シゲナル伝達と細胞機能調節
薬物耐性依存の分子機構 -サ イ ク リ ッ クAMPを
介 す る遺 伝 子 発 現-
大杉
武 ，池本
光 志 ，谷浦
秀 夫 ，三 木
直正
とい う知 見 が 最 近 多 く得 られ つ つ あ る。 本稿 で は ，遺 伝 は じめ に
子 発 現 の重 要 な調 節 機 構 と して 転 写 レベ ル の 制 御 を 中心
中 枢 抑 制 薬 で あ るモ ル ヒネ ， エ タ ノー ル や 中枢 興 奮 作
に， 遺 伝 子 上 の調 節 領 域 や そ の 部 位 に 結 合 す る転写 因子 ，
用 の あ る ア ン フ ェ タ ミン， コ カイ ンは慢 性 投 与 に よ り耐
及 び それ ら の耐 性 ，依 存 形 成 との 関 連 の 可 能 性 に つ い て
性 や 依 存 を 生 じる こ とが 古 くか ら知 られ て い る ． この耐
述べ たい．
性依存 の機構 を解明す るために， 受容体 やサ イ クリッ クAMP(cAMP)，
カル シ ウ ム， ジ グ リセ リ ドな どの セ
カ ン ドメ ッセ ンジ ャ ー と， そ れ らに よ って 活性 調節 を 受
1． 転 写 レ ベ ル の調 節 機 構 遺伝 子 発現 の調 節 に は二 種 のDNA配
列 が 必 要 と され
け る プ ロテ イ ンキ ナ ー ゼ な ど の 系 を 中 心 に 研 究 が 進 ん
る． プ ロモ ー タ ー とエ ンハ ンサ ー であ る． プ ロモ ー タ ー
だ ． モ ル ヒネ は アデ ニ レー トシ ク ラ ー ゼ抑 制 性GTP結
はmRNAを
合 タ ンパ ク質(Gi)と
示 を 与 え るDNA配
て ，cAMP量
連 関 す る オ ピエ ー ト受 容 体 を 介 し
を 減 少 させ るが ，1975年 にSharmaら1)
は 神 経 由 来 の 培 養 細 胞(NG108-15)を
用 いて， モル ヒ
作 るRNAポ
リメ ラ ーゼIIに 転 写 開 始 の 指
列 で， 転 写 開 始 点 か らす ぐ上 流 に あ
り約100塩 基 対 か ら成 っ て い る． 例 え ば ，TA-rich領 のTATAボ
ッ クス はTATAAAの
域
よ うな コ ソセ ソサ ス
ネ に よ る耐 性 ， 依 存 と禁 断 症 状 を ア デ ニ レー トシ ク ラ ー
配 列 を 持 つ プ ロモ ー ター で ，転 写 開始 点 の上 流 約 ―30付
ゼ 活 性 ，cAMP量
近 に 存 在 し方 向 性 が あ り，転 写 開 始点 を決 定 して い る ．
の 変 化 との 関 係 か ら説 明 した ． ア ン
フ ェタ ミン， コ カイ ンの作 用 につ い ては 脳 内 ア ミンで あ
こ のTATAボ
ッ ク ス に トラ ン ス 作 用 因 子 と し て ，
る ドー パ ミソを 主 とす る フ ァー ス トメ ッセ ンジ ャー系 で
TFIIDと
呼 ぼ れ る核 タ ンパ ク質 が 結 合 し，プ ロモ ー タ ー
の 解 析 が進 め られ て い る ． ドー パ ミン作 動 性 ニ ュー ロ ソ
と して 働 く． 細 胞 の 代 謝 に 基 本 的 に必 要 な ハ ウス キ ー ピ
に お い て ， コ カイ ンは ドー パ ミンの再 取 り込 み を 抑 制 す
ング遺 伝 子 の上 流 には ，プ ロモ ー ター と してTATAボ
る．また ，ア ン フ ェ タ ミンは再 取 り込 み の抑 制 と とも に ，
ク ス の 代 わ りに ㏄
ッ
ボ ックス が散 在 し，転 写 開始 点
遊 離 を 促 進 し， ドーパ ミンの効 果 を上 げ る と考 え られ て
も単 一 で な い こ とが 多 い ． プ ロモ ー ター は転 写 に必 須 の
い る2)． しか し， これ らの 薬 物 の長 期 処理 に よ って 現 わ
配 列 であ るが ，これ に 対 し，エ ンハ ソサ ー は プ ロモ ー タ ー
れ る耐 性 依 存 の 現 象 を ， 比較 的短 時 間 の反 応 で あ る ア デ
の活 性 を 調 節 す る配 列 で ， 通 常 ， プ ロモ ー タ ーの 上流 に
ニ レー トシ ク ラ ーゼ 活性 や タ ンパ ク質 リン酸 化 の研 究 の
あ る が， 開 始 点 よ り下 流 に 存 在 す る場 合 もあ り，位 置 や
み で 説 明 す るの は 困 難 で あ る． この よ うな観 点 か ら ，遺
方 向 が変 わ って も 同様 に 働 くこ とが 多 い ． また ， エ ンハ
伝 子 発 現 調 節 の 研 究 が耐 性 依 存 の機 構 を 解 明 す る上 で重
ンサ ー と同 様 に 方 向性 は な い がTATAボ
要 で あ る と思 わ れ る ．実 際 ， プ ロテ イ ンキ ナ ー ゼAあ
れ る と活 性 が減 少 す る中 間 的 配 列 もあ り， プ ロモ ー ター
る い は プ ロテ イ ンキ ナ ー ゼCが
とエ ンハ ンサ ー の機 能 を 厳 密 に 分 け る こ とは で きな い ．
遺伝 子発現 を誘導す る
ッ クス よ り離
これ らの領 域 に結 合 す る タ ンパ ク質 の相 互 作 用 や 立 体構 大阪大学医学部第一薬理学教室 (〒565吹 田市 山 田丘2-2) 原稿 受 領 日:1991年6月8日 編 集 委 員会 依 頼 総 説
造 の 変化 が転 写 調 節 に必 要 で あ る と考 え られ て い る3)． これ らの特 定 領 域 の配 列 に 結 合 す る転 写 制 御 因 子 は ゲ ル シ フ ト法 や フ ッ トプ リ ソ ト法 に よって 解 析 が 行 わ れ て
い る ， 目的 の 配 列 要 素(element)を オ リ ゴDNAを32Pで
含む数 十塩 基対 の
末 端 標 識 した後 ，核 タ ンパ ク質 と
イ ンキ ュ ベ ー トし，SDSを
含 ま な い4%程
の低濃度 ポ
∬．転 写 制 御 因 子 の構 造 転 写 制 御 因子 の構 造 は 現 在 の と こ ろ， 三 型 に 分 け られ
リア ク リル ア ミ ドゲ ル電 気 泳 動 に か け る と， タ ンパ ク質
る(図1)．
と結 合 した オ リゴDNAの
2つ
泳動 度 が 遅 くな る(シ フ トす
第 一 は ヘ リ ッ ク ス ータ ー ン・ヘ リ ッ ク ス 型 で ，
の αヘ リ ッ ク ス が β タ ー ンで つ な が っ た 構 造 を し
る)． ゲル シ フ ト法 は こ の原 理 を 用 い た ， 特 定DNAに
て お り ，α ヘ リ ッ ク ス がDNAに
結 合 す る転 写 制 御 因 子 の 存 在 を 証 明 す る簡 便 な 測定 法 で
ジ の リ プ レ ッ サ ー や ホ メ オ ボ ッ ク ス を 持 つ タ ンパ ク質 が
あ る ． タ ンパ ク質 が 結 合 した 部 位 の 塩 基 を 決 定 す るた め
この型 に属 す る ．
には ， フ ッ トプ リ ン ト法 が 用 い られ る． 核 タ ンパ ク質 と DNAを
結 合 した 後 ，DNア
ー ゼ で 処 理 し， シ ー ケ ンス
ゲ ル で電 気 泳 動 す る と， 転 写 制 御 因 子 が 結 合 した部 位 は DNア
ー ゼに よ る 消化 か ら保 護 され ，結 合 部 位 が 同定 で
検 討 され て い る ．
解 析 か ら構 造 が
コ ン セ ン サ ス 配 列 を 持 つGCボ
ク ス に 結 合 す る トラ ン ス 作 用 因 子 のSP4や
ッ
ス テ ロイ ド
レセ プ タ ー な どは 亜 鉛 分 子 を 結 合 した タ ンパ ク質 で ， Zn2+一 フ ィ ン ガ ー あ る い は メ タ ル フ ィ ン ガ ー 型 と 呼 ば れ る ．4個
きる． これ らの 転 写 因 子 の 精 製 やcDNAの
次 に ， ㏄GCGGの
結 合 す る ．ラ ム ダ フ ァ ー
の シ ス テ イ ンか ヒ ス チ ジ ン と シ ス テ イ ンが2個
ず つ亜 鉛 分 子 の 周 囲 に配 位 して結 合 した構 造 を 持 つ ． 第 三 型 は ロ イ シ ン ジ ッ パ ー と呼 ば れ る 構 造 で ， が ん 遺
Fig. 1 Schematic representation of the three structural motifs. a-Helices are represented by cylinders with arrows indicating directionality; conserved amino acid residues are shown in one-letter code. The shaded boxes indicate the regions of the proteins proposed to be involved in specific contacts to DNA. Cited from Ref. 17.
伝 子 のc―jun，c-fosやc-mycの Mycタ
産 物 で あ るJun，Fos，
ンパ ク質 な どが こ の構 造 を 持 つ こ とか ら注 目 さ
れ て い る ． ま た ， 後 に 述 べ るcAMPresponseelement (CRE)結
はCATボ
し てCCAATを
ッ ク ス(コ
持 つ)に
構 造 解 析 し ，35ア
ンセ ンサ ス配 列 と
結 合 す るC/EBPを
ミ ノ酸 中 に4∼5個
用 い て，
の ロ イ シ ソが7ア
が わ か っ た ．TREは
ヘテ ロダイマーであ る こと パ リ ン ド ロ ー ム(回
ち ， ダ イ マ ー の2つ
文 構 造)を
持
の 塩 基 性 領 域 が は さみ の様 に パ リン
ド ロ ー ム に 結 合 す る と 考 え ら れ て い る ．TPAに
よる転
写 活 性 の 増 加 は 活 性 化 さ れ た プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼCの
ミ ノ酸 ご と に ， 繰 り返 し配 位 し て い る こ と ， ま た ， コ ン
作 用 で あ る ．JunのDNA結
ピ ュ ー タ ー 検 索 か ら 他 の 多 く のDNA結
glycogensynthasekinase3に
合 タ ンパ ク 質 に
結 合 して 転 写 を 活
見 つ か った が ， 後 に ， が ん
遺 伝 子 産 物 のJunとFosの
合 タ ン パ ク 質 も ロ イ シ ン ジ ッパ ー 構 造 を 持 つ ．
McKnightら4〕
よ り ， 配 列 決 定 さ れ た ． こ のTREに 性 化 す る 因 子 と し てAP-1が
合 領 域 近 傍 の セ リ ン残 基 は よ り リ ン酸 化 さ れ て い る
も 同 様 の 構 造 が あ る こ と を 発 見 し た ． こ の ア ミ ノ酸 配 列
が ， こ の 状 態 で はJunとFosの
結 合 が 低 下 して い る ．
の αヘ リ ッ ク スを 立 体 的 に 見 る と ， 片 側 に ロ イ シ ンが
活 性 化 プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼCが
ホ ス フ ァタ ― ゼ の機 能
1列 に 並 ん だ ジ ッパ ー 構 造 に な り ， こ の ロ イ シ ン ジ ッ
を 充 進 し ，Junの
脱 リ ン酸 化 を 促 進 す る ． そ の 結 果 ，
パ ー が 同 様 の 構 造 を 持 つ 他 の タ ン パ ク質 と 平 行 し て2量
Jun/Fosヘ
体(ダ
す る と 考 え ら れ る6)． ま た ， プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼCに
イ マ ー)を
構 成 す る こ とが わ か った ． ダイ マ ー形
テ ロ ダ イ マ ー が 増 加 し，DNA結
成 に は ， 同 じ タ ンパ ク質 が ホ モ ダイ マ ー を 作 る場 合 と
りjun，fos両
TPAresponseelement(TRE)に
イ マ ー のTREへ
結 合 す るJun/Fosの
よ うに ヘ テ ロ ダイ マ ーを 形 成 す る こ とに よ って 転 写 活 性 が 増 大 す る場 合 が あ る ． ま た ， こ の ロ イ シ ン ジ ッ パ ー のN一 末 端 側 に は 正 に 荷 電 し た 塩 基 性 ア ミ ノ酸 が 多 い 領 域 が あ り， ダ イ マ ー の 形 成 に よ っ て ， そ れ ぞ れ の 塩 基 性 領 域 がDNAと
結合す る
よ
遺 伝 子 自身 の 転 写 も 増 加 す る ．Jun，Fosダ の 結 合 の 親 和 性 はJun-Fos>Jun-
Jun>>Fos-Fosの TREに
合能が上 昇
順 でJun-Fosヘ
テ ロ ダ イ マ ー は
高 親 和 性 結 合 を 示 し ， 転 写 活 性 も 高 い ．Junの
ホ モ ダイ マ ー は 結 合 も 弱 く， 活 性 も 低 い ．Fosだ ダ ィ マ ー を 形 成 せ ず ，TREに
けでは
結 合 で き な い ．Junフ
ミ リ ー に はc―Jun，JunB，JunDな
ァ
ど が あ る 。DNA結
合
よ う に 腕 を 伸 ば した 構 造 に な る と 考 え ら れ て い る ． こ の
部 位 へ の 特 異 性 は 同 じで あ る が ア ミ ノ 酸 配 列 が 異 な り，
こ と は ，circulardichroism，
転 写 活 性 に 差 が あ る ．JunB/c-Fosヘ
二 次 元NMR，
ク ロス リン
キ ン グ な ど の 解 析 か ら も 証 明 さ れ て い る5)． ケ ラ チ ン ，
写 を 抑 制 す る ．JunDは
テ ロ ダイ マ ー は転
ほ と ん どの 細 胞 で 発 現 され て い
ミオ シ ソ な ど の 繊 維 状 タ ン パ ク質 も ロ イ シ ソ ジ ッパ ー の
る ．Fosフ
よ う に 疎 水 性 ア ミ ノ酸 の 繰 り返 し構 造 を 持 つ が ，
な どが 知 られ て い る． 神経 伝 達 物 質 や 成長 因 子 の 刺 激 に
C/EBP，Jun，Fos，GCN4(酵
母 の 転 写 因 子)と
イ シ ン ジ ッパ ー と ，DNAに
い った ロ
結 合 す る塩 基 性 領 域 を 持 つ
ァ ミ リ ー と し て はc-Fos，Fra―1，Fra-2，FosB
よ り， こ れ ら の 転 写 因 子 が ダ イ マ ー を 形 成 し ， そ の 組 合 せ で 転 写 を 調 節 して い る と 思 わ れ る ．
タ ン パ ク質 は 新 し い フ ァ ミ リ ー に 属 す る と 思 わ れ る ． ロ イ シ ンジ ッパ ーを 持 つ 種 々 の転 写 因 子 が ヘ テ ロダ イマ ー を 作 る と ， そ れ ら のDNA結
合 能 だ け で は な く認 識 部 位
も 変 化 す る 可 能 性 が あ り， ダ イ マ ー を 作 る 相 手 に よ っ て
次 に ， ロ イ シ ン ジ ッ パ ー 構 造 を 持 つTRE結
合 タ ンパ
合 タ ン パ ク質 に つ い て プ ロ テ イ ン キ ナ ー
色 々 な ホ ル モ ン や 神 経 伝 達 物 質 に よ り， 細 胞 内 の サ イ 度 が 上 昇 し， そ の 結 果 ， 遺 伝 子 発 現
に 作 用 す る こ と が 知 ら れ て い る ． 大 腸 菌 で はcAMPが 直 接 ， 転 写 調 節 因 子 に 結 合 し ，DNAへ
高 等 動 物 で は ，cAMPや 合 タ ンパ ク
呼 ば れ る エ ン ハ ン サ ー はTGA(G/C)TCA
に よ っ て 転 写 因 子 を リ ン酸 化 し ， 転 写 活 性 が 高 ま る と 考 え ら れ て い る ．cAMPに
チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ(CAT)遺
遺 伝 子 上 流 の エ
ドに ，部 分 削 除 した エ ン ハ ンサ ー を つ な ぎ ，エ ン ハ ン サ ー 活 性 を 調 べ るCATア
ッ セ イ や フ ッ ト プ リ ン ト法 な ど に
役割
触 媒 サ ブ ユ ニ ッ トが 核 へ 移 行 す る こ と
の コ ンセ ン サ ス 配 列 を 持 つ ． ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル ア セ 伝 子 を 含 む プ ラス ミ
プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼAの
は ま だ 完 全 に わ か った わ け で は な い が ， プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼAの
質 TREと
の 転 写 因 子 の結
合 を 増 し ， 遺 伝 子 発 現 を 促 進 す る こ と が 知 られ て い る ．
ゼに よ る制 御 を 中 心 に 述 べ る ．
皿 ．TPAresponseelement(TRE)結
合 タ ンパ ク
質
ク リ ッ クAMP濃 転 写 活 性 を 促 進 ， 抑 制 す る こ とが 考 え られ る．
ク質 とCRE結
麗 ．cAMPresponseelement(CRE)結
配 列 一TGACGTCA一 (CRE)と
よ り転 写 活 性 が 増 加 す る
ン ハ ン サ ー 領 域 に 共 通 のDNA が 存 在 し，cAMPresponseelement
呼 ぽ れ ，TREと
同様 ， パ リン ドロー ム構 造 を
次 構 造 が リ ン酸 化 に よ り変 化 し， 他 の 転 写 因 子 との 相 互
Table 1 The CRE-sequence, 5'-TGACGTCA-3', that is conserved among cAMP-responsive genes
作 用 が 正 に 働 くの では な い か と考 え られ て い る． cAMPに
よ る 遺 伝 子 発 現 は 比 較 的 速 や か に 生 じ， シ
ク ロ ヘ キ シ ミ ドで 抑 制 さ れ な い こ と か ら ， 新 た な タ ン パ ク質 の 生 合 成 で は な く， 存 在 す る タ ン パ ク 質 の リ ン 酸 化 に よ る 修 飾 が 重 要 で あ る ． こ の リ ソ酸 化 に よ る 転 写 促 進 の 機 構 と し て ， 次 の よ うな モ デ ル が 考 え られ て い る(図 2)．CRE結 CREに
a Genes known
to be transcriptionally
regulated
cAMP. The CRE consensus sequences lined. Modified from Ref. 18.
by
合 タ ン パ ク 質 はcAMPに
サ ー と し て 働 い て い る(A)．
are under
り，CRE結
Montminyら7・8}は ゴDNAの
(B)，
ソ マ ト ス タ チ ン ， エ ン ケ フ ァ リ ン ，VIP
等 の 生 理 活 性 ペ プ チ ドの 遺 伝 子 上 流 にCREが ， ソ マ ト ス タ チ ンCREを
あ る． 含 む オ リ
ア フ ィ ニ テ ィ カ ラ ム を 用 い て ，PCI2フ
ェオ
ク ロ モ サ イ ト ー マ 細 胞 や ラ ッ ト脳 か ら ，43kDaのCRE 結 合 タ ン パ ク質(CREB)を ロ テ イ ン キ ナ ー ゼAに
精 製 し た ， こ のCREBは よ り133番
プ
目 の セ リ ン残 基 が リ ン
トア ッ セ イ の 結 果 か ら ， こ の リ ン 酸 化 に よ っ て ， の結 合 能 は変 化 せ ず ， タ ンパ ク質 の 高
Fig.
2
Models
for the mechanism
あ る い はCRE結
ク 質(DNA結
の増加 に よ
合 タ ソ パ ク 質 が 修 飾 を 受 け ，RNAポ 合 因 子 のTFIIDと
リメ
の 結 合 が増 す
合 タ ン パ ク質 が 他 の 介 在 タ ン パ
合 因 子 で は な い)と
結 合 して 高 次 構 造 を
構 成 し ， 転 写 を 促 進 す る(C)． CRE結
合 タ ン パ ク 質 は カ ル シ ウ ム/カ ル モ ジ ュ リ ン依
存 性 プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ に よ っ て も ，133番
酸 化 さ れ る9)． し か し， ゲ ル シ フ ト法 や ， フ ッ ト プ リ ン
CREBのCREへ
この 基 本 活 性 は 組 織 に 存
在 す る 転 写 因 子 の 量 に 依 存 す る ．cAMP量
ラ ー ゼIIやTATA結 持 つ(表1)．
依 存 せ ず に
結 合 し ， プ ロ モ ー タ ー に 対 し基 本 的 な エ ン ハ ン
目の セ リ ン
残 基 が リ ン 酸 化 ， 活 性 化 さ れ る こ と が 示 さ れ た10:〕 ． 従 っ て ， こ の タ ン パ ク 質 が 結 合 す るCREはcalcium responseelement(CaRE)と
も い え る ．CRE結
合 タ ン
パ ク質 は 現 在 ， 十 種 類 以 上 存 在 す る と 考 え ら れ て い る ． こ れ ら の タ ン パ ク 質 はJun，Fosと
of cAMP-stimulated
transcription.
同 様 ， ロイ シ ンジ ッ
Cited from Ref.
19.
パ ー 構 造 と 塩 基 性 ア ミノ 酸 の ク ラ ス タ ー か ら 成 るDNA 結 合 領 域 を 持 つ ． こ のCRE結
合 タ ン パ ク質 とTRE結
合 タ ン パ ク 質 の 構 造 の 類 似 性 か ら ， こ れ ら の タ ン パ ク質 は 大 き なsupergeneフ る ．CRE結
ァ ミ リー の メ ン バ ー と 考 え ら れ
合 タ ン パ ク質 は ロ イ シ ン ジ ッ パ ― を 介 し て
ホ モ ダ イ マ ー を 作 り ， ま た ， 他 の タ ン パ ク質 と も ヘ テ ロ ダイ マ ー を形 成 す る ． 最 近 ， 石 井 らDに
よ っ て 発 見 さ れ た 新 し いCRE結
タ ン パ ク 質(CRE-BP1)はJunと 成 す る ．CRE-BPIは
合
ヘ テ ロ ダイ マ ー を 形
組 織 か ら精 製 され た タ ンパ ク質 で
は な く ，CREを
プP一
ブ と し て ， ヒ ト脳 のcDNAラ
イ
ブ ラ リ―を ス ク リー ニ ン グす るサ ウ ス ウ ェ ス タ ン法 か ら 発 見 さ れ た 。 こ のcDNAク ら 成 る ，54．5kDaの
ロ ー ン は505個
の ア ミ ノ酸 か
タ ン パ ク質 を コ ー ドし， ロイ シ ン
ジ ッ パ ー 構 造 と そ のN一 末 端 側 にDNA結
合 領 域 と して ，
塩 基 性 ア ミノ 酸 の ク ラ ス タ ― が 存 在 し た ． 抗 体 を 用 い た 実 験 か ら ，CRE-BPIは
脳 ， 特 に 海 馬 に 多 く存 在 し ， プ
ロ テ イ ン キ ナ ー ゼA，Cに
よ り リン酸 化 され る こ とが 明
ら か と な っ た ． ま た ，CRE-BP1の 御 領 域 にCREが CRE-BPI自 た12㌧
遺 伝 子 上 流 の転 写 制
存 在 し，プ ロテ イ ンキ ナ ー ゼ に よ って ， 身 の 発 現 が 制 御 を 受 け る こ とが 示 唆 され
同 様 の 方 法 に よ り，Pイ
る ，38kDaのCRE結
シ ンジ ッパ ー構 造 を有 す
合 タ ン パ ク 質 が ， ヒ ト胎 盤 か ら
同 定 さ れ た131． ま た ， あ る 遺 伝 子 のCREを
Fig. 3 Gel shift assay with competitors. Nuclear extracts were prepared from NG108-15 cells. The probe and competitors used in this experiment are diagramed below the panel. CRE and THE se quences are underlined. The bands A and B derived from the Soma-CRE-protein complex are indicated by arrows. Lane 1, no nuclear extract added; lane 2, no competitor; lane 3-5, excess unlabeled Soma CRE as indicated; lane 6-8, excess unlabeled FSE TRE. Cited from Ref. 20.
含 むCAT
プ ラ ス ミ ドを ， そ の 遺 伝 子 を 持 た な い 組 織 に 入 れ て も CAT活
性 を 生 じ る こ と か ら ，CRE結
合 タ ン パ ク質 は 細
胞 に と っ て 本 質 的 な タ ン パ ク質 で あ る と い え る 。 以 上 の よ う に ，1つ ク質 は1つ
の 転 写 制 御 部 位 に 結 合 す る タ ンパ
で は な く， ま た ， タ ン パ ク質 も 互 い に 干 渉 ，
補 足 し合 って い る こ とが わ か った ．以 下 で は 我 々が 発 見 し た1本
鎖CRE結
合 タ ン パ ク 質 に つ い て 述 べ ，モ ル ヒ
ネ及 び ア ル コ ― ル中 毒 との 関 係 に つ い て も言 及 した い ． V．1本
鎖CRE結
合 タ ンパ ク質
ソ マ ト ス タ チ ンCREは
前 に も述 べ た よ う に パ リ
ン ド ロ ー ム 構 造 を 持 ち ，2本 TGACGTCA配
両 鎖 と も
列 を 含 む ． し か し ， 各 々 の1本
32Pで 標 識 し
，ゲ ル シ フ ト法 に よ っ てDNA結
質 を 調 べ る と ，1方 がNGIO8-15細 DNAか
鎖DNAの
の1本
鎖 に 強 く結 合 す る タ ン パ ク質
胞 核 に 見 つ か っ た14}．
らCRE部
この オ リ ゴ
位 を 除 く と， こ の タ ンパ ク質 の 結 合
が 減 少 す る ． 従 っ て ， こ の タ ン パ ク 質 はCREと 外 の 配 列 も 認 識 し て い る こ と を 示 唆 す る ．CREは が ，cAMPに
鎖 を
合 タ ンパ ク
反 応 し な い 遺 伝 子 も あ り(表1)，CRE以
それ以 あ る
Fig. 4 Effects of morphine or ethanol on CRE-pro tein complex formation. NG108-15 cells were in cubated for 1 hr (lane 2 4) or 48 hr (lane 5-7) with no addition (c), 50 pM morphine (Mor), and 100 mM ethanol (EtOH). Nuclear extracts from the cells were utilized for the gel shift assay. The numbers below each lane show the radioactivity of band B cut out from the gel. Cited from Ref. 20.
Fig. 5 Gel shift assay with single or double-stranded Some-CRE. NG108-15 cells were incubated for 48 hr with no addition (C), 50 pM morphine (Mor), and 100 mM ethanol (EtOH). The probes used in this experiment are diagramed below the panel. Lanes 1-4, single-stranded somatostatin CRE (Soma-ss-CRE) as probe; lanes 5-8, single-stranded complimentary somatostatin CRE (Soma-ss-cCRE) as probe; lanes 9.12, double-stranded somatostatin CRE (Soma-ds-CRE) as probe. Cited from Ref. 20.
外 の配 列 も必 要 で あ る こ とを 考 え る と， この 結 果 は 興 味
合 体 量 は これ らの 薬 物 の1時 間 処 理 で は 変 化 しな い こ と
深 い ． こ の タ ンパ ク質 が1本 鎖CREに
か ら，cAMPが
ど の様 に結 合 し
て い るか は わ か らな い が ，1本 鎖 の オ リゴDNAが
，あ
直接 に 作 用 して い る の で は な く， また ，
エ タ ノー ル の 非 特 異 的 作 用 で も な い と考 え られ る ． プ
る条 件下 で ヘ ア ピン構 造 を形 成 す る とい う報 告 が あ る い．
ロ ー ブ と してTREあ
1本 鎖CRE結
合 ， タ ンパ ク質―DNA複
合 タ ソパ ク質 が この よ うな構 造 を認 識 し
る い は2本
鎖CREを
用 い た場
合 体 量 の 減 少 は 見 られ な い こ と
て い るの か も しれ な い ． ゲル シ フ トア ッセ イ に お い て こ の1本
鎖CRE結
合 タ ンパ ク質 とCREの
本 の バ ン ドと して 検 出 さ れ た(図3)． ン ドAは
タ ンパ ク質 の ダイ マ ー を示 して い る の か も し
れ な い ． これ らの バ ン ドは 非 標 識CREを よ り減 少 す る．CREとTREの 似 して お り，TREは が ，TREは CREに
複 合 体 量 は2 移動度 の遅 いバ
加 え る こ とに
コ ソ セ ンサ ス配 列 は 類
グ ア ニ ンが1つ
欠け た構 造 を 持 つ
こ れ ら の バ ン ド と競 合 しな い こ とか ら ，
特 異 的 で あ る と考 え られ る．
モ ル ヒ ネ(50μM)あ NG108―15細
胞 を2日
る い は エ タ ノ ー ル(100mM)で 間 処 理 し， ソ マ トス タ チ ンCRE
を プ ロ ー ブ に し て ゲ ル シ フ ト法 を 用 い た ． タ ン パ ク 質 一 オ リ ゴDNA複 108―15細
合 体 量 は 有 意 に 減 少 し た(図4)．NG
胞 に お い て ， 短 期 投 与 で は ， モ ル ヒネ は ア デ
ニ レ ー ト シ ク ラ ー ゼ 活 性 を 下 げ ， エ タ ノ ー ル はcAMP 量 を 増 加 さ せ る ．1本
鎖CRE結
合 タ ン パ ク 質 一DNA複
Fig. 6 Time course for the inhibition CRE complex formation by morphine treatment. After 4 days, morphine was as indicated by an arrow, and then the cultured in the absence of morphine. Ref. 20.
of Soma or ethanol withdrawn cells were Cited from
Fig. 7 Dose-response curve for morphine or ethanol-induced changes in Soma-CRE-protein complex forma tion. A: NG108-15 cells were incubated with the indicated concentrations of morphine in the absence (-Q-) or presence (-•) of naloxone for 2 days. B: Cells were incubated with the indicated concentrations of ethanol for 2 days. Cited from Ref. 20. か ら ， こ の タ ン パ ク 質 が 特 異 的 に 変 化 し た と い え る(図 5)．
エ タ ノ ー ル の 長 期 処 理 に よ り ，GTP結
質 のGsα
のmRNA量
合 タ ンパ ク
の 減 少 が 報 告 さ れ て い る16)が ，
を 用 い て ，1本 標 識CREと PAGEを
鎖CRE結
合 タ ンパ ク質 に つ い て調 べ た ．
タ ン パ ク 質 を ク ロ ス リ ン ク し た 後 ，SDS用 い る と45kDaと50kDaの1本
鎖CRE結
現 在 の と こ ろ ， こ の タ ンパ ク質 と の 関 係 は わ か ら な い ．
合 タ ン パ ク 質 の バ ン ドを 検 出 し た ． モ ル ヒ ネ ， エ タ ノ ー
モ ル ヒ ネ ， エ タ ノ ー ル の 効 果 は 処 理 後 ，1∼2日
ル 処 理 に よ り， こ れ ら の バ ン ドは 減 少 し た ． 陰 イ オ ン交
れ た(図6)． 2日
で現わ
慢 性 投 与 後 ， モ ル ヒ ネ を 除 去 す る と1∼
で 対 照 群 の レ ベ ル に 回 復 し ，cAMP量
換(Q・ セ フ ァ ロ ー ス)，
で み られ る
1本
鎖CREア
ゲ ル ろ 過(セ
フ ァ ク リ ルS-300)，
フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム を 用 い て ， 約50
一 過 性 の増 加 は なか った ． 効 果 を 示 す モ ル ヒネ 濃 度 は ア
kDaの1本
デ ニ レー トシ ク ラ ― ゼ 活 性 に 作 用 す る 量 に一 致 して い
ン パ ク 質 は ゲ ル ろ 過 に よ っ て ， 約110∼130kDaの
る ． こ の効 果 は モ ル ヒネ拮 抗 薬 で あ るナ ロ キ ソソで 抑 制
に 溶 出 さ れ ， ダ イ マ ー か テ ト ラ マ ー を 形 成 し て い る と思
さ れ ， オ ピ エ ー ト受 容 体 を 介 す る 作 用 で あ る と 考 え ら れ
わ れ る(未
る ． ま た ，25∼50mMの
明 で あ る が ， エ ン ハ ソ サ ー のCRE領
エ タ ノ ー ル は ヒ トの ア ル コ ―
鎖CRE結
合 タ ン パ ク質 を 精 製 し た ． こ の タ
発 表 論 文)．
分画
こ の タ ンパ ク質 の 機 能 は まだ 不 域 に 結 合 し， 薬 物
ル 中 毒 時 の 血 中 濃 度 で あ り，生 理 的 な 濃 度 で タ ン パ ク質 一
の 慢 性 投 与 に よ り変 化 す る こ と か ら ， 他 のCRE結
DNA複
ン パ ク 質 と 隣 接 し てDNAに
合 体 量 が 変 化 し た と い え る(図7)．
ホ ス フ ァタ ー
合 タ
結 合 し，あ る いは ， 他 の タ
ゼ 処 理 は タ ンパ ク 質 に 影 響 し な か っ た ．こ の こ と か ら ，モ
ソ パ ク 質 と ダ イ マ ー形 成 し て ， 転 写 活 性 を 調 節 し て い る
ル ヒネ， エ タ ノ ール の 効 果 は タ ンパ ク質 の リソ酸 化 に よ
の か も しれ な い ．
る も の で は な い こ と を 示 唆 す る ． 核 抽 出 液 を10%SDS一 ポ リ ア ク リル ア ミ ド ゲ ル で 電 気 泳 動(SDS-PAGE)後
，
ニ ト ロ セ ル ロ ー ス フ ィ ル タ ー に 転 写 し ， プ ロ ー ブDNA と の 結 合 を 調 べ る サ ウ ス ウ ェ ス タ ン 法 を 用 い て ，2本 CREに
遺 伝 子 の転 写 制 御 機 構 が 初 期 に考 え られ た よ うに 単 純 鎖
結 合 す る タ ン パ ク 質 に つ い て 調 べ た ．43kDaの
タ ン パ ク 質 が2本
鎖CREに
ト脳 か ら 精 製 さ れ たCRE結
結 合 し ，PC12細
お わ りに
胞 ， ラッ
で は な く，複 数 の転 写 因 子 が 相 互 作 用 して調 節 して い る こ とが 明 らか とな って きた ． また ，CRE-BP1とJunの 結 合 な どTREとCREの
間 のcross-talkも
あ る と考 え
合 タ ンパ ク質 と同 じで あ る
られ て い る 。 これ らの転 写 因 子 と薬 物 耐 性 依 存 との 関 係
と思 わ れ る． モ ル ヒネ ， エ タ ノ ール処 理 は この タ ンパ ク
の研 究 は ， ま だ こ こで述 べ た モ ル ヒネ， エ タ ノ ール の 作
ニ トロセ ル ロー ス
用 やc-fos遺 伝 子 に 対 す る ア ンフ ェタ ミソや コ カイ ソ効
フ ィル タ ー に 吸 着 す る た め サ ウ ス ウ ェ ス タ ン 法 が 使 え な
果 の 報 告20)が あ るぽ か りで ， この 分 野 の 今 後 の発 展 が
い ． 核 抽 出 液 と1本
期 待 され る ．
質 に 影 響 しな か っ た ．1本
鎖DNAを
鎖DNAは
イ ン キ ュ ベ ー ト後 ， 紫 外
線 を 照 射 し て ク ロ ス リ ン ク さ せ るUV一
ク ロ ス リ ン ク法
謝 辞:CRE-BPIに
関 し，貴 重 な 資料 を 提 供 して頂 き ま
した理 化 学 研 究 所 の石 井 俊 輔 先 生 に 深 謝 致 し ます ． 12)
文
10) Sheng, M., McFadden, G. and Greenberg, M.E.: Membrane depolarization and calcium induce c-fos transcription via phosphorylation of transcription factor CREB. Neuron 4, 571-582 (1990) 11) Maekawa, T., Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Sudo, T., Yoshimura, T., Fujisawa, J., Yoshida, M. and Ishii, S.: Leucine zipper structure of the protein CRE-BP1
to the
EMBO
J.
Nagase,
of
AMP
response
2023-2028
T.,
region
cyclic
8,
Sodo,
Maekawa,
T.,
Yoshida,
M.
Ishii,
the
human
CRE-BP
transcriptional
T.,
regulator
response
element
element.
in
brain.
(1989)
J.,
Fujisawa,
献
1) Sharma, S.K., Klee, W.A. and Nirenberg, M.: Dual regulation of adenylate cyclase accounts for nar cotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975) 2) Koob, G.F. and Bloom, F.E.: Cellular and molecular mechanisms of drug dependence. Science 242, 715-723 (1988) 3) Maniatis, T., Goodbourn, S. and Fischer, J.A. Regulation of inducible and tissue-specific gene ex pression. Science 236, 1237-1245 (1987) 4) Landschulz, W.H., Johnson, P.F. and McKnight, S.L.: The leucine zipper: A hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science 240, 1759-1764 (1988) 5) O'Shea, E.K., Rutkowski, R. and Kim, P.S.: Evidence that the leucine zipper is a coiled coil. Science 243, 538-542 (1989) 6) Boyle, W.J., Smeal, T., Defize, L.H.K., Angel, P., Woodgett, J.R., Karin, M. and Hunter, T.: Activa tion of protein kinase c decreases phosphorylation of c-jun at sites that negatively regulate its DNA-bind ing activity. Cell 64, 573-584 (1991) 7) Montminy, M.R. and Bilezikjian, L.M.: Binding of a nuclear protein to the cyclic-AMP response ele ment of the somatostatin gene. Nature 328, 175-178 (1987) 8) Yamamoto, K.K., Gonzalez, G.A., Biggs III, W.H. and Montminy, M.R.: Phosphorylation-induced binding and transcriptional efficacy of nuclear factor CREB. Nature 334, 494-498 (1988) 9) Gonzalez, G.A. and Montminy, M.R.: Cyclic AMP stimulates somatostatin gene transcription by phosphorylation of CREB at serine 133. Cell 59, 675 -680 (1989)
binding
and
Biol.
S.:
1 gene
binding
J.
Yoshimura,
encoding
to
Chem.
T.,
Promoter
the
the
cyclic
265,
AMP
17300-17306
(1990) 13)
Hoeffler, and
J.P.,
binding tal 14)
Meyer,
Habener, protein:
cDNA.
Osugi,
T.,
morphine
H.,
174,
McMurray, Hairpin
the
human
U.S.A. 16)
causes
Miki,
N.:
cells
to
factors
to
Biophys.
W.D.
and
the
gene.
Res.
Douglass,
enhancer
Proc.
Chang,
and
F.,
Gordon,
heterologous
reducing ƒ¿5
and 10 8-15
J.
region
Natl.
of
Acad.
Sci.
L.,
Kim,
(1991) D.,
I.
NG
of nuclear
within
666-670
Diamond,
placen -
(1991) Wilson,
enkephalin
88,
a cloned
Biochem.
formation
Mochly-Rosen, M.,
binding
25-31
C.T.,
J.L. DNA
M. of
element.
Commun.
Jameson,
(1988)
Ikemoto,
on
cAMP-response
on
1430-1433
exposure
or ethanol
0.:
based
242,
chronic
Y.,
AMP-responsive
Structure
Taniura,
of
Yun,
Cyclic
Science
Effects
15)
T.E.,
J.F.:
Cheever,
A.S.:
Chronic
desensitization
messenger
RNA.
of Nature
ethanol
receptors 333,
by
848-850
(1988) 17)
Struhl,
K.:
zipper
motifs
Helix-turn-helix,
ulatory
proteins.
for
zinc-finger,
eukaryotic Trends
and
leucine
transcriptional
Biochem.
Sci.
reg
14,
137-140
(1989) 18)
Montminy,
M.R.,
Mandel,
G.
and
Sevarino,
K.A.,
Goodman,
cyclic-AMP-responsive somatostatin
19)
gene
Natl.
of
within Acad.
Sci.
W.J., Cyclic
Vandenbark, AMP
and
transcription.
J.
G.R. the
rat
U.S.A.
83,
Biol.
and
induction Chem.
Hanson,
of eukaryotic 263,
9063-9066
(1988) 20)
Graybiel, H.A.:
A.M.,
specific
activation
matrix
compartments
striatum. 6916
Moratalla,
Amphetamine
Proc. (1990)
and of
Natl.
R.
the
c-fos
and
limbic
Acad.
and
cocaine
Sci.
gene
Robertson, induce in
drug
striosome
subdivisions U.S.A.
a
the
(1986)
Roesler, R.W.:
Proc.
J.A.,
Identification
element
gene.
6682-6686
Wagner,
R.H.:
of the 87,
6912-
Abstract-Molecular mechanism of drug tolerance and dependence.Takeshi OSUGI, Mitsushi IKEMOTO, Hideo TANIURA and Naomasa MIKIDepartment of Pharmacology I, Osaka University School of Medicine, Suita, Osaka 565, Japan). Folia pharmacol. japon. 98, 187^-195 (1991) Morphine and ethanol drugs known to develop tolerance and dependence, induce changes in the adenylate cyclase system. Morphine inhibits the adenylate cyclase activity in NG 10 8-15 cells and causes increases in adenylate cyclase synthesis and the down-regulation of opiate receptors in cells treated for several days. Chronic exposure of NG108-15 cells to ethanol also causes a decrease in the mRNA of the GTP-binding protein (Gs). These observations suggest the possibility that a group of genes is expressed in response to morphine or ethanol during the acquisition of tolerance and dependence. Recently, it has been reported that cAMP regulates a number of genes through a cAMP response element (CRE) in their promotor regions and that nuclear CRE-binding proteins bind specifically to the CRE to stimulate the transcription of cAMP-responsive genes. The gel shift assay with a single stranded oligo-DNA of CRE in a somatostatin promotor region was employed to examine the possibility of transcriptional regulation of cAMP-inducible genes by chronic morphine or ethanol treatment of NG 108-15 cells. When the nuclear proteins from the cells treated with morphine or ethanol for several days were provided for the assay, the amounts of DNA-protein complex were decreased. The decreased complexes were recovered by 1 ??2 days after morphine withdrawal. The nuclear proteins were purified partially by a combination of chromatography on Q-Sepharose, Sephacryl S-300 and DNA affinity-Sepharose. Changes in CRE-binding proteins from the cells treated chronically with morphine or ethanol suggest that these drugs can modulate the expression of cAMP-inducible genes through which tolerance and dependence may develop.
薬物耐性依存の分子機構 -サ イ ク リ ッ クAMPを
介 す る遺 伝 子 発 現-
大杉
武 ，池本
光 志 ，谷浦
秀 夫 ，三 木
直正
とい う知 見 が 最 近 多 く得 られ つ つ あ る。 本稿 で は ，遺 伝 は じめ に
子 発 現 の重 要 な調 節 機 構 と して 転 写 レベ ル の 制 御 を 中心
中 枢 抑 制 薬 で あ るモ ル ヒネ ， エ タ ノー ル や 中枢 興 奮 作
に， 遺 伝 子 上 の調 節 領 域 や そ の 部 位 に 結 合 す る転写 因子 ，
用 の あ る ア ン フ ェ タ ミン， コ カイ ンは慢 性 投 与 に よ り耐
及 び それ ら の耐 性 ，依 存 形 成 との 関 連 の 可 能 性 に つ い て
性 や 依 存 を 生 じる こ とが 古 くか ら知 られ て い る ． この耐
述べ たい．
性依存 の機構 を解明す るために， 受容体 やサ イ クリッ クAMP(cAMP)，
カル シ ウ ム， ジ グ リセ リ ドな どの セ
カ ン ドメ ッセ ンジ ャ ー と， そ れ らに よ って 活性 調節 を 受
1． 転 写 レ ベ ル の調 節 機 構 遺伝 子 発現 の調 節 に は二 種 のDNA配
列 が 必 要 と され
け る プ ロテ イ ンキ ナ ー ゼ な ど の 系 を 中 心 に 研 究 が 進 ん
る． プ ロモ ー タ ー とエ ンハ ンサ ー であ る． プ ロモ ー タ ー
だ ． モ ル ヒネ は アデ ニ レー トシ ク ラ ー ゼ抑 制 性GTP結
はmRNAを
合 タ ンパ ク質(Gi)と
示 を 与 え るDNA配
て ，cAMP量
連 関 す る オ ピエ ー ト受 容 体 を 介 し
を 減 少 させ るが ，1975年 にSharmaら1)
は 神 経 由 来 の 培 養 細 胞(NG108-15)を
用 いて， モル ヒ
作 るRNAポ
リメ ラ ーゼIIに 転 写 開 始 の 指
列 で， 転 写 開 始 点 か らす ぐ上 流 に あ
り約100塩 基 対 か ら成 っ て い る． 例 え ば ，TA-rich領 のTATAボ
ッ クス はTATAAAの
域
よ うな コ ソセ ソサ ス
ネ に よ る耐 性 ， 依 存 と禁 断 症 状 を ア デ ニ レー トシ ク ラ ー
配 列 を 持 つ プ ロモ ー ター で ，転 写 開始 点 の上 流 約 ―30付
ゼ 活 性 ，cAMP量
近 に 存 在 し方 向 性 が あ り，転 写 開 始点 を決 定 して い る ．
の 変 化 との 関 係 か ら説 明 した ． ア ン
フ ェタ ミン， コ カイ ンの作 用 につ い ては 脳 内 ア ミンで あ
こ のTATAボ
ッ ク ス に トラ ン ス 作 用 因 子 と し て ，
る ドー パ ミソを 主 とす る フ ァー ス トメ ッセ ンジ ャー系 で
TFIIDと
呼 ぼ れ る核 タ ンパ ク質 が 結 合 し，プ ロモ ー タ ー
の 解 析 が進 め られ て い る ． ドー パ ミン作 動 性 ニ ュー ロ ソ
と して 働 く． 細 胞 の 代 謝 に 基 本 的 に必 要 な ハ ウス キ ー ピ
に お い て ， コ カイ ンは ドー パ ミンの再 取 り込 み を 抑 制 す
ング遺 伝 子 の上 流 には ，プ ロモ ー ター と してTATAボ
る．また ，ア ン フ ェ タ ミンは再 取 り込 み の抑 制 と とも に ，
ク ス の 代 わ りに ㏄
ッ
ボ ックス が散 在 し，転 写 開始 点
遊 離 を 促 進 し， ドーパ ミンの効 果 を上 げ る と考 え られ て
も単 一 で な い こ とが 多 い ． プ ロモ ー ター は転 写 に必 須 の
い る2)． しか し， これ らの 薬 物 の長 期 処理 に よ って 現 わ
配 列 であ るが ，これ に 対 し，エ ンハ ソサ ー は プ ロモ ー タ ー
れ る耐 性 依 存 の 現 象 を ， 比較 的短 時 間 の反 応 で あ る ア デ
の活 性 を 調 節 す る配 列 で ， 通 常 ， プ ロモ ー タ ーの 上流 に
ニ レー トシ ク ラ ーゼ 活性 や タ ンパ ク質 リン酸 化 の研 究 の
あ る が， 開 始 点 よ り下 流 に 存 在 す る場 合 もあ り，位 置 や
み で 説 明 す るの は 困 難 で あ る． この よ うな観 点 か ら ，遺
方 向 が変 わ って も 同様 に 働 くこ とが 多 い ． また ， エ ンハ
伝 子 発 現 調 節 の 研 究 が耐 性 依 存 の機 構 を 解 明 す る上 で重
ンサ ー と同 様 に 方 向性 は な い がTATAボ
要 で あ る と思 わ れ る ．実 際 ， プ ロテ イ ンキ ナ ー ゼAあ
れ る と活 性 が減 少 す る中 間 的 配 列 もあ り， プ ロモ ー ター
る い は プ ロテ イ ンキ ナ ー ゼCが
とエ ンハ ンサ ー の機 能 を 厳 密 に 分 け る こ とは で きな い ．
遺伝 子発現 を誘導す る
ッ クス よ り離
これ らの領 域 に結 合 す る タ ンパ ク質 の相 互 作 用 や 立 体構 大阪大学医学部第一薬理学教室 (〒565吹 田市 山 田丘2-2) 原稿 受 領 日:1991年6月8日 編 集 委 員会 依 頼 総 説
造 の 変化 が転 写 調 節 に必 要 で あ る と考 え られ て い る3)． これ らの特 定 領 域 の配 列 に 結 合 す る転 写 制 御 因 子 は ゲ ル シ フ ト法 や フ ッ トプ リ ソ ト法 に よって 解 析 が 行 わ れ て
い る ， 目的 の 配 列 要 素(element)を オ リ ゴDNAを32Pで
含む数 十塩 基対 の
末 端 標 識 した後 ，核 タ ンパ ク質 と
イ ンキ ュ ベ ー トし，SDSを
含 ま な い4%程
の低濃度 ポ
∬．転 写 制 御 因 子 の構 造 転 写 制 御 因子 の構 造 は 現 在 の と こ ろ， 三 型 に 分 け られ
リア ク リル ア ミ ドゲ ル電 気 泳 動 に か け る と， タ ンパ ク質
る(図1)．
と結 合 した オ リゴDNAの
2つ
泳動 度 が 遅 くな る(シ フ トす
第 一 は ヘ リ ッ ク ス ータ ー ン・ヘ リ ッ ク ス 型 で ，
の αヘ リ ッ ク ス が β タ ー ンで つ な が っ た 構 造 を し
る)． ゲル シ フ ト法 は こ の原 理 を 用 い た ， 特 定DNAに
て お り ，α ヘ リ ッ ク ス がDNAに
結 合 す る転 写 制 御 因 子 の 存 在 を 証 明 す る簡 便 な 測定 法 で
ジ の リ プ レ ッ サ ー や ホ メ オ ボ ッ ク ス を 持 つ タ ンパ ク質 が
あ る ． タ ンパ ク質 が 結 合 した 部 位 の 塩 基 を 決 定 す るた め
この型 に属 す る ．
には ， フ ッ トプ リ ン ト法 が 用 い られ る． 核 タ ンパ ク質 と DNAを
結 合 した 後 ，DNア
ー ゼ で 処 理 し， シ ー ケ ンス
ゲ ル で電 気 泳 動 す る と， 転 写 制 御 因 子 が 結 合 した部 位 は DNア
ー ゼに よ る 消化 か ら保 護 され ，結 合 部 位 が 同定 で
検 討 され て い る ．
解 析 か ら構 造 が
コ ン セ ン サ ス 配 列 を 持 つGCボ
ク ス に 結 合 す る トラ ン ス 作 用 因 子 のSP4や
ッ
ス テ ロイ ド
レセ プ タ ー な どは 亜 鉛 分 子 を 結 合 した タ ンパ ク質 で ， Zn2+一 フ ィ ン ガ ー あ る い は メ タ ル フ ィ ン ガ ー 型 と 呼 ば れ る ．4個
きる． これ らの 転 写 因 子 の 精 製 やcDNAの
次 に ， ㏄GCGGの
結 合 す る ．ラ ム ダ フ ァ ー
の シ ス テ イ ンか ヒ ス チ ジ ン と シ ス テ イ ンが2個
ず つ亜 鉛 分 子 の 周 囲 に配 位 して結 合 した構 造 を 持 つ ． 第 三 型 は ロ イ シ ン ジ ッ パ ー と呼 ば れ る 構 造 で ， が ん 遺
Fig. 1 Schematic representation of the three structural motifs. a-Helices are represented by cylinders with arrows indicating directionality; conserved amino acid residues are shown in one-letter code. The shaded boxes indicate the regions of the proteins proposed to be involved in specific contacts to DNA. Cited from Ref. 17.
伝 子 のc―jun，c-fosやc-mycの Mycタ
産 物 で あ るJun，Fos，
ンパ ク質 な どが こ の構 造 を 持 つ こ とか ら注 目 さ
れ て い る ． ま た ， 後 に 述 べ るcAMPresponseelement (CRE)結
はCATボ
し てCCAATを
ッ ク ス(コ
持 つ)に
構 造 解 析 し ，35ア
ンセ ンサ ス配 列 と
結 合 す るC/EBPを
ミ ノ酸 中 に4∼5個
用 い て，
の ロ イ シ ソが7ア
が わ か っ た ．TREは
ヘテ ロダイマーであ る こと パ リ ン ド ロ ー ム(回
ち ， ダ イ マ ー の2つ
文 構 造)を
持
の 塩 基 性 領 域 が は さみ の様 に パ リン
ド ロ ー ム に 結 合 す る と 考 え ら れ て い る ．TPAに
よる転
写 活 性 の 増 加 は 活 性 化 さ れ た プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼCの
ミ ノ酸 ご と に ， 繰 り返 し配 位 し て い る こ と ， ま た ， コ ン
作 用 で あ る ．JunのDNA結
ピ ュ ー タ ー 検 索 か ら 他 の 多 く のDNA結
glycogensynthasekinase3に
合 タ ンパ ク 質 に
結 合 して 転 写 を 活
見 つ か った が ， 後 に ， が ん
遺 伝 子 産 物 のJunとFosの
合 タ ン パ ク 質 も ロ イ シ ン ジ ッパ ー 構 造 を 持 つ ．
McKnightら4〕
よ り ， 配 列 決 定 さ れ た ． こ のTREに 性 化 す る 因 子 と し てAP-1が
合 領 域 近 傍 の セ リ ン残 基 は よ り リ ン酸 化 さ れ て い る
も 同 様 の 構 造 が あ る こ と を 発 見 し た ． こ の ア ミ ノ酸 配 列
が ， こ の 状 態 で はJunとFosの
結 合 が 低 下 して い る ．
の αヘ リ ッ ク スを 立 体 的 に 見 る と ， 片 側 に ロ イ シ ンが
活 性 化 プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼCが
ホ ス フ ァタ ― ゼ の機 能
1列 に 並 ん だ ジ ッパ ー 構 造 に な り ， こ の ロ イ シ ン ジ ッ
を 充 進 し ，Junの
脱 リ ン酸 化 を 促 進 す る ． そ の 結 果 ，
パ ー が 同 様 の 構 造 を 持 つ 他 の タ ン パ ク質 と 平 行 し て2量
Jun/Fosヘ
体(ダ
す る と 考 え ら れ る6)． ま た ， プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼCに
イ マ ー)を
構 成 す る こ とが わ か った ． ダイ マ ー形
テ ロ ダ イ マ ー が 増 加 し，DNA結
成 に は ， 同 じ タ ンパ ク質 が ホ モ ダイ マ ー を 作 る場 合 と
りjun，fos両
TPAresponseelement(TRE)に
イ マ ー のTREへ
結 合 す るJun/Fosの
よ うに ヘ テ ロ ダイ マ ーを 形 成 す る こ とに よ って 転 写 活 性 が 増 大 す る場 合 が あ る ． ま た ， こ の ロ イ シ ン ジ ッ パ ー のN一 末 端 側 に は 正 に 荷 電 し た 塩 基 性 ア ミ ノ酸 が 多 い 領 域 が あ り， ダ イ マ ー の 形 成 に よ っ て ， そ れ ぞ れ の 塩 基 性 領 域 がDNAと
結合す る
よ
遺 伝 子 自身 の 転 写 も 増 加 す る ．Jun，Fosダ の 結 合 の 親 和 性 はJun-Fos>Jun-
Jun>>Fos-Fosの TREに
合能が上 昇
順 でJun-Fosヘ
テ ロ ダ イ マ ー は
高 親 和 性 結 合 を 示 し ， 転 写 活 性 も 高 い ．Junの
ホ モ ダイ マ ー は 結 合 も 弱 く， 活 性 も 低 い ．Fosだ ダ ィ マ ー を 形 成 せ ず ，TREに
けでは
結 合 で き な い ．Junフ
ミ リ ー に はc―Jun，JunB，JunDな
ァ
ど が あ る 。DNA結
合
よ う に 腕 を 伸 ば した 構 造 に な る と 考 え ら れ て い る ． こ の
部 位 へ の 特 異 性 は 同 じで あ る が ア ミ ノ 酸 配 列 が 異 な り，
こ と は ，circulardichroism，
転 写 活 性 に 差 が あ る ．JunB/c-Fosヘ
二 次 元NMR，
ク ロス リン
キ ン グ な ど の 解 析 か ら も 証 明 さ れ て い る5)． ケ ラ チ ン ，
写 を 抑 制 す る ．JunDは
テ ロ ダイ マ ー は転
ほ と ん どの 細 胞 で 発 現 され て い
ミオ シ ソ な ど の 繊 維 状 タ ン パ ク質 も ロ イ シ ソ ジ ッパ ー の
る ．Fosフ
よ う に 疎 水 性 ア ミ ノ酸 の 繰 り返 し構 造 を 持 つ が ，
な どが 知 られ て い る． 神経 伝 達 物 質 や 成長 因 子 の 刺 激 に
C/EBP，Jun，Fos，GCN4(酵
母 の 転 写 因 子)と
イ シ ン ジ ッパ ー と ，DNAに
い った ロ
結 合 す る塩 基 性 領 域 を 持 つ
ァ ミ リ ー と し て はc-Fos，Fra―1，Fra-2，FosB
よ り， こ れ ら の 転 写 因 子 が ダ イ マ ー を 形 成 し ， そ の 組 合 せ で 転 写 を 調 節 して い る と 思 わ れ る ．
タ ン パ ク質 は 新 し い フ ァ ミ リ ー に 属 す る と 思 わ れ る ． ロ イ シ ンジ ッパ ーを 持 つ 種 々 の転 写 因 子 が ヘ テ ロダ イマ ー を 作 る と ， そ れ ら のDNA結
合 能 だ け で は な く認 識 部 位
も 変 化 す る 可 能 性 が あ り， ダ イ マ ー を 作 る 相 手 に よ っ て
次 に ， ロ イ シ ン ジ ッ パ ー 構 造 を 持 つTRE結
合 タ ンパ
合 タ ン パ ク質 に つ い て プ ロ テ イ ン キ ナ ー
色 々 な ホ ル モ ン や 神 経 伝 達 物 質 に よ り， 細 胞 内 の サ イ 度 が 上 昇 し， そ の 結 果 ， 遺 伝 子 発 現
に 作 用 す る こ と が 知 ら れ て い る ． 大 腸 菌 で はcAMPが 直 接 ， 転 写 調 節 因 子 に 結 合 し ，DNAへ
高 等 動 物 で は ，cAMPや 合 タ ンパ ク
呼 ば れ る エ ン ハ ン サ ー はTGA(G/C)TCA
に よ っ て 転 写 因 子 を リ ン酸 化 し ， 転 写 活 性 が 高 ま る と 考 え ら れ て い る ．cAMPに
チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ(CAT)遺
遺 伝 子 上 流 の エ
ドに ，部 分 削 除 した エ ン ハ ンサ ー を つ な ぎ ，エ ン ハ ン サ ー 活 性 を 調 べ るCATア
ッ セ イ や フ ッ ト プ リ ン ト法 な ど に
役割
触 媒 サ ブ ユ ニ ッ トが 核 へ 移 行 す る こ と
の コ ンセ ン サ ス 配 列 を 持 つ ． ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル ア セ 伝 子 を 含 む プ ラス ミ
プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼAの
は ま だ 完 全 に わ か った わ け で は な い が ， プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼAの
質 TREと
の 転 写 因 子 の結
合 を 増 し ， 遺 伝 子 発 現 を 促 進 す る こ と が 知 られ て い る ．
ゼに よ る制 御 を 中 心 に 述 べ る ．
皿 ．TPAresponseelement(TRE)結
合 タ ンパ ク
質
ク リ ッ クAMP濃 転 写 活 性 を 促 進 ， 抑 制 す る こ とが 考 え られ る．
ク質 とCRE結
麗 ．cAMPresponseelement(CRE)結
配 列 一TGACGTCA一 (CRE)と
よ り転 写 活 性 が 増 加 す る
ン ハ ン サ ー 領 域 に 共 通 のDNA が 存 在 し，cAMPresponseelement
呼 ぽ れ ，TREと
同様 ， パ リン ドロー ム構 造 を
次 構 造 が リ ン酸 化 に よ り変 化 し， 他 の 転 写 因 子 との 相 互
Table 1 The CRE-sequence, 5'-TGACGTCA-3', that is conserved among cAMP-responsive genes
作 用 が 正 に 働 くの では な い か と考 え られ て い る． cAMPに
よ る 遺 伝 子 発 現 は 比 較 的 速 や か に 生 じ， シ
ク ロ ヘ キ シ ミ ドで 抑 制 さ れ な い こ と か ら ， 新 た な タ ン パ ク質 の 生 合 成 で は な く， 存 在 す る タ ン パ ク 質 の リ ン 酸 化 に よ る 修 飾 が 重 要 で あ る ． こ の リ ソ酸 化 に よ る 転 写 促 進 の 機 構 と し て ， 次 の よ うな モ デ ル が 考 え られ て い る(図 2)．CRE結 CREに
a Genes known
to be transcriptionally
regulated
cAMP. The CRE consensus sequences lined. Modified from Ref. 18.
by
合 タ ン パ ク 質 はcAMPに
サ ー と し て 働 い て い る(A)．
are under
り，CRE結
Montminyら7・8}は ゴDNAの
(B)，
ソ マ ト ス タ チ ン ， エ ン ケ フ ァ リ ン ，VIP
等 の 生 理 活 性 ペ プ チ ドの 遺 伝 子 上 流 にCREが ， ソ マ ト ス タ チ ンCREを
あ る． 含 む オ リ
ア フ ィ ニ テ ィ カ ラ ム を 用 い て ，PCI2フ
ェオ
ク ロ モ サ イ ト ー マ 細 胞 や ラ ッ ト脳 か ら ，43kDaのCRE 結 合 タ ン パ ク質(CREB)を ロ テ イ ン キ ナ ー ゼAに
精 製 し た ， こ のCREBは よ り133番
プ
目 の セ リ ン残 基 が リ ン
トア ッ セ イ の 結 果 か ら ， こ の リ ン 酸 化 に よ っ て ， の結 合 能 は変 化 せ ず ， タ ンパ ク質 の 高
Fig.
2
Models
for the mechanism
あ る い はCRE結
ク 質(DNA結
の増加 に よ
合 タ ソ パ ク 質 が 修 飾 を 受 け ，RNAポ 合 因 子 のTFIIDと
リメ
の 結 合 が増 す
合 タ ン パ ク質 が 他 の 介 在 タ ン パ
合 因 子 で は な い)と
結 合 して 高 次 構 造 を
構 成 し ， 転 写 を 促 進 す る(C)． CRE結
合 タ ン パ ク 質 は カ ル シ ウ ム/カ ル モ ジ ュ リ ン依
存 性 プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ に よ っ て も ，133番
酸 化 さ れ る9)． し か し， ゲ ル シ フ ト法 や ， フ ッ ト プ リ ン
CREBのCREへ
この 基 本 活 性 は 組 織 に 存
在 す る 転 写 因 子 の 量 に 依 存 す る ．cAMP量
ラ ー ゼIIやTATA結 持 つ(表1)．
依 存 せ ず に
結 合 し ， プ ロ モ ー タ ー に 対 し基 本 的 な エ ン ハ ン
目の セ リ ン
残 基 が リ ン 酸 化 ， 活 性 化 さ れ る こ と が 示 さ れ た10:〕 ． 従 っ て ， こ の タ ン パ ク 質 が 結 合 す るCREはcalcium responseelement(CaRE)と
も い え る ．CRE結
合 タ ン
パ ク質 は 現 在 ， 十 種 類 以 上 存 在 す る と 考 え ら れ て い る ． こ れ ら の タ ン パ ク 質 はJun，Fosと
of cAMP-stimulated
transcription.
同 様 ， ロイ シ ンジ ッ
Cited from Ref.
19.
パ ー 構 造 と 塩 基 性 ア ミノ 酸 の ク ラ ス タ ー か ら 成 るDNA 結 合 領 域 を 持 つ ． こ のCRE結
合 タ ン パ ク質 とTRE結
合 タ ン パ ク 質 の 構 造 の 類 似 性 か ら ， こ れ ら の タ ン パ ク質 は 大 き なsupergeneフ る ．CRE結
ァ ミ リー の メ ン バ ー と 考 え ら れ
合 タ ン パ ク質 は ロ イ シ ン ジ ッ パ ― を 介 し て
ホ モ ダ イ マ ー を 作 り ， ま た ， 他 の タ ン パ ク質 と も ヘ テ ロ ダイ マ ー を形 成 す る ． 最 近 ， 石 井 らDに
よ っ て 発 見 さ れ た 新 し いCRE結
タ ン パ ク 質(CRE-BP1)はJunと 成 す る ．CRE-BPIは
合
ヘ テ ロ ダイ マ ー を 形
組 織 か ら精 製 され た タ ンパ ク質 で
は な く ，CREを
プP一
ブ と し て ， ヒ ト脳 のcDNAラ
イ
ブ ラ リ―を ス ク リー ニ ン グす るサ ウ ス ウ ェ ス タ ン法 か ら 発 見 さ れ た 。 こ のcDNAク ら 成 る ，54．5kDaの
ロ ー ン は505個
の ア ミ ノ酸 か
タ ン パ ク質 を コ ー ドし， ロイ シ ン
ジ ッ パ ー 構 造 と そ のN一 末 端 側 にDNA結
合 領 域 と して ，
塩 基 性 ア ミノ 酸 の ク ラ ス タ ― が 存 在 し た ． 抗 体 を 用 い た 実 験 か ら ，CRE-BPIは
脳 ， 特 に 海 馬 に 多 く存 在 し ， プ
ロ テ イ ン キ ナ ー ゼA，Cに
よ り リン酸 化 され る こ とが 明
ら か と な っ た ． ま た ，CRE-BP1の 御 領 域 にCREが CRE-BPI自 た12㌧
遺 伝 子 上 流 の転 写 制
存 在 し，プ ロテ イ ンキ ナ ー ゼ に よ って ， 身 の 発 現 が 制 御 を 受 け る こ とが 示 唆 され
同 様 の 方 法 に よ り，Pイ
る ，38kDaのCRE結
シ ンジ ッパ ー構 造 を有 す
合 タ ン パ ク 質 が ， ヒ ト胎 盤 か ら
同 定 さ れ た131． ま た ， あ る 遺 伝 子 のCREを
Fig. 3 Gel shift assay with competitors. Nuclear extracts were prepared from NG108-15 cells. The probe and competitors used in this experiment are diagramed below the panel. CRE and THE se quences are underlined. The bands A and B derived from the Soma-CRE-protein complex are indicated by arrows. Lane 1, no nuclear extract added; lane 2, no competitor; lane 3-5, excess unlabeled Soma CRE as indicated; lane 6-8, excess unlabeled FSE TRE. Cited from Ref. 20.
含 むCAT
プ ラ ス ミ ドを ， そ の 遺 伝 子 を 持 た な い 組 織 に 入 れ て も CAT活
性 を 生 じ る こ と か ら ，CRE結
合 タ ン パ ク質 は 細
胞 に と っ て 本 質 的 な タ ン パ ク質 で あ る と い え る 。 以 上 の よ う に ，1つ ク質 は1つ
の 転 写 制 御 部 位 に 結 合 す る タ ンパ
で は な く， ま た ， タ ン パ ク質 も 互 い に 干 渉 ，
補 足 し合 って い る こ とが わ か った ．以 下 で は 我 々が 発 見 し た1本
鎖CRE結
合 タ ン パ ク 質 に つ い て 述 べ ，モ ル ヒ
ネ及 び ア ル コ ― ル中 毒 との 関 係 に つ い て も言 及 した い ． V．1本
鎖CRE結
合 タ ンパ ク質
ソ マ ト ス タ チ ンCREは
前 に も述 べ た よ う に パ リ
ン ド ロ ー ム 構 造 を 持 ち ，2本 TGACGTCA配
両 鎖 と も
列 を 含 む ． し か し ， 各 々 の1本
32Pで 標 識 し
，ゲ ル シ フ ト法 に よ っ てDNA結
質 を 調 べ る と ，1方 がNGIO8-15細 DNAか
鎖DNAの
の1本
鎖 に 強 く結 合 す る タ ン パ ク質
胞 核 に 見 つ か っ た14}．
らCRE部
この オ リ ゴ
位 を 除 く と， こ の タ ンパ ク質 の 結 合
が 減 少 す る ． 従 っ て ， こ の タ ン パ ク 質 はCREと 外 の 配 列 も 認 識 し て い る こ と を 示 唆 す る ．CREは が ，cAMPに
鎖 を
合 タ ンパ ク
反 応 し な い 遺 伝 子 も あ り(表1)，CRE以
それ以 あ る
Fig. 4 Effects of morphine or ethanol on CRE-pro tein complex formation. NG108-15 cells were in cubated for 1 hr (lane 2 4) or 48 hr (lane 5-7) with no addition (c), 50 pM morphine (Mor), and 100 mM ethanol (EtOH). Nuclear extracts from the cells were utilized for the gel shift assay. The numbers below each lane show the radioactivity of band B cut out from the gel. Cited from Ref. 20.
Fig. 5 Gel shift assay with single or double-stranded Some-CRE. NG108-15 cells were incubated for 48 hr with no addition (C), 50 pM morphine (Mor), and 100 mM ethanol (EtOH). The probes used in this experiment are diagramed below the panel. Lanes 1-4, single-stranded somatostatin CRE (Soma-ss-CRE) as probe; lanes 5-8, single-stranded complimentary somatostatin CRE (Soma-ss-cCRE) as probe; lanes 9.12, double-stranded somatostatin CRE (Soma-ds-CRE) as probe. Cited from Ref. 20.
外 の配 列 も必 要 で あ る こ とを 考 え る と， この 結 果 は 興 味
合 体 量 は これ らの 薬 物 の1時 間 処 理 で は 変 化 しな い こ と
深 い ． こ の タ ンパ ク質 が1本 鎖CREに
か ら，cAMPが
ど の様 に結 合 し
て い るか は わ か らな い が ，1本 鎖 の オ リゴDNAが
，あ
直接 に 作 用 して い る の で は な く， また ，
エ タ ノー ル の 非 特 異 的 作 用 で も な い と考 え られ る ． プ
る条 件下 で ヘ ア ピン構 造 を形 成 す る とい う報 告 が あ る い．
ロ ー ブ と してTREあ
1本 鎖CRE結
合 ， タ ンパ ク質―DNA複
合 タ ソパ ク質 が この よ うな構 造 を認 識 し
る い は2本
鎖CREを
用 い た場
合 体 量 の 減 少 は 見 られ な い こ と
て い るの か も しれ な い ． ゲル シ フ トア ッセ イ に お い て こ の1本
鎖CRE結
合 タ ンパ ク質 とCREの
本 の バ ン ドと して 検 出 さ れ た(図3)． ン ドAは
タ ンパ ク質 の ダイ マ ー を示 して い る の か も し
れ な い ． これ らの バ ン ドは 非 標 識CREを よ り減 少 す る．CREとTREの 似 して お り，TREは が ，TREは CREに
複 合 体 量 は2 移動度 の遅 いバ
加 え る こ とに
コ ソ セ ンサ ス配 列 は 類
グ ア ニ ンが1つ
欠け た構 造 を 持 つ
こ れ ら の バ ン ド と競 合 しな い こ とか ら ，
特 異 的 で あ る と考 え られ る．
モ ル ヒ ネ(50μM)あ NG108―15細
胞 を2日
る い は エ タ ノ ー ル(100mM)で 間 処 理 し， ソ マ トス タ チ ンCRE
を プ ロ ー ブ に し て ゲ ル シ フ ト法 を 用 い た ． タ ン パ ク 質 一 オ リ ゴDNA複 108―15細
合 体 量 は 有 意 に 減 少 し た(図4)．NG
胞 に お い て ， 短 期 投 与 で は ， モ ル ヒネ は ア デ
ニ レ ー ト シ ク ラ ー ゼ 活 性 を 下 げ ， エ タ ノ ー ル はcAMP 量 を 増 加 さ せ る ．1本
鎖CRE結
合 タ ン パ ク 質 一DNA複
Fig. 6 Time course for the inhibition CRE complex formation by morphine treatment. After 4 days, morphine was as indicated by an arrow, and then the cultured in the absence of morphine. Ref. 20.
of Soma or ethanol withdrawn cells were Cited from
Fig. 7 Dose-response curve for morphine or ethanol-induced changes in Soma-CRE-protein complex forma tion. A: NG108-15 cells were incubated with the indicated concentrations of morphine in the absence (-Q-) or presence (-•) of naloxone for 2 days. B: Cells were incubated with the indicated concentrations of ethanol for 2 days. Cited from Ref. 20. か ら ， こ の タ ン パ ク 質 が 特 異 的 に 変 化 し た と い え る(図 5)．
エ タ ノ ー ル の 長 期 処 理 に よ り ，GTP結
質 のGsα
のmRNA量
合 タ ンパ ク
の 減 少 が 報 告 さ れ て い る16)が ，
を 用 い て ，1本 標 識CREと PAGEを
鎖CRE結
合 タ ンパ ク質 に つ い て調 べ た ．
タ ン パ ク 質 を ク ロ ス リ ン ク し た 後 ，SDS用 い る と45kDaと50kDaの1本
鎖CRE結
現 在 の と こ ろ ， こ の タ ンパ ク質 と の 関 係 は わ か ら な い ．
合 タ ン パ ク 質 の バ ン ドを 検 出 し た ． モ ル ヒ ネ ， エ タ ノ ー
モ ル ヒ ネ ， エ タ ノ ー ル の 効 果 は 処 理 後 ，1∼2日
ル 処 理 に よ り， こ れ ら の バ ン ドは 減 少 し た ． 陰 イ オ ン交
れ た(図6)． 2日
で現わ
慢 性 投 与 後 ， モ ル ヒ ネ を 除 去 す る と1∼
で 対 照 群 の レ ベ ル に 回 復 し ，cAMP量
換(Q・ セ フ ァ ロ ー ス)，
で み られ る
1本
鎖CREア
ゲ ル ろ 過(セ
フ ァ ク リ ルS-300)，
フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム を 用 い て ， 約50
一 過 性 の増 加 は なか った ． 効 果 を 示 す モ ル ヒネ 濃 度 は ア
kDaの1本
デ ニ レー トシ ク ラ ― ゼ 活 性 に 作 用 す る 量 に一 致 して い
ン パ ク 質 は ゲ ル ろ 過 に よ っ て ， 約110∼130kDaの
る ． こ の効 果 は モ ル ヒネ拮 抗 薬 で あ るナ ロ キ ソソで 抑 制
に 溶 出 さ れ ， ダ イ マ ー か テ ト ラ マ ー を 形 成 し て い る と思
さ れ ， オ ピ エ ー ト受 容 体 を 介 す る 作 用 で あ る と 考 え ら れ
わ れ る(未
る ． ま た ，25∼50mMの
明 で あ る が ， エ ン ハ ソ サ ー のCRE領
エ タ ノ ー ル は ヒ トの ア ル コ ―
鎖CRE結
合 タ ン パ ク質 を 精 製 し た ． こ の タ
発 表 論 文)．
分画
こ の タ ンパ ク質 の 機 能 は まだ 不 域 に 結 合 し， 薬 物
ル 中 毒 時 の 血 中 濃 度 で あ り，生 理 的 な 濃 度 で タ ン パ ク質 一
の 慢 性 投 与 に よ り変 化 す る こ と か ら ， 他 のCRE結
DNA複
ン パ ク 質 と 隣 接 し てDNAに
合 体 量 が 変 化 し た と い え る(図7)．
ホ ス フ ァタ ー
合 タ
結 合 し，あ る いは ， 他 の タ
ゼ 処 理 は タ ンパ ク 質 に 影 響 し な か っ た ．こ の こ と か ら ，モ
ソ パ ク 質 と ダ イ マ ー形 成 し て ， 転 写 活 性 を 調 節 し て い る
ル ヒネ， エ タ ノ ール の 効 果 は タ ンパ ク質 の リソ酸 化 に よ
の か も しれ な い ．
る も の で は な い こ と を 示 唆 す る ． 核 抽 出 液 を10%SDS一 ポ リ ア ク リル ア ミ ド ゲ ル で 電 気 泳 動(SDS-PAGE)後
，
ニ ト ロ セ ル ロ ー ス フ ィ ル タ ー に 転 写 し ， プ ロ ー ブDNA と の 結 合 を 調 べ る サ ウ ス ウ ェ ス タ ン 法 を 用 い て ，2本 CREに
遺 伝 子 の転 写 制 御 機 構 が 初 期 に考 え られ た よ うに 単 純 鎖
結 合 す る タ ン パ ク 質 に つ い て 調 べ た ．43kDaの
タ ン パ ク 質 が2本
鎖CREに
ト脳 か ら 精 製 さ れ たCRE結
結 合 し ，PC12細
お わ りに
胞 ， ラッ
で は な く，複 数 の転 写 因 子 が 相 互 作 用 して調 節 して い る こ とが 明 らか とな って きた ． また ，CRE-BP1とJunの 結 合 な どTREとCREの
間 のcross-talkも
あ る と考 え
合 タ ンパ ク質 と同 じで あ る
られ て い る 。 これ らの転 写 因 子 と薬 物 耐 性 依 存 との 関 係
と思 わ れ る． モ ル ヒネ ， エ タ ノ ール処 理 は この タ ンパ ク
の研 究 は ， ま だ こ こで述 べ た モ ル ヒネ， エ タ ノ ール の 作
ニ トロセ ル ロー ス
用 やc-fos遺 伝 子 に 対 す る ア ンフ ェタ ミソや コ カイ ソ効
フ ィル タ ー に 吸 着 す る た め サ ウ ス ウ ェ ス タ ン 法 が 使 え な
果 の 報 告20)が あ るぽ か りで ， この 分 野 の 今 後 の発 展 が
い ． 核 抽 出 液 と1本
期 待 され る ．
質 に 影 響 しな か っ た ．1本
鎖DNAを
鎖DNAは
イ ン キ ュ ベ ー ト後 ， 紫 外
線 を 照 射 し て ク ロ ス リ ン ク さ せ るUV一
ク ロ ス リ ン ク法
謝 辞:CRE-BPIに
関 し，貴 重 な 資料 を 提 供 して頂 き ま
した理 化 学 研 究 所 の石 井 俊 輔 先 生 に 深 謝 致 し ます ． 12)
文
10) Sheng, M., McFadden, G. and Greenberg, M.E.: Membrane depolarization and calcium induce c-fos transcription via phosphorylation of transcription factor CREB. Neuron 4, 571-582 (1990) 11) Maekawa, T., Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Sudo, T., Yoshimura, T., Fujisawa, J., Yoshida, M. and Ishii, S.: Leucine zipper structure of the protein CRE-BP1
to the
EMBO
J.
Nagase,
of
AMP
response
2023-2028
T.,
region
cyclic
8,
Sodo,
Maekawa,
T.,
Yoshida,
M.
Ishii,
the
human
CRE-BP
transcriptional
T.,
regulator
response
element
element.
in
brain.
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Wagner,
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Abstract-Molecular mechanism of drug tolerance and dependence.Takeshi OSUGI, Mitsushi IKEMOTO, Hideo TANIURA and Naomasa MIKIDepartment of Pharmacology I, Osaka University School of Medicine, Suita, Osaka 565, Japan). Folia pharmacol. japon. 98, 187^-195 (1991) Morphine and ethanol drugs known to develop tolerance and dependence, induce changes in the adenylate cyclase system. Morphine inhibits the adenylate cyclase activity in NG 10 8-15 cells and causes increases in adenylate cyclase synthesis and the down-regulation of opiate receptors in cells treated for several days. Chronic exposure of NG108-15 cells to ethanol also causes a decrease in the mRNA of the GTP-binding protein (Gs). These observations suggest the possibility that a group of genes is expressed in response to morphine or ethanol during the acquisition of tolerance and dependence. Recently, it has been reported that cAMP regulates a number of genes through a cAMP response element (CRE) in their promotor regions and that nuclear CRE-binding proteins bind specifically to the CRE to stimulate the transcription of cAMP-responsive genes. The gel shift assay with a single stranded oligo-DNA of CRE in a somatostatin promotor region was employed to examine the possibility of transcriptional regulation of cAMP-inducible genes by chronic morphine or ethanol treatment of NG 108-15 cells. When the nuclear proteins from the cells treated with morphine or ethanol for several days were provided for the assay, the amounts of DNA-protein complex were decreased. The decreased complexes were recovered by 1 ??2 days after morphine withdrawal. The nuclear proteins were purified partially by a combination of chromatography on Q-Sepharose, Sephacryl S-300 and DNA affinity-Sepharose. Changes in CRE-binding proteins from the cells treated chronically with morphine or ethanol suggest that these drugs can modulate the expression of cAMP-inducible genes through which tolerance and dependence may develop.
