Die Nahrung 23, 1, 1979, 63-81 Zentralinstitut fur Ernahrung in Potsdam-Rehbrucke (Direktor : Prof. Dr. H. HAENEL,), Forschungszentrum fur Molekularbiologieund Medizin, Akademie der Wissenschaften der DDR

Methodik zur Identifizierung und Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in Lebensmitteln, im Boden und Trinkwasser W. FRITZ

Zur Identifuierung und Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) in Lebensmitteln, im Boden und Trinkwasser wird eine Methodik beschrieben, die durch Kombination von extraktiven, chromatographischen und spektrophotometrischen Verfahren einen Nachweis von 0,Ol pg Benzo(a)pyren/kg neben anderen PAK ermriglicht. Probenvorbereitung, Vorreinigung und Anreicherung sind bei den Proben unterschiedlich. Die sich anschliel3ende Isolierung und Auftrennung der PAK wird nacheinander in zwei diinnschichtchromatographischen Systemen - Kieselgel und acetylierte Cellulose durchgefuhrt. Identifuierung und Bestimmung erfolgen durch Aufnahme der UV-Spektren (Erfassungsgrenze etwa 0,5 pg/ml) und im ng-Bereich durch in situ-Fluoreszenzspektralanalyse (Erfassungsgrenze 0,0005 pg Benzo(a)pyren/Fleck). Die Fluoreszenz-Anregungs- und Emissionsspektren direkt von der acetylierten Celluloseplatte gestatten neben einer sicheren Identifizierung auch eine Bestimmung der PAK, die in situ-Fluoreszenzortskurven unter verschiedenen Aufnahmebedingungeneine simultane Bestimmung. Die Recovery-Werte Iiegen in Abhiingigkeit vom Probenmaterial zwischen 75 und 99.6% bei einem Variationskoeffizienten zwischen 10,3 und 22,1%. Weiterhin wird eine Grenzwertmethode vorgestellt, die mit Hilfe eines dunnschichtchromatographischen Screenings ohne komplizierte Me5technik , j a - nein"Entscheidungen gestattet mit der Aussage, ob die vorliegende Probe dem Benzo(a)pyren-Richtwert genugt oder nicht.

Bei der Suche nach Geschwulstursachen stehen die exogenen Noxen im Vordergrund. Vonden bisher bekanntenetwa 2000Cancerogenen[11stellen die polycyclischenaromatischen Kohlenwasserstoffe(PAK), von denen etwa 200 krebserzeugend sind [2], die gro8te chemisch einheitliche Gruppe dar. PAK treten in der Umwelt niemals als Einzelsubstanzen, sondern stets im komplexen Gemisch auf. Sie konnten als krebserzeugende Faktoren bei zahlreichen Berufskrebsfallen in RuDen, Teeren, Paraffinen und Mineralolen identifiziert werden [3]. Auch tierexperimentellsind diese Gemische krebserzeugend. So konnte z. B. die cancerogene Wirkung von Autoabgaskondensaten an Mausen vollstandig auf die Fraktion der PAK zuriickgefuhrt werden, wobei nach Isolierung 9 % der cancerogenen Aktivitat allein dem Benzo(a)pyren (BaP) zugeschrieben werden mu13 [4]. BaP wird international als Leitsubstanz der PAK angesehen. Grundsiitzlich gilt, daf3 Substanzen, die im Tierexperiment eindeutig Krebs erzeugt haben, entsprechend den international iiblichen Gepflogenheiten (WHO, IARC, UICC) als suspekt fur den Menschen gelten [l]. Zur Bestimmung der PAK in Lebensmitteln mu8 eine Methode mindestens 0,l pg/kg erfassen, um Fehlergebnisse zu vermeiden [5]. Eine Bestimmung allein des BaP-Gehaltes ist zur Beurteilung der cancerogenen Aktivitat eines Substrates nicht ausreichend, da andere wirksame Kohlenwasserstoffe synergistisch und nicht cancerogene Kohlenwasserstoffe

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FRITZ

als Inhibitoren wirken konnen [5]. Da das Verhaltnis,des BaP-Gehaltes zu den anderen Kohlenwasserstoffen nicht konstant ist, erscheint deshalb fur eine Aussdge uber eine evtl. Krebsgefahrdung durch den PAK-Gehalt die Bestimmung eines moglichst breiten Spektrums an PAK wiinschenswert. Ein oberblick iiber die Analytik der PAK in Lebensmitteln aus historischer Sicht wird von FRITZ[5] gegeben, moderne Analysenmethoden werden in einem Manual der IARC [6] zusammengestellt. Zur Erfassung des BaP-Gehaltes neben anderen PAK in Lebensmitteln hat sich eine Kombination von extraktiven, chromatographischen und spektrophotometrischen Verfahren als geeignet erwiesen [7]. 1.

Extraktionsverfahren

I.I .

Fest-Fliissig- Extraktion

Als notwendige erste Stufe zur Anreicherung der lipophilen PAK aus Feststoffen ist eine Fest-Flussig-Extraktion mit organischen Losungsmitteln wie Benzol oder Cyciohexan erforderlich. Es werden Soxhlet-Apparate benutzt, deren Dimension dem jeweils zur Verfiigung stehenden Quantum an Untersuchungsmaterial weitgehend angemessen ist. Eine Extraktionsdauer von 8 h hat sich als ausreichend erwiesen. 1.2.

Flussig-Fliissig-Extruktion

Eine sehr effektive Anreicherung der PAK kann durch Verteilung zwischen zwei Phasen erfolgen, wenn durch Flussig-Fliissig-Extraktion die PAK moglichst selektiv in eine Phase iibergehen. Folgende Phasenverteilungen werden bei der vorliegenden Methode zur Anreicherung der Polyaromaten aus Lebensm&teln angewendet : - Methanol (80 %ig)/Cyclohexan (HOFFMANN u. a. [8]) - Cyclohexan/Nitromethan (HOFFMANN u. a. [8]) - Cyclohexan/N,N-Dimethylformamid(90 %ig) (GRIMMER u. a. [9]) - N,N-Dimethylformamid (45 %ig)/Cyclohexan (GRIMMER u. a. [9]) Proteinreiche Lebensmittel wie Fleisch, Fisch, Hefe und Speck werden durch Hydrolyse mit methanolischer Kalilauge in eine fliissige methanolische Phase iibergefiihrt. Die Polyaromaten konnen durch Fliissig-Fliissig-Extraktion aus dieser Phase in Cyclohexan iibergefiihrt werden [9]. Aus fliissigen Untersuchungsmaterialien wie pflanzlichen Olen, Trinkwasser oder Paraffinen stellt die Fliissig-Fliissig-Extraktiondie erste Stufe der Anreicherung dar. 2.

Chromatographische Verfahren

2.1.

Dunnschichtchromutogruphie uuf Kieselgel G

Die PAK wandern diinnschichtchromatographisch auf Kieselgel G mit Cyclohexan als Laufmittel in gut getrennten Frdktionen mit unterschiedlicher Fluoreszenz. Die meist gelb, braun oder griin gefarbten, nicht fluoreszierenden Inhaltsstoffe bleiben an der Start-

65

Polycyclische Kohlenwasserstoffe

h i e liegen bzw. bleiben hinter den PAK zuruck. Durch einen direkten Vergleich mit mitlaufenden Testsubstanzen auf der gleichen Platte kann das Wanderungsverhalten in jeder Phase der Trennung durch Fluoreszenz im UV-Licht verfolgt werden. Geringe Unterschiede in Schichtdicke und Aktivitatsgrad des Adsorbens, Temperatur und Kammersattigung, die den Rf-Wert beeinflussen, sind ohne Bedeutung, da jede Fraktion durch das Verhaltnis ihrer Laufstrecke zu der des BaP, d. h. durch den sogen. RB-Wert charakterisiert wird.

Tabelle 1 RB-Wert polycyclischer aromatischer Kohlenwasserstoffe, geordnet nach dem Wanderungsverhalten auf der Dunnschichtplatte (Kieselgel G) Beilstein-Nomenklatur I . Fraktion Phenanthren Anthracen Pyren 2. Fraktion Fluoranthen 1,2-Benzanthracen Chrysen 3. Fraktion 3.4-Benzpyren 1,2-Benzpyren 1 1, 12-Benzfluoranthen Perylen Anthanthren 4. Frul tion 3,4-Benzfluoranthen 10, 1 I-Benzfluoranthen 1, 12-Benzperylen 5 . Frcrktion I , 2, 3,4-Dibenzanthracen 1.2, 5,6-Dibenzanthracen Coronen Indenopyren 6. Fraktion 1,2,3,4-Dibenzpyren 1,2,6, 7-Dibenzpyren 3,4,9, 10-Dibenzpyren I , 2.4, 5,8,9-Tribenzpyren

* - keine

+ schwach

Kieselgel G

IUPAC-Nomenklatur

AcetylCellulose

Cancerogenitat *

1 ,S 1,45

1.4 Benz(a)anthracen Benzo(a)pyren Benzo(e)pyren Benzo(k)fluorant hen

Benzo(b)fluoranthen BenzoQ)fluoranthen Benzo(g, h, i)perylen

0,9

0,9 0.9

Dibenz(a, c)anthracen Dibenzo(a, h)anthracen Indeno( 1,2,3-c, d)pyren

0,75 0,75 0,75 0.75

Dibenzo(a, 1)pyren Dibenzo(a, h)pyren Dibenzo(a, i)pyren Tribenzo(a, e, i)pyren

+ + maI3ig stark

3.2 4,o 3,7 2.0 4,o 3,o 2,s 4,4

+ +++ + + +++ +++ +

+ + + stark

Durch 2-3malige Wiederholung der Chromatographie nach Zwischentrocknung kann die Trennung verbessert werden. Das chromatographische Verhalten der aufgetrennten PAK ist in Tab. 1 zusammengestellt. Bei der auf Kieselgel G-Dunnschichtplatten vorgenommenen Grobtrennung liegen jeweils mehrere Kohlenwasserstoffe in einer Fraktion vor (Tab. 1). 5 Die Nahrung, 23. Jhg., Heft I

66

2.2.

FRITZ

Dunnschichtchromatographie auf acetylierter Cellulose

In einem zweiten diinnschichtchromatographischen System auf acetylierter Cellulose mit dem Laufmittel Methanol/Ather/Wasser (4: 4: 1) erfolgt eine weitere Auftrennung der PAK, vor allem wird BaP selektiv abgetrennt (Tab. 1).

3.

Spektrophotometrische Verfahren

3.1.

U V-Spek tralanalyse

Liegen die PAK in den durch Dunnschichtchromatographie auf Kieselgel getrennten Fraktionen im pg-Bereich vor, konnen Identifizierung und Bgtimmung durch Aufnahme der UV-Spektren erfolgen. Die in einer Fraktion vorliegenden PAK konnen nebeneinander bestimmt werden, z. B. Anthracen, Pyren oder Anthanthren, BaP und Benzo(e)pyren [7], wobei sich besonders die a- und p-Banden im langerwelligen Bereich eignen, in dem die Untergrundabsorption am wenigsten stort. Zur quantitativen Auswertung werden fur jeden Kohlenwasserstoff Eichkurven fur den in Frage kommenden Konzentrationsbereich aufgenommen. Die UV-Spektren einschlieBlich ihrer Maxima und Aufnahmebedingungen sind bei FRITZ[S] zusammengestellt.

Abb. 1. UV-Spektren von 0,s-I0 pg Benzo(a)pyren/ml

Es erscheint zweckmaBig, die Konzentrationsbestimmung nicht nur auf einen MeDwert einer Bande zu griinden, weil verschiedene PAK bei gleichen Wellenlangen absorbieren -- allerdings mit unterschiedlicher Intensitat ; erst durch Vergleich der bei verschiedenen MeDpunkten erhaltenen Ergebnisse lassen sich mit ausreichender Sicherheit quantitative

Polycyclische Kohlenwasserstoffe

61

Aussagen erzielen. Erforderlich sind deshalb Aufnahmen der UV-Spektren uber den gesamten Absorptionsbereich. Die Auswertung erfolgt nach der Basislinientechnik. Die UVSpektren werden mit dem USP 2, einem selbstregistrierenden Zweistrahlphotometer, aufgenommen [ 101. Beim selbstregistrierenden USP 2 werden die Spektren uber die Wellenzahl aufgenommen. Das USP 2 gestattet im Zweistrahlbetrieb eine kontinuierliche Registrierung von 48000 cm-' (206 nm) bis ins nahe Infrarot bei 3700 cm-' (2,6 pm) in % Absorption, wobei automatisch spektrale Unterschiede in der Intensitat der Lichtquellen, der Empfindlichkeit des Empfiingers und der Transparenz des Losungsmittels eliminiert werden. Die Nachweisgrenze fur BaP betragt 0,2 pg/ml.

3.2.

Fluoreszenzspektralanalyse

Die intensive Fluoreszenz der meisten Polyaromaten im UV-Licht der Analysenlampe erleichtert den Analysengang. So konnen chromatographisch getrennte Fraktionen durch ihre Fluoreszenz markiert werden. Da die Nachweisgrenze der UV-Absorption im pg-Bereich liegt, reidht dies oft fur den Nachweis cancerogener Kohlenwasserstoffe in Lebensmitteln nicht aus. Mit der Fluoreszenz konnen hingegen BaP und andere intensiv fluoreszierende PAK 3 GroDenordnungen empfindlicher im ng-Bereich nachgewiesen werden [ 111. Eine eindeutige Aussage kann aber nur bei einer spektralen Auflosung der Fluoreszenz, also durch Aufnahme von Fluoreszenzspektren getroffen werden. Die Fluoreszenzspektren werden selbstregistrierend mit einem Fluoreszenzspektrophotometer Perkin-Elmer MPF 3 aufgenommen. Eine Xenon-Hochdrucklampe dient zur Erzeugung eines kontinuierlichen Lichtes ab 200 nm. Die Doppelmonochromatoren erlauben die Aufnahme von Fluoreszenz-Anregungs- und Fluoreszenz-Emissionsspektren,im folgenden erstere als Anregungs- und letztere als Fluoreszenzspektren bezeichnet. Fluoreszenzspektren von PAK in Losung einschliel3lich ihrer Maxima und Aufnahme'bedingungen mit dem Fluoreszenzzusatz zum USP 2 sind bei FRITZ[5] zusammengestellt. Die kombinierte Aufnahme von Anregungs- und Fluoreszenzspektren gestatten bei selektiver Anregung eine sichere Identifizierung von Polyaromaten. Die Nachweisgrenze fur BaP betragt 0,5 ng/ml, bei Verwendung eines Hochempfindlichkeitszusatzes 0,2 ng/ml und bei Verwendung einer 10 pl-Mikrokiivette 0,02 ng/ml. Voraussetzung ist allerdings, daD nicht mehrere PAK nebeneinander in der MeDlosung vorliegen. Die Fluoreszenz wird u. a. durch Loschung und uberlagerung beeinflufit. Die erforderliche Auftrennung der PAK kann dunnschichtchromatographisch auf acetylierter Cellulose erfolgen. Abgesehen von der selektiven Auftrennung unter den angegebenen Bedingungen ist die Fluoreszenz intensiver und differenzierter als auf anderen Schichtmaterialien. AuDerdem sind die PAK auf Platten mit acetylierter Cellulose im Gegensatz zu Kieselgel bzw. Aluminiumdxidschichtmaterial sehr bestandig. Allerdings lassen sich ng-Mengen an PAK von acetylierter Cellulose schwieriger eluieren als von Kieselgel. Aus all diesen Griinden bietet sich die Identifizierung und Bestimmung der PAK durch Aufnahme der Anregungs- und Fluoreszenzspektren direkt von der Platte an. Die spektralfluorometrische in situ-Analyse von PAK nach Trennung auf acetylierten Celluloseschichten wird von TOTH[12] und WOIDICHu. a. [13] beschrieben. Die Aufnahme von Anregungs- und Fluoreszenzspektren direkt von der Diinnschichtplatte gestattet ein aufsetzbares Diinnschichtauswertegerat zum MPF 3 FluoreszenzSpektrophotometer. Die zur Auswertung vorgesehene Dunnschichtplatte liegt mit der

FRITZ

68

Schicht nach unten auf einem horizontal angebrachten Kreuztisch. Das monochromatische Anregungslicht [200-700 nm] trifft durch eine verstellbare Schlitzplatte auf den Substanzfleck. Das Fluoreszenzlicht wird in Reflektion durch einen weiteren Monochromator [220 bis 800 nm] spektral zerlegt und selbstregistrierend aufgezeichnet [Schlitzplatte 5 x 5 mm].

5.

fluomnthen 36l

a 6 (412)

Abb. 2. In situ-Anregungs- und Fluoreszenzspektren (direkt von der acetylierten Celluloseplatte) einiger polycyclischer und aromatischer Kohlenwasserstoffe

Polycyclische Kohlenaasser\toll'e

69

Die Messung in Transmission. die das Geriit auch ermoglicht, ist wesentlich storanfiilliger. Die Einstellung der Wellenllnge an den Anregungs- und Emissionsmonochromatoren is1 von der zu messenden Substanz abhingig. Die Anregungsspektren werden mit einem Fluoreszenzmaximum im langwelligen Bereich. die Fluoreszenzspektren rnit einem Anregungsmaximum im kurzwelligen Hereich angeregt. um storendc. Streulicht zu vcrmeidcn. das bei der in situ-Aufnahrne von Platten cine grolJere Rolle spiclt ills in Losung. In situ-Anregungs- und Fluoreszenyspektren einiger PAK sind iius Abb. 2. die Maxima aus Tab. 2 zu ersehen. Zur Aufnahmc der Anregungsspektren sollte der Spalt des Emissionsnionochromators moglichst weit geoffnet werden (40 mm), um ausreichende Fluoreszenzintensitaten zu erhalten. Der Spalt des Anregungsinonochron~at(~rs sollte moglichst eng eingestellt werden (0.5-5 mm). um eine gute Auflosung der Spektren zu erreichen. Bei der Aufnahme der Emissionsspektren wird umgekehrt der Spalt des Anregungsmonochromators auf 40 mm, der des Emissionsmonochromators entsprechend eng eingestellt. Die Anregungs- und Fluoreszenzspektren der Polyaromaten direkt von der IX-Platte gleichen weitgehend den entsprechenden Spektren i n Losung. Sie sind lediglich um wenige nm zum langwelligen Bereich verschoben und einige unwesentliche kleine Maxima nicht aufgeliist. Dies ist abcr vollig ohne Belang, da die Identifizierung durch Vergleich von Testsubstanzen auf der gleichen Platte erfolgt. Durch Anregung eines fluoreszierenden Fleckes mit unterschiedlicher Wellenlinge kann die Reinheit einer Substanz uberpriift werden. Beim Erhalt verschiedener Fluoreszenzspekt ren licgt el n Substanzgemisch vor. Die quantitative Bestimmung von BaP im ng-Bercich erfolgt durch Vergleich der in situ-Emmissionsspektren der aufgetrennten Probe mit den i n situ-Emissioiisspektreii von BaP (0,5-I0 ng, Fleck) iius Testgemischen unterschiedlicher Konzentration. die a u f der gleichen Platte mitlaufen. Ausgewertet wird uber die Basislinie bei 408 und 436 nm (Abb. 2). Weitere PAK wie Benzo(k)-fluoranthen und Benzo(g, h. i)-perylen werden neben BaP durch Aufnahme der in situ-Fluoreszenz-Ortskurven bestimmt. Am Anregungsmonochromator(A) wirddas Anregungsmaximum, bei den vorgenannten Substanzen 309 nm, am Emissionsmonochromator ( E ) das Fluoreszenzmaximum 408 nm eingestellt. Zur Bestimmung von Benzo(b)-fluoranthen und Fluoranthen wird A auf 300 und E auf 458 nm. L L I Hestim~ mung von lndenopyren wird A auf 318 und E auf 500 nm eingestellt. Die aufgetrennten Fluoreszenzflecken werden kontinuierlich an einer Schlitzplatte ( 2 x 6 mm) mil Ililfe eines Motors des Diinnschichtauswertegerates des M P F 3 voriibergefiihrt. Die Schlitzplatte wird mit Quarzglas bedeckt, um ein Einstauben der Optik durch das Schichtmaterial der DC-Platte zu verhindern. Beim Durchfahren der Platte wird die Anderung der Fluoreszenzintensitat registriert (Ortskurven) und nach Durchfahren unter gleichen Bedingungen der aufgetrennten Fluoreszenzflecken des Testgemisches unterschiedlicher KonZentrdtionen verglichen (Abb. 3). Die Spalte der Monochromatoren werden beide bei der Aufnahme von in situ-Ortskurven auf den gleichen Wert gestellt. Die Auswertung erfolgt uber das Produkt von Peakhohe und Halbwertsbreite. Die Identitat eines Kohlenwasserstoffes mu0 durch mehrere Kriterien -- einmal durch R,-Werte, nach Moglichkeit in zwei unterschiedlichen Systemen wie Diinnschichtchromatographie auf Kieselgel G und acetylierter Cellulose, und zum anderen durch UV- bzw. Fluoreszenzspektren - gesichert sein. BaP und Benzo(g, h. i)perylen haben lhnliche UV-Spektren, BaP und Uenzo(k)fluoranthen ihnliche Emissionsspektren. Eine eindeutige Identifizierung und Bestimmung wird durch Aufnahme von in situ-Fluoreszenzspektren und der Ortskurven nach Abtrennung auf acetylierter Cellulose erreicht (Abb. 2 und 3).

*A

= Anregungswellenlange

448 500 502 472 445

400

457 390 434 448 490 452 506 432 446

404

425 396 456 412

Anthracen Pyren Fluoranthen Benz(a)anthracen Chrysen Benzo(a)pyren Benzo(e)pyren Benzo(k)fluoranthen Perylen Anthanthren Benzo( b)fluoranthen Benzo0)fluoranthen Benzo(h, g, ilperylen Dibenz(a, h)anthracen Dibenz(a, c)anthracen Coronen Indeno(l,2, 3, c-d)pyren Dibenzo(a, 1)pyren Dibenzo(a, h)pyren Tribenzo(a, e, i)pyren

KonzenA* tration [~/Fleckl 408

*

Phenanthren

PAK

294,306, 320, 328,335,344,352, 364, 384 252, 341, 360, 378 275,310,327,338 260,289,325, 346,361 281,292,302, 334, 344 272,298,310.323 258,274,288,300,352,370,380,388 284,292, 320,334 258,310,330, 346, 362,382 255,270,292,372,385 270,299,310,367, 384, 397 296,304,353,370 322,334,365,375,384 293, 304,316,332,350,366, 393 293,301,323, 336,352 280,291 296,307,327,338, 342, 348 307,318,362,378 258, 306,318, 333, 370,376, 380 260,318, 370 300,309, 325, 350, 367, 386,414

Anregungsmaxima

349, 356. 366,386,408,432,454 382,400,425,450 368,376,380,386,3% 444,456 388,412,436,460 363, 376, 382,404,425 397,408,430,457 380,390,400,410,420 408,434,460 448,470,498 437,463,490 436,452 476,506 392, 396,400,408,418,421.432.446,456 398,420,446 378,388,400,420 428, 435, 448, 455, 476. 4Sf . I \ 412,472,500 398,420,478, 502 424,443,472 419,445,472

34 I 338 289 292 2 72 300 334 310 385 299 304 365 304 30 1 291 307 307 306 318 300

Fluoreszenzmaxima

335

A

in situ

Tabelle 2 Maxima der in situ-Anregungs- und Fluoreszenzspektrenvon polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen(PAK) auf acetylierter Cellulosediinnschicht

4 N

2

Polycyclische Kohlenwasserstoffe

71

Abb. 3. Iq situ-Ortskurven einiger polycyclischer aromatischer Kohlenwasserstoffe A - Anregungswellenlange, E - Emissionswellenlange 1Benzo(a)pyren [0,01 pg]; 2 - Benzo(b)fluoranthen [0,02 pg]; 3 - Indenopyren [ O M pg]; 4 - Benzo(k)fluoranthen [0,02pg]; 5 - Fluoranthen [O,l pg]; dBenzo(g, h, i)perylen [0,04 pg]

5

4.

70 em

Analyseogang

Gerate und Reagenzien Umwalz-Trockenschrank Soxhlet-Apparate verschiedener GroBen Rotationsverdampfer Schiitteltrichter (2, I , 0,5 I) Schiittelmaschine Streichgerkt fur Diinnschichtchromatographie (VEB Glaswerke Ilmenau) Sittigungskammern nach STAHL Analysenquarzlampen (Solimed und Desaga Heidelberg) Universalspektrophotometer USP 2 Perkin-Elmer-Fluoreszenzspektrophotometermit Diinnschichtauswertegerat Fluoreszenzansatz zum USP 2 (Fluoreszenzspektren in Losung [S]) Benzol, Cyclohexan, Diathylather, Methanol, N,N-Dimethylformamid, Nitromethan (alle Losungsmittel werden iiber eine Kolonne destilliert, so daD sie fluoreszenzfrei sind; je 10% Vor- und Nachlauf werden verworfen) bidest. Wasser Fluka Cyclohexan p.a., benzolfrei, fur UV-Spektroskopie Kieselgel G nach Stahl fur Diinnschichtchromatographie (Merck) Acetylierte Cellulose MN 300 AC 40 (Macherey, Nagel & Co) Der Analysengang fur verschiedene Lebensmittel (Fleisch, Fisch, Vegetabilien, Obst, Fette u. a.) ist im Schema 1 zusammengestellt.

FRITZ

72 4.1.

Fleisch, Fleischwuren, Fisch, Hejti

4.1.1.

Hvdrolyse

100 g Untersuchungsgut werden rnit einem Fleischwolf homogenisiert. Das Homogenat wird rnit 200 ml 2 N KOH in 90 xigem Methanol ca. 4 h bis zur volligen Verseifung unter RuckfluB im siedenden Wasserbad erhitzt.

4.1.2.

Fliissig-fliissig-Extrak tion :Methanol- Wasser-Cyclohexan

Der Verseifungsansatz wird in einen Scheidetrichter iibergefiihrt, der Kolben mit insgesamt 200 ml80 %igem Methanol ausgespiilt. Die vereinigten methanolischen Phasen werden zusammen rnit Cyclohexan (400 ml) in den Scheidetrichter gegeben und 5 min geschiittelt. Nach Trennung der Phasen wird die untere (methanolische) Phase in einen zweiten Scheidetrichter abgelassen und die Extraktion rnit frischem Cyclohexan (400 ml) wiederholt. Nach der Phasentrennung kann die untere Phase verworfen werden. Die beiden Cyclohexanphasen in beiden Scheidetrichtern werden nacheinander rnit 400 ml 50 xigem Methanol gewaschen und anschlieDend mit 200 ml aqua bidest. nachgewaschen. Die vereinigten Cyclohexanextraktionsphasen werden am Rotationsverdampfer (40 "C Badtemperatur, Wasserstrahlvakuum) bis auf etwa 30 ml eingeengt.

4.1.3.

Fliissig-jliissig-Extraktion: Dimethylformamid- Wasser-Cyclohexan

Der eingeengte Cyclohexanextrakt (30 ml) wird quantitativ in einen 250 ml-Scheidetrichter iibergefuhrt, DMF-Wasser (60 ml 9 1) hinzugegeben und 5 min geschuttelt. Nach dem Trennen der Phasen la& man die untere Phase (DMF-Wasser) in einen Scheidetrichter ab. Die Extraktion der Cyclohexanphase wird mit frischem DMF-Wasser (60 ml 9 I ) wiederholt und die untere Phase ebenfalls in den Scheidetrichter gegeben. Nach Verdunnen der vereinigten DMF-Wasserlosungen rnit Wasser (120 ml) sind alle PAK wiederum fast quantitativ rnit Cyclohexan (120 ml) extrahierbar. Nach dem Abtrennen der unteren DMF-Wasserphase wird die verbleibende Cyclohexanphase zweimal mit Wasser (50ml) gewaschen, rnit Natriumsulfat getrocknet und in einen Rundkolben ubergefuhrt. Das Losungsmittel wird am Rotationsverdampfer bis auf ca. 0,3-0,s ml abdestilliert.

+

+

4.1.4.

DAnschichtchromatogruphie auf Kieseigrl G

Beschichtung der Platten. Es werden 35 g Kieselgel G und 70 ml dest. Wasser fur jeweils 5 Platten verruhrt. Die mit dem Auftragegerat beschichteten Platten werden 24 h an der Luft getrocknet. Der erhaltene Extrakt wird als Strich 3,s cm vom unteren Rand auf eine Kieselgel-Diinnschichtplatte mit einer Kolbenpipette quantitativ aufgetragen. Als Vergleichssubstanz wird 1 pg BaP neben der Analysensubstanz punktfijrmig aufgebracht. Das Adsorbens wird an den beiden Langsseiten und oben etwa 5 mm breit rnit einem Spatel von der Platte entfernt. Eine andere, ebenfalls 20 x 20 cm groDe Platte, die an den gleichen drei Seiten 5 mm breite Glasstreifen aufgekittet tragt, wird sandwichartig zu einer S-Kammer daraufgeklappt. Bei der Entwicklung sol1 die Platte etwa 5 mm in das Elutionsmittel Cyclohexan eintauchen. Nach etwa 30 min ist die Entwicklung der Platte beendet. Durch Betrachten unter der Analysenquarzlampe (366 und 254 nm) la& sich die Trennung der Polyaromaten schnell an den unterschiedlich fluoreszierenden, scharf getrennten Zonen verfolgen. Durch wiederholte Entwicklung (etwa zwei- bis viermal) kann die Abtrennung von den iibrigen Inhaltsstoffen, die langsamer wandern, verbessert werden. Auch die fluoreszierenden Polyaromatenzonen sind weiter auseinandergezogen. Unter der Analysenquarzlampe werden die fluoreszierenden Fraktionen markiert, vom Glas abgehoben und quantitativ in jeweils eine der Menge angepaDte Mikrosaule iibergefiihrt. Die PAK werden vom Schichtmaterial bis zur Fluoreszenzfreiheit rnit Cyclohexan eluiert. Die Cyclohexaneluate der jeweiligen Fraktionen werden bis auf ca. zwei ml im Wasserstrahlvakuum im Rotationsverdampfer eingeengt und in der MeBkiivette auf 3 ml aufgefiillt.

Polycyclische Kohlenwasserstoffe

4.1.5.

73

Aufnahme von UV-Spekrren

Bei intensiv fluoreszierenden, deutlich getrennten Fraktionen werden UV-Spektren rnit dem selbstregistrierenden Doppelstrahlspektrophotometer USP-2 aufgenommen. Aus den UV-Spektren k,onnen ab etwa 0,5 pg/ml qualitative und quantitative Aussagen gemacht werden. Die Auswertung erfolgt an Hand von Eichkurven nach der Basislinientechnik.

4.1.6.

Spektraljluorimetrische in situ-Analyse nach dunnschichtchromatographischer Trennung auf acetyfierter Cellulose

Nach Aufnahme der UV-Spektren werden die Fraktionen in Spitzkolbchen rnit angeschmolzenem graduierten Rohrchen am Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 0,1-0,5 ml eingeengt. Es werden in Abhangigkeit von der Konzentration der PAK (an Hand der UV-Spektren) 10-100 pI rnit einer pl-Prazisionsspritze punktformig auf die acetylierte Celluloseplatte aufgetragen (Durchmesser i4 mm). Es werden auf jede Platte Testgemische der gleichen pl-Menge unterschiedlicher Konzentration zum Vergleich aufgetragen, z. B. BaP zwischen 0,s und 10 ng. Die Entwicklung erfolgt in einer S-Kammer rnit Methanol/Ather/H20 (4/4/1). Unter der Analysenquarzlampe (366 und 254 nm) werden die Substanzen markiert und durch Aufnahme von Anregungs- und Fluoreszenzspektren direkt von der Platte identifiziert. BaP wird an Hand des Emissionsspektrums bestimmt. Durch Vergleich gegen Testsubstanzen (Aufnahme der Ortskurven) erfolgt die Bestimmung weiterer PAK. Beschichrung der Platten. Es werden 15 g acetylierte Cellulose und 60 ml Methanol fur jeweils 5 Platten verriihrt. Die mit dem Auftragegerat beschichteten Platten werden 24 h an der Luft getrocknet.

4.2.

Pflnnzliche Ole und Fette

4.2.1.

Probenvorbereitung

20 g Margarine werden im Wasserbad verfliissigt; die waSrige Phase wird im Scheidetrichter abgetrennt und rnit 50 ml Cyclohexan ausgeschiittelt. Die wlSrige Phase wird verworfen. Die Cyclohexanphase wird zur Losung des Fettes eingesetzt.

4.2.2.

Fliissig-fliissig-Extraktion

10 g Speiseol bzw. Fett werden in 50 ml Cyclohexan gelost u n d h einem Scheidetrichter mit 500 ml Dimethylformamid-Wasser (9: 1) ausgeschiittelt. Die abgetrennte DMF-Wasserphase wird mit 50 ml aqua bidest. versetzt und 5 min mit 50 ml Cyclohexan ausgeschiittelt. Die Cyclohexanphase wird zweimal mit je 100 ml Wasser gewaschen und im Vakuumrotationsverdampfer (Wasserbadtemperatur 40 "C) eingeengt.

4.2.3.

Trennung, Idenlijzierung und Bestirnrnung

wie unter 4.1.4.. 4.1.5. und 4.1.6. beschrieben.

4.3.

Vegetabilien

4.3.1.

Probenvorbereitung

Die Proben werden bei maximal 40 "C im Umwalztrockenschrank getrocknet und in'einer Schlagmiihle staubfein pulverisiert.

FRITZ

74

4.3.2.

Fest-jlussig-Extraktion

10 g werden rnit 250 ml Benzol im Soxhlet 8 h im siedenden Wasserbad extrahiert, im Rotationsverdampfer bei maximal 40 "C Wassertemperatur unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe) weitgehend eingeengt.

4.3.3.

Fliissig-flissig-Estruktion

Vegetabilien rnit hohem Chlorophyll- und Carotinoidgehalt werden nach 4.1.3. ausgeschiittelt. Bei vielen Vegetabilien, z. B. Kartoffeln, Rettich, Zuckerriiben, wird der Extrakt von 4.3.2. unmittelbar auf die Kieselgeldiinnschichtplatte quantitativ aufgetragen. Bei hohen Extraktionsverunreinigungen kann die Abtrennung auf Kieselgeldiinnschichtwiederholt werden.

4.3.4.

Trennung, Identi9zierung und Bestimmung

Wie unter 4.1.4., 4.1.5. und 4.1.6. beschrieben.

4.4.

. Getreide

4.4.1.Prohenvorbereitung 10 g Getreide werden staubfein in einer Schlagmuhle pulverisiert.

4.4.2.

Fest-jlussig-Extraktion und Hydrolyse

Die Probe wird rnit 100 ml methanolischer KOH ( 5 g KOH und 20 ml aqua bidest. auf 100 ml mit Methanol auffullen) 8 h im Soxhlet extrahiert und der Extrakt gleichzeitig hydrolysiert.

4.4.3.

Fliissig-fliissig-Estraktion

Der Verseifungsansatzwird in einen Scheidetrichter iibergefiihrt, der K o l h rnit 80 ml80D/gem Methanol nachgespiilt. Die vereinigten methanolischen Phasen werden rnit 150 ml Cyclohexan 5 min ausgeschiittelt, die Extraktion einmal wiederholt. Nach der Phasentrennung kann die untere Phase verworfen werden. Die beiden Cyclohexanphasenwerden nacheinander in beiden Scheidetrichternrnit 100 ml50 xigem Methanol gewaschen und mit 100 ml aqua bidest. nachgewaschen. Die vereinigten Cyclohexanphasen werden auf 30 ml eingeengt.

4.4.4.

Isolierung, Identifizierung und Bestimmung

Wie unter 4.1.3., 4.1.4., 4.1.5. und 4.1.6. beschrieben.

4.5.

Erde (RuP)

4.5. I .

Fest-jliissig-Estruktion

10 g luftgetrocknete Erde werden mit 250 ml Benzol im Sokhlet 8 h im siedenden Wasserbad extrahiert, im Rotationsverdampfer bei maximal 40 "C Wassertemperatur und Wasserstrahlvakuum eingeengt und

15

Polycyclische Kohlenwasserstoffe

quantitativ als Strichchromatogramm auf einer Kieselgeldiinnschichtplatte aufgetragen. Bei sehr hohen Polyaromatengehalten (BaP-Gehalt iiber 1 mg/kg) geniigt das Auftragen eines aliquoten Anteils, z. B. 100 p1 von 1 ml Extrakt (s. 4.1.4.).

4.5.2.

Identifiierung und Bestimmung

Wie unter 4.1.5. und 4.1.6. beschrieben.

4.6.

Paraffine, Wachse

4.6.1.

Extraktion

200 g Paraffinol werden in 200 ml Cyclohexan gelost, Wachse und feste Paraffine geschmolzen und in Cyclohexan analog iibergefiihrt und fiinfmal mit je 100 ml Nitromethan je 5 min ausgeschiittelt. Die vereinigten Nitromethanphasen werden durch usfrieren uber Nacht gereinigt (Kiihltruhe -25 "C), abfiltriert, mit eiskaltem Nitromethan gewasch n und anschlieDend im Vakuumrotationsverdampfer auf ca. 0,5 mi eingeengt. Dieser Extrakt dient quantitativ zur diinnschichtchromatographischenAuftrennung auf Kieselgel (s. 4.1.4.).

P

4.6.2.

IdentijZerung und Bestimmung

Wie unter 4.1.5. und 4.1.6. beschrieben.

4.7.

Trinkwasser

4.7.1.

Probenahme

Eine sorgfaltig gereinigte braune 5-I-Flasche wird mit dem jeweiligen Probenwasser ausgespiilt; man fiillt 3 I Trinkwasser ein.

4.7.2.

Fliissig-jliissig-Extraktion

Die Extraktion erfolgt in der Probenflawhe mit 500 ml Cyclohexan 30 min auf einer Schiittelmaschine. Nach Abtrennen in einen Scheidetrichter wird die Wasserphase in die Flasche abgelassen, die Cyclohexanphase im Vakuumrotationsverdampfer bei einer Wasserbadtemperatur bis 40 "C auf ca. 1 ml eingeengt. Das abdestillierte Cyclohexan wird zur nochmaligen Extraktion des Wassers (30 min) verwendet. Nach sorgf"1tiger Abtrennung der Phasen wird das Cyclohexan rnit Natriumsulfat sicc. getrocknet und wie oben beschrieben - eingeengt. Der Gesamtextrakt wird auf ein Volumen von 100 p1 gebracht.

-

4.7.3.

Diinnschicht chroma tograph ische A b rrennung

Aliquote Teile des Extraktes (10,20 bnv 50 pl) werden punktformig (Durchmesser nicht g r o k r als 4 mm) mit pi-Prizisionsspritzen auf eine acetylierte Cellulosediinnschichtplatte von 20 x 20 cm aufgetragen. Neben jedem Extrakt wird als Vergleich ein Testgemisch der entsprechenden Konzentration aufgetragen.

FRITZ

76 4.7.4,

ldentifizierung und Bestimmung

Wie unter 4.1.6. beschrieben.

4.8.

Oberjlachen- und Brauchwasser

Die voliegende Methode ist nach geringfiigiger h d e r u n g auch auf Oberilachen- und Brauchwasser anwendbar. Wegen der hoheren PAK-Konzentrationen ist die Wasserausgangsmenge auf 1 I zu begrenzen. Die Extraktion erfolgt nach 4.7. I . Der Gesamtcyclohexanextrakt wird nach 4.1.4. auf eine Kieselgeldiinnschichtplatte quantitativ strichformig aufgetragen. Nach Elution vom Kieselgel werden die Fraktionen wie unter 4. I .6. beschrieben - aufgetragen, identifiziert und bestimmt.

4.9.

Anmerkung

Da die PAK sehr lichtempfindlich sind, wird bei allen Arbeitsgangen direktes Licht vermieden. Alle ArI beitsgange werden deshalb, soweit moglich, im verdunkelten Raum durchgefiihrt. Die MeDkolbchen mit Testsubstanzen (1 ml der in spektralreinem Cyclohqxan aufgenommenen Testsubstanz = 100 kg) sind mit Tusche schwarz gestrichen. Zur Untersuchung aller Losungsmittel auf Fluoreszenzfreiheit werden 100 ml Losungsmittel auf etwa 0,1 ml eingeengt und diinnschichtchromatographisch auf acetylierter Cellulose iiberpriift.

5.

fjberpriifung des Analysengangs

5 .I .

Vuriutionsko~^fiziL.nt

Als Ma0 fur die Reproduzierbarkeit der Analyse kann die Bestimmung des Variationskoeffizienten herangezogen werden. Die Variationskoeffizienten liegen fur 15 verschiedene PAK bei Malzkaffee zwischen 10,3 und 22,1% [5, 71. Bei einer Hefecharge wurde bei einem durchschnittlichen BaP-Gehalt von 9,71 & 0,99 pg/kg (10 Analysen) ein VK von 10,1%, bei einer Kartoffelcharge bei einem durchschnittlichen BaP-Gehalt von 0,54 0,06 ein V, von 13,9% gefunden.

5.2.

Wiedrrfindungsra ten

In Tab. 3 werden Wiederfindungsraten fur BaP angegeben. Sie liegen zwischen 75 und 99,6 yo, wobei in einigen Fallen auch die Standardabweichungen und der V, bestimmt wurde. Sie entsprechen weitgehend anderen in der Literatur angegebenen Recovery-Werten. 5.3.

Vergleich mit anderen Luhorutorirn

In Tab. 4 sind die Ergebnisse von Ringanalysen rnit Laboritorien verschiedener LBnder im RGW-Bereich zusammengestellt. Die Ubereinstimmung der Werte ist gut. Die vorliegende Methode ist hinsichtlich Empfindlichkeit (z. B. 0,0005 pg BaP/kg Wasser bzw. 0,Ol pg BaP/kg der verschiedensten Lebensmittel), Reproduzierbarkeit, Wieder-

77

Polycyclische Kohlenwasserstoffe

Tabelle 3 Wiederfindungsraten fur Benzo(a)pyren (BaP) Substrat

Malzkaffee Ersatzkaffeextrdkt Speiseol Trinkwasser Hefe

Anzahl der Proben

Zugdbe an BaP bg/kgl

2 2 16

32

11

0,005 2

2

092 2

Wiederfindungsrate

Standardabweichung

[ %I

Variationskoeftizient [ %I

88.5 75 ni 99,6

-

-

-

19 17,2 -

k 15,5 k 17,l

no

-

Tabelle 4 Benzo(a)pyren-Werte von Proben verschiedener Laboratorien [pg/kg] Probe

Zentralinstitut OnkologischfLir Ernahrung wiss. Zentrurn, der Akademie der Wissenschaften der DDR Moskau*

Wurst (Braunschweiger) Erde IV, 111, 111 1,

0,13 200 5 I60 14800 50 no0

190

5 100 I4 100 50500

,

Onkologisches Institut Petrow,

Institut fur Ernahrungswissenschaften,

Leningrad*

Budapest*

0,12 210 6180 15120 55 880

150 4 300 15800

0,12

-

* Wir danken Frau Dr.

sc. CHESINA und Herrn Dr. sc. ILNITZKI, Onkologisch-wiss. Zentrum Moskau, Herrn Dr. sc. D I K U Nund Frau Dr. KALININA,Onkologisches Institut Petrow Leningrad, und Frau Dr. Soos, Institut fur Ernahrungswissenschaften Budapest, fur die Beteiligung an der Ringanalyse.

findungsraten und auch nach Vergleich mit anderen Laboratorien anderer Lander geeignet, BaP neben anderen PAK in Lebensmitteln, im Boden und Trinkwasser zu identifizieren und zu bestimmen.

6.

Grenzwertmethode

6.1.

Problemstellung

Die Methoden zur Identifizierung und Bestimmung von BaP in Lebensmitteln erfordern eine komplizierte MeBtechnik, die der Anwendung bei Routinekontrollen durch Hygieneeinrichtungen entgegensteht. Wunschenswert ist ein Screeningtest, der sich mit einfachen Methoden durchfuhren 1aDt. Beniuhungen hierzu hat es wiederholt gegeben. Grundlage war fast immer die Dunnschichtchromatographie [ 14- 181. Die Diinnschichtchromatographie hat sich bei Verwendung von Kieselgel als stationare Phase nicht bewahrt, da BaP mit einer Reihe anderer PAK in einer Fraktion vorliegt (Tab. 1).

FRITZ

78

Eine Abtrennung auf acetylierter Cellulose gestattet hingegen nach vorangegangenem ,,Clean-up" eine selektive Abtrennung des BaP (Tab. l), wobei eine zweidimensionale Entwicklung die Auftrennung verbessert [ 16, 171. Wahrend BORNEFF u. a. [ 181 eine semiquantitative Abschatzung der PAK aus Wasser durch Vergleich mit Testsubstanzen vorschlagen, handelt es sich bei der hier beschriebenen Methode um eine sogenannte Grenzwertmethode. Mit Hilfe einer in allen Hygieneeinrichtungen geiibten Labortechnik gestattet sie eine Uberprufung z. B. eines Richtwertes von 5 ng BaP/1 Trinkwasser, von 500 pg BaP/kg RuL3 oder 1 pg BaP/kg Lebensmittel. Es geht hierbei nicht um eine semiquantitative Abschatzung des BaP-Gehaltes, sondern urn eine einfache Methode, die es ermoglicht, durch einen schnellen Screening ,,ja - nein"-Entscheidungen zu treffen mit der Aussage, ob in der vorliegenden Probe der Grenzwert uberschritten worden ist oder nicht. Die Aussage ist lediglich orientierend.

Testlosung I ( T L I ) 5 mg BaP werden in einen 100-ml-MeBkolbenquantitativ iibergefiihrt, in Cyclohexan gelost und zur Marke aufgefiillt. 1 ml TL 1 & 50 pg BaP.

Testlosung I1 ( T L I I ) 100 pl TL I werden in einem 100-ml-MeBkolben rnit Cyclohexan aufgefiillt: 1 ml TL 11 s 50 ng BaP 10 pITL11 P 0,5 ngBaP 5 plTLII f 0,25ngBaP

6.3.

Analysengang

6.3.1.

Trinkwasser.

3 I Trinkwasser werden, wie unter 4.7 beschrieben, ausgeschuttelt und in einem Spitzkolbchen rnit angeschmolzenem graduiertem Rohrchen auf ein Volumen von 300 pl gebracht.

Dunns~hic.litchromut~gr~~pIiischt~ Ahtrmnung Es werden 5,10,20 und 40 pI Extrakt (E) punktformig neben der Testlosung II (T) nach folgendem Schema aufgetragen: 5 p1 T, 5 pl E, 10 p1 T, 10 pl E, 20 pl T, 20 p1 E, 40 p1 T, 40 pI E. Die Entwicklung erfolgt wie unter 4.1.6. beschrieben.

Auswertung Die entwickelte DC-Platte wird unter der Analysenquarzlampe (Filter UG 5, Einbrenndauer Cd. 3 min) durch Fleckenvergleich ausgewertet. BaP ist unter den 0.a. Bedingungen selektiv von anderen Polyaromaten abgetrennt und zeigt eine intensive blauviolette Fluoreszenz. Der Fleck des Extraktes auf der DC-Platte darf bei LO pi im Rf-Bereich cles BaP hiichstens die gleiche Fluoreszenzintensitat haben wie 10 pl des Fleckes TL 11, 20 p1 E wie 20 pl TL 11 und 40 p1 E wie 40 ~1 TL I1 (entspricht 0.5; 1 ng bzw. 2 ng BaP/Fleck). Bei 5 p1 Extrakt darf dagegen - wie bei einer Vergleichsprobe rnit 5 pI TL I1 (entspricht 0,25 ng BaP) --- eine Fluores7enz nicht mehr sichtbar sein. Sind diese Bedingungen erfiillt, enthalt das Trinkwasser unter 5 ng BaPil.

Polycyclische Kohlenwasserstoffe

79

Eine visuelle Auswertung wird unmoglich, wenn sich im Wasser Erdolprodukte oder andere Verunreinigungen befinden, die eine selektive Abtrennung des BaP auf der Platte nicht gestatten.

6.3.2.

RuJ

1 g RUBwird nach 4.5. extrahiert und aufein Volumen von 5 ml gebracht.’Es werden nach dem 0.a. Schema 5, 10 und 20 pI des Benzolextraktes der Rullrobe und 5, 10 und 20 p1 T L I1 aufgetragen. Die Entwicklung und Auswertung erfolgt wie 0.a. Die Flecke des Benzolextraktes auf der DC-Platte durfen bei 10 p1 hiichstens die gleiche Fluoreszenzintensitit haben wie 10 p1 TL I1 und 20 p1 Benzolextrakt wie 20 p1 TL 11. Bei 5 p1

Benzolextrakt darf dagegen eine Fluoreszenz nicht mehr sichtbar sein. Sind diese Bedingungen erfullt, enthalt der RUB unter 500 pg BaP/kg.

6.3.3.

Weitere Lebensmittel

Auch bei anderen Lebeilsmitteln kann nach der unter 5. beschriebenen Grenzwertmethode ein BaP-Richtwert z. 8. von 1 pg BaP/kg Frischgewicht festgestellt werden. Nach den unter 4. angegebenen Methoden werden 10 g Lebensmittel aufgearbeitet und mit Cyclohexan auf ein Volumen von 200 pI gebracht. Es werden - wie unter 5.3.1. beschrieben - 5, 10, 20 und 40 p1 Extrakt aufgetragen, die 0,25 bis 20 ng der entsprechenden pl-Menge an TL I1 entsprechen mussen, wenn der Richtwert von 1 pg/kg erfallt werden soll. Die Auswertung erfolgt nach 5.3.1.

Summary W. FRITZ:Method for identifying and determining polycyclic aromatic hydrocarbons in foods, soil and drinking water A method is described for identifying and determining polycyclic aromatic hydrocarbons in foods, soil and drinking water that, owing to the combination of extractive, chromatographic and spectrophotometric techniques, permits to detect 0,Ol pg of bezo(a)pyrene/kg in the presence of other polycyclic aromatic hydrocarbons. The preparation, pretreatment and concentration of the samples depend upon their nature. The isolation and separation of the polycyclic aromatic hydrocarbons are achieved with the aid of two consecutive thin-layer chromatographic systems, silica gel and acetylated cellulose. The subsequent identification and determination are based on the ulta-violet spectra (limit of detection, almost 0,5 pg/ml) and, in the nanogram range, on the in situ fluorescence spectral analysis (limit of detection, 0,005 pg of benzo(a)pyrene/spot). Fluorescence excitation and emission spectra obtained directly from the acetylated cellulose plate permit not only the reliable identification but also the determination of the polycyclic aromatic hycrocarbons; fluorescence transfer loci obtained under various conditions, the simultaneous determination. Depending upon the kinds of sample material, the recovery values range from 75 to 99.6 % with a variation coefficient between 10.3 and 22.1 %. Furthermore, a limiting value method is presented that permits to take yes-no decisions, by means of thin-layer chromatographic screening without using complicated measuring techniques, indicating whether or not the respective sample complies with the benzo(a)pyrene standard.

80

. FRITZ

Speck Fisch He&

Momogenat

Of

a/kalischeHydrolyse Anreiherung

7

Rickstand

+fhO+Cflfohexan

/so fierung

Dunnschiitchmmarbgtuphie &*$elgel G ) I

1

/denfifizierung

und Bestimmung

UV- Spektmlana&se

i 1

im pg- 8ereicb

dufyrennung

Dunnsclrihtchmma~gmphie (Ae&fieier/e Cellulose)

ZdentiWerung und Bestimmung

/in ng- Bereich

dnmgungs- und Fluomszenzspktren /in sifu ) FluoresrenI- Orfskurven

Schema I . Analvsengang fur verschiedene Lebensmittel

7 Wasser

Polycyclische Kohlenwasserstoffe

81

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.

Dr. W. FRITZ,Zentralinstitut fur Emahrung, DDR-1505 Bergholz-Rehbriicke, Arthur-Scheunert-Allee 114-116 Eingegangen 2.6. 1978

6 Die Nphmn& 23. Jhg.. Hen I