BIOCHIMIE, 1975, 57, 121-122.
Prdparation des acides ddsoxyribonucldiques de la thyroide de boeuf l'aide de Sdpharose 2B. J e a n BESSON (*/.> ), M i c h e l B E r m ~ R et J a c q u e l i n e RADISSON. Laboratoire de Biophysique, Facult6 de M6decine, 8 Avenue Rockefeller, 69008 Lyon (France). (15-11-197~).
L'introduction des S6pharoses (Pharmaeia) a permis ] ' a p p l i c a t i o n de ]a f i l t r a t i o n s u r gel a u x m o l d c u l e s de t r 6 s h a u t p o i d s m o i d e u l a i r e c o m m e le DNA et ]a m a j o r ] t 6 d e s R N A [1-3]. R d c e m m e n t , Z a d r a z i l et coll. o n t u t i l i s d le 8 6 p h a r o s e 4B p o u r p r d p a r e r le DNA h p a r t i r de l y s a t s b a c t d r i e n s . N o u s d d c r i v o n s ici u n e m ~ t h o d e de p r d p a r a t i o n des DNA t h y r o i d i e n s s a n s p h e n o l , h l ' a i d e de S d p h a r o s e 2B. L c s g l a n d e s t h y r o i d e s de B ceuf p r o v i e n n e n t d e s a b a t t o i r s . E l l e s s o n t pr61ev6es a u s s i t S t a p r ~ s la m o r t de F a n ] r e a l , t r a n s p o r t ~ e s d u n s la glace c a r b o n i q u e , p u i s e o n s e r v ~ e s h 2~5°C. Le t i s s u est b r o y d avec m 6 n a g e m e n t h 2:0°C d u n s u u t a m p o n t r i s 0,01 M, u r d e 5 M; SDS 2 p. cent, p H 7,5 (5 m l p a r g r a m m e de t i s s u ) . U n e c e n t r i f u g a t i o n de 10 i n n h 4000 g h 20°(] et u n p a s s a g e h t r a v e r s u n filtre e n n y l o n d o n t ]a m a i l l e a 0,1 m m de c6t6 p e r m e t t e n t d ' d l i m i n e r les d ~ b r i s i n s o l u b l e s . Le f i l t r a t s e r a d i r e e t e m e n t placd s u r la e o l o n n e . L a c o l o n n e de S ~ p h a r o s e 2B ( d i a m 6 t r e : 2,5 cm, h a u t e u r : 90 era) e s t 6 q u i l i b r 6 e a v e e NaC1 0,1 M, t r i s 0,05 M, p H 7,5. J u s t e a v a n t d ' a p p l i q u e r l ' d c h a n t i l l o n , o n d 6 p o s e s u r le gel 10 m g de P r o t 6 a s e VI ( S i g m a ) d a n s 2t) h 30 m l de ce d e r n i e r t a m p o n . L o r s q u e ]a p r o t d a s e a e n t i 6 r e m e n t p 6 n 6 t r 6 d u n s la c o l o n n e , on a p p l i q u e l ' d c h a n t i l l o n (10-15 nfl c o r r e s p o n d a n t h 2-3 g de t i s s u ) . Le d 6 b i t est de 10 m l / h . Le d i a g r a m l n e d e s a b s o r b a n c e s h 230, 260 et 280 n m e s t i l l u s t r 6 s u r la figure 1. L e s r a p p o r t s A~;0/Az~ et A_.~,,/A.,~o s o n t 6 g a u x h 2"70 et 1,82 r e s p e c t i v e m e n t d u n s les f r a c t i o n s c e n t r a l e s d n pic I. (]es m 6 m e s r a p p o r t s s o n t de 1,80 et 1,65 r e s p e c t i v e m e n t si l ' o n o m e t le t r a i t e i n e n t h ]a p r o t d a s e . L e s r a p p o r t s o b t e n u s d u n s la m d t h o d e avec p r o t ~ a s e s o n t p l u s dlev~s q u e e e u x o b t e n u s p a r Z a d r a z i l et coll. [4] (A~aJAm~. = 1,82' h 1,92 et A~,:o/Ae~u = 1,71 h 1',81). L e s f r a c t i o n s d u pie I s o n t p a s s d e s s u r c o l o n n e MAK [5] s o i t d i r e e t e m e n t , s o i t a p r ~ s p r 6 e i p i t a t i o n h l'alcool. L a figure 2 m o n t r e q u e le p i e I de la figure 1 ne r e n f e r m e q u e d u DNA, s a n s a u e u n e c o n t a m i n a t i o n p a r l e s RNA. U n d o s a g e h l ' o r c i n o l [6] c o n f i r m e ee r~sultat. Le r e n d e m e n t d ' e x t r a c t i o n e s t de l ' o r d r e de 1,4 m g p a r g r a m m e de t i s s u . L a c o n s t a n t e de s d d i m e n l a t i o n S.~. d e s B N A o b t e n u s a dtd d i r e c t e m e n t d ~ t e r m i n d e a n (*) A t t a c h d de R e c h e r c h e s a u C.N.R.S. % A q u i t o u t e c o r r e s p o n d a n c e d o i t ~tre a d r e s s d e . Abrdoiations. DNA : acide d 4 s o x y r i b o n u c l 6 i q u e . RNA : acide r i b o n u c l ~ i q u e . A~,, A~o, A~o : a b s o r b a n c e s h 230, 260 et 2~0 n m . MAK : k i e s e l g u h r i m p r 6 g n 5 d ' a l b u m i n e m 6 t h y l d e . SDS : s o d i u m d o d d c y l s u l f a t e . T r i s : tris(hydroxymdthyl)-aminom~thanc.
moyen d'une ultracentrifugeuse analytique M.S.E. m u n i e d ' u n d d t e c t e u r U.V, h 260 n m et d ' n n s c a n n e r . Elle a dr6 t r o u v d e 6gale h 26.
o,
I
qs
0,1
°" °x
02
~
OO
b
i
°
~
2"0
/
°
i
"
3'0
ab
Nos FRACTIONS
FIG. 1. - - Filtration sur gel de SEphadex 2B d'un brogat de thyrofde de Bceuf (cf. t e x t e ) . L ' d e h a n t i l l o n , d u n s u n t a m p o n t r i s 0,01 M,, u r d e 5 M,, SDS 2 p. cent, p H 7,5, a u n v o l u m e de 9 m]. C o l o n n e de 90 c m de h a u t e u r et de 2,5 c m de d i a i n 6 t r e . Ddbit : 10 m l / h . T a m p o n d'dlmtion : t r i s 0,05 M, NaC1 0,10 M, p H 7,5. V o l u m e d e s f r a c t i o n s : 10 m l . L e s t r o i s c o u r h e s c o r r e s p o n d e n t a u x a b s o r b a n e e s h 230, 260 et 280 n m .
'
~260
0,3 0,2 q~ 0 0,2
CONCENTRATIONEN NaO.(M)
I~2 "
Fro. 2. - - Chromatographie sur colonne MAK des fractions du pie I de la figure 1. Ces f r a c t i o n s s o n t r 6 u n i e s ; u n e p a r t i e c o r r e s p o n d a n t h 10 u n i t d s d ' a b s o r b a n c e h 260 n m e s t a p p l i q u 6 e d i r e e t e m e n t s u r la c o l o n n e MAK. L ' d l u t i o n est r6alisde a v e c u n g r a d i e n t l i n 6 a i r e 0,2-1,2 M en NaC1 ( v o l u m e t o t a l : 500 roll. L ' a b s o r b a n c e h 260 n m e s t e n r e g i s t r d e a u t o m a t i q u e m e n t h l ' a i d e d ' u n d d t e c t e u r UV et d ' u n e n r e g i s t r e u r .
J. B e s s o n , M. B e r g e r el J. R a d i s s o n .
122
N o u s r e m e r c i o n s v i v e m e n t M mo A. C h a m b o s s e et M. R. T e y s s i e r p o u r l e u r e x c e l l e n t e c o l l a b o r a t i o n t e c h n i q u e . Ce t r a v a i l a b6n6fici6 d ' u n e a i d e f i n a n e i ~ r e d u C.N.R.S. et de l ' U n i t 6 de B i o l o g i e H u m a i n e de la F a c u l t 6 de M6decine de L y o n . BIBLIOGRAPH1E. 1. Oberg, B. a P h i l i p s o n , L. (19'67) Arch. Biochem. Biophys., 119, 504-509.
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.
2. N o v a k o v i e , M. B. ~ P e t r o v i c , S. L. (1972) Anal. Biochem., 49, 367-372. 3. B e s s o n , J., R a d i s s o n , J. ~ Berger, M. (1973) C. R. Soc. Biol., 167, 1156-11,59. 4. Z a d r a z i l , S., S a t a v a , J. ~ S o r m o v a , Z. (1973) J. Chromatogr., 91, 451-458. 5. M a n d e l l , J. D. ,~ H e r s h e y (19,60) Anal. Bioehem., 1, 66. 6. H u t c h i s o n , SV. C. t, M u n r o , H. N. (1961)Anahjst, 86, 768-813.
Prdparation des acides ddsoxyribonucldiques de la thyroide de boeuf l'aide de Sdpharose 2B. J e a n BESSON (*/.> ), M i c h e l B E r m ~ R et J a c q u e l i n e RADISSON. Laboratoire de Biophysique, Facult6 de M6decine, 8 Avenue Rockefeller, 69008 Lyon (France). (15-11-197~).
L'introduction des S6pharoses (Pharmaeia) a permis ] ' a p p l i c a t i o n de ]a f i l t r a t i o n s u r gel a u x m o l d c u l e s de t r 6 s h a u t p o i d s m o i d e u l a i r e c o m m e le DNA et ]a m a j o r ] t 6 d e s R N A [1-3]. R d c e m m e n t , Z a d r a z i l et coll. o n t u t i l i s d le 8 6 p h a r o s e 4B p o u r p r d p a r e r le DNA h p a r t i r de l y s a t s b a c t d r i e n s . N o u s d d c r i v o n s ici u n e m ~ t h o d e de p r d p a r a t i o n des DNA t h y r o i d i e n s s a n s p h e n o l , h l ' a i d e de S d p h a r o s e 2B. L c s g l a n d e s t h y r o i d e s de B ceuf p r o v i e n n e n t d e s a b a t t o i r s . E l l e s s o n t pr61ev6es a u s s i t S t a p r ~ s la m o r t de F a n ] r e a l , t r a n s p o r t ~ e s d u n s la glace c a r b o n i q u e , p u i s e o n s e r v ~ e s h 2~5°C. Le t i s s u est b r o y d avec m 6 n a g e m e n t h 2:0°C d u n s u u t a m p o n t r i s 0,01 M, u r d e 5 M; SDS 2 p. cent, p H 7,5 (5 m l p a r g r a m m e de t i s s u ) . U n e c e n t r i f u g a t i o n de 10 i n n h 4000 g h 20°(] et u n p a s s a g e h t r a v e r s u n filtre e n n y l o n d o n t ]a m a i l l e a 0,1 m m de c6t6 p e r m e t t e n t d ' d l i m i n e r les d ~ b r i s i n s o l u b l e s . Le f i l t r a t s e r a d i r e e t e m e n t placd s u r la e o l o n n e . L a c o l o n n e de S ~ p h a r o s e 2B ( d i a m 6 t r e : 2,5 cm, h a u t e u r : 90 era) e s t 6 q u i l i b r 6 e a v e e NaC1 0,1 M, t r i s 0,05 M, p H 7,5. J u s t e a v a n t d ' a p p l i q u e r l ' d c h a n t i l l o n , o n d 6 p o s e s u r le gel 10 m g de P r o t 6 a s e VI ( S i g m a ) d a n s 2t) h 30 m l de ce d e r n i e r t a m p o n . L o r s q u e ]a p r o t d a s e a e n t i 6 r e m e n t p 6 n 6 t r 6 d u n s la c o l o n n e , on a p p l i q u e l ' d c h a n t i l l o n (10-15 nfl c o r r e s p o n d a n t h 2-3 g de t i s s u ) . Le d 6 b i t est de 10 m l / h . Le d i a g r a m l n e d e s a b s o r b a n c e s h 230, 260 et 280 n m e s t i l l u s t r 6 s u r la figure 1. L e s r a p p o r t s A~;0/Az~ et A_.~,,/A.,~o s o n t 6 g a u x h 2"70 et 1,82 r e s p e c t i v e m e n t d u n s les f r a c t i o n s c e n t r a l e s d n pic I. (]es m 6 m e s r a p p o r t s s o n t de 1,80 et 1,65 r e s p e c t i v e m e n t si l ' o n o m e t le t r a i t e i n e n t h ]a p r o t d a s e . L e s r a p p o r t s o b t e n u s d u n s la m d t h o d e avec p r o t ~ a s e s o n t p l u s dlev~s q u e e e u x o b t e n u s p a r Z a d r a z i l et coll. [4] (A~aJAm~. = 1,82' h 1,92 et A~,:o/Ae~u = 1,71 h 1',81). L e s f r a c t i o n s d u pie I s o n t p a s s d e s s u r c o l o n n e MAK [5] s o i t d i r e e t e m e n t , s o i t a p r ~ s p r 6 e i p i t a t i o n h l'alcool. L a figure 2 m o n t r e q u e le p i e I de la figure 1 ne r e n f e r m e q u e d u DNA, s a n s a u e u n e c o n t a m i n a t i o n p a r l e s RNA. U n d o s a g e h l ' o r c i n o l [6] c o n f i r m e ee r~sultat. Le r e n d e m e n t d ' e x t r a c t i o n e s t de l ' o r d r e de 1,4 m g p a r g r a m m e de t i s s u . L a c o n s t a n t e de s d d i m e n l a t i o n S.~. d e s B N A o b t e n u s a dtd d i r e c t e m e n t d ~ t e r m i n d e a n (*) A t t a c h d de R e c h e r c h e s a u C.N.R.S. % A q u i t o u t e c o r r e s p o n d a n c e d o i t ~tre a d r e s s d e . Abrdoiations. DNA : acide d 4 s o x y r i b o n u c l 6 i q u e . RNA : acide r i b o n u c l ~ i q u e . A~,, A~o, A~o : a b s o r b a n c e s h 230, 260 et 2~0 n m . MAK : k i e s e l g u h r i m p r 6 g n 5 d ' a l b u m i n e m 6 t h y l d e . SDS : s o d i u m d o d d c y l s u l f a t e . T r i s : tris(hydroxymdthyl)-aminom~thanc.
moyen d'une ultracentrifugeuse analytique M.S.E. m u n i e d ' u n d d t e c t e u r U.V, h 260 n m et d ' n n s c a n n e r . Elle a dr6 t r o u v d e 6gale h 26.
o,
I
qs
0,1
°" °x
02
~
OO
b
i
°
~
2"0
/
°
i
"
3'0
ab
Nos FRACTIONS
FIG. 1. - - Filtration sur gel de SEphadex 2B d'un brogat de thyrofde de Bceuf (cf. t e x t e ) . L ' d e h a n t i l l o n , d u n s u n t a m p o n t r i s 0,01 M,, u r d e 5 M,, SDS 2 p. cent, p H 7,5, a u n v o l u m e de 9 m]. C o l o n n e de 90 c m de h a u t e u r et de 2,5 c m de d i a i n 6 t r e . Ddbit : 10 m l / h . T a m p o n d'dlmtion : t r i s 0,05 M, NaC1 0,10 M, p H 7,5. V o l u m e d e s f r a c t i o n s : 10 m l . L e s t r o i s c o u r h e s c o r r e s p o n d e n t a u x a b s o r b a n e e s h 230, 260 et 280 n m .
'
~260
0,3 0,2 q~ 0 0,2
CONCENTRATIONEN NaO.(M)
I~2 "
Fro. 2. - - Chromatographie sur colonne MAK des fractions du pie I de la figure 1. Ces f r a c t i o n s s o n t r 6 u n i e s ; u n e p a r t i e c o r r e s p o n d a n t h 10 u n i t d s d ' a b s o r b a n c e h 260 n m e s t a p p l i q u 6 e d i r e e t e m e n t s u r la c o l o n n e MAK. L ' d l u t i o n est r6alisde a v e c u n g r a d i e n t l i n 6 a i r e 0,2-1,2 M en NaC1 ( v o l u m e t o t a l : 500 roll. L ' a b s o r b a n c e h 260 n m e s t e n r e g i s t r d e a u t o m a t i q u e m e n t h l ' a i d e d ' u n d d t e c t e u r UV et d ' u n e n r e g i s t r e u r .
J. B e s s o n , M. B e r g e r el J. R a d i s s o n .
122
N o u s r e m e r c i o n s v i v e m e n t M mo A. C h a m b o s s e et M. R. T e y s s i e r p o u r l e u r e x c e l l e n t e c o l l a b o r a t i o n t e c h n i q u e . Ce t r a v a i l a b6n6fici6 d ' u n e a i d e f i n a n e i ~ r e d u C.N.R.S. et de l ' U n i t 6 de B i o l o g i e H u m a i n e de la F a c u l t 6 de M6decine de L y o n . BIBLIOGRAPH1E. 1. Oberg, B. a P h i l i p s o n , L. (19'67) Arch. Biochem. Biophys., 119, 504-509.
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.
2. N o v a k o v i e , M. B. ~ P e t r o v i c , S. L. (1972) Anal. Biochem., 49, 367-372. 3. B e s s o n , J., R a d i s s o n , J. ~ Berger, M. (1973) C. R. Soc. Biol., 167, 1156-11,59. 4. Z a d r a z i l , S., S a t a v a , J. ~ S o r m o v a , Z. (1973) J. Chromatogr., 91, 451-458. 5. M a n d e l l , J. D. ,~ H e r s h e y (19,60) Anal. Bioehem., 1, 66. 6. H u t c h i s o n , SV. C. t, M u n r o , H. N. (1961)Anahjst, 86, 768-813.
