498 K/in. Mb/. A ugenheilk. 197 (1990)
Lektinhistochemische Untersuchungen des retinalen Pigmentepithels bei Netzhautablösung S. Bopp, E. El-Hifnawi, H. Laqua Herrn Prof. Dr. med. O.-E. Lund zum 65. Geburtstag gewidmet
Zusammenfassung
Das retinale Pigmentepithel (RPE) entwickelt unter pathologischen Bedingungen em breites Spektrum morphologischer Varianten. Auf der Suche nach zytochemischen Markern für diesen Zeiltyp und sei-
ne unterschiedlichen Reaktionsformen haben wir das RPE lektinhistochemisch an gesunden Bulbi und an Bulbi mit Netzhautablosung untersucht. Damit konnte normales, reaktiv verändertes und proliferierendes bzw. migrierendes RPE vergleichend beurteilt werden. Die Darstellung der Lektinbindungsstellen erfolgte mit einer modifi-
zierten PAP-Methode am Paraffinschnitt. Von 8 Lektinen unterschiedlicher Zuckerspezifitat (Con A, WGA, PNA, RCA I, SBA, UEA I, DBA, LPA) besitzt normales und reaktiv verandertes RPE Bindungsstellen für Con A, WGA, PNA und RCA I. Mit den morphologischen Veranderungen der RPE-Zellen geht eine Modifikation der Lektinbindungsstellen einher. Während sich die Lektinbindungsstellen beim RPE im Zeilverband uberwiegend in den apikalen Kompartimenten der Zellen befinden, zeigt sich bei migrierenden RPE-Zellen, spez. den sog. Pigmentepithel-Makrophagen, eine positive Reaktion innerhaib der gesamten Zelle ohne topographische Bevorzugung einer bestimmten Region. Dieser Zelltyp bindet aul3erdem das Lektin SBA. Die für die dargesteliten mor-
phologischen Varianten des RPE festgestellten Lektinbindungsstellen für Con A, WGA, PNA und RCA I sind in dieser Kombination bei keinem anderen Zelltyp in der Retina nachweisbar und konnen damit als spezifische zytochemische Marker fur das RPE angesehen werden.
Einleitu ng
Lectin Histochemical Investigation of the Retinal Pigment Epithelium in Retinal Detachment The retinal pigment epithelium (RPE) exhibits a broad spectrum of morphological changes under pathological conditions. Since RPE cells cannot be immunocytochemically characterized with certainty, lectin histochemical investigations were performed to study the lectin binding pattern of different morphological RPE variants in human globes. Normal RPE with attached retinas was compared to reactive changes in RPE following retinal detachment. Lectin binding sites were visualized by a modified PAP technique performed on paraffin-embedded tissue sections. Eight lectins of different sugar affinity (Con A, WGA, PNA, RCA 1, SBA, UEA 1, DBA, LPA) were tested for binding sites on the RPE. Both normal and reactively changed RPE possess receptors for Con A, WGA, PNA, and RCA 1. Modifications in the lectin binding pattern occurred simultaneously with the morphological changes within the RPE cells. RPE cells which form a monolayer on Bruch's membrane mainly have lectin binding sites in their apical portions. Proliferating and migrating RPE cells, especially RPE macrophages, which have withdrawn from the basal cell layer were found to contain lectin binding sites dispersed over the entire cytoplasm. RPE macrophages exhibited additional binding sites for the lectin SBA. These results indicate that RPE cell variants can be designated by means of their specific combination of lectin binding sites for Con A WGA, PNA, and RCA I not found on other cell types in the retina.
Membran- und Strukturproteinen einher, die u. a. mit der Lektinhistochemie erfa!3t werden konnen.
Das retinale Pigmentepithel (RPE) besitzt unter patho!ogischen Bedingungen eine groBe morphologi-
sche und funktionelle Plastizität. Jede Storung der Interaktion zwischen RPE und Photorezeptorzellen fuhrt zu reaktiven Veranderungen des RPE, die sich als Migration, Proliferation und Pseudometaplasie der RPE-Zelle aul3ern konnen (8, 14). Auf subzellularer Ebene gehen derartige Prozesse mit biochemischen Veranderungen von zellulären Kim. Mbl. Augenheilk. 197 (1990) 498—502
1990 F. Enke Verlag Stuttgart
Lektinhistochemisch werden endstandige Zuckerreste von zellularen Glykoproteinen und -lipiden dargestelit. Lektine sind zuckerbindende Proteine oder Glykoproteine natUrlicher Herkunft, die sich spezifisch an komplementare zellulare Glykoproteine binden. Diesen terminalen Zuckerresten wird eine bedeutende Rolle bei Zelldifferenzierungsprozessen und interzellulären Regulationsmechanismen zugeschrieben (1, 16, 19). Ferner ist durch die histochemische Darstellung terminaler Carbohydrate durch Lektine eine zytochemische Charakterisierung
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Augenklinik der Universitat zu Lubeck (Direktor: Prof. Dr. H. Laqua)
Lekiinhistochemische Untersuchungen des retinalen Pigmentepithels
ne spezifische Kombination von Lektinbindungsstellen
Ergebnisse
Histologie auszeichnen (6, 22). Da sich zellulare Lektinbindungsstellen mit morphologischen und funktionellen Alterationen Normales RPE: Die zu Transplantationsder Zelle verändern, ist zu erwarten, dalI sich auch die unzwecken entnommenen Augen besitzen em normales RPE terschiedlichen morphologischen Varianten des RPE lekund unversehrte sensorische Netzhaut. Praparationstechtinhistochemisch different verhalten 1, 2, 6, 16, 22). nisch bedingt kam es gelegentlich zur Ablosung der sensorischen Netzhaut, was gleichzeitig eine genauere DifferenDie reaktiven Veranderungen des RPE bei zierung der Lektinbindungsstellen zwischen apikalem RPE Netzhautablosung sind eingehend untersucht (10, 12, 13, und distalen Photorezeptorzell-AuBengliedern erlaubte. 14). Daher haben wir das Lektinbindungsmuster des RPE bei Ablatio bestimmt und mit dem des normalen RPE verReaktiv verandertes RPE: Die lichtrnikroglichen, urn zu sehen, inwieweit die morphologischen Verskopischen Veranderungen des reaktiv veränderten RPE anderungen mit Anderungen des Lektinbindungsmusters wurden sowohi tierexperimentell als auch am Menschen korrelieren. Ferner soilte beurteilt werden, ob die Lektinhibeschrieben und stimmen mit unseren Befunden an stochemie em geeignetes zytodiagnostisches Verfahren fur das RPE mit semen morphologischen Varianten darsteilt. menschlichen Bulbi uberein (10, 12, 13, 14). Material und Methode Fur unsere Fragestellung war folgendes Untersuchungsmaterial erforderlich: Normales RPE aus Augen mit anliegender Netzhaut urid reaktiv verändertes RPE aus Augen mit Ablatio retinae. Bei letzteren liegt verändertes RPE in Kontakt zur
Bruchschen Membran und migrierendes bzw. proliferierendes RPE ohne Kontakt zur Bruchschen Membran vor.
Bei langer bestehender NetzhautablOsung kommt es zu einer Verbreiterung, Abflachung und Abrun-
dung der RPE-ZelIen, die in Kontakt zur Bruchschen Membran stehen. Die Mikrovilli sind verkurzt und frei von Melaningranula, die sich im apikalen Area! der Zelle angesammelt haben. Ferner sind proliferierende RPE-Zellen erkennbar, die eine mehrschichtige Epithellage bilden oder tubular angeordnet sind. Mit dem Verlust der polaren An-
ordnung im Epithelverband runden sich proliferierende und migrierende RPE-Ze!len ab. Zunachst haben sic noch Das Lektinbindungsmuster des normalen RPE Kontakt zum basalen Zeliverband, konnen sich aber ablowurde an 3 gesunden hinteren Augensegmenten untersucht, die sen und frei im subretinalen Raum liegen. Diese groBen, bei Explantationen gewonnen wurden. Reaktiv verAndertes RPE pigmeotbeladenden runden Zellen zeigen die typischen lag bei 4 weiteren Bulbi vor, die aus unterschiedlichen Grunden enukleiert wurden: em Auge mit Ziliarkorpermelariom und Se- Charakteristika des sog. Pigmentepithelmakrophagen kundbrer Ablatio, wobei die tumorfreien Anteile zur Untersu- (PE-Makrophagen). chung kamen, und 3 Bulbi mit proliferativer diabetischer Retinopathie und therapieresistentem Neovaskularisationsglaukom, die eine Traktionsamotio aufwiesen. Das menschliche Untersuchungsmaterial wurde
unmittelbar nach Entnahme in 4o Neutralformalin fixiert, um postmortale Veranderungen des RPE auszuschliellen, die sich in einer Denaturierung der zellularen Glykoproteine und damit in cincr veränderten Lektinbindung aullern kann. Nach Dehydrierung des Materials in aufsteigender Alkoholreihe und Einbettung in Paraffin wurden 5jtm dicke Schnitte hergestellt. Vor der histochemischen Untersuchung erfolgte die Entparaffinierung mit Xylol und Hydrierung der Paraffinschnitte mit Alkohol in absteigender Reihe.
Lektinhistochemie Normales RPE: Normales RPE in Kontakt zur Bruch'schen Membran lallt eine spezifisch positive Re-
aktion für Con A, WGA, PNA und RCA I erkennen. Die Lektinbindungsstellen befinden sich in den apikalen Anteilen der RPE-Zelle, auch in den Mikrovilli (Abb. 1). Die Bindung für Con A findet sich auch im basalen Anteil, ist aber im apikalen Kompartiment deutlich intensiver. Für die Lektine SBA, UEA I, DBA und LPA lassen sich keine Bindungsstellen am normalen RPE erkennen (Abb. 2).
Die Darstellung der Lektinbindungsstellen erfolgte am Paraffinschnitt mit einer PAP-Methode in der schon
Lektinbindungsm uster des reaktiv veränderten RPE mit Kontakt zur Bruch'schen Membran: RPE im Zeliverband bei Netzhautablosung zeigt em ahnliches Spektrum zellularer Zuckerreste zu erfassen: Con A, WGA, Lektinbindungsmuster wie normales RPE, solange die ZelPNA, RCA I, SBA, UEA I, DBA, LPA. Das positive Reaktions- len untei-einander und mit der Bruch'schen Membran in produkt ist anhand seiner rot-braunen Farbung (PAP-gekoppelKontakt stehen, d.h. mit einer positiven Reaktion betont tes AEC-H202 bei positiver Lektinbindung) erkennbar, die sich im apikalen Kompartiment der Zelle (Abb. 3). Es erfolgt von der gelb-braunen Farbe der Melaningranula auch beim RPE ebenfalls eine Bindung der Lektine Con A, WGA, PNA deutlich abhebt. Die Spezifitat der Reaktion wurde durch Hemund RCA I, und meist ist das Reaktionsprodukt intensiver mung der Lektinbindung am Gewebeschnitt durch Vorinkubation als bei normalem RPE. Die Bindung von Con A findet in mit dem lektinspezifischen komplementaren Mono- bzw. Disaccharid bzw. durch Ersatz des zu inkubierenden Lektins durch der ganzen Zelle statt (Abb. 4). Anders als beim normalen Phosphatpuffer uberpruft. Die Auswertung der Befunde erfolgte RPE fehlt bei Netzhautablosung das positive Reaktionslichtmikroskopisch und wurde photodokumentiert. Zur histologiprodukt in den Mikrovilli oder ist ausgesprochen schwach. schen Beurteilung wurden konventionell HE-gefarbte Paraffin- Die Lektine SBA, UEA I, DBA und LPA zeigen keine Binschnitte mitgefQhrt. dung am reaktiv veranderten RPE (Abb. 8). verOffentlichten Modifikation (4). Acht Lektine unterschiedlicher Carbohydratspezifitat kamen zur Anwendung, um em breites
Lektmnbmndungsmuster des reaktiv veränderten RPE ohne Kontakt zur Bruch 'schen Mem bran: Mi-
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von bestimmten Zelitypen moglich, wenn sic sich durch ci-
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S. Bopp und Mitarb.
500 KIm. Mb!. Augenheilk. 197 (1990)
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Abb. 1 PNA: Lektinbindungsstellen für PNA an der normalen Netzhaut. Des positive Reaktionsprodukt rostbraun) steilt s:ch in den apikalen Kompartimenten der RPE-ZeIIen einschlieRlich in den Mikroviti dar, die basalen Anteile des RPE bleiben ungefärbt (gelbbraune Melaningranula(. Ferner reagieren die Photorezeptorinnen- und dista(en AuRenglieder positiv. (V =R6Ofach(
Abb. 2 UEA (: Das RPE normaler Netzhaut zeigt keine Reektion mit diesem Lektin. Dagegen st mit UEA I, einem bekannten GefdRendothelzell-Marker, eine deutliche Reaktion an der Choriokapil(ars erkennbar. (V = 96Ofach(
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Abb. 3 RCA I: Reaktiv verändertes APE im Epithelverband auf der Bruchschen Membran bindet WGA, PNA und RCA in den apikalen Kompartimenten der Zelle. Anders als bei norma(em RPE, st die positive Reaktion in den Mikrovi(Ii schwach oder nicht erkennbar. (V=96Ofach(
Abb. 4 Con A: Bei verdndertem RPE im Mono(ayer sind die
grierende und proliferierende RPE-Zellen, die den Kon-
Bindungsstellen für die Lektine Con A, WGA, PNA, RCA
takt zur Bruch'schen Membran verlieren, binden die Lektine Con A, WGA, PNA und RCA I wie normales und ver-
I (Abb. 6). Anders als bei RPE im Zeliverband laI3t sich bei
ändertes RPE im Monolayer auf der Bruch'schen Mem-
SBA nachweisen (Abb. 7). Für den PE.-Makrophagen gilt, daB das Reaktionsprodukt für alle 5 Lektine homogen innerhaib der ganzen Zelle zu beobachten ist. Eine topographische Bevorzugung bestimmter Regionen in der Zelle 1a13t sich nicht erkennen. Die Lektine UEA I, DBA und LPA werden nicht an den PE-Makrophagen gebunden.
bran. Die Bindungscharakteristik verRndert sich: Bei proli-
ferierenden RPE-Zellen, die zwar noch in Kontakt zur basalen Zellschicht stehen, sich aber aus dem basalen Zellverband lösen oder eine mehrschichtige Zellage bilden, findet man noch eine apikal betonte Anfarbung oder eine Reaktion in den randstRndigen Anteilen der Zelle, d. h. nahe der Zelloberflache (Abb. 5). Gleichzeitig kommt es zu einer schwächeren Bindung des Lek tins auch innerlialb der Zelle
Bindungsste(Ien für dieses Lektin innerha(b der ganzen Zelle 10kalisiert. (V = 96Ofach(
PE-Makrophagen eine starke Reaktion mit dem Lektin
Diskussion
und perinuklear.
Zellen, die sich volistandig aus dem Epithelverband gelost haben und als sog. PE-Makrophagen frei im subretinalen Raum vorliegen, besitzen ebenfalls
Das Lektinbindungsmuster des gesunden menschlichen RPE besteht nach unseren Untersuchungen aus Rezeptoren für die Lektine Con A, WGA, PNA und RCA I. Da eine Anderung in der Lektinbindung bei funk-
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Lektinhistochemische Untersuchungen des retinal en Pigmentepithels
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'6 Abb. 5 PNA: Proliferierende RPE-ZeIIen kbnnen mehrschichtige Zellagen bilden oder sich aus dem Epithelverband Idsen. Dabei verändert sich die Topographie der Lektinbindungsstelen: zunächst ist noch eine Reaktion in den apikalen Arealen der Zelle zu erkennen, dann eine randstdndige und zuletzt eine homogen positive innerhaib der ganzen Zete. (V = 96Ofach)
Abb. 6 PNA: PE-Makrophagen besitzen Lektinbindungsstelen innerhaib der gesamten Zelle und zeigen mit aI(en am RPE reagierenden Lektinen eine kräftig positive Reaktion. (V = 96Ofach)
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Abb. 7 SBA: Das Lektin SBA zeigt ausschlieRlich bei PE-Makrophagen eine positive Reaktion. Alle anderen RPE-Varianten sind SBA-negativ.
Abb. 8 DBA: Für die Lektine DBA, UEA I und LPA sind an
tionellen und morphologischen Alterationen von Zellen
Proliferierende RPE-Zellen bilden eine mehrschichtige Zellage und verlieren damit mehr oder weniger ihre polare Differenzierung (10, 12, 13). Lektinhisto-
bekannt ist (1, 2,6, 16,22), erschien uns die RPE-Zelle mit ihren vielfaltigen Varianten fur diese zytochemische Methode geeignet, urn die Lektinbindungscharakteristik bei den unterschiedlichen morphologischen Erscheinungsformen zu studieren.
Die vergleichende Untersuchung von normalem RPE und verandertem RPE bei Netzhautablosung hat gezeigt, dal3 reaktiv verändertes RPE die Lektine bindet, die auch an normalem RPE nachweisbar sind. Solange sich die RPE-Zellen im Epithelverband auf der Bruch'schen Membran befinden und damit eine polare Differenzierung zeigen, befindet sich das Reaktionsprodukt uberwiegend im apikalen Anteil der RPE-Zelle. Anders als beim normalen RPE werden die veränderten Mikrovilli nicht mehr angefarbt (4).
keinem der untersuchten HPE-Varianten Bindungssteflen nachweisbar. (V = 600fach(
chemisch zeigt sich entsprechend eine veranderte
Bindungscharakteristik: einerseits findet man Zellen, die noch eine betont apikale oder eine randstandige Anfärbung zeigen, andererseits Zellen, die in ihrer Gesamtheit homogen positiv reagieren.
Auch die PE-Makrophagen binden die Lektine, die an normalem RPE und an verandertem RPE in Kontakt zur Bruch'schen Membran nachweisbar sind: Con A, WGA, PNA und RCA 1. Zusatzlich zeigt sich eine positive Reaktion mit dem Lektin SBA, die bei normalem und auch proliferierendem RPE im Zeliverband nicht vorkommt. Selbst bei den sog. ,,Ubergangsformen", d. h. den Zellen, die im Begriff sind, sich aus dem Epithelverband zu
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S. Bopp und Mit arb.: Lektinhistochemische Untersuchungen des Pigment epit he/s
losen, findet man noch keine Reaktion mit SBA. Die Bindung dieses Lektins ist streng auf den PE-Makrophagen beschrankt und stelit damit em Spezifikum dieser morphoIogischen Variante des RPE dar. Auffallig ist beim PEMakrophagen eine starke Reaktionsintensität mit alIen positiv reagierenden Lektinen, was als Ausdruck einer vermehrten Anzahl von Bindungsstellen zu werten ist. Ferner ist beim PE-Makrophagen stets eine homogene Anfarbung der gesamten Zelle ohne Bevorzugung einer bestimmten Zeliregion zu beobachten.
Literatur
2
Sci. 25 (1984) 546—557 1
Mit der Iichtmikroskopischen Methode der Bestimmung von Lektinbindungsstellen kann derzeit noch nicht sicher bestimmt werden, an weiche zellulären Strukturen die Lektine gebunden werden. Tierexperimentelle lektinhistochemische Studien auf elektronenmikroskopischem Niveau haben Bindungsstellen an der Zelimembran und in den Mikrovilli, daneben auch an Phagosomen nachgewiesen (9, 11, 15). Unsere Beobachtungen, daB das positive Reaktionsprodukt in den apikalen Kompartimenten der RPE-Zelle bzw. bei den proliferierenden Formen und dem PE-Makrophagen uberwiegend in der gesamten Zeile lokalisiert ist, deuten darauf hin, daB nicht allein die Zellmembran oder Glykokalix fur die Lektinbindung verantwortlich ist, sondern daB auch eine Bindung an intrazellulare Strukturproteine erfolgt.
Das von uns gefundene Lektinbindungsmuster des normalen RPE stimmt mit tierexperimentellen Studien uberein, wobei gewisse Spezies- und methodische Unterschiede bestehen (3, 7, 9, 11, 15, 17, 18, 20, 21, 23). Eingehende lektinhistochemische Studien zum menschlichen RPE liegen bisher nicht vor. Trotz gewisser Variationen in den bisherigen Iektinhistochemischen Resultaten zum RPE kann daraus abgeleitet werden, daB Lektinbindungsstellen fur Con A, WGA, PNA und RCA I typisch für das RPE sind. Nach unseren Untersuchungen weist kein anderer Zeiltyp retinalen Ursprungs em dem RPE identisches Lektinbindungsmuster auf, so daB man diese Lektine als zytochemische Marker für das RPE betrachten kann. Unsere Untersuchungen bei den morphologischen Varianten des RPE bei Netzhautablosung und in Photokoagulationsnarben (5) haben weiterhin gezeigt, daB Lektinbindungsstellen für Con A, WGA, PNA und RCA I auch in reaktiv verandertem (migrierendem und prolife-
rierendem) RPE erhalten bleiben, dort aber zusätzliche Modifikationen aufweisen.
Weitere lektinhistochemische Untersuchungen werden z. Z. durchgefuhrt, um festzustellen, ob dieses Lektinbindungsmuster auch bei metaplastisch veränderten RPE-Zellen zutrifft, die fibrozyten- oder myofibroblastenahnliche Gestalt angenommen und ihre Melaningranula weitgehend verloren haben. Damit ware eine zytochemische Diagnostik von metaplastisch veranderten RPE-ZeIlen, z. B. in periretinalen Membranen, gegeben, deren sicherer morpho1oischer Nachweis bisher nicht moglich war.
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Dr. S. Bopp Augenklinik der Medizinischen Universitat zu LUbeck Rateeburger Alice 160 D-2400 Li/beck
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Das retinale Pigmentepithel (RPE) entwickelt unter pathologischen Bedingungen em breites Spektrum morphologischer Varianten. Auf der Suche nach zytochemischen Markern für diesen Zeiltyp und sei-
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Lectin Histochemical Investigation of the Retinal Pigment Epithelium in Retinal Detachment The retinal pigment epithelium (RPE) exhibits a broad spectrum of morphological changes under pathological conditions. Since RPE cells cannot be immunocytochemically characterized with certainty, lectin histochemical investigations were performed to study the lectin binding pattern of different morphological RPE variants in human globes. Normal RPE with attached retinas was compared to reactive changes in RPE following retinal detachment. Lectin binding sites were visualized by a modified PAP technique performed on paraffin-embedded tissue sections. Eight lectins of different sugar affinity (Con A, WGA, PNA, RCA 1, SBA, UEA 1, DBA, LPA) were tested for binding sites on the RPE. Both normal and reactively changed RPE possess receptors for Con A, WGA, PNA, and RCA 1. Modifications in the lectin binding pattern occurred simultaneously with the morphological changes within the RPE cells. RPE cells which form a monolayer on Bruch's membrane mainly have lectin binding sites in their apical portions. Proliferating and migrating RPE cells, especially RPE macrophages, which have withdrawn from the basal cell layer were found to contain lectin binding sites dispersed over the entire cytoplasm. RPE macrophages exhibited additional binding sites for the lectin SBA. These results indicate that RPE cell variants can be designated by means of their specific combination of lectin binding sites for Con A WGA, PNA, and RCA I not found on other cell types in the retina.
Membran- und Strukturproteinen einher, die u. a. mit der Lektinhistochemie erfa!3t werden konnen.
Das retinale Pigmentepithel (RPE) besitzt unter patho!ogischen Bedingungen eine groBe morphologi-
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Lektinhistochemisch werden endstandige Zuckerreste von zellularen Glykoproteinen und -lipiden dargestelit. Lektine sind zuckerbindende Proteine oder Glykoproteine natUrlicher Herkunft, die sich spezifisch an komplementare zellulare Glykoproteine binden. Diesen terminalen Zuckerresten wird eine bedeutende Rolle bei Zelldifferenzierungsprozessen und interzellulären Regulationsmechanismen zugeschrieben (1, 16, 19). Ferner ist durch die histochemische Darstellung terminaler Carbohydrate durch Lektine eine zytochemische Charakterisierung
Dieses Dokument wurde zum persönlichen Gebrauch heruntergeladen. Vervielfältigung nur mit Zustimmung des Verlages.
Augenklinik der Universitat zu Lubeck (Direktor: Prof. Dr. H. Laqua)
Lekiinhistochemische Untersuchungen des retinalen Pigmentepithels
ne spezifische Kombination von Lektinbindungsstellen
Ergebnisse
Histologie auszeichnen (6, 22). Da sich zellulare Lektinbindungsstellen mit morphologischen und funktionellen Alterationen Normales RPE: Die zu Transplantationsder Zelle verändern, ist zu erwarten, dalI sich auch die unzwecken entnommenen Augen besitzen em normales RPE terschiedlichen morphologischen Varianten des RPE lekund unversehrte sensorische Netzhaut. Praparationstechtinhistochemisch different verhalten 1, 2, 6, 16, 22). nisch bedingt kam es gelegentlich zur Ablosung der sensorischen Netzhaut, was gleichzeitig eine genauere DifferenDie reaktiven Veranderungen des RPE bei zierung der Lektinbindungsstellen zwischen apikalem RPE Netzhautablosung sind eingehend untersucht (10, 12, 13, und distalen Photorezeptorzell-AuBengliedern erlaubte. 14). Daher haben wir das Lektinbindungsmuster des RPE bei Ablatio bestimmt und mit dem des normalen RPE verReaktiv verandertes RPE: Die lichtrnikroglichen, urn zu sehen, inwieweit die morphologischen Verskopischen Veranderungen des reaktiv veränderten RPE anderungen mit Anderungen des Lektinbindungsmusters wurden sowohi tierexperimentell als auch am Menschen korrelieren. Ferner soilte beurteilt werden, ob die Lektinhibeschrieben und stimmen mit unseren Befunden an stochemie em geeignetes zytodiagnostisches Verfahren fur das RPE mit semen morphologischen Varianten darsteilt. menschlichen Bulbi uberein (10, 12, 13, 14). Material und Methode Fur unsere Fragestellung war folgendes Untersuchungsmaterial erforderlich: Normales RPE aus Augen mit anliegender Netzhaut urid reaktiv verändertes RPE aus Augen mit Ablatio retinae. Bei letzteren liegt verändertes RPE in Kontakt zur
Bruchschen Membran und migrierendes bzw. proliferierendes RPE ohne Kontakt zur Bruchschen Membran vor.
Bei langer bestehender NetzhautablOsung kommt es zu einer Verbreiterung, Abflachung und Abrun-
dung der RPE-ZelIen, die in Kontakt zur Bruchschen Membran stehen. Die Mikrovilli sind verkurzt und frei von Melaningranula, die sich im apikalen Area! der Zelle angesammelt haben. Ferner sind proliferierende RPE-Zellen erkennbar, die eine mehrschichtige Epithellage bilden oder tubular angeordnet sind. Mit dem Verlust der polaren An-
ordnung im Epithelverband runden sich proliferierende und migrierende RPE-Ze!len ab. Zunachst haben sic noch Das Lektinbindungsmuster des normalen RPE Kontakt zum basalen Zeliverband, konnen sich aber ablowurde an 3 gesunden hinteren Augensegmenten untersucht, die sen und frei im subretinalen Raum liegen. Diese groBen, bei Explantationen gewonnen wurden. Reaktiv verAndertes RPE pigmeotbeladenden runden Zellen zeigen die typischen lag bei 4 weiteren Bulbi vor, die aus unterschiedlichen Grunden enukleiert wurden: em Auge mit Ziliarkorpermelariom und Se- Charakteristika des sog. Pigmentepithelmakrophagen kundbrer Ablatio, wobei die tumorfreien Anteile zur Untersu- (PE-Makrophagen). chung kamen, und 3 Bulbi mit proliferativer diabetischer Retinopathie und therapieresistentem Neovaskularisationsglaukom, die eine Traktionsamotio aufwiesen. Das menschliche Untersuchungsmaterial wurde
unmittelbar nach Entnahme in 4o Neutralformalin fixiert, um postmortale Veranderungen des RPE auszuschliellen, die sich in einer Denaturierung der zellularen Glykoproteine und damit in cincr veränderten Lektinbindung aullern kann. Nach Dehydrierung des Materials in aufsteigender Alkoholreihe und Einbettung in Paraffin wurden 5jtm dicke Schnitte hergestellt. Vor der histochemischen Untersuchung erfolgte die Entparaffinierung mit Xylol und Hydrierung der Paraffinschnitte mit Alkohol in absteigender Reihe.
Lektinhistochemie Normales RPE: Normales RPE in Kontakt zur Bruch'schen Membran lallt eine spezifisch positive Re-
aktion für Con A, WGA, PNA und RCA I erkennen. Die Lektinbindungsstellen befinden sich in den apikalen Anteilen der RPE-Zelle, auch in den Mikrovilli (Abb. 1). Die Bindung für Con A findet sich auch im basalen Anteil, ist aber im apikalen Kompartiment deutlich intensiver. Für die Lektine SBA, UEA I, DBA und LPA lassen sich keine Bindungsstellen am normalen RPE erkennen (Abb. 2).
Die Darstellung der Lektinbindungsstellen erfolgte am Paraffinschnitt mit einer PAP-Methode in der schon
Lektinbindungsm uster des reaktiv veränderten RPE mit Kontakt zur Bruch'schen Membran: RPE im Zeliverband bei Netzhautablosung zeigt em ahnliches Spektrum zellularer Zuckerreste zu erfassen: Con A, WGA, Lektinbindungsmuster wie normales RPE, solange die ZelPNA, RCA I, SBA, UEA I, DBA, LPA. Das positive Reaktions- len untei-einander und mit der Bruch'schen Membran in produkt ist anhand seiner rot-braunen Farbung (PAP-gekoppelKontakt stehen, d.h. mit einer positiven Reaktion betont tes AEC-H202 bei positiver Lektinbindung) erkennbar, die sich im apikalen Kompartiment der Zelle (Abb. 3). Es erfolgt von der gelb-braunen Farbe der Melaningranula auch beim RPE ebenfalls eine Bindung der Lektine Con A, WGA, PNA deutlich abhebt. Die Spezifitat der Reaktion wurde durch Hemund RCA I, und meist ist das Reaktionsprodukt intensiver mung der Lektinbindung am Gewebeschnitt durch Vorinkubation als bei normalem RPE. Die Bindung von Con A findet in mit dem lektinspezifischen komplementaren Mono- bzw. Disaccharid bzw. durch Ersatz des zu inkubierenden Lektins durch der ganzen Zelle statt (Abb. 4). Anders als beim normalen Phosphatpuffer uberpruft. Die Auswertung der Befunde erfolgte RPE fehlt bei Netzhautablosung das positive Reaktionslichtmikroskopisch und wurde photodokumentiert. Zur histologiprodukt in den Mikrovilli oder ist ausgesprochen schwach. schen Beurteilung wurden konventionell HE-gefarbte Paraffin- Die Lektine SBA, UEA I, DBA und LPA zeigen keine Binschnitte mitgefQhrt. dung am reaktiv veranderten RPE (Abb. 8). verOffentlichten Modifikation (4). Acht Lektine unterschiedlicher Carbohydratspezifitat kamen zur Anwendung, um em breites
Lektmnbmndungsmuster des reaktiv veränderten RPE ohne Kontakt zur Bruch 'schen Mem bran: Mi-
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von bestimmten Zelitypen moglich, wenn sic sich durch ci-
Kim. MbI. Augenheilk. 197 (1990) 499
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S. Bopp und Mitarb.
500 KIm. Mb!. Augenheilk. 197 (1990)
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Abb. 1 PNA: Lektinbindungsstellen für PNA an der normalen Netzhaut. Des positive Reaktionsprodukt rostbraun) steilt s:ch in den apikalen Kompartimenten der RPE-ZeIIen einschlieRlich in den Mikroviti dar, die basalen Anteile des RPE bleiben ungefärbt (gelbbraune Melaningranula(. Ferner reagieren die Photorezeptorinnen- und dista(en AuRenglieder positiv. (V =R6Ofach(
Abb. 2 UEA (: Das RPE normaler Netzhaut zeigt keine Reektion mit diesem Lektin. Dagegen st mit UEA I, einem bekannten GefdRendothelzell-Marker, eine deutliche Reaktion an der Choriokapil(ars erkennbar. (V = 96Ofach(
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Abb. 3 RCA I: Reaktiv verändertes APE im Epithelverband auf der Bruchschen Membran bindet WGA, PNA und RCA in den apikalen Kompartimenten der Zelle. Anders als bei norma(em RPE, st die positive Reaktion in den Mikrovi(Ii schwach oder nicht erkennbar. (V=96Ofach(
Abb. 4 Con A: Bei verdndertem RPE im Mono(ayer sind die
grierende und proliferierende RPE-Zellen, die den Kon-
Bindungsstellen für die Lektine Con A, WGA, PNA, RCA
takt zur Bruch'schen Membran verlieren, binden die Lektine Con A, WGA, PNA und RCA I wie normales und ver-
I (Abb. 6). Anders als bei RPE im Zeliverband laI3t sich bei
ändertes RPE im Monolayer auf der Bruch'schen Mem-
SBA nachweisen (Abb. 7). Für den PE.-Makrophagen gilt, daB das Reaktionsprodukt für alle 5 Lektine homogen innerhaib der ganzen Zelle zu beobachten ist. Eine topographische Bevorzugung bestimmter Regionen in der Zelle 1a13t sich nicht erkennen. Die Lektine UEA I, DBA und LPA werden nicht an den PE-Makrophagen gebunden.
bran. Die Bindungscharakteristik verRndert sich: Bei proli-
ferierenden RPE-Zellen, die zwar noch in Kontakt zur basalen Zellschicht stehen, sich aber aus dem basalen Zellverband lösen oder eine mehrschichtige Zellage bilden, findet man noch eine apikal betonte Anfarbung oder eine Reaktion in den randstRndigen Anteilen der Zelle, d. h. nahe der Zelloberflache (Abb. 5). Gleichzeitig kommt es zu einer schwächeren Bindung des Lek tins auch innerlialb der Zelle
Bindungsste(Ien für dieses Lektin innerha(b der ganzen Zelle 10kalisiert. (V = 96Ofach(
PE-Makrophagen eine starke Reaktion mit dem Lektin
Diskussion
und perinuklear.
Zellen, die sich volistandig aus dem Epithelverband gelost haben und als sog. PE-Makrophagen frei im subretinalen Raum vorliegen, besitzen ebenfalls
Das Lektinbindungsmuster des gesunden menschlichen RPE besteht nach unseren Untersuchungen aus Rezeptoren für die Lektine Con A, WGA, PNA und RCA I. Da eine Anderung in der Lektinbindung bei funk-
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K/in. Mbl. A ugenheilk. 197 (1990) 501
Lektinhistochemische Untersuchungen des retinal en Pigmentepithels
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'6 Abb. 5 PNA: Proliferierende RPE-ZeIIen kbnnen mehrschichtige Zellagen bilden oder sich aus dem Epithelverband Idsen. Dabei verändert sich die Topographie der Lektinbindungsstelen: zunächst ist noch eine Reaktion in den apikalen Arealen der Zelle zu erkennen, dann eine randstdndige und zuletzt eine homogen positive innerhaib der ganzen Zete. (V = 96Ofach)
Abb. 6 PNA: PE-Makrophagen besitzen Lektinbindungsstelen innerhaib der gesamten Zelle und zeigen mit aI(en am RPE reagierenden Lektinen eine kräftig positive Reaktion. (V = 96Ofach)
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Abb. 7 SBA: Das Lektin SBA zeigt ausschlieRlich bei PE-Makrophagen eine positive Reaktion. Alle anderen RPE-Varianten sind SBA-negativ.
Abb. 8 DBA: Für die Lektine DBA, UEA I und LPA sind an
tionellen und morphologischen Alterationen von Zellen
Proliferierende RPE-Zellen bilden eine mehrschichtige Zellage und verlieren damit mehr oder weniger ihre polare Differenzierung (10, 12, 13). Lektinhisto-
bekannt ist (1, 2,6, 16,22), erschien uns die RPE-Zelle mit ihren vielfaltigen Varianten fur diese zytochemische Methode geeignet, urn die Lektinbindungscharakteristik bei den unterschiedlichen morphologischen Erscheinungsformen zu studieren.
Die vergleichende Untersuchung von normalem RPE und verandertem RPE bei Netzhautablosung hat gezeigt, dal3 reaktiv verändertes RPE die Lektine bindet, die auch an normalem RPE nachweisbar sind. Solange sich die RPE-Zellen im Epithelverband auf der Bruch'schen Membran befinden und damit eine polare Differenzierung zeigen, befindet sich das Reaktionsprodukt uberwiegend im apikalen Anteil der RPE-Zelle. Anders als beim normalen RPE werden die veränderten Mikrovilli nicht mehr angefarbt (4).
keinem der untersuchten HPE-Varianten Bindungssteflen nachweisbar. (V = 600fach(
chemisch zeigt sich entsprechend eine veranderte
Bindungscharakteristik: einerseits findet man Zellen, die noch eine betont apikale oder eine randstandige Anfärbung zeigen, andererseits Zellen, die in ihrer Gesamtheit homogen positiv reagieren.
Auch die PE-Makrophagen binden die Lektine, die an normalem RPE und an verandertem RPE in Kontakt zur Bruch'schen Membran nachweisbar sind: Con A, WGA, PNA und RCA 1. Zusatzlich zeigt sich eine positive Reaktion mit dem Lektin SBA, die bei normalem und auch proliferierendem RPE im Zeliverband nicht vorkommt. Selbst bei den sog. ,,Ubergangsformen", d. h. den Zellen, die im Begriff sind, sich aus dem Epithelverband zu
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S. Bopp und Mit arb.: Lektinhistochemische Untersuchungen des Pigment epit he/s
losen, findet man noch keine Reaktion mit SBA. Die Bindung dieses Lektins ist streng auf den PE-Makrophagen beschrankt und stelit damit em Spezifikum dieser morphoIogischen Variante des RPE dar. Auffallig ist beim PEMakrophagen eine starke Reaktionsintensität mit alIen positiv reagierenden Lektinen, was als Ausdruck einer vermehrten Anzahl von Bindungsstellen zu werten ist. Ferner ist beim PE-Makrophagen stets eine homogene Anfarbung der gesamten Zelle ohne Bevorzugung einer bestimmten Zeliregion zu beobachten.
Literatur
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Sci. 25 (1984) 546—557 1
Mit der Iichtmikroskopischen Methode der Bestimmung von Lektinbindungsstellen kann derzeit noch nicht sicher bestimmt werden, an weiche zellulären Strukturen die Lektine gebunden werden. Tierexperimentelle lektinhistochemische Studien auf elektronenmikroskopischem Niveau haben Bindungsstellen an der Zelimembran und in den Mikrovilli, daneben auch an Phagosomen nachgewiesen (9, 11, 15). Unsere Beobachtungen, daB das positive Reaktionsprodukt in den apikalen Kompartimenten der RPE-Zelle bzw. bei den proliferierenden Formen und dem PE-Makrophagen uberwiegend in der gesamten Zeile lokalisiert ist, deuten darauf hin, daB nicht allein die Zellmembran oder Glykokalix fur die Lektinbindung verantwortlich ist, sondern daB auch eine Bindung an intrazellulare Strukturproteine erfolgt.
Das von uns gefundene Lektinbindungsmuster des normalen RPE stimmt mit tierexperimentellen Studien uberein, wobei gewisse Spezies- und methodische Unterschiede bestehen (3, 7, 9, 11, 15, 17, 18, 20, 21, 23). Eingehende lektinhistochemische Studien zum menschlichen RPE liegen bisher nicht vor. Trotz gewisser Variationen in den bisherigen Iektinhistochemischen Resultaten zum RPE kann daraus abgeleitet werden, daB Lektinbindungsstellen fur Con A, WGA, PNA und RCA I typisch für das RPE sind. Nach unseren Untersuchungen weist kein anderer Zeiltyp retinalen Ursprungs em dem RPE identisches Lektinbindungsmuster auf, so daB man diese Lektine als zytochemische Marker für das RPE betrachten kann. Unsere Untersuchungen bei den morphologischen Varianten des RPE bei Netzhautablosung und in Photokoagulationsnarben (5) haben weiterhin gezeigt, daB Lektinbindungsstellen für Con A, WGA, PNA und RCA I auch in reaktiv verandertem (migrierendem und prolife-
rierendem) RPE erhalten bleiben, dort aber zusätzliche Modifikationen aufweisen.
Weitere lektinhistochemische Untersuchungen werden z. Z. durchgefuhrt, um festzustellen, ob dieses Lektinbindungsmuster auch bei metaplastisch veränderten RPE-Zellen zutrifft, die fibrozyten- oder myofibroblastenahnliche Gestalt angenommen und ihre Melaningranula weitgehend verloren haben. Damit ware eine zytochemische Diagnostik von metaplastisch veranderten RPE-ZeIlen, z. B. in periretinalen Membranen, gegeben, deren sicherer morpho1oischer Nachweis bisher nicht moglich war.
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Dr. S. Bopp Augenklinik der Medizinischen Universitat zu LUbeck Rateeburger Alice 160 D-2400 Li/beck
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502 K/in. Mbl. Augenheilk. 197(1990)
