BIOCHIMIE, 1975, 57, 85-90.
Etude par 61ectro[bcalisation des gonadotrophines hypophysaires du rat. H. KERCRET et J. DUVAL. Laboratoire de Neurobiologie Mol~culaire, Facult~ des Sciences Biologiques, avenue du Gdndral Leclerc, 35031 Rennes Cedex. (16-9-197~).
Summary. - - lsoelectric focusing of rat gonadotropins has been studied using a small scale column and various pH gradients. Hormones were detected by radioimmunoassay. FSH focuses as a single peak, the pl being 2.8. It is thus slightly more acidic than the pI of FSH from other species. LH is more heterogeneous, the main activity focusing in the pH 9.0 area, whereas a second activity appears, for some samples, in the acidic part of the gradient. TSH exhibits a broad zone of activity between pH 7.0 and 10.0. The fraetionation of pituitary glyeoproteins using a pH 3-10 gradient followed by removal of sucrose and ampholytes through Sephad~ex G 50 chromatography allows the recovery with good yields of a purified rat FSH fraction devoid of LH activity as estimated by radioimmunoassay.
INTRODUCTION. L ' a n a l y s e de la biosynth6se in vitro et de la seer6tion des g o n a d o t r o p h i n e s sous l ' i n f l u e n c e de faeteurs h o r m o n a u x d i v e r s ( h y p o t h a l a m i q u e s ou g o n a d i q u e s ) se r6v6le dblicate ~tant donn~ que ces h o r m o n e s n ' i n c o r p o r e n t que faiblement un a c i d e amin6 p r 6 c u r s e u r , l'essentiel de la radioactivit6 6rant r e t r o u v 6 dons la GH et la LTIL De plus, la secr6tion basale des gonado~rophines dans le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n est faible en 1'absence de f a c t e u r h y p o t h a l a m i q u e tandis que GH et L T H sont secr6t6es en a b o n d a n c e . De ce fair, l ' a n a l y s e p a r 61ectrophor6se en gel de p o l y a c r y l a m i d e des substances marqu6es s ecr6t6es dans un m i l i e u d ' i n c u b a t i o n est inutilisable dons le cas des gonadotrophines. D ' a u t r e part, la purification des h o r m o n e s p h y s a i r e s n6cessite g6n6ralement diverses p i t a t i o n s et c h r o m a t o g r a p h i e s sur colonnes proc6d6s non utilisables p o u r de trbs petites tit6s de substances.
hypopr6ei[1, 2], quan-
Nous avons d o n c essay6 de m e t t r e au p o i n t une m 6 t h o d e utilisable h la fois sur le plan analytique et pr6paratif. L'61ectrofocalisation en milieu liquide, d6jh utilis6e p o u r la p r 6 p a r a t i o n de L t t et T S H h u m a i n e [3, 41, LH p o r c i n e [5] et TSH b o v i n e [ ~ p o u v a i t 6 v e n t u e l l e m e n t 6tre a p p l i q u 6 e Abr6viations : LH ---- hormone lut6inisante, TSH = hormone thyr6otrope, LTH = prolactine, FSH ---- hormone folliculo-stimulante, ~H ---- hormone de eroissanee, pI ---- pH iso61eetrique.
aux h o r m o n e s de rat fi c o n d i t i o n d ' a d a p t e r appareillage et m6thodologie. E t a n t donn6 la g r a n d e h6t6rog6n6it6 des h o r m o nes h y p o p h y s a i r e s , LH et TSH n o t a m m e n t , nous avons p r 6 a l a b l e m e n t analys6 les mobilit6s d ' h o r m o n e s s t a n d a r d s p a r t i e l l e m e n t ou h a u t e m e n t purifi6es, puts focalis6 des extraits d ' h y p o p h y s e s de rat ; nous a v o n s enfin 6tudi6 la possibilit6 d'obten i r avec un bon ren d e m e n t une f r a c t i o n F S H d6barrass6e des activit6s LH et TSH. M A T E R I E L E T METHODES.
Materiel. Les eoffrets p o u r dosages r a d i o i m m u n o l o g i q u e s de LH, F S H et TSH et les h o r m o n e s de r6f6renee LTH-RP-1 et GH-B-1 nous ont 6t~ gdn6reusement f o u r n i s p a r le National Institute of A r t h r i t i s and Metabolic Diseases (rat p i t u i t a r y h o r m o n e program). La FSH-205 de rat est un don du Dr. Von B e r s w o r d t - W a l l r a b e ( S c h e r i n g AG, Berlin) tandis que la LH-DNW-8-59 B nous a 6t6 f o u r n i e grac i e u s e m e n t p a r le Dr. W a r d ( U n i v e r s i t y of Texas). Le s6rum de m o u t o n anti-v-globulines de l a p i n est soit un p r o d u i t c o m m e r c i a l (NBC) soit un s6rum g6n6reusement f o u r n i p a r les Drs Blanc et Pellet i e r (INRA Tours). Les a m p h o l y t e s pH 3-10, pH 3-6 et p H 2,5-4 p r o v i e n n e n t de LKB. NaI (125I) utilis6 p o u r tes dosages p r o v i e n t du CEA. L ' a p p a reil d'61eetrofoealisation a 6t6 c o n s l r u i t au labor a t o i r e ; il est s e m b l a b l e ~ la plus petite c o l o n n e LKB mats avec un v o l u m e r6duit (capacit6 totale 24,5 ml) ce qui a p e r m i s de s u p p r i m e r le m a n c h o n de r e f r o i d i s s e m e n t interne. Les rats rubles W i s t a r p r o v i e n n e n t de l'61evage CERJ.
H. Kercret el J. Dural.
86
Extraits hgpophgs.aires. Les glycopro~6ines sont extraites selon Hartree [7]. Les h y p o p h y s e s sont trait6es p a r le m61ange acbtate d ' a m m o n i u m 10 p. cent pH 5,1 + 6thanol 95 p. cent (6.0:40 v/v). Apr6s la p r 6 c i p i t a t i o n l'6thanol, l ' 6 c h a n t i l l o n est dissous darts l'eau bidistill6e et dialys6 contre de l ' e a u ou contre u n e solution de glycine 1 p. cent p o u r les focalisalions ult6rieures.
Electrof ocalisation. Toutes les op6rations sont r6alis6es h 4°C. La c o l o n n e est r e m p l i e successivement avec la solution a n ~ d i q u e (5,5 ml de saccharose 85 p. cent c o n t e n a n t 0,1 p. cent d'acide p h o s p h o r i q u e ) , puis le gradient linSaire de saccharose (50 p. cent ~ 5 p. cent, ces solutions c o n t e n a n t 1 p. cent d ' a m p h o lyres) enfin la solution cathodique (1,5 ml de NaOH 1 p. cent ou 1,5 ml d ' a m p h o l y t e 0,5 p. cent darts le cas de la gamme pH 2,5-4). L ' 6 c h a n t i l l o n (2,5 ml darts du saccharose 36 p. cent) est i n t r o duit dans la solution dense lorsque le g r a d i e n t a atteint a p p r o x i m a t i v e m e n t cette valeur (une courbe de c o n c e n t r a t i o n de saccharose en f o n c t i o n du volume 6could a did pr~6tablie) ; 0,5 m l de saccharose 5 p. cent est ajout6 au sornmet du g r a d i e n t a v a n t a d d i t i o n de NaOH. Ces deux derni6res op6rations a n t p o u r but d'6viter que l ' 6 c h a n t i l l o n prot~ique se trouve en contact soit avec H3PO 4 soil avec NaOH. La t e n s i o n appliqu6e est 450 V e t l ' i n t e n s i t 6 du c o u r a n t d6croit de 2 mA 0,2 mA d u r a n t la foealisation (65 heures). Le c o n t e n u de la co lonne est reeu.eilli p a r fraction de 0,4 m l ; le p H e s t d6termin6 a pr6s addition de 0,4 ml d ' e a u dans chaque tube. Les actirites LH, FSH et TSH sont estim6es p a r dosage r a d i o i m m u n o l o g i q u e sur des fractions aliquotes (0,025 nil h 0,100 nil). Les h o r m o n e s LTH el GH de r6f6rences o n i 6t6 i n t r o d u i t e s en doses suffisautes (200 h 400 I~g) dans les colonnes p o u r 6tre d'6tectdes p a r a b s o r p t i o n UV h 280 rim.
Dosages radioimmunologiqnes. Les activit6s LH, FSH et TSH sont d.6termindes l'aide de la t e c h n i q u e r e c o m m a n d 6 e p a r le NIAMD. Le c o n t e n u en h o r m o n e s des 6chantillons est exprim6 en ng des h o r m o n e s de r6f6rence LH-RP-1, FSH-RP-1 et TSH-RP-1.
S@aration hormones-ampholytes. Bien que dialys6es d ' u n e m a n i 6 r e i n t e n s i v e eontre l'eau bidistillde (plus de 100 heures), les fractions recueillies c o n t i e n n e n t to,ujours des traces d'ampholytes, compos6s qui r6agissent fortement avec les r6actifs utilis~s p o u r le dosage des pro t~ines [8]. I1 est done i n d i s p e n s a b l e de r 6 u n i r les fractions int6ressantes et de les filtrer
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.
h 4°C sur u n e c o l o n n e de Sephadex G 50 (longueur 20 em, diambtre 1,5 cm). Les fractions sont pr6alab l e m e n t dialys6es bri6ve.ment contre d u t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M pH 7,4 de m a n i 6 r e h 61iminer une p a t t i e du saccharose et & r a m e n e r le pH neutralit6. Le profil d'61ution des h o r m o n e s et des ampholytes est repr6sent6 darts la figure 1.
P9 LH D.O. 280
1~9 FSH
"/ o
/
•
•
/
/
1,0
't
il i ",
I ,5
i
0,5
t
10
20
30 m l
Fie. 1. - - S~paration de LH et FSH des ampholytes par chromatographic sur gel de Sephadex G 5ff (fine). Les fractions FSH et LH rassembldes apr~s dleetrofoealisation d,'un extrait hypophysaire en pH, 3-1'0 ant 6td bri6vement dialys~es eontre du tampon phosphate 0,01 M pH 7,4. Ghaque hormone a 6t6 ehromatographi6e indivicbnellement et elle a dt~ d~termin~e en sortie de eolonne par dosage radioimmunologique tandis que les ampholytes 6taient d~teet6s par leur absorption h 2~(~ nm. L'ensemble des manipulations a dt~ r6alis6 h 5°C. t - - o Aeti~itd FSH ; © - - © Aetivit6 LH ; A - - A Ampholytes.
Preparation de [ractions FSH et LH puri[i~es. Une exp6rience pr61imin:aire a p e r m i s de d6term i n e r les fractions h r 6 u n i r p o u r la filtration ult6r i e u r e s u r gel. Dans une seconde exp6rience, l'extrait de 10 glandes a 6t6 focalis6 en g r a d i e n t de pH 3-10; les ampholytes (rot 6t6 $1imin6s e.t les fractions r e n f e r m a n t r e s p e c t i v e m e n t LH et FSH out 6t6 dialys6es contre de l'eau bidistill6e. RESULTATS.
Focalisation en gradient de pH 3-10. La FSH-205 p r6sente u n pie centr~ sur pH 3,3 et u n 6 p a u l e m e n t ~ pH 4,3 (fig. 2A). I1 n ' y a a u c u n e r6action darts les zones neutre et alcaline. La FSH h a u t e m e n t purifi6e (FSH-I-1) pr6sente u n seul pic, d.e m a x i m u m au pH 3,6 (fig. 2B). L'activit6 FSH d ' u n extrait h y p o p h y s a i r e (qui r e n f e r m e done s i m u l t a n 6 m e n t FSH, LH et TSH) ressemble
EIectrofocalisation des gonadotrophines de rat. h celle du s t a n d a r d FSH-205 : m a x i m u m & pH 3,3 et 6paulement (fig. 2C). La LH-RP-1 a p p a r a i t p o l y d i s p e r s e ; le p i c p r i n cipal est centr6 sur pH 9;0, mais il a p p a r a i t une c e r t a i n e activit6 en zone acide (fig. 2,A). La LH ng RP-I
87
L'activit6 TSH a 6t6 d6tect6e dans une zone trbs large (pH 7 h 10), qu'il s'agisse de TSH hautem e n t purifi6e (TSH-I-1, fig. 2B) ou d'un ex t r ai t hypophysaire. Nous avons i n d i q u 6 dans la figure 2A la position du m a x i m u m des pics c o r r e s p o n d a n t h LTH (pH 4,3) et GH (pH 4,8).
pH F S H 205
+
LH R P - 1
/ ' ~
A
5001 2 400-
/
42 49 .8
300-C 200-
Focalisation en gradient de pH 3-6. La figure 3 m o n t r e que la FSH-205 et l'activit6 F S H d'un ex t r ai t h y p o p h y s a i r e ont l e u r m a x i m u m pH 3,25, tandis que L T H et GH se localisent r e s p e c t i v e m e n t h pH 4,4 et 4,8.
.4 100-2
lb ng
2'o
3b
4b
ng F S H
sb
pH
JJg TSH R P _ I
LH R P _ I
ng
FSH R P _ I
pH
30O" FSH I - 1
+ LH I - 2
+ TSH I - 1
r.,~
//
42
°/
2oo 1o0o
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.10 "8
~oo-.5oo
300
.
go:,,(o/ o
\
SO
10
20
30
40
50
fractions
ng RP_I EXTRAIT
ooo
/
pH tl 2
/\, •
....
"-%
-
i.o ~ ° ~ . . . . . . . . . . . . . . .
lb
6
L ~ . . , - , . o..: "_~_ . . . . . . . . . . . . . . .
2b
ab
4o
.",_ 1
a'o
FRACTIONS
FIG. 2. Electrofoealisation en pH 3-10 d'hormones partiellement purifi~es (A), hautement purifi~es (B) et d'extraits hypophysaires (C). Anode (partie inf~rieurc de la colonne) h gauche. e--o Activit6 FSH ; O - - O Activit6 LH ; Activit6 T S H ; 1 et 2 dans la figure 2A repr6sentent les positions de LTH et GH respectivement. La fl~che dans la figure 2C signifie que la concentration de chaque hormone dans les tubes correspondants est trop dlev~e pour 6tre exprim~e avec pr6eision. -
-
h a u t e m e n t ptrrifi6e (LH-I-2) pr6sente 2 zones i m m u n o - r 6 a c t i v e s d ' i m p o r t a n c e s e n s i b l e m e n t 6gale (fig. 2 B ) ; p a r contre, un e x t r a i t h y p o p h y s a i r e f r a i c h e m e n t p r 6 p a r 6 ne pr6sente d'activit6 que vers pH 9,0 (fig. 2C).
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Fro. 3. - - Eleetrofocalisation en pH 3-6 de FSH, LTH et GH. o - - o FSH d'un extrait hypophysaire : O - - © FSH205 ; LTH-RP-1 ; GH-B-1. Les activit~s FSH ont 6t6 d6termin6es par radioimmunologie tandis que LTH et GH 6taient d6tect~es par absorption h 289 nm, apr6s soustraction de l'absorption due aux ampholytes.
Focalisation en gradient de pH 2,5-4. Cette 6tude r6v~le que le m a x i m u m de l'activit6 F S H d ' u n ex t r ai t h y p o p h y s a i r e f r a i c h e m e n t pr6par6 focalise en t r e pH 2,7 et 2,9 (fig. 4), et non plus & 3,3 c o m m e dans les e x p 6 r i e n c e s pr6c6denies.
Preparation de fractions purifi~es. Et an t donn6 que la focalisation d'un ex t r ai t hypop h y s a i r e f r a i c h e m e n t pr6par6 ne r6v6le q u ' u n e c o n t a m i n a t i o n crois6e tr6s faible entre FSH et LH, nous avons e n t r e p r i s la p u r i f i c a t i o n de ces 2 h o r m o n e s h p a r t i r de 10 glandes. Les r6sultats sont indiqu6s dans le tableau I. Le r e n d e m e n i en F S H est bon (41 p. cent) p u i s q u e seules les fractions c o r r e s p o n d a n t ~ la zone c e n t r a l e du p i c F S H ont 0 6 r6unies p o u r la filtration sur Sepha-
H. Kercret et J. Duval.
88
pH
ng FSH I
1'
"10
I
8
oo
400
300
./
o
200
6 4
o.i
100 •
o~),(~ 10
,
•
.
%" ,*olO
20
2
o • °l,o_ i
30
, "
40
50
Fractions FIG. 4. Electrofoealisation en pH 2,5-4 d'un extrait d'hypophyse ; activitds FSH ddtermindes par dosage radioimmunologiques ; la concentration dans les fractions correspondant au maximum du pic dtait trop dlevde pour gtre ddterminde avec une grande precision. -
F S H prdsente un pI a p p a r e n t de 3,25 ; cette v a l e u r est r e l a t i v e m e n t p r o c h e de celle de la F S H h u m a i n e mats plus a c i d e que celle des F S H bovine, p o r c i n e ou 6quine (voir R e i c h e r t [9] p o u r une r e v u e d6taillde). En u t i l i s a n t une g a m m e plus 6tal6e de p H (2,5-4,0), nous o b s e r v o n s tin d6plac e m e n t du p i c de F S H avec un m a x i m u m h pH 2,8. Nous avons 0 6 c o n d u i t s h utiliser eette g a m m e c a r nous o b s e r v i o n s en pH 3-6 que les premibres fractions immunor6actives coineidaient avee la zone f r o n t i 6 r e e n t r e a c i d e p h o s p h o r i q u e p u r et a m p h o l y t e s ; de fair, en g r a d i e n t 2,5-4,0, le p i e F S H se stabilise vers le m i l i e u de la e o l o n n e et la v a l e u r ddtermin6e est pro.b.ablement plus pr6eise. Nous serions done tentds de c o n c l u r e que la F S H de rat est un p e u plus acide que eelle des autres esp6ees a n i m a l e s 6tudi6es, mats il serait p r o b a b l e m e n t ndeessaire de f o e a l i s e r ees autres F S H dans Ires mSmes c o n d i t i o n s que celle du rat afin d ' o b t e n i r une c o m p a r a i s o n plus exaete.
-
dex G 50. Le taux de p u r i f i c a t i o n h p a r t i r de la glande est de 87 et il est de 6 p a r r a p p o r t h l'extrait. La c o n t a m i n a t i o n p a r la LH est ndgligeable ( < 1 p. cent estim6e p a r dosage r a d i o i m m u n o l o g i q u e ) . Les r6sultats c o n c e r n a n t la LH sont m o i n s b o n s ; il y a une p e r t e c o n s i d 6 r a b l e d ' a c t i v i t d apr6s la c h r o m a t o g r a p h i c et le taux de p u r i f i c a t i o n est faible.
DISCUSSION. L'6tude des g o n a d o t r o p h i n e s de rat p a r dlect r o f o c a l i s a t i o n r6v61e quelques points int6ressants. Dans les g r a d i e n t s de pH 3-10 et 3-6, la
Dans la p l u p a r t des expdriences, le p i c de F S H est assez l a r g e ; ceci p eut&tre expliqu6 p a r une pc)pulation h6t6ro.g6ne de mol6cules de F S H part i e l l e m e n t d6sialyldes, bien que to ujours i m m u n o rdactives. De fait, les O u d e s r~alis6es p a r S h e r i n s et coll. [10] sur la F S H h u m a i n e ont mis en 6vid e n c e que la d6sialylation p r o g r e s s i v e de la moldcule i n d u i t une m i g r a t i o n de l ' b o r m o n e vers des p H plus basiques (de pH 4,0 h pH 6,0). Si la F S H de rat r e n f e r m e e n c o r e plus d ' a e i d e s i a l i q u e que la F S H humain,e, on peut doric s ' a t t e n d r e h observ e r u n e h6tdrog6n~itd assez marqude. L ' a c t i v i t 6 F S H de rat, apr6s focalisation, n ' a p p a r a i t co n t a m i n 6 e ni p a r la LH, ni p a r la TSH. Elle est, de plus, p a r f a i t e m e n t sdparde de L T H et GH, ce qui p e r m e t d ' e n v i s a g e r l'dtude du m a r q u a g e de cette g o n a d o t r o p h i n e au cours d'inc u b a t i o n s d ' h y p o p h y s e s . Nous avons pu, apr6s
TABLEAU I.
Purification de FSH et de L H ~ partir de 10 o d ~ n o h y p o p h y s e s de rat (~4 m g de tissu frais). iI
FSH Etape Unit6s(')
LH
I
Protdines Activit6 Rendementl Uuilds ~g spdcifique
Protdines ~g -
Q u a n t i t d i n i t i a l e dans 10 glandes (") . . . . . . . . . . . . . . . . . Extrait selon Hartree . . . . . . . . . . . t~lectrofocalisation -~- chromatographic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I
284 204 117
3828
0,074
100
,
-
-,-
970
3828
0,26
100
2,50
47
5,01
184
1,11
72
460
184
18
6,43
41
63
13
(*) Unitds exprimdes en I~g de FSH-B.P-1 et LH-RP-I. (**) Calculde & partir de 2 hypophyses provenant du m~me groupe d'animaux.
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-
Activit6 spdcilique Rendement
6,5
E l e c t r o ~ o c a l i s a t i o n des g o n a d o t r o p h i n e s de rat. 61imination des a m p h o l y t e s p a r c h r o m a t o g r a p h i e , o b t e n i r une f r a c t i o n FSH e n r i c h i e sans activit6 LH ; cette o b s er v a ti o n c o n tr a s le avec celle de R e i c h e r t [9] qui, t r a v a i l l a n t h p a r t i r de glandes hum ai n es , a toujours trouv6 une activit6 LH associ6e h la f r a c t i o n F S H ; notons c e p e n d a n t que cet auteur ad m et ta it entre aulres la possibilit6 que le test b i o l o g i q u e utilis6 p o u r doser LH ne soil pas a b s o l u m e n t sp6cifique ; nous ajouterons de plus que le c o u p l e F S H + LH de rat se cornpor t e peut-6tre d i f f 6 r e m m e n t d.e ee m6me couple i f ' h o r m o n e s h u m a i n e s en 61ectrofocalisalion. L ' h o r m o n e F S H ainsi purifi6e d e v r a 6tre ult6rieur e m e n t test6e p o u r v6rifier si activit6 b i o l o g i q u e et dosage r a d i o i m m u n o l o g i q u e sont en a c c o r d . Les r6sultats obtenus avee la LH sont p a r f o i s eurieux. La position du pie p r i n c i p a l vers p H 9,0 est tout h fail en a c c o r d avec les r6sultats relatifs h la LH d'esp6ees diverses [9, 11]. Nous observons une c e r t a i n e h6t6rog6n6it6 qui t r a d u i t prob a b l e m e n t l ' e x i s t e n c e de p l u s i e u r s espbces mol6culaires. Le p i c d ' a c t i v i t 6 en zone acide est partic u l i b r e m e n t t ro u b la n t et les d i v e r s auteurs qui l'ont d6jfi signal6 p o u r les autres espbces a n i m a l e s n ' o n t pu en d o n n e r d ' e x p l i c a t i o n pr6cise. Nous devons r e m a r q n e r q u ' i l est le plus i m p o r t a n t dans la LH h a u t e m e n t purifi6e (LH-I-2), qu'il est faible dans la LH de r6f6rence (LH-RP-1) et qu'il est p r a t i q u e m e n t n6gligeable dans un extrait glycopr o t6ique f r a l e h e m e n t pr6par6. Dans une sbrie d ' e x p 6 r i e n c e s pr61iminaires, nous avons constal6 q u ' u n e autre p r 6 p a r a t i o n de LH h a u t e m e n t purifi6e (LH-DNW-8) pr~sente b.galement ce p i c en zone acide, sans que nous ayons pu toutefois en e sti m er la p r o p o r t i o n p a r r a p p o r t h l'aclivit6 totale (gradients r6alis6s essen.tiellement en pH 3-5). On peut d onc se d e m a n d e r si ee pic c o r r e s p o n d ~ une mol6cule existant r 6 e l l e m e n t dans l'ad6n.ohypophyse ou s'il s'agit de modifications qui a p p a r a i s s e n t au cours des divers stades de p u r i f i c a t i o n et lors du stockage. Nous n ' a v o n s pas r6ussi ~ o b t e n i r de fraction LH avec un bon r e n d e m e n t ; l'activit6 disp a r a i t apr6s filtration sur gel de Sephadex. Nous pe n s o n s que les c o n d i t i o n s de focalisation au voisinage de la cat h o d e sont inad6quates et que certaines mol6cul,es, q u o i q u e toujours i m m u n o r 6 a c tives, soient tr~s p a r t i e l l e m e n t d6grad6es et ne sortent plus de la c o l o n n e de S e p h a d e x an m6me n i v e a u que les mol6cules intactes. Enfin, la large zone observ6e p o u r l'activit6 TSH t r a d u i t la tr6s grande h6t6rog6n6it6 de cette h o r m o n e de rat, h6t6rog6n6it6 d6jh constat6e avec les TSH b o v i n e [6] et p o r c i n e [12]. Nous avons c o m m e n c 6 ~ a p p l i q u e r les r6sultats obtenus au cours de ce t r a v a i l h deux p r o c e s s u s :
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-- d'une part de FSH de rat c o l o n n e LKB de seul passage, de
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h la p r 6 p a r a t i o n & g r a n d e 6chelle tr6s e n r i c h i e ; l 'u t i l i sat i o n d ' u n e 440 ml de capacit6 p er m et , en un p r 6 p a r e r p l u si eu r s mg de FSH.
- - d ' a u t r e p a r t h l 'an al y se de la biosynthbse et de la secr6tion de la F S H : nous avons en effet constat6 que la F S H peut 6tre m ar q u 6 e in vitro h l ' a i d e de (SH)-fucose, et analys6e p a r focalisal i o n ; les deux pics d'activit6 F S H et de radioaetivit6 c o i n c i d e n t p a r f a i t e m e n t . Les m i l i e u x d'inc u b a t i o n p e u v e n t 6ga!ement ~tre analys6s, c e p e n dant, l ' h o r m o n e secr6t6e dans le milieu foealise dans une zone de p H c o m p r i s e en t r e 3 et 4. Notre m6thode d e v r a i t nous p e r m e t t r e de d 6 t e r m i n e r s'il s'agit s e u l e m e n t d'un art6fact de m i g r a t i o n dfi h la pr6sence simultan6e de n o m b r e u s e s h o r m o n e s dans le milieu, ou si la F S H est p a r t i e l l e m e n t modifi6e lors du p r o cessu s de secr6tion.
Remerciements. Ce travail a b~n6fici~ de l'aide du CNRS (E.R.A. 119). Nous remereions le Dr Jutisz pour l'initiation aux dosages radioimmunologiques et le Professeur Jacquemin pour l'initiation h ]'61ectrofocalisation. Nous sornrnes rcconnaissants au Dr Parlow et au NIA,MD, aux Dr Von Berswordt-Wallrabe, Dr Ward, Dr Blanc et Dr Pelletier pour leurs dons gdn6reux d'hormones et de sdrum. R~suM~. Nous avons adapt~ la m~thode d'61ectrofocalisation h l'6tude des hormones de l'ad~nohypophyse du rat. Les gonadetrophines et la TSH ont ~t6 d~tect~es h l'aide des dosages radioimmunologiques. En utilisant une colonne de faible eapacit6 et divers gradients de pH (3-10, 3-6 et 2,,5-4) nous eonstatons que la FSH pr6sente un pH iso61ectrique de 2,8, e'est-&-dire sensiblement plus acide que eelui de la FSH d'autres esp~ces animales. La LH est plus h~t6rog6ne, l'activit~ principale focalisant clans la zone de pH 9,0 ; un second pie apparait, pour certains 6chantillons, dans ]a partie aeide du gradient. La TSH pr~sente une zone d'aetivit~ tr6s large s'~tendant de pH 7,0 h 10,0. Le fraetionnement d'extraits hypophysaires /i l'aide du gradient de pH 3-10 suivi d'une filtration sur gel de Sephadex G 50 pour ~lirniner ampholytes et saccharose permet d'obtenir, avee un bon rendement, une fraction FSH purifl6e d6barrass6e d'activit~ LH.
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1975, 57, n ° 1.
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Etude par 61ectro[bcalisation des gonadotrophines hypophysaires du rat. H. KERCRET et J. DUVAL. Laboratoire de Neurobiologie Mol~culaire, Facult~ des Sciences Biologiques, avenue du Gdndral Leclerc, 35031 Rennes Cedex. (16-9-197~).
Summary. - - lsoelectric focusing of rat gonadotropins has been studied using a small scale column and various pH gradients. Hormones were detected by radioimmunoassay. FSH focuses as a single peak, the pl being 2.8. It is thus slightly more acidic than the pI of FSH from other species. LH is more heterogeneous, the main activity focusing in the pH 9.0 area, whereas a second activity appears, for some samples, in the acidic part of the gradient. TSH exhibits a broad zone of activity between pH 7.0 and 10.0. The fraetionation of pituitary glyeoproteins using a pH 3-10 gradient followed by removal of sucrose and ampholytes through Sephad~ex G 50 chromatography allows the recovery with good yields of a purified rat FSH fraction devoid of LH activity as estimated by radioimmunoassay.
INTRODUCTION. L ' a n a l y s e de la biosynth6se in vitro et de la seer6tion des g o n a d o t r o p h i n e s sous l ' i n f l u e n c e de faeteurs h o r m o n a u x d i v e r s ( h y p o t h a l a m i q u e s ou g o n a d i q u e s ) se r6v6le dblicate ~tant donn~ que ces h o r m o n e s n ' i n c o r p o r e n t que faiblement un a c i d e amin6 p r 6 c u r s e u r , l'essentiel de la radioactivit6 6rant r e t r o u v 6 dons la GH et la LTIL De plus, la secr6tion basale des gonado~rophines dans le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n est faible en 1'absence de f a c t e u r h y p o t h a l a m i q u e tandis que GH et L T H sont secr6t6es en a b o n d a n c e . De ce fair, l ' a n a l y s e p a r 61ectrophor6se en gel de p o l y a c r y l a m i d e des substances marqu6es s ecr6t6es dans un m i l i e u d ' i n c u b a t i o n est inutilisable dons le cas des gonadotrophines. D ' a u t r e part, la purification des h o r m o n e s p h y s a i r e s n6cessite g6n6ralement diverses p i t a t i o n s et c h r o m a t o g r a p h i e s sur colonnes proc6d6s non utilisables p o u r de trbs petites tit6s de substances.
hypopr6ei[1, 2], quan-
Nous avons d o n c essay6 de m e t t r e au p o i n t une m 6 t h o d e utilisable h la fois sur le plan analytique et pr6paratif. L'61ectrofocalisation en milieu liquide, d6jh utilis6e p o u r la p r 6 p a r a t i o n de L t t et T S H h u m a i n e [3, 41, LH p o r c i n e [5] et TSH b o v i n e [ ~ p o u v a i t 6 v e n t u e l l e m e n t 6tre a p p l i q u 6 e Abr6viations : LH ---- hormone lut6inisante, TSH = hormone thyr6otrope, LTH = prolactine, FSH ---- hormone folliculo-stimulante, ~H ---- hormone de eroissanee, pI ---- pH iso61eetrique.
aux h o r m o n e s de rat fi c o n d i t i o n d ' a d a p t e r appareillage et m6thodologie. E t a n t donn6 la g r a n d e h6t6rog6n6it6 des h o r m o nes h y p o p h y s a i r e s , LH et TSH n o t a m m e n t , nous avons p r 6 a l a b l e m e n t analys6 les mobilit6s d ' h o r m o n e s s t a n d a r d s p a r t i e l l e m e n t ou h a u t e m e n t purifi6es, puts focalis6 des extraits d ' h y p o p h y s e s de rat ; nous a v o n s enfin 6tudi6 la possibilit6 d'obten i r avec un bon ren d e m e n t une f r a c t i o n F S H d6barrass6e des activit6s LH et TSH. M A T E R I E L E T METHODES.
Materiel. Les eoffrets p o u r dosages r a d i o i m m u n o l o g i q u e s de LH, F S H et TSH et les h o r m o n e s de r6f6renee LTH-RP-1 et GH-B-1 nous ont 6t~ gdn6reusement f o u r n i s p a r le National Institute of A r t h r i t i s and Metabolic Diseases (rat p i t u i t a r y h o r m o n e program). La FSH-205 de rat est un don du Dr. Von B e r s w o r d t - W a l l r a b e ( S c h e r i n g AG, Berlin) tandis que la LH-DNW-8-59 B nous a 6t6 f o u r n i e grac i e u s e m e n t p a r le Dr. W a r d ( U n i v e r s i t y of Texas). Le s6rum de m o u t o n anti-v-globulines de l a p i n est soit un p r o d u i t c o m m e r c i a l (NBC) soit un s6rum g6n6reusement f o u r n i p a r les Drs Blanc et Pellet i e r (INRA Tours). Les a m p h o l y t e s pH 3-10, pH 3-6 et p H 2,5-4 p r o v i e n n e n t de LKB. NaI (125I) utilis6 p o u r tes dosages p r o v i e n t du CEA. L ' a p p a reil d'61eetrofoealisation a 6t6 c o n s l r u i t au labor a t o i r e ; il est s e m b l a b l e ~ la plus petite c o l o n n e LKB mats avec un v o l u m e r6duit (capacit6 totale 24,5 ml) ce qui a p e r m i s de s u p p r i m e r le m a n c h o n de r e f r o i d i s s e m e n t interne. Les rats rubles W i s t a r p r o v i e n n e n t de l'61evage CERJ.
H. Kercret el J. Dural.
86
Extraits hgpophgs.aires. Les glycopro~6ines sont extraites selon Hartree [7]. Les h y p o p h y s e s sont trait6es p a r le m61ange acbtate d ' a m m o n i u m 10 p. cent pH 5,1 + 6thanol 95 p. cent (6.0:40 v/v). Apr6s la p r 6 c i p i t a t i o n l'6thanol, l ' 6 c h a n t i l l o n est dissous darts l'eau bidistill6e et dialys6 contre de l ' e a u ou contre u n e solution de glycine 1 p. cent p o u r les focalisalions ult6rieures.
Electrof ocalisation. Toutes les op6rations sont r6alis6es h 4°C. La c o l o n n e est r e m p l i e successivement avec la solution a n ~ d i q u e (5,5 ml de saccharose 85 p. cent c o n t e n a n t 0,1 p. cent d'acide p h o s p h o r i q u e ) , puis le gradient linSaire de saccharose (50 p. cent ~ 5 p. cent, ces solutions c o n t e n a n t 1 p. cent d ' a m p h o lyres) enfin la solution cathodique (1,5 ml de NaOH 1 p. cent ou 1,5 ml d ' a m p h o l y t e 0,5 p. cent darts le cas de la gamme pH 2,5-4). L ' 6 c h a n t i l l o n (2,5 ml darts du saccharose 36 p. cent) est i n t r o duit dans la solution dense lorsque le g r a d i e n t a atteint a p p r o x i m a t i v e m e n t cette valeur (une courbe de c o n c e n t r a t i o n de saccharose en f o n c t i o n du volume 6could a did pr~6tablie) ; 0,5 m l de saccharose 5 p. cent est ajout6 au sornmet du g r a d i e n t a v a n t a d d i t i o n de NaOH. Ces deux derni6res op6rations a n t p o u r but d'6viter que l ' 6 c h a n t i l l o n prot~ique se trouve en contact soit avec H3PO 4 soil avec NaOH. La t e n s i o n appliqu6e est 450 V e t l ' i n t e n s i t 6 du c o u r a n t d6croit de 2 mA 0,2 mA d u r a n t la foealisation (65 heures). Le c o n t e n u de la co lonne est reeu.eilli p a r fraction de 0,4 m l ; le p H e s t d6termin6 a pr6s addition de 0,4 ml d ' e a u dans chaque tube. Les actirites LH, FSH et TSH sont estim6es p a r dosage r a d i o i m m u n o l o g i q u e sur des fractions aliquotes (0,025 nil h 0,100 nil). Les h o r m o n e s LTH el GH de r6f6rences o n i 6t6 i n t r o d u i t e s en doses suffisautes (200 h 400 I~g) dans les colonnes p o u r 6tre d'6tectdes p a r a b s o r p t i o n UV h 280 rim.
Dosages radioimmunologiqnes. Les activit6s LH, FSH et TSH sont d.6termindes l'aide de la t e c h n i q u e r e c o m m a n d 6 e p a r le NIAMD. Le c o n t e n u en h o r m o n e s des 6chantillons est exprim6 en ng des h o r m o n e s de r6f6rence LH-RP-1, FSH-RP-1 et TSH-RP-1.
S@aration hormones-ampholytes. Bien que dialys6es d ' u n e m a n i 6 r e i n t e n s i v e eontre l'eau bidistillde (plus de 100 heures), les fractions recueillies c o n t i e n n e n t to,ujours des traces d'ampholytes, compos6s qui r6agissent fortement avec les r6actifs utilis~s p o u r le dosage des pro t~ines [8]. I1 est done i n d i s p e n s a b l e de r 6 u n i r les fractions int6ressantes et de les filtrer
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h 4°C sur u n e c o l o n n e de Sephadex G 50 (longueur 20 em, diambtre 1,5 cm). Les fractions sont pr6alab l e m e n t dialys6es bri6ve.ment contre d u t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M pH 7,4 de m a n i 6 r e h 61iminer une p a t t i e du saccharose et & r a m e n e r le pH neutralit6. Le profil d'61ution des h o r m o n e s et des ampholytes est repr6sent6 darts la figure 1.
P9 LH D.O. 280
1~9 FSH
"/ o
/
•
•
/
/
1,0
't
il i ",
I ,5
i
0,5
t
10
20
30 m l
Fie. 1. - - S~paration de LH et FSH des ampholytes par chromatographic sur gel de Sephadex G 5ff (fine). Les fractions FSH et LH rassembldes apr~s dleetrofoealisation d,'un extrait hypophysaire en pH, 3-1'0 ant 6td bri6vement dialys~es eontre du tampon phosphate 0,01 M pH 7,4. Ghaque hormone a 6t6 ehromatographi6e indivicbnellement et elle a dt~ d~termin~e en sortie de eolonne par dosage radioimmunologique tandis que les ampholytes 6taient d~teet6s par leur absorption h 2~(~ nm. L'ensemble des manipulations a dt~ r6alis6 h 5°C. t - - o Aeti~itd FSH ; © - - © Aetivit6 LH ; A - - A Ampholytes.
Preparation de [ractions FSH et LH puri[i~es. Une exp6rience pr61imin:aire a p e r m i s de d6term i n e r les fractions h r 6 u n i r p o u r la filtration ult6r i e u r e s u r gel. Dans une seconde exp6rience, l'extrait de 10 glandes a 6t6 focalis6 en g r a d i e n t de pH 3-10; les ampholytes (rot 6t6 $1imin6s e.t les fractions r e n f e r m a n t r e s p e c t i v e m e n t LH et FSH out 6t6 dialys6es contre de l'eau bidistill6e. RESULTATS.
Focalisation en gradient de pH 3-10. La FSH-205 p r6sente u n pie centr~ sur pH 3,3 et u n 6 p a u l e m e n t ~ pH 4,3 (fig. 2A). I1 n ' y a a u c u n e r6action darts les zones neutre et alcaline. La FSH h a u t e m e n t purifi6e (FSH-I-1) pr6sente u n seul pic, d.e m a x i m u m au pH 3,6 (fig. 2B). L'activit6 FSH d ' u n extrait h y p o p h y s a i r e (qui r e n f e r m e done s i m u l t a n 6 m e n t FSH, LH et TSH) ressemble
EIectrofocalisation des gonadotrophines de rat. h celle du s t a n d a r d FSH-205 : m a x i m u m & pH 3,3 et 6paulement (fig. 2C). La LH-RP-1 a p p a r a i t p o l y d i s p e r s e ; le p i c p r i n cipal est centr6 sur pH 9;0, mais il a p p a r a i t une c e r t a i n e activit6 en zone acide (fig. 2,A). La LH ng RP-I
87
L'activit6 TSH a 6t6 d6tect6e dans une zone trbs large (pH 7 h 10), qu'il s'agisse de TSH hautem e n t purifi6e (TSH-I-1, fig. 2B) ou d'un ex t r ai t hypophysaire. Nous avons i n d i q u 6 dans la figure 2A la position du m a x i m u m des pics c o r r e s p o n d a n t h LTH (pH 4,3) et GH (pH 4,8).
pH F S H 205
+
LH R P - 1
/ ' ~
A
5001 2 400-
/
42 49 .8
300-C 200-
Focalisation en gradient de pH 3-6. La figure 3 m o n t r e que la FSH-205 et l'activit6 F S H d'un ex t r ai t h y p o p h y s a i r e ont l e u r m a x i m u m pH 3,25, tandis que L T H et GH se localisent r e s p e c t i v e m e n t h pH 4,4 et 4,8.
.4 100-2
lb ng
2'o
3b
4b
ng F S H
sb
pH
JJg TSH R P _ I
LH R P _ I
ng
FSH R P _ I
pH
30O" FSH I - 1
+ LH I - 2
+ TSH I - 1
r.,~
//
42
°/
2oo 1o0o
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.10 "8
~oo-.5oo
300
.
go:,,(o/ o
\
SO
10
20
30
40
50
fractions
ng RP_I EXTRAIT
ooo
/
pH tl 2
/\, •
....
"-%
-
i.o ~ ° ~ . . . . . . . . . . . . . . .
lb
6
L ~ . . , - , . o..: "_~_ . . . . . . . . . . . . . . .
2b
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4o
.",_ 1
a'o
FRACTIONS
FIG. 2. Electrofoealisation en pH 3-10 d'hormones partiellement purifi~es (A), hautement purifi~es (B) et d'extraits hypophysaires (C). Anode (partie inf~rieurc de la colonne) h gauche. e--o Activit6 FSH ; O - - O Activit6 LH ; Activit6 T S H ; 1 et 2 dans la figure 2A repr6sentent les positions de LTH et GH respectivement. La fl~che dans la figure 2C signifie que la concentration de chaque hormone dans les tubes correspondants est trop dlev~e pour 6tre exprim~e avec pr6eision. -
-
h a u t e m e n t ptrrifi6e (LH-I-2) pr6sente 2 zones i m m u n o - r 6 a c t i v e s d ' i m p o r t a n c e s e n s i b l e m e n t 6gale (fig. 2 B ) ; p a r contre, un e x t r a i t h y p o p h y s a i r e f r a i c h e m e n t p r 6 p a r 6 ne pr6sente d'activit6 que vers pH 9,0 (fig. 2C).
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.
Fro. 3. - - Eleetrofocalisation en pH 3-6 de FSH, LTH et GH. o - - o FSH d'un extrait hypophysaire : O - - © FSH205 ; LTH-RP-1 ; GH-B-1. Les activit~s FSH ont 6t6 d6termin6es par radioimmunologie tandis que LTH et GH 6taient d6tect~es par absorption h 289 nm, apr6s soustraction de l'absorption due aux ampholytes.
Focalisation en gradient de pH 2,5-4. Cette 6tude r6v~le que le m a x i m u m de l'activit6 F S H d ' u n ex t r ai t h y p o p h y s a i r e f r a i c h e m e n t pr6par6 focalise en t r e pH 2,7 et 2,9 (fig. 4), et non plus & 3,3 c o m m e dans les e x p 6 r i e n c e s pr6c6denies.
Preparation de fractions purifi~es. Et an t donn6 que la focalisation d'un ex t r ai t hypop h y s a i r e f r a i c h e m e n t pr6par6 ne r6v6le q u ' u n e c o n t a m i n a t i o n crois6e tr6s faible entre FSH et LH, nous avons e n t r e p r i s la p u r i f i c a t i o n de ces 2 h o r m o n e s h p a r t i r de 10 glandes. Les r6sultats sont indiqu6s dans le tableau I. Le r e n d e m e n i en F S H est bon (41 p. cent) p u i s q u e seules les fractions c o r r e s p o n d a n t ~ la zone c e n t r a l e du p i c F S H ont 0 6 r6unies p o u r la filtration sur Sepha-
H. Kercret et J. Duval.
88
pH
ng FSH I
1'
"10
I
8
oo
400
300
./
o
200
6 4
o.i
100 •
o~),(~ 10
,
•
.
%" ,*olO
20
2
o • °l,o_ i
30
, "
40
50
Fractions FIG. 4. Electrofoealisation en pH 2,5-4 d'un extrait d'hypophyse ; activitds FSH ddtermindes par dosage radioimmunologiques ; la concentration dans les fractions correspondant au maximum du pic dtait trop dlevde pour gtre ddterminde avec une grande precision. -
F S H prdsente un pI a p p a r e n t de 3,25 ; cette v a l e u r est r e l a t i v e m e n t p r o c h e de celle de la F S H h u m a i n e mats plus a c i d e que celle des F S H bovine, p o r c i n e ou 6quine (voir R e i c h e r t [9] p o u r une r e v u e d6taillde). En u t i l i s a n t une g a m m e plus 6tal6e de p H (2,5-4,0), nous o b s e r v o n s tin d6plac e m e n t du p i c de F S H avec un m a x i m u m h pH 2,8. Nous avons 0 6 c o n d u i t s h utiliser eette g a m m e c a r nous o b s e r v i o n s en pH 3-6 que les premibres fractions immunor6actives coineidaient avee la zone f r o n t i 6 r e e n t r e a c i d e p h o s p h o r i q u e p u r et a m p h o l y t e s ; de fair, en g r a d i e n t 2,5-4,0, le p i e F S H se stabilise vers le m i l i e u de la e o l o n n e et la v a l e u r ddtermin6e est pro.b.ablement plus pr6eise. Nous serions done tentds de c o n c l u r e que la F S H de rat est un p e u plus acide que eelle des autres esp6ees a n i m a l e s 6tudi6es, mats il serait p r o b a b l e m e n t ndeessaire de f o e a l i s e r ees autres F S H dans Ires mSmes c o n d i t i o n s que celle du rat afin d ' o b t e n i r une c o m p a r a i s o n plus exaete.
-
dex G 50. Le taux de p u r i f i c a t i o n h p a r t i r de la glande est de 87 et il est de 6 p a r r a p p o r t h l'extrait. La c o n t a m i n a t i o n p a r la LH est ndgligeable ( < 1 p. cent estim6e p a r dosage r a d i o i m m u n o l o g i q u e ) . Les r6sultats c o n c e r n a n t la LH sont m o i n s b o n s ; il y a une p e r t e c o n s i d 6 r a b l e d ' a c t i v i t d apr6s la c h r o m a t o g r a p h i c et le taux de p u r i f i c a t i o n est faible.
DISCUSSION. L'6tude des g o n a d o t r o p h i n e s de rat p a r dlect r o f o c a l i s a t i o n r6v61e quelques points int6ressants. Dans les g r a d i e n t s de pH 3-10 et 3-6, la
Dans la p l u p a r t des expdriences, le p i c de F S H est assez l a r g e ; ceci p eut&tre expliqu6 p a r une pc)pulation h6t6ro.g6ne de mol6cules de F S H part i e l l e m e n t d6sialyldes, bien que to ujours i m m u n o rdactives. De fait, les O u d e s r~alis6es p a r S h e r i n s et coll. [10] sur la F S H h u m a i n e ont mis en 6vid e n c e que la d6sialylation p r o g r e s s i v e de la moldcule i n d u i t une m i g r a t i o n de l ' b o r m o n e vers des p H plus basiques (de pH 4,0 h pH 6,0). Si la F S H de rat r e n f e r m e e n c o r e plus d ' a e i d e s i a l i q u e que la F S H humain,e, on peut doric s ' a t t e n d r e h observ e r u n e h6tdrog6n~itd assez marqude. L ' a c t i v i t 6 F S H de rat, apr6s focalisation, n ' a p p a r a i t co n t a m i n 6 e ni p a r la LH, ni p a r la TSH. Elle est, de plus, p a r f a i t e m e n t sdparde de L T H et GH, ce qui p e r m e t d ' e n v i s a g e r l'dtude du m a r q u a g e de cette g o n a d o t r o p h i n e au cours d'inc u b a t i o n s d ' h y p o p h y s e s . Nous avons pu, apr6s
TABLEAU I.
Purification de FSH et de L H ~ partir de 10 o d ~ n o h y p o p h y s e s de rat (~4 m g de tissu frais). iI
FSH Etape Unit6s(')
LH
I
Protdines Activit6 Rendementl Uuilds ~g spdcifique
Protdines ~g -
Q u a n t i t d i n i t i a l e dans 10 glandes (") . . . . . . . . . . . . . . . . . Extrait selon Hartree . . . . . . . . . . . t~lectrofocalisation -~- chromatographic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I
284 204 117
3828
0,074
100
,
-
-,-
970
3828
0,26
100
2,50
47
5,01
184
1,11
72
460
184
18
6,43
41
63
13
(*) Unitds exprimdes en I~g de FSH-B.P-1 et LH-RP-I. (**) Calculde & partir de 2 hypophyses provenant du m~me groupe d'animaux.
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-
Activit6 spdcilique Rendement
6,5
E l e c t r o ~ o c a l i s a t i o n des g o n a d o t r o p h i n e s de rat. 61imination des a m p h o l y t e s p a r c h r o m a t o g r a p h i e , o b t e n i r une f r a c t i o n FSH e n r i c h i e sans activit6 LH ; cette o b s er v a ti o n c o n tr a s le avec celle de R e i c h e r t [9] qui, t r a v a i l l a n t h p a r t i r de glandes hum ai n es , a toujours trouv6 une activit6 LH associ6e h la f r a c t i o n F S H ; notons c e p e n d a n t que cet auteur ad m et ta it entre aulres la possibilit6 que le test b i o l o g i q u e utilis6 p o u r doser LH ne soil pas a b s o l u m e n t sp6cifique ; nous ajouterons de plus que le c o u p l e F S H + LH de rat se cornpor t e peut-6tre d i f f 6 r e m m e n t d.e ee m6me couple i f ' h o r m o n e s h u m a i n e s en 61ectrofocalisalion. L ' h o r m o n e F S H ainsi purifi6e d e v r a 6tre ult6rieur e m e n t test6e p o u r v6rifier si activit6 b i o l o g i q u e et dosage r a d i o i m m u n o l o g i q u e sont en a c c o r d . Les r6sultats obtenus avee la LH sont p a r f o i s eurieux. La position du pie p r i n c i p a l vers p H 9,0 est tout h fail en a c c o r d avec les r6sultats relatifs h la LH d'esp6ees diverses [9, 11]. Nous observons une c e r t a i n e h6t6rog6n6it6 qui t r a d u i t prob a b l e m e n t l ' e x i s t e n c e de p l u s i e u r s espbces mol6culaires. Le p i c d ' a c t i v i t 6 en zone acide est partic u l i b r e m e n t t ro u b la n t et les d i v e r s auteurs qui l'ont d6jfi signal6 p o u r les autres espbces a n i m a l e s n ' o n t pu en d o n n e r d ' e x p l i c a t i o n pr6cise. Nous devons r e m a r q n e r q u ' i l est le plus i m p o r t a n t dans la LH h a u t e m e n t purifi6e (LH-I-2), qu'il est faible dans la LH de r6f6rence (LH-RP-1) et qu'il est p r a t i q u e m e n t n6gligeable dans un extrait glycopr o t6ique f r a l e h e m e n t pr6par6. Dans une sbrie d ' e x p 6 r i e n c e s pr61iminaires, nous avons constal6 q u ' u n e autre p r 6 p a r a t i o n de LH h a u t e m e n t purifi6e (LH-DNW-8) pr~sente b.galement ce p i c en zone acide, sans que nous ayons pu toutefois en e sti m er la p r o p o r t i o n p a r r a p p o r t h l'aclivit6 totale (gradients r6alis6s essen.tiellement en pH 3-5). On peut d onc se d e m a n d e r si ee pic c o r r e s p o n d ~ une mol6cule existant r 6 e l l e m e n t dans l'ad6n.ohypophyse ou s'il s'agit de modifications qui a p p a r a i s s e n t au cours des divers stades de p u r i f i c a t i o n et lors du stockage. Nous n ' a v o n s pas r6ussi ~ o b t e n i r de fraction LH avec un bon r e n d e m e n t ; l'activit6 disp a r a i t apr6s filtration sur gel de Sephadex. Nous pe n s o n s que les c o n d i t i o n s de focalisation au voisinage de la cat h o d e sont inad6quates et que certaines mol6cul,es, q u o i q u e toujours i m m u n o r 6 a c tives, soient tr~s p a r t i e l l e m e n t d6grad6es et ne sortent plus de la c o l o n n e de S e p h a d e x an m6me n i v e a u que les mol6cules intactes. Enfin, la large zone observ6e p o u r l'activit6 TSH t r a d u i t la tr6s grande h6t6rog6n6it6 de cette h o r m o n e de rat, h6t6rog6n6it6 d6jh constat6e avec les TSH b o v i n e [6] et p o r c i n e [12]. Nous avons c o m m e n c 6 ~ a p p l i q u e r les r6sultats obtenus au cours de ce t r a v a i l h deux p r o c e s s u s :
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-- d'une part de FSH de rat c o l o n n e LKB de seul passage, de
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h la p r 6 p a r a t i o n & g r a n d e 6chelle tr6s e n r i c h i e ; l 'u t i l i sat i o n d ' u n e 440 ml de capacit6 p er m et , en un p r 6 p a r e r p l u si eu r s mg de FSH.
- - d ' a u t r e p a r t h l 'an al y se de la biosynthbse et de la secr6tion de la F S H : nous avons en effet constat6 que la F S H peut 6tre m ar q u 6 e in vitro h l ' a i d e de (SH)-fucose, et analys6e p a r focalisal i o n ; les deux pics d'activit6 F S H et de radioaetivit6 c o i n c i d e n t p a r f a i t e m e n t . Les m i l i e u x d'inc u b a t i o n p e u v e n t 6ga!ement ~tre analys6s, c e p e n dant, l ' h o r m o n e secr6t6e dans le milieu foealise dans une zone de p H c o m p r i s e en t r e 3 et 4. Notre m6thode d e v r a i t nous p e r m e t t r e de d 6 t e r m i n e r s'il s'agit s e u l e m e n t d'un art6fact de m i g r a t i o n dfi h la pr6sence simultan6e de n o m b r e u s e s h o r m o n e s dans le milieu, ou si la F S H est p a r t i e l l e m e n t modifi6e lors du p r o cessu s de secr6tion.
Remerciements. Ce travail a b~n6fici~ de l'aide du CNRS (E.R.A. 119). Nous remereions le Dr Jutisz pour l'initiation aux dosages radioimmunologiques et le Professeur Jacquemin pour l'initiation h ]'61ectrofocalisation. Nous sornrnes rcconnaissants au Dr Parlow et au NIA,MD, aux Dr Von Berswordt-Wallrabe, Dr Ward, Dr Blanc et Dr Pelletier pour leurs dons gdn6reux d'hormones et de sdrum. R~suM~. Nous avons adapt~ la m~thode d'61ectrofocalisation h l'6tude des hormones de l'ad~nohypophyse du rat. Les gonadetrophines et la TSH ont ~t6 d~tect~es h l'aide des dosages radioimmunologiques. En utilisant une colonne de faible eapacit6 et divers gradients de pH (3-10, 3-6 et 2,,5-4) nous eonstatons que la FSH pr6sente un pH iso61ectrique de 2,8, e'est-&-dire sensiblement plus acide que eelui de la FSH d'autres esp~ces animales. La LH est plus h~t6rog6ne, l'activit~ principale focalisant clans la zone de pH 9,0 ; un second pie apparait, pour certains 6chantillons, dans ]a partie aeide du gradient. La TSH pr~sente une zone d'aetivit~ tr6s large s'~tendant de pH 7,0 h 10,0. Le fraetionnement d'extraits hypophysaires /i l'aide du gradient de pH 3-10 suivi d'une filtration sur gel de Sephadex G 50 pour ~lirniner ampholytes et saccharose permet d'obtenir, avee un bon rendement, une fraction FSH purifl6e d6barrass6e d'activit~ LH.
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