle u n d DShler, 1963; Mokronosov u n d Nekrasova, 1966). Die ,,primgre CO2-Aufnahme" a m A n f a n g der B e l i c h t u n g wurde u n t e r anderein m i t der A n n a h m e eines prim/~ren CO2-Aeceptors (Vejlby, 1961) u n d 3

Planta (Berl.), Bd. 107

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G. D6h]er:

einer lichtinduzierten reduktiven Carboxylierung y o n P y r u v a t zu Malat (Butler, 1960) erkl/~rt. N a c h Auffassung yon Mokronosov u n d Nekrasova (1966) sollen die Induktionsphs das Ergebnis einer Selbstregulation des Photosyntheseapparates darstellen, an denen mehrere Prozesse beteiligt sind. Eine Regulation des Photosynthese-Stoffwechsels durch Intermediate, die in andere Biosynthesewege fliel]en, u n d durch die Kontrolle der Sehliisselenzyme (z.B. RuDP-carboxylase, FDP-ase) wird aueh als I n t e r p r e t a t i o n der Ubergangseffekte angeffihrt (Bassham, 1971). Die Ausbfldung der mit dem U R A S gemessenen Induktionsphase der photosynthetisehen CO~-Aufnahme wird neuerdings mit der Uberlageruug yon zwei verschiedenen Carboxyherungsreaktionen gedeutet (DShler, 1968; DShler, 1969; DShler u n d W e g m a n n , 1969). D a n a e h soll a m Anfang der Belichtung vor dem Anlaufen des Calvin-Cyclus eine Carboxylierung yon P h o s p h o e n o l p y r u v a t ablaufen u n d fiir das Auftreten eines P h o t o s y n t h e s e m a x i m u m s veranSwor$lich sein. Da die T e m p e r a t u r die Kinetik der C02-Aufnahme bei Chloretla stark beeinfluSt, haben wit bei + 1 0 ~ u n d + 3 5 ~ zu verschiedenen Zeiten die markierten Photosyntheseprodukte bestimmt. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dab tats~ehlieh eine Carboxylierung yon Phosphoenolp y r u v a t ~m Anfang der Beliehtung auftritt u n d dal~ die 14CO2-Fixierung naeh dem Calvin-Cyclus bei einer T e m p e r a t u r y o n + 1 0 ~ erst sparer einsetzt.

Methodik P/lanzenmaterial. Versuchsobjekt war die Grtinalge Chlorella vulgari~ (S~amm 211--11f) aus der Algenreinkultur-Sammlung des Pflanzenphysiologischen Instituts der Universit~t GSttingen. Die Algen wurden in einem Anzuchtthermostaten bei einer Temperatur yon +27~ einem Licht-Dunkel-Wechsel yon 16:8 Std und unter Begasung mit normaler a~mosph/~rischer Luft (0,03 Vol.- % C02) kultiviert. Die Beleuchtung erfolgte mit LeuehtstoffrShren (Osram de Luxe 40 W); Beleuchtungsst/~rke in HShe der Kul~urrShren 8 000 Lux. Weitere Efnzelheiten der Anzucht s. Egle und DShler (1963). Eine rasch wachsende Algenkultur wurde vor den Experimenten nach Abzentrifugieren der Algen in frischer N~hrlSsung resuspendiert, im Dunkeln 21/2 Std an die jeweilige Versuchstemper~tur adaptier~ und in einer speziellen Assimilationskammer aus Plexiglas mit atmosph~rischer Luft (0,03 Vol.- % C02) begast (Algenvolumen = 9,0 ml). Fixierungsexperimente mit radioaktivem Bicarbonat. ~r der gleichen Algensuspension wurden parallele Versuchsreihen bei + 10~ und + 35~C angesetzt. Wenige Sekunden vor Lichtbeginn sind der Algensuspension (9 ml) 1,0 ml einer radioaktiven NatriumbicarbonatlSsung (spezifische Aktivit/it 54,5 ~zCi/~zMol)zugegeben worden. Dies entspricht einem C02-Gehalt yon 0,45 Vol.-% COv Die Bestrahlung der Algen erfolgte mit einem Dia-Projek~or yon Quelle (Halogenprojektionslampe 24V/250W). Die Beleuchtungsst/~rke betrug 379 • 10a erg/cm2.sec oder 278' 10a erg/cm ~. sec. Naeh Zugabe von radioaktivem Biearbonat wurde die Beltiftung mit a~mosph~rischer Lu{t gestoppt, und nach Photosyntheseperioden yon 10, 20, 30, 40, 50 und 60 sec sowie 2 und 5 rain 1 ml der Algensuspension entnommen. Die Algenzellen

Photosynthese-Induktion bei Chlorella

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wurden in 5 ml siedendem Athano[ abget6tet und damit die Extraktion der 16sliehen Substanzen begonnen.

Extralction und Au/arbeitung der Extrakte. Naeh 10 rain Extraktion mit siedendem Athanol wurde zentrifugiert und der Riiekstand mit 50 %igem J~thanol sowie anschliel~end mit destilliertem Wasser extrahiert. Die gesamten Extrakte sind im l~undkolben unter Stiekstoffbegasung bei 60~ bis zur Trockne eingedampft worden. Der Riickstand wurde in 0,5 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Bestimmung der Gesamt]ixierung. Die Rate der 14C02-Fixierung wurde mit dem Fliissigkeitscintillator (Tricarb, Packard) bestimmt; 10 ~l des Extraktes wurden in ein 10 ml Scintillatorgemisch gespritzt, das aus 1 Liter Toluol, 10 g PPO und 1 Liter/'~thylenglyeolmonomethyI~therbestand. Di~nnsehichtchromatographische Trennung der 14C-markiertenFixierungsprodulcte. Zur Herstellung der Diinnschichtplatten wurde Cellulosepulver MN 300 (Maehery, Nagel & Co, Diiren) benutzt; das Gemisch setzte sich aus 2,8 g Cellulose, 0,2 ml einer 0,1 M EI)TA-LSsung und 25 ml destilliertem Wasser je Platte zusammen. i0 ~I Extrakt wurde a~ffgetragen und zweidimensional nach der Methode von Schiirmann (1969) aufgetrennt. Naeh dem gleichm~l~igen Besprfihen der Platten mit einem Essigs~ure-Pyridin-Ptlffer (pH 4,0) erfolgte die Trennung in der ersten

Riehtung elektrophoretisch (100O V; 36 mA) innerhalb 1 Std. Danach wurde fiber Nacht getrocknet und in der zweiten Riehtung mit einem Butanol-Ameisens~ureWassergemisch (6 : 1 : 2) chromatographisch entwickelt.

Autoradiographie und Ermittlung der 1~C-Verteilung. Die Platten wurden iiber Nacht getrocknet und danach ein RSntgenfilm Osray DW (Agfa Gevaert) aufgelegt. Nach einer Exponierungszeit yon 10 Tagen wurden die Filme entwickelt and die geschw~rzten Fleeken anhand friiherer Verteilungsmuster (vgl. Schiirmann, 1969; Ries, 1970) den markierten Substanzen zugeordnet. Nach t3bertragung des gefundenen Verteilungsmusters mittels Transparentpapier sind die entsprechenden Fleeke von der Dfinnschiehtplatte abgekratzt und ihre Zahlraten mit dem Fliissigkeitscintillator gemessen worden. Aus den Z~hlraten der einzelnen Verbindungen wurde die prozentuale Verteilung errechnet. Messung des C02-Gaswechsels. Die photosyntetische CO,-Aufnahme der Algen wurde mit Hilie eines URAS der Firma Hartmann & Braun, Frankfurt a.M. bei I0, 15, 25 und 35~ erfal3t. Zu diesem Zweck warden die Chlorella-Zellen auf ein i"r gesaugt und in eine Assimilationskammer aus Plexiglas gebracht. Weitere Einzelheiten dieser Mef~technik sind in der Arbeit I)6hler und Egle (1963) enthalten.

Ergebnisse W ~ h r e n d v. d. Veen (1951) a n d e m Gras Holcus lanatus u n d a n T a b a k bls in d e m T e m p e r a t u r b e r e i c h von 0 ~ bis ~-30~ keine Beeintr~cht i g u n g d e r ,,prim~ren C 0 2 - A u f n a h m e " l a n d , b e o b a c h t e n wir einen stark e n Einflul~ d e r T e m p e r a t u r auf die Ausbfldung der I n d u k t i o n s p h a s e bei der Griinalge Chlorella (vgl. A b b . 1). U n t e r unseren V e r s u c h s b e d i n g u n g e n (0,03 Vol.- % CO2; B e l e u c h t u n g s s t ~ r k e ]0000 Lux) t r i t t eine o p t i m a l e A u s p r ~ g u n g des Induktionsph/~nomens bei d e r V e r s u c h s t e m p e r a t u r y o n ~-25~ in Erscheinung. Bei niedrigen T e m p e r a t u r e n (z.B. -~10~ wird 3*

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G. DOhler:

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rain Abb. 1. Induktionseffekte der photosynthetischen C02-Aufnahme eines Sedimentes yon Chlorella vulgaris (211 -llf) in Abh~s yon der Temper~tur (-~10~ +15 ~ +25 ~ und -~35~ Beleuchtungsst~rke 10000Lux; Durchstr5mung der Assimilationskammer mit wasserdampfges~ttigter Prel3luf~ (0,03Vol.-% COs), 15 Liter/Std; Trockensubstanz der Algen: 30,1 rag/din 2

am Anfang der Belichtung eine kurze Zeit konstant bleibende geringe C02-Aufnahme gemessen, der dann ein allm~hlicher Anstieg auf das Niveau der stationaren Photosynthese folgt. Ein deutlich ausgepr~gtes Minimum, das sich der prim~ren COs-Aufnahme anschlie~t, wird ab einer Temperatur yon d-15~ beobachtet. Bei einer weiteren TemperaturerhShung k o m m t es vornehmlieh zu einer Verkfirzung des Anstiegs zum station~ren Photosynthesewert. Der starke Temperatureinflu6 zeigt sieh nicht nur in dem unterschiedlichen Niveau der charakteristischen GrS~en (Maximum, Minimum und station~rer Wert der COs-Aufnahme), sondern auch in der Zeit, in der diese Werte erreicht werden. Die starke Ausbildung der Induk~ionsph~nomene - - wie sie in den t~egistrierkurven der Abb. 1 dargestellt ist - - wird nicht immer in dem Ma•e beobachtet ; der physiologische Znstand der Algen beeinflu~t den zeitlichen Verlauf der photosynthetischen C02-Aufnahme (DShler, 1968). Da die extremsten Unterschiede in der Kinetik der C02-Aufnahme yon Chlorella-Sedimenten bei den Temperaturen d-10~ und d-35~ auftra~en, sind ffir die laCO~-Fixierungsexperimente diese Temperatnren gewi~hlt worden. U m direkte Itinweise fiber die wahrend der Indnktionsphase ablaufenden Reaktionen zu erhalten, wurden zu verschiedenen Zeiten unmittelbar nach Lichtbeginn die 14C02-Fixierung und die markierten Photosyntheseprodukte bestimmt. Die Rate und der zeitliche Verlauf der 14COs-Fixierung ist ebenfalls stark yon der Versuchstemperatur abhangig. Obwohl die mit dem URAS bei 0,03 Vol.- % CO s gemesse-

Photosynthese-Induktion bei Chlorella

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Abb. 2 a--d. Au~oradiogrammeder Chlorella-Extrakte. a Nach 20 see Photosyn~hese bei d- 10~C; b nach 5 rain Photosynthese bei d- 10~C; c nach 20 sec Photosynthese bei d-35~ und d nach t rain Photosynthese bei d-35~ Beleuchtungssth.rke 278. 10~erg/cm2.sec; Trockensubstanz der Algen: 50 rag/10 ml; 0,14 mg Chtorophylt/ml Algen; Zellzahl 10,8.10L Die auf den Autoradiogrammen bezeichneten Flecke bedeuten: 1 Aspartat, 2+9 Glucose-l-phosphat und Glueose-6-phosphat, 3 3-Phosphoglycerat, i Phosphoenolpyruva.t, 5 Malat, 6~-11 Serin und Glyein, 7 Alanin, 14 Fructose-6-phosphat, 15 Saeeharose, 16 Fruetose-l,6-diphosphat, 17 Uridindiphosphoglueose und 20 Glycerat und Citrat

hen Induktionseffekte bei der 14CO~-Fixierung nicht auftraten, wird bei + 10~ eine deutliehe Verz6gerungsphase in der 14C02-Fixierung und im Vergleieh zu dem Versuch bei + 3 5 ~ eine wesentlich niedrigere Fixierungsrate beobachtet. Somit ist auch eine gewisse ~bereinstimmung mit den Gaswechselexperimen~en festzustellen. Wenn man das Verteilungsmuster auf den Autoradiogrammen betrachtet (Abb. 2), erkennt man den starken Einflu6 der Temperatur auf den Einbau yon laC in die Photosyntheseprodukte. Die hier wiedergegebenen Autoradiogramme naeh 20 und 60 see bzw. 5 rain Photosynthese yon Chlorella.Zellen zeigen die wesentliehen Unterschiede im Verteilungsmuster, die am An~ang der

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G. DShler: 100

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Abb. 3. Kinetik des 14C-Ehlbaues in die einzelnen Substanzen (prozentuale Verteiiung) w~hrend der Induktionsphase yon Chlorella vulgaris (211-11 f) bei einer Versuchstemperatur yon 4-10~und 35~ C-4 Mala~ und Aspartat, PGS 3-Phosphoglycerat, ZmP Zuckermonopho@hate, Sacch Saccharose. Weitere Angaben s. Abb. 2 Belichtung vor allem nach kurzen Photosynthesezeiten bei den Versuchstemperaturen yon 4-10 ~ und -F35~ bestehen. Malat (5) und Aspartat (1) sind bei + 1 0 ~ nach 20 sec (Abb. 2a) die ersten markierten Photosyntheseprodukte; dagegen werden zur gleichen Zeit (Abb. 2c) bei -F35~ vor allem 3-Phosphoglycerins~urc (3), in geringem MaSe Aspart a t (1), Phosphoenolypruvat (4) und Serin (6), jedoch wenig Malat (5) markiert. Nach einer Belichtungszeit yon 5 rain finder man bei -F10~ e~wa das gleiche Verteilungsmuster, das bei 4-35~ bereits nach 1 min Photosynthese erhalten wird (vgl. Abb. 2 b und d). Die Autoradiogramme belegen, da6 bei 10~ am Anfang der Belichtung 14C nur in Malat und Aspartat ehlgebaut wird; d.h. es finder lediglich eine Carboxylierung yon Phosphoenolpyruvat start. Die Kinetik des 14C-Einbaus in die ffir die Problemstellung in Betracht kommenden Substanzen zeigt die Abb. 3 (prozentuale Verteilung). Die Auswertung der Autoradiogramme ergab danach, dal~ bei -F10~ die Chlorella-Zellen ab einer Photosyntheseperiode yon 40 sec 14CO~ auBer in Malat und Aspartat auch in Phosphoglycerins~ure einbauen; die Pro-

Photosynthese-Induktion bei Chlorella

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dukte des Calvin-Cyclus werden erst nach 2 min gebildet. Besonders auffiillig ist, dab bei dieser Temperatur nach kurzen Photosynthesezeiten nur Malat und Aspartat markiert sind; Saccharose tritt in geringen Mengen erst naeh 5 min auf. Bei der Versuehstemperatur von -~35~ wird die h6chste Markierungsrate in Malat und Aspartat (68 % ) nut nach einer Fixierungszeit yon 10 see gefunden. Bereits naeh 20 see Photosynthese dominieren die Produkte des Calvin-Cyelus; Saeeharose wird bereits naeh 1 min naehgewiesen. Die Einbaurate in Malat ist vor allem bei +10~ stets h6her als die in Aspartat. Die hier dargestellten Versuehsergebnisse konnten durch mehrere Wiederholungsexperimente reproduziert werden. In Dunkelfixierungsexperimenten mit Chlorella sind nur Aspartat, Glyeerat, Serin und Glutamat markiert; eine Malat- oder eine Phosphoglyceratsynthese ist nie beobachtet worden.

Diskussion

Unter den benutzten Bedingungen wird am Anfang der Belichtung yon den Chlorella-Zellen das 14C0~ in Malat, Aspartat und 3-Phosphoglycerat eingebaut. Bei einer Temperatur von ~-35~ werden relativ rasch (nach 20 sec bzw. 30 sec Photosynthese) Produkte des CalvinCyelus markiert. Dagegen wird bei ~-10~ ls Zeit (bis 1 min) nut ein Einbau des 14C in Malat und Aspartat - - Folgeprodukte einer Carboxylierung yon Phosphoenolpyruvat (PEP) - - beobachtet; eine Markierung der Produkte des Calvin-Cyclus tritt hier erst nach 2 rain Beliehtung der Algen auf. Aus diesen Befunden lassen sieh mehrere Sehliisse ziehen: 1. Neben dem Calvin-Cyclus existiert bei Chlorella eine weitere Carboxylierungsreaktion mit den Folgeprodukten Malat und Aspartat. 2. Das Anlaufen des Calvin-Cyclus ist temperaturabhi~ngig; die PEP-earboxylierung setzt mit Lichtbeginn ein. 3. Die Ausbildung der Induktionsphase lgBt sich auf die Beteiligung dieser beiden Carboxylierungsreaktionen zuriickffihren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen ebenso wie die Befunde yon DShler und Wegmann (1969), dab die beiden Carboxylierungsreaktionen im wesentlichen parallel verlaufen und um d~s zur Verffigung stehende COs konkurrieren. Wenn die Konkurrenzreaktion (z.B. Calvin-Cyelus) fehlt, dominiert die PEP-earboxylierung, was bei einer Temperatur yon §176 der Fall ist (vgl. Abb. 3). Die yon Bassham und Jensen (1967) gefundene sehnelle Malatbildung dfirfte sich nunmehr erkl~ren lassen. Unsere enzymatisehen Untersuehungen haben gezeigt, dab dieser Stamm yon Chlorella vulgaris - - im Vergleieh zu den Verhi~ltnissen bei der C4-Pflanze Mais - - eine ausreiehend hohe Aktivit~t der ffir die PEP-carboxylierung erforderliehen Enzyme (PEP-earboxylase, Malatdehydrogenase, ,,malie enzyme") besitzt. Genauere Angaben

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G. D6hler:

tiber die Lokalisa~ion dieser Carboxylierungsreaktion innerhalb der Chlorella-Zelle kSnnen jedoch aufgrund dieser Befunde noch nicht gemaeht werden; d.h. es kann nicht entschieden werden, ob diese Reaktion im Chloroplasten oder im Cytoplasma abl~uft. Die yon D6hler (1968, 1969) aufgrund eingehender Untersuchung der C02-Aufnahme aufgestellte ttypothese, dal~ zwei verschiedene Carboxyherungsreaktionen an der Ausbildung der Induktionseffekte beteiligt sind, wird also dutch die Befunde dieser Arbeit gestfitzt. Danach sol1 dem Calvin-Cyclus eine Carboxylierung yon PEP vorausgehen. Die PEPcarboxylierung ist in zahlreichen Untersuchungen des sog. Ca-Weges tier Photosynthese inzwischen intensiv erforscht worden (Hatch u. Slack, 1970; Hatch, 1971). W/~hrend Vejlby (1961) die Induktionseffekte mit der Annahme eines prim/~ren C02-Acceptors deutet, sind nach Mokronosov und Nekrasova (1966) die Induktionsphanomene die Resultante yon mehreren Prozessen und das Ergebnis der Regulation des Photosyntheseapparates. Neben Ribulose-l,5-diphosphat sollen PEP sowie Acceptoren der Proteinsynthese, auf die die Autoren nicht n/~her eingehen, als C02-Aeceptoren um das COs konkurieren. So untersuchten Mokronosov und Nekrasova an Kartoffel- und Gerstenpflanzen die Kinetik und Zusammensetzung der Photosyntheseprodukte in verschiedenen Phasen der Induktionsperiode nach untersehiedlicher Vorbehandlung. Nach einer l~ngeren Dunkelperiode (14 Std) wurde eine Hemmung der Kohlenhydratproduktion und eine Intensivierung der Proteinsynthese am Anfang der Belichtung beobachte~. Eine starke Regulation des Photosyn~hesestoffwechsels durch Kontrollfunktion der Schl/isselenzyme des Calvin-Cyclus und die yore Calvin-Cyclus abzweigenden Biosynthesewege sol1 nach Bassham (1971) die Induktionsphase der CO,-Aufnahme beeinflussen. Besondere Bedeutung kommt danach der l~uDP-carboxylase und der FDP-ase zu. Die starke Temperaturabhangigkeit der mit dem URAS gemessenen Bilanzkurven der photosynthetischen CO~-Aufnahme (vgl. Abb. 1) deutet auf eine Begrenzung der Photosyntheserate dutch die Aktivitat der Enzyme hin. Untersehiede in der Temperaturempfindlichkeit yon RuDPcarboxylase- und PEP-carboxylase-Aktivit/~t aus tropischen Gr/~sern sowie aus Gr/~sern der gemKl~igten Zone fanden Treharne und Cooper (1969). Danach war die Aktivit~t der RuDP-carboxlyase in den niedrigen Temperaturbereiehen stets hSher als die PEP-carboxylase. Da unter unseren Bedingungen der Hauptearboxylierungsweg der Calvin-Cyclus ist, kSnnte bei + 10~ die beobaehtete VerzSgerung in der Carboxylierung yon RuDP auf eine Verz6gerung in der Bereitstellung dieses C02-Acceptots zuriiekgehen ; Ursaehe hierffir diirfte eine VerzSgerung der Aktivit~t yon Enzymen des RuDP-Regenerationscyclus sein. Genauere Aussagen miissen die entspreehenden enzymatischen Untersuchungen ergeben.

Photosynthese-Induktion bei Chlorella

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Herrn K. Przybylla danke ich fiir seine :Vlitarbeit und Frl. H. Zehetmayr ffir die technische Assistenz. Mein besonderer Dank gilt der Deutschen Forschungsgemeinschaft, die dutch ihre Unterstfitzung mir die Durchfiihrung der Versuehe erst ermSglichte.

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