Planta (BEE.) 111, 187--198 (1973) 9 by Springer-Verlag 1973

Zur Lokalisation von Dehydrogenasen des Energiestoffwechsels im Phloem yon Cucurbita pepo L. Johannes Lehmann Botanisches Institnt der Universit~it Kiel, Lehrstuhl fiir Zellbiologie D-2300 Kiel, Federal Republik of Germany Eingegangen am 13. Dezember 1972/8. Januar 1973 Localization of Dehydrogenases of E n e r g y Metabolism i n the P h l o e m of Cucurbita pepo L.

Summary. I n the stem phloem of Cucurbita pepo the enzymes GAPDH, ADtt, ~II)H, NADP-IDH, NAD-IDH, GsPDH and SDH were localized histechemically with the aid of tetrazolium salt (NBT). When the stems were deep-frozen the most intense formation of formazan was found in companion cells, less in phloem parenehyma cells, and very little in sieve tubes. The distribution of enzymes in phloem markedly changes when stems were cut 2 minutes before freezing: 2,5 cm behind the sectional area little formazan was found. Companion cells and parenchyma cells had lost nearly all activity. 15 cm behind the sectional area there was again a higher concentration of formazan in the companion cells and parenchyma cells. In this region an even higher activity was detected in sieve tubes. 25-30 cm behind the sectional area the distribution of formazan was nearly the same as in the intact stems. Apparently activities of the enzymes tested primarily occur in the companion cells and parenchyma cells only. After wounding they are translocated into sieve tubes or exudate.

Einleitung SiebrShren, Geleit- u n d P a r e n e h y m z e l l e n sowie h~ufig auch Skler e n e h y m e l e m e n t e bilden gemeinsam das Angiospermenphloem, i n n e r h a l b dessen der F e r n t r a n s p o r t der Assimilate erfolgt. Die eigentliehen Transp o r f b a h n e n , die SiebrShren, sind gegeniiber a n d e r e n Zellen durch eine A n z a h l cytologiseher Besonderheiten charakterisiert. So versehwindet im Verlauf ihrer Ausdifferenzierung der Zellkern u n d der Tonoplast (s. Esau, 1969), w~hrend Mitochondrien u n d P l a s t i d e n aueh i m F u n k t i o n s z u s t a n d noeh v o r h a n d e n sind (s. Schumacher, 1967, p. 80if). I n den Geleitzellen werden diese V e r ~ n d e r u n g e n n i e h t beobaehtet, deshalb liegt die Verm u t u n g nahe, da~ sic a u f g r u n d der engen ontogenetischen u n d r s V e r b i n d u n g zu d e n SiebrShrengliedern a n deren stoffwechselphysiologisehen Versorgung u n d Steuerung teflhaben. 13

Planta (Berl.),Bd. iii

188

J. Lehmann:

E i n b l i c k e in d e n Stoffwechsel d e r L e i t g e w e b e w u r d e n d u r c h U n t e r suchung~n y o n E x s u d a t e n (Zieg]er u n d Mittler, 1959; G a r d n e r u n d Peel, 1971 ; B e c k e r et al., 1971 ; K e n n e c k e et al., 1971), L e i t b i i n d e l h o m o g e n a t e n (Ziegler, i 9 5 8 ; K u r s a n o w , 1 9 6 3 ) u n d Schnittpr/~paraten (Frey, 1954) erzielt. N e b e n d e r U n t e r s u e h u n g der m i k r o s k o p i s c h e n u n d s u b m i k r o s k o pischen S t r u k t u r (s. Esau, 1969) sowie des T r a n s p o r t g u t e s (s. Schureacher, 1967, p. 106if; Z i m m e r m a n n , 1971, p. 238ff), sind Messungen der E n z y m a k t i v i t ~ t e n u n d ihre cellul~re L o k a l i s a t i o n i m P h l o e m d e s h a l b y o n B e d e u t u n g , well sie H i n w e i s e auf stoffwechselphysiologische Leis t u n g e n einzelner Z e l l t y p e n geben kSnnen. So f a n d e n F r e y (1954), Eschrich et al. (1971), Ullrich (1961) u n d K e n n e c k e et al. (1971), d a b eine g r S ] e r e Z a h l y o n e n z y m a t i s c h e n U m setzungen i m L e i t g e w e b e bzw. i m P h l o e m e x s u d a t mSglich sind. U b e r die Verteflung y o n E n z y m e n i m Phloem, nachgewiesen m i t histochemischen Methoden, sind d a g e g e n weniger B e o b a c h t u n g e n m i t g e t e f l t w o r d e n (Frey, 1954; L e s t e r a n d E v e r t , 1965; S a u t e r u n d Braun, 1972). I n der hier vorliegenden U n t e r s u c h u n g w i r d fiber die L o k a l i s a t i o n y o n E n z y m e n des Energiestoffwechsels i m P h l o e m y o n Cucurbita pepo b e r i c h t e t . Aufierdem w e r d e n E r g e b n i s s e besehrieben, die tiber die cellul~tre H e r k u n f t d e r i m P h l o e m e x s u d a ~ nachgewiesenen E n z y m e Ausk u n f t g e b e n kSnnen. Material und Methode Untersucht wurde das Sprol~phloem von Cucurbita pepo L. Die Pflanzen wuchsen bei Langtagbedingungen in einem Gew~ehshaus. Der Untersuehungszeitraum erstreekte sieh fiber die Monate Dezember bis Februar. Die Versuche wurden in zwei Gruppen unter~eilt. In der ersten Versuehsgruppe wurden ausschlieBlieh Pflanzen verwendet, die unverletzt waren. Von ihnen wurden zun~chst 10 und 20 em unterhalb des SproBvegetationspunktes Absehnitte mit CO2-Sehnee eingefroren und erst d~nn yon der fibrigen Pflanze abgetrennt. In der zweiten Gruppe wurden Pflanzen benutzt, die 2 rain vor dem Einfrieren yon Sprol~bsehnitten 45--50 cm unterhalb des Vegetationspunktes abgesehnitten wurden. An diesen Sprossen sind drei Zonen histochemisch untersucht worden: 2,5 em, 15 und 25--30 em yon der Anschnittstelle entfernt. Die Zeit zwisehen Abschneiden und Einfrieren wurde mit 2 min konstant eingehalten. Das w~hrend dieser Zeit austretende Phloemexsudat wurde fiber den Leitbfindeln mit CelluloseAcetat-Folie (Fa. Schleieher & Schfill) aufgesaugt und den gleichen Enzymversuehen unterworfen, wie sie auch an den Phloemsehnitten durchgeftihrt wnrden. Die etwa 1 cm langen SproI3abschnitte wurden in einem Kryostaten (System Dittes-Duspiva) bei einer Schneidetemperatur yon --23~ 16--26 ~m dick geschnitten. Die Schnitte wurden auf Deekgl~schen gelegt, durch Auftauen gestreckt und danach wenige Minuten an der Luft getroeknet. Zum histoehemisehen Nachweis wurden die Deekgl~schen mit dem Schnitt naeh unten auf einen Tropfen des ffir das jeweils zu priifende Enzym spezifisehen Reaktionsgemisehes gelegt. AnseMie2end wurde bei 37 ~ C inkubiert.

Lokalisation von Dehydrogenasen im Phloem

189

Bei der Zusammenste]lung der t~eaktionsmedien wurde auf die Arbeiten yon Pette und Brandau (1966) und Pearse (1961) zurfckgegriffen. Nachfolgend slnd die einzelnen Reaktionsgemisehe aufgeffihrt. Die angegebenen Konzentrationen sind die millimolaren (raM) Endkonzentratlonen im gesamten Testansatz.

Glycerinaldehyd-3-Phophat-Dehydrogense (GA PDH ) E.C. 1.2.1.12 TriS~thanolamin-HC1-Puffer (TRAP), pH 7,6, 50mM, EDTA 5mM, NaeHAs04 2 mM, NAD 1,8 mM, Glycerinaldehyd-3-Phosphat 3 mM, 2,2'-di-(p-nitrophenyl)5,5'- diphenyl - 3,3' (3,3"dimethoxy - 4,4'biphenylen)- ditetrazolium - chlorid (NBT) 1,5 mM, Phenazin-methosulfat (PMS) 0,1 mM, Glutathion 1,2 raM. Inkubationszeit: l0 min.

Alkohol-Dehydrogenase (ADH)

E.C. 1.1.1.1

Na-Pyrophoaphat 50 mM, Semicarbazid 35 mM, Glyein 15 raM, J~thanol 10 mM, NAD 1,8 mM, RIBT 1,5 mM, PMS 0,1 raM. pH 8,7 Inkubationszeit 10 rain.

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH )

E.C. 1.1.1.49

TRAP pH 7,6 50 mM, EDTA 5 raM, Glucose-6-Phosphat 15 mM, NADP 1,4 raM, NBT 1,5 raM, PMS 0,1 mM. Inkubationszeit 15 rain.

NADP-Isocitrat-Dehydrogenase (NADP-IDH) TRAP pH 7,6 50mM, EDTA 5 raM, MgSO~ 8mM,

E.C. 1.1.1.42

d,l-Isocitrat 16 mM, NADP 1,4 mM, NBT 1,5 mM, PMS 0,1 raM. Inkubationszeit 25 min.

NAD-Isocitrat-Dehydroqenase (NAD-IDH)

E.C. 1.1.1.41

TRAP pH 7,6 50 mM, EDTA 5 mM, MgSO4 8 mM, d,l-Isocitrat 16 mM, Glutathion 4,8 mM, NAD 1,8 mM, ADP 4 mM, NBT 1,5 raM, PlgS 0,1 mM. Inkubationszeit 30 rain.

Malat-Dehydrogenase (MDH)

E.C. 1.1.1.37

TRAP pH 7,6 50 raM, EDTA 5 mM, d,]-Apfels~iure 60 mM, NAD ],8 mM, NBT 1,5 mM, PMS 0,1 mM. Inkubationszeit 10 rain.

Succinat-Dehydrogenase (SDH)

E.C. 1.3.99.1

Na-K-Phosphat-Puffer pH 7,2 100 mM, EDTA 2 n~I, Na-Succinat 50 mM, KCN 1,2 mM, NBT 1,5 mM, PMS 0,1 mM. Inkubationszeit 60 rain. Der entstandene blau-violette Niederschlag wurde nur dann als Zeiehen yon Enzymaktivit~t gewertet, wenn in parallel angesetzten Testreihen, die kein umsetzbares Substrat enthielten, die Diformazanbildung betr~chtlich geringer ausfie]. Die mikroskopisehe Auswertung der Schnitte erfolgte unmittelbar im AnschluB an die Inkubation. 13"

190

J. Lehmann:

Ergebnisse I. Untersuchungen am Phloem unverletzter P/lanzen Die sieben getesteten Dehydrogenasen aus den Stoffwechselwegen der Glykolyse, Gi~rung, Pentose-Phosphat- und Citrat-Cyclus sind in den einzelnen Zelltypen des Phloems nicht mit gleicher Aktivit&t nachzuweisen. Aul~erdem bestehen Untersehiede zwischen cytoplasmatiseh lokalisierten Enzymen (vg]. Pette, 1965; Pette und Brandau, 1966) und jenen, die an partikul~re Strukturen gebunden sind (s. u.). Aktivit~ten der eytoplasmatisch lokalisierten Enzyme G A P D H (Abb. 1), A D H (Abb. 3 und 6), N A D P - I D H , M D H und G6PDH sind im gesamten Phloem vorzufinden. Die Diehte des Formazanniederschlages unterseheidet sieh jedoch in den einzelnen Zelltypen (Abb. 1 und 3). Die grSI~ten Mengen an Formazan entstehen stets in den Geleitzellen. I n den SiebrShren wird dagegen nur i~ul~erst wenig Formazan gefunden (Abb. 3). I n den Phloemparenchymzellen sind die Formazanbildungen wieder sti~rker (Abb. 5). Da aus der Reaktionssti~rke, unter Berficksichtigung der Reaktionszeit, auf die vorliegende Enzymaktiviti~t rfiekgesehlossen werden kann (s. Arnold, 1968, p. 80if), n i m m t die Aktivit~t der genannten fiinf Enzyme yon der SiebrShre fiber die Phloemparenchymzelle zur Geleitzelle hin sprunghaft zu. Dureh zwei Kontrollreaktionen wird die Bildung der dichten Formazanniederschli~ge aufgrund yon Enzymaktiviti~ten im Phloem gesichert: 1. Die Inkubation yon Sehnitten in Reaktionsmedien, die mit Ausnahme der enzymspezifischen Substrate alle Komponenten enthalten, ergeben nur sehr sehwache Formazanniedersehl~ge; 2. der Zusatz yon p-Chlormercuribenzoat (p-CMB), in einer Konzentration yon 0,5 mM zum vollst~ndigen Reaktionsgemiseh, ffihrt ebenfalls nur zu einer niedrigen Formazanbildung. Sie entsprieht vollkommen der vorgenannten Kontrollreaktion. Die beiden Enzyme SDH und N A D - I D H sind vergleichenden Untersuehungen an tierischen Geweben zufolge ausschlie]Mieh in den Mitoehondrien lokalisiert (Goebell und Klingenberg, 1964; Pette und Brandau, 1966). Aueh bei U. pepo werden Aktivit~ten nur an partikul~ren Strukturen beobachtet.

Abb. 1. L~ngsschnitt durch das Phloem eines unverletzt eingefrorenen Sprosses. Nachweis der GAPDH: dichte Formazanniederschl~ge in den Geleitzellen (G), geriugere in den Parenchymzellen (P). In den SiebrShren (S) nur ~ullerst wenig Formazan. X 600 Abb. 2. L~ngsschnitt dureh das Phloem eines angeschnittenen Sprosses (2,5 em yon der Ansehnittstelle entfernt). Der Nachweis der GAPDH ist mit Ausnahme einer Geleitzelle (G) in allen anderen Zellen sehr sehwaeh. X 500

Lokalisation yon Dehydrogenasen ira Phloem

191

Abb. 3. Naehweis der A D H in Geleitzellen (G) und SiebrShrengliedern (S) aus dem Phloem unverletzg eingefrorener Pflanzen. Sehr geringe Aktivitgt im ,,wandstgndigen '~ Plasma (Pfeil). • 1700 Abb. 4. Nachweis der A D H im Bereich 2,5 cm yon der Schni~tstelIe en~fernt. I n der Parenehyrazelle (P) sind die st~rksten Formazanniederschlage vorhanden, in Gleitze]le u n d SiebrShre (S) n u r geringe Mengen. • 1300

Abb. 5. Naehweis der G6PDI-I im Phloem unverletzt eingefrorener Sprosse. I n der Geleitzelle (G) sehr hohe Aktivit~it, wesentlich geringer in der Parenchymzelle (P) und sehr schwach in der SiebrShre (S). • 700 Abb. 6. Querschnitt durch eine SiebrShre (S), m i t Aufsicht auf eine Siebplatte, Gelei~zel]e (G) u n d Parenchymze]len (P). Aktivit~it der A D H n u t in der Geleitzelle u n d in den Parenchymzellen. • 1600 Abb. 7. Nachweis der ~ D H in einer Entfernung yon 25--30 cm yon der Schnittstelle. Hohe Aktivit~it in der Geleitzelle (G), dagegen n u r diffus verteflte FormazanniederschUige in der SiebrShre (S). • 1350

J. Lehmann: LokMisation yon I)ehydrogenasen im Phloem

193

I m Phloem der unverletzten Sprosse werden die SDH und N A D - I D H nut in den Geleitzellen und im Phloemparenchym nachgewiesen. In den Siebr6hren werden keine lokal auftretenden, st/~rkeren Formazanbildungen gesehen. Diffus auftretende, sehwaehe F~rbungen erfiillen nieht die Kriterien eines positiven histochemisehen Enzymnaehweises. Daher liegt ein Fehlen der SDH und der N A D - I D H in den Siebr6hren sehr nahe. Die Enzymverteilung in den beiden untersuchten Sprol]abschnitten (10 und 20 cm unterhalb des Vegetationspunktes) unterseheiden sich bei keiner der gepriiften Dehydrogenasen. Ebenfalls identisch sind die Verteilungen in Langs- a n d Querschnitten (Abb. 6). I I . Untersuchungen am Phloem angeschnittener P]lanzen Nach einer Exsudationszeit von 2 rain werden die Enzymaktivit~ten, abh~ngig yon der Entfernung zur Anschnittstelle, nicht mehr in der gleiehen Form im Phloem verteilt gefunden, wie das fiir den unverletzt eingefrorenen SproB beschrieben wurde. 2,5 cm yon der Schnittstelle entfernt sind nur noch sehr geringe Formazanniederschl~ge in allen Phloemelementen zu linden (Abb. 2). Der Vergleieh zu den Kontrollreaktionen zeigt, dab das tats~chlieh auf sehr niedrigen Aktivit/~ten in dieser Zone beruht. Von dem ausgesprochen grogen Aktivit/~tsverlnst sind besonders die Geleitzellen erfagt. Nut in sehr seltenen Fallen werden einzelne Geleitzellen angetroffen, die noeh, wie in Abb. 2 dargestellt, grSfiere Mengen an Formazan beinhalten. Die Aktivitgten in den Phloemparenchymzellen sind gleichfalls erheblich vermindert, doch haben gerade sic noeh die h6chsten Aktivit/~ten im Bereieh der Sehnittstelle (Abb. 4). I n den Siebr6hren ist eine nut nnwesentlieh tiber die Kontrollen hinausgehende Farbtiefe zu sehen. Besonders hoeh sind die Aktivit/~tsverluste yon cytoplasmatiseh lokalisierten Enzymen (GAPDH, ADH, N A D P - I D H , MDH, G6PDH ). Die partikelgebundenen Enzyme SDH und N A D - I D H werden nieht so stark beeiniluBt. Die histoehemisehen Naehweise zeigen jedoeh auch hier einen deutlich siehtbaren Aktivit/~tssehwund. Die an granul/tren Struktnren abgelagerten Formazanmengen sind in den Parenchym- und Geleitzellen wesentlieh geringer als in den yon unverletzten Pflanzen stammenden Pr/~paraten. Die Auswirknngen einer Phloemverletzung, kenntlich an den niedrigen Enzymaktivit/~ten in den Geleit- und Parenehymzellen, lassen sieh his zu einer Zone zwischen 30 und 35 em sproflaufwgrts feststellen. Diese beeinflugte Streeke zeigt ~hnlichkeit mit dem yon Weatherley et al. (1959) als ,contributory length' bezeiehneten Bereich bei Salix viminalis. Der zweite untersuchte Sprogabschnitt - - 15 cm yon der Ansehnittstelle

194

J. Lehmann: GZ

SR

PZ

~

2 5 - 3 0 cm

~ ~;.:~

...,.:,::,...

. . . . . .-. 9

ANSCHNITTSTELLE

2,5cm

9

Abb. 8. Naehweis yon ADtt in einer SiebrShre (S), die Geleitzelle besitzt keine Aktivit~t. Entfernung zur Ansehnitts~elle 15 em. >< 1000 Abb. 9. Schematisehe Derstellung fiber die Verteilung der eytoplasmatiseh lokalisierten Enzyme GAPDH, ADH, NADP-IDH, MDH und G6PDH im Phloem in Abhgngigkeit yon der Entfel~aung zur Anschnittstelle. Die Diehte der Punktierung soll die Aktivit/it in Geleitzellen (GZ), SiebrShren (SR) und Parenehymzellen (PZ) widerspiegeln

e n t f e r n t - - liegt d a m i t e t w a in der M i t t e des EinfluBbereiches. A u c h hier m a c h e n sich noch s t a r k e Aktivit/~tsverluste b e m e r k b a r . Gegenfiber d e r 2,5 cm-Zone werden jedoch schon h/~ufiger Geleitzellen angetroffen, die keinen oder doeh n u r einen geringen A k t i v i t ~ t s v e r l u s t d e r cytop l a s m a t i s e h lokalisierten E n z y m e aufweisen. Zahlenm~Big tiberwiegen n o c h die Zellen, die n a h e z u alle A k t i v i t g t verloren haben. Besonders h e r v o r z u h e b e n i s t ~ber fiir diesen Bereieh d a s V o r k o m m e n y o n hSheren A k t i v i t g t e n cy~oplasmatisch lokglisierter E n z y m e in d e n SiebrShren (Abb. 8). N u r in diesem m i t t l e r e n Bereieh w u r d e diese wesentlieh fiber die K o n t r o l l w e r t e h i n a u s g e h e n d e F o r m a z a n b i l d u n g in d e n SiebrShren b e o b a e h t e t .

Lokalisation yon Dehydrogenasen im Phloem

195

Die Aktivit~ten der SDH und I~AD-IDH sind in den Geleit- und Parenchymzellen der gleiehen Zone etwas erniedrigt, wie der Vergleich mit unverletzten Pflanzen zeigt. Doch iibt das Ansehneiden 15 cm yon der Schnittstelle entfernt nicht mehr den grol~en Einflu[~ aus, wie er flit die nicht strukturgebundenen Enzyme zu verzeichnen war. Gegen das Ende des Einflul~bereiches (25---30 cm) sind Enzymverluste nur noch sehr vereinzelt zu beobachten. Hier entspricht die Aktiviti~tsverteilung aller untersuchter Enzyme weitgehend der der an unverletzten Pflanzen. In den SiebrShIen werden keine wesentlich iiber die Kontrollen hinausgehenden Formazanniedersehli~ge mehr angetroffen (Abb. 7). In Abb. 9 sind alle Befunde, auch die, die hier nicht durch Abbildungen belegt werden, zusammenfassend dargestellt. Die Dichte der Punktierung soll die Aktiviti~t aller cytoplasmatiseh lokalisierter Enzyme in den drei untersuchten SproBzonen wiedergeben. Sie soll einem Mittelweft vergleichbar sein, yon dem Einzelbeobachtungen verschieden stark abweichen kSnnen. I I I . Untersuchungen am Phloemexsudat

Die Inkubation des in Cellulose-Acetat-Folie aufgesaugten Exsudates mit den Testmedien fiihrt zuns bei allen sieben Dehydrogenasen zu einer positiven Reaktion. Sie unterscheidet sich jedoch in der Intensit~t der Formazanbildung zwischen den cytoplasmatisch und den partikul~r lokalisierten Enzymen. Auch in den Kontrollreaktionen, in denen die enzymspezifischen Substrate weggetassen wurden, kommt es zu einem ausgepr~gten Formazanniederschlag. Das erschwert ein sicheres Erkennen yon Enzymaktivit~ten; deshatb sind die Enzyme mit p-CMB gehemmt worden. Trotz der Inhibierung erfolgt dennoch eine Farbstoffbildung, die hier wie bei den anderen Kontrollversuchen nach kurzer Zeit zum Stillstand kommt. Diese Formazanmengen sind nicht durch Enzymaktivit~ten hervorgerufen worden. Werden die Enzyme nicht gehemmt und mit dem vollsti~ndigen Reaktionsmedium inkubiert, so sehreitet die l~ormazanbildung bei den cytoplasmatisch lokalisierten Enzymen stetig fort. Die Farbtiefe wird immer starker als bei den beiden Kontrollen. Danaeh sind die GAPDH, ADH, NADP-IDH, MDH und G~PDH im Exsudat vorhanden. Im Test auf die SDH wird aueh nach l~ngerer Inkuba~ionszeit keine zus~tzliche Formazanbildung festgestellt. Fiir die NAD-IDH gilt dieses nicht uneingeschri~nkt. Hier kommt es zu einer zwar sehr langsamen, aber doch merklich zunehmenden Formazanbildung. Eine Abwesenheit der NAD-IDH kann daher nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden. Das Vorhandensein der SDH kann dagegen wohl verneint werden.

196

J. Lehmann: Oiskussion

Die histochemische Technik besitzt gegeniiber biochemischen Arbeitsweisen den Vorteil der direkten cellul/iren und intraeellul&ren Lokalisation der untersuchten Reaktionen. Jedoch bedarf es bei der Tetrazolium-Technik der Vermittlung yon ,Tetrazolium-Reductasen', um den Wasserstoff einer Dehydrogenase-Reaktion auf das benutzte Tetrazoliumsalz zu iibertragen (vgl. Pette und Brandau, 1966). Die ,Tetrazolium-Rednctasen' sind vor allem in den Mitochondrien and am endoplasmatischen l~eticulum (n~ikrosomale Tetrazolinm-I~eductase) vorh~nden. Im Hil~blick auf die fragliche Funktionstiiehtigkeit der Mitochondrien in den SiebrShren (s. Schumacher, 1967, p. 80ff) wiirde trotz der m6glicherweise vorhandenen I)ehydrogenasen nut ein geringer Formazanniedersehlag zu erwarten sein. Deshalb ist den l~eaktionsgemischen PMS zugefiigt worden, das als/~edox-Mediator in der gleichen Weise wirkt, wie endogen vorhandene ,Tetrazolium-Reductasen'. Die beschriebene Verteilung der Enzyme im Phloem diirfte somit der wirklichen Aktivit~tsverteilung der Dehydrogenasen entsprechen. Die histoehemische Lokalisution yon Enzymen in unfixierten Sehnit~en schliegt eine durch Diffusion bedingte Verlagernng nicht aus. Zwar werden ffir die Beurteilungen der Aktivit~ten in den einzelnen Phloemelementen ausschlie21ich unangeschnittene Zellen herangezogen (Ausnahme: Querschnitte), doch k6nnten insbesondere sehr niedrige Aktivit/~ten, wie in den Siebr6hren, trotzdem pr~parationsbedingte Ursachen haben. Die groBen Aktivi~iitsuntersehiede in den einzelnen Zelltypen des Phloems lassen diesen Einwand jedoch sehr unwahrscheinlich werden. Nach der benutzten Methode kSnnen die Unterschiede in der Aktivit/~t so interpretiert werden: die Geleitzellen abet auch die Parenchymzellen sind aufgrund der h6heren Enzymaktivit/iten vorrangig am Energiestoffweehsel des gesamten Phloems beteiligt. Die Siebr6hren wtirden, wenn sie iiberhanpt die hier untersuehten Enzyme enthalten, nut einen sehr geringen Beitrag leisten k6nnen. Wesen~liche Voraussetzung zur Konservierung dieser, m6glicherweise als ,normal' zu bezeichnenden Enzymverteilung ist das schnelle Einfrieren yon Sprol3abschnitten aus unverletzten Pflanzen. Der tiefgreifende Einflufl einer Verletzung yon Leitelementen wird dureh den enormen Aktivit/~tsschwund in unmittelbarer N~he der Anschnittstelle besonders deutlich. Der Enzymverlust der Geleitzellen und, wenn auch im geringeren MaBe, der Parenchymzellen beruht mit grol~er Wahrscheinliehkeit auf einer Verlagerung in die SiebrShren. Aus diesen gelangen sic dann ins Exsudat. Fiir diese Vorstellung spreehen insbesondere die h6heren Aktivit~ten in den Siebr6hren der 15 cm-Zone.

Lokalisation von Dehydrogenasen im Phloem

197

Aktiviti~ten der gleichen GrSBenordnung sindin SiebrShren der unverletzt eingefrorenen Pflanzen niemals gefunden worden. Eine Verlagerung yon Enzymen in die SiebrShren aus den Geleitzellen scheint leichter zu erfolgen, als aus den Parenehymzellen. Die folgende Beobachtung gibt AnlaB zu dieser Annahme: in unmittelbarer N~he der Schnittstelle bflden die Parenchymzellen sehr hgnfig mehr Formazan als die Geleitzellen. Auch wenn Parenchymzellen unmittelb~r an Siebr6hren grenzen, ist der AktivitS,tsverlust oftmals nicht so groB wie in den Geleitzellen (Abb. 4). Dagegen wurden keine Anhaltspunkte dafiir gefunden, dab cytoplasmatisch lokalisierte Enzyme in unterschiedlichem AusmaB aus den Parenchym- bzw. Geleitzellen in die Siebr6hren iibertreten. Die groBen Enzymverluste der Geleitzellen sind, zumindest unter den Bedingungen des Experiments, mit Sicherheit als pathologiseh zu betrachten. Dariiber hinaus bleibt aber die Frage naeh in vivo auftretenden Enzymtranslokationen zwischen Geleitzellen und Siebr6hren unbean~wortet. Die sehr geringen, auf Enzymwirkungen beruhenden Formazanniedersehli~ge in den Siebr6hren diirfen nieht nnehlgeschr~nkt als ein derartiger Hinweis bewertet werden. Far sie k6nnen artifizielle Verlagernngen wghrend der Praparation und der Inknbation nieht sieher ausgeschlossen werden. Ob weiterhin ein EinfluB auf die Aktivitat der einzelnen Enzyme dutch die im Verlauf der Exsudation eintretende Verlagerung ausgeiibt wird, war dureh die Untersuehungen nieht zu kl~ren. Doch sprechen die Aktivitgtsminderungen der partikelgebnndenen Enzyme fiir eine sotche M6gliehkeit. Zu welehen spezifisehen enzymatischen Leistungen die Siebr6hren bef~higt sind, bleibt welter ungekl~rt. Die gezeigten Enzymverteilungen im Phloem yon C. pepo deuten zuni~chst lediglich auf eine Vorrangstellung der Geleit- und Parenehymzellen im Energiestoffwechsel hin.

Literatur Arnold, M. : Histochemie, S. 80--86. Berlin-Heidelberg-New York: Springer 1968. Becker, D., Kluge, M., Ziegler, tt. : Der Einbau yon a2PO~in organisehe Verbindungen durch SiebrShrensaft. Planta (Berl.) 99, 154--162 (1971). Esau, K. : The phloem. In: Handbuch der Pflanzenanatomie, Bd. V, Tell 2 (Zimmermann, W., Ozenda, P., Wulff, H.D., eds.), S. 17--115. Berlin-Stuttgart: Borntri~ger 1969. Eschrich, W., Evert, R. F., Heyser, W. : Proteins of sieve-tube exsudate of Cucurbita maxima. Planta (Berl.) 1O0, 208--221 (1971). :Frey, G. : Aktivit~t nnd Lokalisation yon saurer Phosphatase in den vegetativen Teilen einiger Angiospemen und einiger Samen. Ber. schweiz, bot. Ges. 64, 390--452 (1954). Gardner, D. C., Peel, A. J. : Metabolism and transport of 14C-labelled glutamic and aspartic acids in the phloem of willow. Phytochemistry 19, 2385--2387 (1971).

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J. Lehmann: Lokalisation yon Dehydrogenasen im Phloem

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