Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. Ophthal. 199, 121--131 (1976) 9 by Springer-Verlag 1976
Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an kurzzeitkonservierten Hornh/iuten* W o l f g a n g K. W a l l e r , S a d a k i Y o k o t a u n d W o l f g a n g L e y d h e e k e r Augenklinik der Universitgt Wiirzburg (Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c.W. Leydheeker) Eingegangen am 26. November 1975 L i g h t a n d E l e c t r o n Microscopic S t u d i e s on S h o r t - T e r m P r e s e r v e d Corneae
Summary. t%abbit corneae were stored at a temperature of +4~ in the following media: 1. 5% Dextran T40, 2. McCoy's Medium 5a (modified), 3. Dextran T 40d-Mc Coy's 5a Medium + gentamicin sulphate (250 ~g/ml). The endothelia of the eorneae were examined by light and electron microscopy after preservation for a varied number of days. The structure of the endothelia, stored for 1, 6, 12, 18 days, was compared to fresh corneal endothelial cells. The results indicate that corneae preserved in Dextran 5 % T 40 -4-McCoy's 5a Medium dgentamicin sulphate might be equivalent to fresh corneal tissue in keratoplasties. Zusammen/assung. Kaninchenhornh~ute wurden mit einem Sklerarand vom Bulbus abpr~pariert und in verschiedenen Medien bei -~4~ konserviert: in 5% Dextran T 40, in McCoy's 5a Medium (modified), in 5% Dextran T 40 d-McCoy's 5a Medium, in Dextran 5% T 40 + McCoy's 5a Medium-4-Gentamycinsulfat (250 ~xg/m]). Das Hornhautendothel wurde nach 1, 6, 12 und 18 Tagen licht- und elektronenmikroskopisch un%ersucht und verg]ichen mit dem Endothel frischer Kaninchenhornh/~nte und mit dem I-Iornhautendothel yon Bulbi, die in feuchter Kammer bei A-4~ gelagert waren. Die Untersuchungen zeigten, dal3 noeh eine 6-tiigige Lagerung der t{ornhiiute in 5% Dextran T 40 d-McCoy's 5a Medium mit Refobaein | gute Voraussetzungen fiir eine erfolgreiche Keratoplastik bietet. E n u k l e i e r t e B u l b i k S n n e n bei d-4~ in f e u c h t e r K a m m e r n i c h t 1/~nger als 48 h g e l a g e r t werden, wenn d i e t I o r n h a u t noch zur T r a n s p l a n t a t i o n v e r w e n d e t w e r d e n soil (Bito u n d Sa]vador, 1970). Capella, K a u f m a n u n d R o b b i n s (1965) e n t w i c k e l t e n d e s h a l b eine Tiefgefrierm e t h o d e der t t o r n h a u t , die auch a n d e r W i i r z b u r g e r A u g e n k l i n i k zu d e n l%outinev e r f a h r e n gehSrt (Waller, 1973). D a b e i w e r d e n Hornh/~ute i n n e r h a l b 6 h n a c h d e r E n u k l e a t i o n m i t D i m e t h y l s u l f o x i d (DMSO), Saccharose u n d S e r u m a l b u m i n in fliissigem Stickstoff bei - - 1 9 6 ~ gelagert. D a j e d o c h diese M e t h o d e eine S p e z i a l e i n r i c h t u n g erfordert, d a s I t o r n h a u t gewebe a u g e r d e m oftmals i n n e r h a l b d e r e r s t e n W o c h e t r a n s p l a n t i e r t wird, entw i c k e l t e n m e h r e r e A u t o r e n eine K u r z z e i t k o n s e r v i e r u n g d e r t t o r n h a u t . Stocker, L e v e n s o n u n d Georgiade (1963) l a g e r t e n erfolgreich K a n i n c h e n h o r n h/~ute fiber zwei W o c h e n in K a n i n c h e n s e r u m bei d-4~ I m a i z u m i (1968) sehlug ebenfalls eine L a g e r u n g in Serum vor. K u w a h a r a u. Mitarb. (1965) v e r w e n d e t e n eine Salzl6sung m i t Glucose, G l y k o s a m i n o g l y k a n e n u n d Ascorbins/~ure. Mizukgwa (1967) w/~hlte ein N/s m i t TC 199, Glykosaminoglykanen, A d e n o s i n u n d * Mit Unferstiitzung der Stiftung Volkswagenwerk (AZ: 111516).
122
W . K . Waller et al.
A d e n i n . Mit diesen b e i d e n M e t h o d e n k o n n t e m a n erfolgreieh fiber eine W o c h e t t o r n h ~ u t e lagern. S a k i m o t o , Valenti, I t o i u n d K a u f m a n (1974) e n t w i c k e l t e n eine K a m m e r , in d e r Hornh/~ute bei ~ 4 ~ in m o d i f i z i e r t e r K r e b s - R i n g e r l 6 s u n g m i t D e x t r a n bis zu zwei W o e h e n k o n s e r v i e r t w e r d e n k o n n t e n . MeCarey u n d K a u f m a n (1974) ffihrten eine K o n s e r v i e r u n g s m e t h o d e t i n m i t M e d i u m 199 u n d 5% D e x t r a n (M-K-Medium). Noch n a c h 14 T a g e n L a g e r u n g in d i e s e m M e d i u m k o n n t e n effolgreiche K e r a t o p l a s t i k e n durehgeffihrt w e r d e n (Bigar, MeCarey u n d K a u f m a n , 1975 ; S t a r k , M a u m e n e e u n d K e n y o n , 1975 ; A q u a v e l l a , V a n H o r n u n d I t a g g e r t y , 1975). V a n H o r n , Schultz u n d D e B r u i n (1975) l a g e r t e n K a t z e n h o r n h & u t e in M-KM e d i u m (5% D e x t r a n , TC 199) u n d in m o d i f i z i e r t e m M - K - M e d i u m (TC 199, 1% Chondroitinsulfat). A n d e r W i i r z b u r g e r A u g e n k l i n i k w u r d e n v e r s c h i e d e n e Method e n d e r K u r z z e i t k o n s e r v i e r u n g d e r H o r n h a u t u n t e r s u c h t , u m ein V e r f a h r e n zu finden, H o r n h a u t g e w e b e m i n d e s t e n s eine W o c h e lagern zu k6nnen. A u g e r d e m k a n n d a s zweite Auge, d a s bei einer T r a n s p l a n t a t i o n i m O p e r a t i o n s s a a l n i c h t v e r w e n d e t wurde, n i c h t m e h r tiefgefforen werden, d a m e i s t die 6-h-Grenze nach d e r E n u k l e a t i o n fiberschritten ist. S t e h t n u n eine K u r z z e i t k o n s e r v i e r n n g s m e t h o d e zur Verfiigung b r a u c h t dieses zweite Auge n i e h t v e r w o f f e n zu werden.
M a t e r i a l u n d Methode Nach der Enukleation der Bulbi yon New Zealand Albinokaninchen (m~nnlich, 2--3 kg) win'de die Hornhaut mit einem 2 mm breiten Sklerarand vom Bulbus abpr~pariert (aul]er bei Lagerung in feuchter Kammer).
Lagerungsbedingungen 1. Lagerung der Bulbi in feuchter Kammer bei -~4~ 2. Konservierung der Hornhiiute mit SMerarand in a) 5 % Dextran T 40 (Carl Roth, Karlsruhe, BRD). b) McCoy's 5a Medium (modified) (Gibco, Sehottland). c) 5% Dextran T 40--McCoy's 5a Medium. d) 5 % Dextran T 40 • McCoy's 5 a Medium -~ Gentamyeinsulfat (250 ~zg/ml) (E. Merck, Darmstadt, BRD). Die Osmolaritgt yon Medium d. betrug 285 mOsm, der pH 7.4. Die Hornhgute wurden nach 1, 6, 12 und 18 Tagen lieht- und elektronenmikroskopiseh untersueht.
Stru]cturuntersuchungen Alle Hornh~ute wurden in 2,5%igem Glutaraldehyd, gel6st in 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7.4, 480 mOsm), fiir 8 h fixiert; anschliefiend 2real 10 rain in 0,1 M Phosphatpuffer-~ 0,2 M Saecharose (420 mOsm) und fiber Nacht in einer dritten Portion aufbewahrt. Nachfixiert wurde 2 h mit 2%iger Osmiums~ure nach Caulfield (1957) bei ~-4~ und 1 h im 0,5%igen Uranylacetat, gel5st in Veronalacetatpuffer (pH 5,0) im Dunkeln und bei Zimmertemperatur. Die Hornh~ute wurden in der aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und in Epon 812 (Luft, 1961) eingebettet. Das Pr~parateblSckchen wurde an der Trimmeinrichtung TM 60 yon Reichert getrimmt. Ultradfinnschnitte des Hornhautendothels wurden mit dem Diamantmesser yon DuPont am Ultramikrotom Om U 3 yon Reichert gesehnitten. Die Sehnitte wurden auf ein Kupfernetz aufgezogen und mit Uranylaeetat (Watson, 1958) und Bleicitrat (Reynolds, 1963) doppelkontrastiert. Die Prgparate wurden mit dem EM 9-S yon Zeiss untersueht. Semidfinnschnitte wurden mit dem Glasmesser am Ultramikrotom geschnitten, auf einen Objekttri~ger aufgezogen und mit l%igem Toluidin-Blau in l%igem Natriumcarbonat (Mercer und Birbeck, 1966) angefgrbt.
Ultrastruktur kurzzeitkonservierter Hornh~tute
123
Ergebnisse L i c h t m i k r o s k o p i e . Das E n d o t h e l d e r frischen H o r n h a u t ist g l e i c h m a $ i g gef/trbt, Zellschi~den sind n i c h t e r k e n n b a r . (Abb. 1 a). N a c h 6t~giger L a g e r u n g des B u l b u s in feuchter K a m m e r bei + 4 ~ ist das H o r n h a u t e n d o t h e l geschwollen u n d
Abb. 1 a--f. Semidfinnschnitte wurden mit 1%igem Toluidin-Blau angef~rbt. • 150. (a) frische Kaninchenhornhaut. Gleichmal]ige Anf~rbung. (b) Endothel einer Hornhaut, die 6 Tage in feuchter Kammer bei +4~ gelagert wurde. Schwellung und ungleichmal~ige Anf~rbbarkeit. Partielle Zerst6rung des basalen Cytololasmas. (c) Endothel nach 6t~giger Lagerung in 5% Dextran T 40 bei +4~ Inhomogene Anfarbbarkeit. (d) Lagerung in McCoy's 5a Medium 6 Tage bei +4~ Spaltbildungen und Vakuolenbi]dung im Cytoplasma. (e) Endothel nach 6ti~giger Lagerung bei +4~ in McCoy's 5a Medium+Dextran 5% T 40. Spalten in der cytoplasmatischen Matrix sind zu sehen. (f) Endothel nach 6 Tage-Lagerung bei -~4~ in McCoy's 5 a Medium + 5 % Dextran T 40 + Refobacin | (250 ~g/ml). Inhomogene Anfarbbarkeit des Cytoplasma mit wenigen Spalten in der Matrix
124
W.K. Waller et al.
Abb. 2. Endothel einer frisehen Kaninehenhornhaut. Die gesamte Zellstruktur ist erhalten, unter der Zelloberfl~che ist das ,,terminal web" zu sehen (T). Es sind eine ~r oeeludens (Doppelpfeil) und eine lViaeula adhaerens (Pfeil) zu erkennen. Die seitliehen Zellgrenzen sind vielfaeh ineinandergefaltet. (D) Descemet-Membran. (N) Kern. (ER) Endoplasmatisehes I%eticulum. >
Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an kurzzeitkonservierten Hornh/iuten* W o l f g a n g K. W a l l e r , S a d a k i Y o k o t a u n d W o l f g a n g L e y d h e e k e r Augenklinik der Universitgt Wiirzburg (Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c.W. Leydheeker) Eingegangen am 26. November 1975 L i g h t a n d E l e c t r o n Microscopic S t u d i e s on S h o r t - T e r m P r e s e r v e d Corneae
Summary. t%abbit corneae were stored at a temperature of +4~ in the following media: 1. 5% Dextran T40, 2. McCoy's Medium 5a (modified), 3. Dextran T 40d-Mc Coy's 5a Medium + gentamicin sulphate (250 ~g/ml). The endothelia of the eorneae were examined by light and electron microscopy after preservation for a varied number of days. The structure of the endothelia, stored for 1, 6, 12, 18 days, was compared to fresh corneal endothelial cells. The results indicate that corneae preserved in Dextran 5 % T 40 -4-McCoy's 5a Medium dgentamicin sulphate might be equivalent to fresh corneal tissue in keratoplasties. Zusammen/assung. Kaninchenhornh~ute wurden mit einem Sklerarand vom Bulbus abpr~pariert und in verschiedenen Medien bei -~4~ konserviert: in 5% Dextran T 40, in McCoy's 5a Medium (modified), in 5% Dextran T 40 d-McCoy's 5a Medium, in Dextran 5% T 40 + McCoy's 5a Medium-4-Gentamycinsulfat (250 ~xg/m]). Das Hornhautendothel wurde nach 1, 6, 12 und 18 Tagen licht- und elektronenmikroskopisch un%ersucht und verg]ichen mit dem Endothel frischer Kaninchenhornh/~nte und mit dem I-Iornhautendothel yon Bulbi, die in feuchter Kammer bei A-4~ gelagert waren. Die Untersuchungen zeigten, dal3 noeh eine 6-tiigige Lagerung der t{ornhiiute in 5% Dextran T 40 d-McCoy's 5a Medium mit Refobaein | gute Voraussetzungen fiir eine erfolgreiche Keratoplastik bietet. E n u k l e i e r t e B u l b i k S n n e n bei d-4~ in f e u c h t e r K a m m e r n i c h t 1/~nger als 48 h g e l a g e r t werden, wenn d i e t I o r n h a u t noch zur T r a n s p l a n t a t i o n v e r w e n d e t w e r d e n soil (Bito u n d Sa]vador, 1970). Capella, K a u f m a n u n d R o b b i n s (1965) e n t w i c k e l t e n d e s h a l b eine Tiefgefrierm e t h o d e der t t o r n h a u t , die auch a n d e r W i i r z b u r g e r A u g e n k l i n i k zu d e n l%outinev e r f a h r e n gehSrt (Waller, 1973). D a b e i w e r d e n Hornh/~ute i n n e r h a l b 6 h n a c h d e r E n u k l e a t i o n m i t D i m e t h y l s u l f o x i d (DMSO), Saccharose u n d S e r u m a l b u m i n in fliissigem Stickstoff bei - - 1 9 6 ~ gelagert. D a j e d o c h diese M e t h o d e eine S p e z i a l e i n r i c h t u n g erfordert, d a s I t o r n h a u t gewebe a u g e r d e m oftmals i n n e r h a l b d e r e r s t e n W o c h e t r a n s p l a n t i e r t wird, entw i c k e l t e n m e h r e r e A u t o r e n eine K u r z z e i t k o n s e r v i e r u n g d e r t t o r n h a u t . Stocker, L e v e n s o n u n d Georgiade (1963) l a g e r t e n erfolgreich K a n i n c h e n h o r n h/~ute fiber zwei W o c h e n in K a n i n c h e n s e r u m bei d-4~ I m a i z u m i (1968) sehlug ebenfalls eine L a g e r u n g in Serum vor. K u w a h a r a u. Mitarb. (1965) v e r w e n d e t e n eine Salzl6sung m i t Glucose, G l y k o s a m i n o g l y k a n e n u n d Ascorbins/~ure. Mizukgwa (1967) w/~hlte ein N/s m i t TC 199, Glykosaminoglykanen, A d e n o s i n u n d * Mit Unferstiitzung der Stiftung Volkswagenwerk (AZ: 111516).
122
W . K . Waller et al.
A d e n i n . Mit diesen b e i d e n M e t h o d e n k o n n t e m a n erfolgreieh fiber eine W o c h e t t o r n h ~ u t e lagern. S a k i m o t o , Valenti, I t o i u n d K a u f m a n (1974) e n t w i c k e l t e n eine K a m m e r , in d e r Hornh/~ute bei ~ 4 ~ in m o d i f i z i e r t e r K r e b s - R i n g e r l 6 s u n g m i t D e x t r a n bis zu zwei W o e h e n k o n s e r v i e r t w e r d e n k o n n t e n . MeCarey u n d K a u f m a n (1974) ffihrten eine K o n s e r v i e r u n g s m e t h o d e t i n m i t M e d i u m 199 u n d 5% D e x t r a n (M-K-Medium). Noch n a c h 14 T a g e n L a g e r u n g in d i e s e m M e d i u m k o n n t e n effolgreiche K e r a t o p l a s t i k e n durehgeffihrt w e r d e n (Bigar, MeCarey u n d K a u f m a n , 1975 ; S t a r k , M a u m e n e e u n d K e n y o n , 1975 ; A q u a v e l l a , V a n H o r n u n d I t a g g e r t y , 1975). V a n H o r n , Schultz u n d D e B r u i n (1975) l a g e r t e n K a t z e n h o r n h & u t e in M-KM e d i u m (5% D e x t r a n , TC 199) u n d in m o d i f i z i e r t e m M - K - M e d i u m (TC 199, 1% Chondroitinsulfat). A n d e r W i i r z b u r g e r A u g e n k l i n i k w u r d e n v e r s c h i e d e n e Method e n d e r K u r z z e i t k o n s e r v i e r u n g d e r H o r n h a u t u n t e r s u c h t , u m ein V e r f a h r e n zu finden, H o r n h a u t g e w e b e m i n d e s t e n s eine W o c h e lagern zu k6nnen. A u g e r d e m k a n n d a s zweite Auge, d a s bei einer T r a n s p l a n t a t i o n i m O p e r a t i o n s s a a l n i c h t v e r w e n d e t wurde, n i c h t m e h r tiefgefforen werden, d a m e i s t die 6-h-Grenze nach d e r E n u k l e a t i o n fiberschritten ist. S t e h t n u n eine K u r z z e i t k o n s e r v i e r n n g s m e t h o d e zur Verfiigung b r a u c h t dieses zweite Auge n i e h t v e r w o f f e n zu werden.
M a t e r i a l u n d Methode Nach der Enukleation der Bulbi yon New Zealand Albinokaninchen (m~nnlich, 2--3 kg) win'de die Hornhaut mit einem 2 mm breiten Sklerarand vom Bulbus abpr~pariert (aul]er bei Lagerung in feuchter Kammer).
Lagerungsbedingungen 1. Lagerung der Bulbi in feuchter Kammer bei -~4~ 2. Konservierung der Hornhiiute mit SMerarand in a) 5 % Dextran T 40 (Carl Roth, Karlsruhe, BRD). b) McCoy's 5a Medium (modified) (Gibco, Sehottland). c) 5% Dextran T 40--McCoy's 5a Medium. d) 5 % Dextran T 40 • McCoy's 5 a Medium -~ Gentamyeinsulfat (250 ~zg/ml) (E. Merck, Darmstadt, BRD). Die Osmolaritgt yon Medium d. betrug 285 mOsm, der pH 7.4. Die Hornhgute wurden nach 1, 6, 12 und 18 Tagen lieht- und elektronenmikroskopiseh untersueht.
Stru]cturuntersuchungen Alle Hornh~ute wurden in 2,5%igem Glutaraldehyd, gel6st in 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7.4, 480 mOsm), fiir 8 h fixiert; anschliefiend 2real 10 rain in 0,1 M Phosphatpuffer-~ 0,2 M Saecharose (420 mOsm) und fiber Nacht in einer dritten Portion aufbewahrt. Nachfixiert wurde 2 h mit 2%iger Osmiums~ure nach Caulfield (1957) bei ~-4~ und 1 h im 0,5%igen Uranylacetat, gel5st in Veronalacetatpuffer (pH 5,0) im Dunkeln und bei Zimmertemperatur. Die Hornh~ute wurden in der aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und in Epon 812 (Luft, 1961) eingebettet. Das Pr~parateblSckchen wurde an der Trimmeinrichtung TM 60 yon Reichert getrimmt. Ultradfinnschnitte des Hornhautendothels wurden mit dem Diamantmesser yon DuPont am Ultramikrotom Om U 3 yon Reichert gesehnitten. Die Sehnitte wurden auf ein Kupfernetz aufgezogen und mit Uranylaeetat (Watson, 1958) und Bleicitrat (Reynolds, 1963) doppelkontrastiert. Die Prgparate wurden mit dem EM 9-S yon Zeiss untersueht. Semidfinnschnitte wurden mit dem Glasmesser am Ultramikrotom geschnitten, auf einen Objekttri~ger aufgezogen und mit l%igem Toluidin-Blau in l%igem Natriumcarbonat (Mercer und Birbeck, 1966) angefgrbt.
Ultrastruktur kurzzeitkonservierter Hornh~tute
123
Ergebnisse L i c h t m i k r o s k o p i e . Das E n d o t h e l d e r frischen H o r n h a u t ist g l e i c h m a $ i g gef/trbt, Zellschi~den sind n i c h t e r k e n n b a r . (Abb. 1 a). N a c h 6t~giger L a g e r u n g des B u l b u s in feuchter K a m m e r bei + 4 ~ ist das H o r n h a u t e n d o t h e l geschwollen u n d
Abb. 1 a--f. Semidfinnschnitte wurden mit 1%igem Toluidin-Blau angef~rbt. • 150. (a) frische Kaninchenhornhaut. Gleichmal]ige Anf~rbung. (b) Endothel einer Hornhaut, die 6 Tage in feuchter Kammer bei +4~ gelagert wurde. Schwellung und ungleichmal~ige Anf~rbbarkeit. Partielle Zerst6rung des basalen Cytololasmas. (c) Endothel nach 6t~giger Lagerung in 5% Dextran T 40 bei +4~ Inhomogene Anfarbbarkeit. (d) Lagerung in McCoy's 5a Medium 6 Tage bei +4~ Spaltbildungen und Vakuolenbi]dung im Cytoplasma. (e) Endothel nach 6ti~giger Lagerung bei +4~ in McCoy's 5a Medium+Dextran 5% T 40. Spalten in der cytoplasmatischen Matrix sind zu sehen. (f) Endothel nach 6 Tage-Lagerung bei -~4~ in McCoy's 5 a Medium + 5 % Dextran T 40 + Refobacin | (250 ~g/ml). Inhomogene Anfarbbarkeit des Cytoplasma mit wenigen Spalten in der Matrix
124
W.K. Waller et al.
Abb. 2. Endothel einer frisehen Kaninehenhornhaut. Die gesamte Zellstruktur ist erhalten, unter der Zelloberfl~che ist das ,,terminal web" zu sehen (T). Es sind eine ~r oeeludens (Doppelpfeil) und eine lViaeula adhaerens (Pfeil) zu erkennen. Die seitliehen Zellgrenzen sind vielfaeh ineinandergefaltet. (D) Descemet-Membran. (N) Kern. (ER) Endoplasmatisehes I%eticulum. >
