Experimentelle Studie
Eine neue Nanofaser-Matrix für den kornealen Gewebeersatz New Nanofibrous Scaffold for Corneal Tissue Engineering
Autoren
S. Salehi 1, 2, A. K. Grünert 2, T. Bahners 1, J. S. Gutmann 1, 3, K. P. Steuhl 4, M. Czugala 2, B. B. Singer 5, T. A. Fuchsluger 2
Institute
Die Institutsangaben sind am Ende des Beitrags gelistet
Schlüsselwörter " Kornea l " Gewebeersatz l " Nanofasern l
Zusammenfassung
Abstract
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Hintergrund: Weltweit leiden circa 10 Millionen Menschen unter einem Sehverlust aufgrund eines Hornhautschadens. Im schlimmsten Fall besteht die einzige Therapieoption in einer Transplantation von kornealem Spendergewebe. In vielen Ländern existiert jedoch ein bedeutender Mangel an qualitativ geeignetem Spendergewebe, der zu verschiedenen Versuchen geführt hat, einen künstlichen Gewebeersatz zu entwickeln. In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Entwicklung einer bioabbaubaren Nanofaser-Matrix aus Poly(glycerolsebazinsäure)(PGS)/Poly(ε-Caprolakton)(PCL)-Gemisch zum kornealen Gewebeersatz. Material und Methoden: Die Nanofaser-Matrizen wurden mittels eines modifizierten Elektrospinnverfahrens hergestellt. Die Biokompatibilität des Materials wurde in vitro durch einen kolorimetrischen MTT-Test zum Nachweis der vitalen kornealen Endothelzellen (HCECs) überprüft. Um eine potentielle immunologische Reaktion gegen die Matrizen zu untersuchen, wurden Matrixproben mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) ausgesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen wurden die Zellen mittels AnnexinV-FITC/Propidiumjodid durch FACS-Analyse auf Apoptose und immunologische Reaktionen untersucht. Ergebnisse: Wir konnten erfolgreich zeigen, dass die Kultivierung von HCECs auf PGS/PCL-Matrizen möglich war. Nach 7 Tagen Kultivierung konnte mittels Mikroplattenabsorption eine signifikant höhere Zelldichte gemessen werden als an Tag 3 (p < 0,0001). Gemäß den MTT-Daten war keine Toxizität der Proben nachweisbar. Mit Hinblick auf PBMCs zeigten unsere FACS-Analysen keine Aktivierung oder Inhibierung von Apoptose und Immunreaktionen. Alle Matrix-Zusammensetzungen waren inert gegenüber naiven und aktivierten T-/B-/NK-Zellen und Monozyten. Folglich
Background: An estimated 10 million people suffer worldwide from vision loss caused by corneal damage. For the worst cases, the only available treatment is transplantation with human donor corneal tissue. However, in numerous countries there is a considerable shortage of corneal tissue of good quality, leading to various efforts to develop tissue substitutes. The present study aims to introduce a nanofibrous scaffold of poly(glycerol sebacate) PGS as a biodegradable implant, for the corneal tissue engineering. Materials and Methods: Nanofibrous scaffolds were produced from PGS and poly(ε-caprolactone) (PCL) by a modified electro-spinning process. The biocompatibility of the material was tested in vitro by colorimetric MTT assay on days 3, 5, and 7 to test the cell viability of human corneal endothelium cells (HCEC). To examine a potential immunological reaction of the scaffolds, samples were exposed to mononuclear cells derived from peripheral blood (PBMCs). After an incubation period of 3 days, supernatants were assayed for apoptotic assessment and immunogenic potentials by annexin V FITC//propidium iodide and flow-cytometric analysis. Results: We could successfully demonstrate that cultivation of HCECs on PGS/PCL scaffolds was possible. Compared to day 3, cell density determined by microplate absorbance was significantly higher after 7 days of cultivation (p < 0.0001). According to the MTT data, none of the samples showed toxicity. Apoptotic assessments by FACS analysis showed that no composition stimulated apoptosis or activated PBMCs occurred. All the compositions were inert for native as well as activated T/B/NK cells and monocytes. It can be concluded that leukocytes and their activity was not affected by the scaffolds. Conclusion: A tissue-like scaffold mimicking the human stroma could be developed. The results in-
Key words " cornea l " tissue engineering l " nanofibres l
eingereicht 28. 2. 2014 akzeptiert 5. 5. 2014 Bibliografie DOI http://dx.doi.org/ 10.1055/s-0034-1368533 Klin Monatsbl Augenheilkd 2014; 231: 626–630 © Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 0023-2165 Korrespondenzadresse Dr. Sahar Salehi, PhD Universität Duisburg-Essen Deutsches Textilforschungszentrum Nord-West gGmbH Adlerstr. 1 47798 Krefeld [email protected]
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wurden Leukozytenüberleben und ‑aktivität durch die Matrizen nicht beeinflusst. Schlussfolgerungen: Es ist uns gelungen, ein gewebeähnliches Konstrukt zu entwickeln, das dem (menschlichen) Hornhautstroma ähnelt. Die Ergebnisse zeigen, dass PGS/PCL-Matrizen eine ideale Alternative für den kornealen Gewebeersatz darstellen, da sie eine hohe Biokompatibilität mit Endothel- und Blutzellen aufweisen.
dicate that PGS/PCL scaffolds could be considered as ideal candidates for corneal tissue engineering as they are biocompatible in contact to corneal endothelial cells and blood cells.
Einleitung Es gibt eine Reihe von Krankheiten, Verletzungen und angeborenen Störungen, die zu einer Hornhautdysfunktion mit daraus resultierender Blindheit führen können [1]. Die Therapie besteht in vielen Fällen in einer Transplantation der Hornhaut eines verstorbenen Spenders. Dies ist jedoch nicht immer möglich, und es gibt praktische Gründe, die die Verwendbarkeit von Spenderhornhäuten limitieren. Spenderhornhäute unterscheiden sich insbesondere hinsichtlich ihrer Qualität, und in ca. 18 % kommt es in Folge einer immunologischen Abstoßungsreaktion zum Transplantatversagen [2, 3]. Da die Entwicklung von Ersatzgeweben einen vielversprechenden Ansatz darstellt, um den bei Spendermangel erhöhten Bedarf an Gewebe- und Organtransplantaten zu decken, haben bereits einige Gruppen versucht, ein Hornhautäquivalent in vitro und in der typischen Art der Gewebeherstellung zu konstruieren [4–6]. Korneales Ersatzgewebe dient der Kultivierung kornealer Zellen und imitiert die verschiedenen Hornhautschichten auf synthetischen Modelloberflächen [7–9]. Matrizen, als Schlüsselelement dieses Ansatzes, bieten ein Grundgerüst für die ausgesäten Zellen. Sie sollten bioabbaubar und biokompatibel sein sowie chemische und optische Eigenschaften besitzen, die für den Hornhautersatz geeignet sind. Im Falle des Hornhautstromas mit seiner einzigartigen Struktur aus parallel angeordneten Lamellen aus Kollagenfibrillen Typ I und Typ V mit einem einheitlichen Durchmesser von 32 nm sollten die Matrizen ebenso aufgebaut werden, um alle Charakteristika des Hornhautstromas nachzuahmen. Die regelmäßige Anordnung der 300–500 Stromalamellen bedingt eine hohe mechanische Stabilität und ist Voraussetzung für die Transparenz der Hornhaut. Verschiedene Spendermaterialien wurden als Hornhautersatzgewebe in Erwägung gezogen und genutzt; die Ergebnisse der meisten neueren Studien stimmen jedoch überein, dass Matrizen aus parallelen Nanofasern die beste Alternative darstellen, um die Struktur des kornealen Stromas zu imitieren. In unserer Studie stellten wir mittels Elektrospinnen eine transparente Matrix aus parallelen Nanofasern aus Poly(glycerolsebazinsäure)(PGS)/Poly(ε-Caprolakton)(PCL)-Gemisch her. Dies wurde durch eine Modifikation des etablierten Verfahrens möglich. Nach der Produktion von Matrizen mit brauchbaren physikalischen Eigenschaften [10], untersuchten wir die Morphologie und die Biokompatibilität der gesponnenen PGS/PCL-Nanofasern im Hinblick auf ihre Anwendbarkeit als Hornhautersatz.
einem Rasterelektronenmikroskop (REM) (HITACHI; S-3400N, Deutschland) untersucht. Zwei PGS/PCL-Nanofaser-Matrizen wurden in eine 24-Well-Platte gelegt, sterilisiert und anschließend mit humanen kornealen Endothelzellen (HCECs) mit einer Dichte von 104 Zellen/cm2 besät. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert und das Kulturmedium alle 48 Stunden gewechselt. Als Negativkontrolle dienten Zellen, die lediglich mit Kulturmedium inkubiert wurden. Die Stoffwechselaktivität der an die Matrix gebundenen Zellen wurde nach 3,5 und 7 Tagen Kulturdauer mittels kolorimetrischem MTT- (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolbromid)-Test bestimmt. Die Absorption wurde mithilfe eines Mikroplattenlesers (TECAN, Schweiz) bei einer Wellenlänge von 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 650 nm gemessen. Es wurden Immunfärbungen mit DAPI und Phalloidin CF™543 (Biotium, Hayward CA, USA) angefertigt und mithilfe eines konfokalen Leica DM IRE2-Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) visualisiert, um die Organisation des Zytoskeletts (beta-Aktin) der HCECs auf der Nanofasermatrix zu beurteilen. Um eine potentielle, gegen die Matrix gerichtete immunologische Reaktion zu untersuchen, wurden verschiedene Matrixproben frisch isolierten mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) gesunder Probanden ausgesetzt. Zudem wurde getestet, ob die Matrixproben einen Effekt auf schon immunologisch aktivierte PBMCs ausüben, indem man einen Teil der naiven PBMCs mit anti-CD3 (200 ng/ml, Biozol) oder IL2 (200 U/ml, Immunotools) vor-stimulierte. Die Negativkontrolle bestand aus den parallel kultivierten unbehandelten Zellen. Diese Ansätze wurden jeweils mit und ohne Matrix in 24-Well-Platten für 3 Tage in einem Zellinkubator kultiviert (37 °C, 5% CO2). Nach der Inkubation wurden die Zellen geerntet und mit Hilfe einer Annexin-VFITC/Propidiumjodid-Färbung durch durchflusszytometrische Messung in einem FACScalibur (Becton Dickinson) auf Apoptose und Veränderung der Zellgröße und ‑granularität gemessen. Der Anteil der vitalen Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt und in Histogrammen veranschaulicht. Für alle Daten wurden Mittelwerte und Standardabweichungen (standard deviation, SD) berechnet. Die statistische Signifikanz wurde mittels univariater Varianzanalyse mit anschließendem Tukey-Test mithilfe der Graphpad, Prism Software (V.5) bestimmt. Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 wurden als signifikant gewertet.
Material und Methoden
Ergebnisse
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PGS/PCL-Nanofaser-Matrizen wurden mittels eines modifizierten Elektrospinnverfahrens hergestellt. Die Morphologie der gesponnenen 300–550 nm dünnen PGS/PCL-Nanofasern wurde mit
Wir konnten erfolgreich PGS/PCL-Gemisch-Fasern mit einem Durchmesser unter 500 nm und exakt paralleler Orientierung " Abb. 1 a). Die Endprodukte waren transparent und herstellen (l
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Abb. 1 a Die Aufnahme mit dem Rasterelektronenmikroskop zeigt die parallele Anordnung der Fasern. b Ausrichtung der mit DAPI (blau, Zellkerne) und Phalloidin (gelb, F-Actin) gefärbten HCECs nach 3 Tagen Kultivierung auf der Matrix.
hatten eine dem natürlichen kornealen Stroma entsprechende Struktur [10]. Die Beurteilung des Aktin-Zytoskelett-Aufbaus und der Morphologie der HCECs auf den durch Elektrospinnen erzeugten Matrizen nach 72 Stunden zeigte, dass die Morphologie und die Aktinfilamente der Zellen signifikant durch die strukturellen Eigenschaften der Matrizen beeinflusst wurden. Auf den Fluoreszenzbildern war eine Ausrichtung und Filopodienbildung entlang der " Abb. 1 b). Faserrichtung der Matrix erkennbar (l Zudem konnten wir zeigen, dass eine Kultivierung kornealer Endothelzellen auf PGS/PCL-Matrizen möglich war. Im Vergleich zu Tag 3 konnte nach 7 Tagen Kultivierung eine signifikant höhere Zelldichte mittels Mikroplattenabsoprtion gemessen werden " Abb. 2). Entsprechend der MTT-Daten sind die (p < 0,001) (l PGS/PCL-Matrizen für Endothelzellen nicht toxisch und die Zellviabilität ist mit der Negativkontrolle vergleichbar. Unsere durchflusszytometrischen Analysen zeigten, dass die verschiedenen PGS/PCL Matrixproben Apoptose in naiven und akti" Abb. 3). In vierten PBMCs weder auslösten noch verhinderten (l den PGS/PCL behandelten, naiven PBMCs zeigte sich keine Veränderung der Zellgöße und der Zellgranularität, beides verlässliche Marker einer Lymphozytenaktivierung (Ergebnisse nicht gezeigt). In anti-CD3 und IL2 vor-behandelten PBMCs zeigte sich die Zellgröße und der Zellgranularität signifikant erhöht wobei die Gegenwart der Matrixproben wiederrum keinen Einfluss auf diese beiden Parameter hatte.
Diskussion !
Die physikalischen, chemischen und optischen Eigenschaften sowie die Abbaubarkeit der PGS/PCL-Nanofaser-Matrizen wurden bereits in einer unserer früheren Studien analysiert und publiziert [10]. Es konnte gezeigt werden, dass die Kombination dieser beiden Polymere in Form von Nanofaser-Matrizen die grundlegenden Voraussetzungen erfüllt, um als bioabbaubarer Hornhautstromaersatz (ähnlich einer Amnionmembran) zu dienen. " Abb. 1 a dargestellt, weisen die Nanofaser-Matrizen eine Wie in l Struktur auf, die dem aus parallelen Kollagen-Nanofibrillen aufgebauten Hornhautstroma ähnelt [11–13]. Allerdings galt es weiterhin, die Bio- und Immunkompatibilität der gesponnenen 300– 550 nm dünnen PGS/PCL-Nanofasern in der vorliegenden Studie zu überprüfen [14–17]. Ähnlich dem Verhalten von HUVEC-Zellen in Kontakt zu PGS und PCL [16] binden, wachsen und proliferieren ebenfalls HCEC auf PGS/PCL-Matrizen ihrem physiologischen Verhalten entsprechend [16]. Die hydrophilen Eigenschaften der Matrix begünstigen das Wachstum von HCEC [10]. Gewebezellen reagieren auf die Topografie ihres Trägermaterials, das außerdem auch als Stimulus für Zellfunktionen wirken kann [18]. Durch Färbung und durch konfokale Mikroskopie von Zellen im " Abb. 1 b), konnte Kontakt mit den Nanofaser-Matrizen (siehe l Salehi S et al. Eine neue Nanofaser-Matrix …
Abb. 2 Die zelluläre Stoffwechselaktivität der HCECs nach 7 Tagen Kultivierung auf einer PGS/PCL-Matrix (gemessen mit dem Tatrazol [MTT]-Test). Die Absorptionswerte wurden basierend auf der Absorption am ersten Tag normalisiert.
diese Beobachtung in unseren Daten bestätigt werden. Des Weiteren weist die Proliferation der Zellen je nach Faserausrichtung verschiedene Charakteristika auf (zufällig oder gerichtet) [19]. In Anbetracht dessen, dass die Matrizen in direktem Kontakt zum natürlichen Gewebe stehen sollen, muss zusätzlich zur Biokompatibilität auch eine Immunneutralität gegeben sein. Unsere Kompatibilitätsuntersuchungen zeigten, dass PGS/PCL-Nanofaser-Matrizen sowohl unschädlich als auch inert sind. In vitro wiesen sie eine gute Kompatibilität mit Endothel- und Blutzellen auf. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die PGS/PCL-Nanofasern für den kornealen Gewebeersatz analysiert. PGS als pures Polymer wurde bereits für die Geweberekonstruktion der Retina [20] und anderer, extraokulärer Weichgewebe, wie kardiales [21], vaskuläres [22] und nervales [23] Gewebe eingesetzt. Dabei zeigte es aufgrund seiner modifizierbaren mechanischen und physikalischen Eigenschaften ein gutes Potenzial. Das reine PGS hat schlechte mechanische Eigenschaften, die durch Mischen mit anderen Polymeren wie PLLA [24] oder PCL [16] verbessert werden können. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass die Mischung als PGS und PCL eine ausreichende mechanische Stabilität aufweist, um als kornealer Gewebeersatz zu dienen [25]. Aufgrund seiner Hydrophilie weist dieses Polymer außerdem eine gute Interaktion mit Zellen auf [15]. Dessen Abbaurate kann durch Modifikation der PGS/PCL-Zusammensetzung gesteuert werden, die Abbauprodukte sind nicht toxisch und werden leicht aus dem Körper entfernt [26, 27]. Andere Gruppen, die auf den Gebrauch von Nanofasern zur kornealen Geweberekonstruktion fokussiert sind, nutzen eben-
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Abb. 3 Der Anteil der vitalen, durch CD3 und IL2 stimulierten mononukleären Zellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs). Als Kontrollen dienen unstimulierte PBMCs. Nach 3 Tagen wird der höchste Viabilitätsanteil bei den unstimulierten PBMCs und bei den durch IL2 stimulierten PBMCs beobachtet.
Schlussfolgerungen !
PGS/PCL-Matrizen eignen sich gut für die Kultivierung kornealer Endothelzellen. Die Matrizen verursachen in vitro weder einen vorzeitigen Zelltod bei HCEC noch lösen sie Immunreaktionen aus. Weitere Studien zu Zell-Matrix-Interaktionen werden zur weiteren Charakterisierung derzeit unternommen.
Interessenkonflikt !
Nein.
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Deutsches Textilforschungszentrum Nord-West gGmbH, Universität Duisburg-Essen, Krefeld Augenklinik, Universitätsklinikum Düsseldorf, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf Physical Chemistry & CENIDE, Universität Duisburg-Essen, Essen Klinik für Erkrankungen des vorderen Augenabschnitts, UniversitätsAugenklinik, Essen Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Essen, Universität Duisburg-Essen, Essen
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falls das Elektrospinnen als die einfachste Methode, Nanofasern aus natürlichen und synthetischen Bipolymeren herzustellen. Nachdem festgestellt wurde, dass natürliche Polymere wie Kollagen schlechte mechanische Eigenschaften haben und durch Abbauprozesse schrumpfen [28–30], wurden zunehmend synthetische Polymere wie Poly (L-Laktidsäure) [31], Poly D,L-Laktid-CoGlykolid (PLGA) [32] oder deren Mischungen wie Gelatine/PLLA [33] eingesetzt. Dennoch erwähnten alle Gruppen, dass die Nachbildung des Hornhautstromagewebes den herausforderndsten Schritt bei der Herstellung einer künstlichen menschlichen Hornhaut darstellt. Die Herstellung einer solchen Mikrostruktur, Hauptschlüssel für biomechanische Eigenschaften und optische Transparenz des Gewebes, ist schwierig. Parallel ausgerichtete Fibrillen werden aufgrund ihrer Ähnlichkeiten zum Aufbau des Hornhautstromas, ihres großen Oberfläche:Volumen-Verhältnisses sowie ihrer anistropen mechanischen Eigenschaften als vorteilhaft für die Geweberekonstruktion angesehen [34, 35]. Auf verschiedene Art und Weise wird versucht, das Hornhautstroma zu rekonstruieren [4–6]. Dennoch verfolgen alle Ansätze das gleiche Ziel, die Struktur und die mechanischen Eigenschaften des natürlichen Gewebes so gut wie möglich zu imitieren. Da der Gebrauch von aus Schweinen gewonnenen, azellulären Substraten [36, 37] oder menschlicher Amnionmembran [38] als korneales Grundgerüst problematisch bzw. kaum standardisiert ist, wurden hydrogelbasierte, mit Epithel- und Stromazellen kokultivierte [39, 40] korneale Implantate aus Kollagen – der Grundsubstanz des kornealen Stromas – entwickelt. Griffith et al. haben umfangreich Kollagen in verschiedenen Formen und Strukturen wie z. B. rekombinantes humanes Kollagen [41], Hydrogel-Kollagen [42] und quervernetzte Kollagengele [43] analysiert, um bessere mechanische und physikalische Eigenschaften zu erhalten [44].
Experimentelle Studie
18 Discher DE, Janmey P, Wang Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science 2005; 310: 1139–1143 19 Kharaziha M, Nikkhah M, Shin SR et al. Gelatin nanofibrous scaffolds with tunable mechanical and structural properties for engineering cardiac tissues. Biomaterials 2013; 34: 6355–6366 20 Neeley WL, Redenti S, Klassen H et al. A microfabricated scaffold for retinal progenitor cell grafting. Biomaterials 2008; 29: 418–426 21 Chen QZ, Ishii H, Thouas GA et al. An elastomeric patch derived from poly(glycerol sebacate) for delivery of embryonic stem cells to the heart. Biomaterials 2010; 31: 3885–3893 22 Motlagh D, Yang J, Lui KY et al. Hemocompatibility evaluation of poly (glycerol-sebacate) in vitro for vascular tissue engineering. Biomaterials 2006; 27: 4315–4324 23 Sundback CA, Shyu JY, Wang Y et al. Biocompatibility analysis of poly (glycerol sebacate) as a nerve guide material. Biomaterials 2005; 2005: 5454–5464 24 Yi F, Lavan DA. Poly(glycerol sebacate) nanofiber scaffolds by core/shell electrospinning. Macromol Biosci 2008; 8: 803–806 25 Salehi S, Bahners T, Gutmann J et al. Characterization of structural, mechanical and nano-mechanical properties of electrospun PGS/PCL fibers. RSC Adv 2014; 4: 16 951–16 957 26 Jaafar IH, Ammar MM, Jedlicka SS et al. Spectroscopic evaluation, thermal, and thermomechanical characterization of poly(glycerol-sebacate) with variations in curing temperatures and durations. J Mater Sci 2010; 45: 2525–2529 27 Pomerantseva I, Krebs N, Hart A et al. Degradation behavior of poly (glycerol sebacate). J Biomed Mater Res A 2009; 91: 1038–1047 28 Shimmura S, Doillon CJ, Griffith M et al. Collagen-poly(N-isopropylacrylamide)-based membranes for corneal stroma scaffolds. Cornea 2003; 22 (Suppl. 7): S81–S88 29 Torbet J, Malbouyres M, Builles N et al. Orthogonal scaffold of magnetically aligned collagen lamellae for corneal stroma reconstruction. Biomaterials 2007; 28: 4268–4276 30 Phu D, Orwin EJ. Characterizing the effects of aligned collagen fibers and ascorbic acid derivatives on behavior of rabbit corneal fibroblasts. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc 2009; 2009: 4242–4245 31 Cejkova J, Trosan P, Cejka C et al. Suppression of alkali-induced oxidative injury in the cornea by mesenchymal stem cells growing on nanofiber
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Autoren
S. Salehi 1, 2, A. K. Grünert 2, T. Bahners 1, J. S. Gutmann 1, 3, K. P. Steuhl 4, M. Czugala 2, B. B. Singer 5, T. A. Fuchsluger 2
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Hintergrund: Weltweit leiden circa 10 Millionen Menschen unter einem Sehverlust aufgrund eines Hornhautschadens. Im schlimmsten Fall besteht die einzige Therapieoption in einer Transplantation von kornealem Spendergewebe. In vielen Ländern existiert jedoch ein bedeutender Mangel an qualitativ geeignetem Spendergewebe, der zu verschiedenen Versuchen geführt hat, einen künstlichen Gewebeersatz zu entwickeln. In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Entwicklung einer bioabbaubaren Nanofaser-Matrix aus Poly(glycerolsebazinsäure)(PGS)/Poly(ε-Caprolakton)(PCL)-Gemisch zum kornealen Gewebeersatz. Material und Methoden: Die Nanofaser-Matrizen wurden mittels eines modifizierten Elektrospinnverfahrens hergestellt. Die Biokompatibilität des Materials wurde in vitro durch einen kolorimetrischen MTT-Test zum Nachweis der vitalen kornealen Endothelzellen (HCECs) überprüft. Um eine potentielle immunologische Reaktion gegen die Matrizen zu untersuchen, wurden Matrixproben mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) ausgesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen wurden die Zellen mittels AnnexinV-FITC/Propidiumjodid durch FACS-Analyse auf Apoptose und immunologische Reaktionen untersucht. Ergebnisse: Wir konnten erfolgreich zeigen, dass die Kultivierung von HCECs auf PGS/PCL-Matrizen möglich war. Nach 7 Tagen Kultivierung konnte mittels Mikroplattenabsorption eine signifikant höhere Zelldichte gemessen werden als an Tag 3 (p < 0,0001). Gemäß den MTT-Daten war keine Toxizität der Proben nachweisbar. Mit Hinblick auf PBMCs zeigten unsere FACS-Analysen keine Aktivierung oder Inhibierung von Apoptose und Immunreaktionen. Alle Matrix-Zusammensetzungen waren inert gegenüber naiven und aktivierten T-/B-/NK-Zellen und Monozyten. Folglich
Background: An estimated 10 million people suffer worldwide from vision loss caused by corneal damage. For the worst cases, the only available treatment is transplantation with human donor corneal tissue. However, in numerous countries there is a considerable shortage of corneal tissue of good quality, leading to various efforts to develop tissue substitutes. The present study aims to introduce a nanofibrous scaffold of poly(glycerol sebacate) PGS as a biodegradable implant, for the corneal tissue engineering. Materials and Methods: Nanofibrous scaffolds were produced from PGS and poly(ε-caprolactone) (PCL) by a modified electro-spinning process. The biocompatibility of the material was tested in vitro by colorimetric MTT assay on days 3, 5, and 7 to test the cell viability of human corneal endothelium cells (HCEC). To examine a potential immunological reaction of the scaffolds, samples were exposed to mononuclear cells derived from peripheral blood (PBMCs). After an incubation period of 3 days, supernatants were assayed for apoptotic assessment and immunogenic potentials by annexin V FITC//propidium iodide and flow-cytometric analysis. Results: We could successfully demonstrate that cultivation of HCECs on PGS/PCL scaffolds was possible. Compared to day 3, cell density determined by microplate absorbance was significantly higher after 7 days of cultivation (p < 0.0001). According to the MTT data, none of the samples showed toxicity. Apoptotic assessments by FACS analysis showed that no composition stimulated apoptosis or activated PBMCs occurred. All the compositions were inert for native as well as activated T/B/NK cells and monocytes. It can be concluded that leukocytes and their activity was not affected by the scaffolds. Conclusion: A tissue-like scaffold mimicking the human stroma could be developed. The results in-
Key words " cornea l " tissue engineering l " nanofibres l
eingereicht 28. 2. 2014 akzeptiert 5. 5. 2014 Bibliografie DOI http://dx.doi.org/ 10.1055/s-0034-1368533 Klin Monatsbl Augenheilkd 2014; 231: 626–630 © Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 0023-2165 Korrespondenzadresse Dr. Sahar Salehi, PhD Universität Duisburg-Essen Deutsches Textilforschungszentrum Nord-West gGmbH Adlerstr. 1 47798 Krefeld [email protected]
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wurden Leukozytenüberleben und ‑aktivität durch die Matrizen nicht beeinflusst. Schlussfolgerungen: Es ist uns gelungen, ein gewebeähnliches Konstrukt zu entwickeln, das dem (menschlichen) Hornhautstroma ähnelt. Die Ergebnisse zeigen, dass PGS/PCL-Matrizen eine ideale Alternative für den kornealen Gewebeersatz darstellen, da sie eine hohe Biokompatibilität mit Endothel- und Blutzellen aufweisen.
dicate that PGS/PCL scaffolds could be considered as ideal candidates for corneal tissue engineering as they are biocompatible in contact to corneal endothelial cells and blood cells.
Einleitung Es gibt eine Reihe von Krankheiten, Verletzungen und angeborenen Störungen, die zu einer Hornhautdysfunktion mit daraus resultierender Blindheit führen können [1]. Die Therapie besteht in vielen Fällen in einer Transplantation der Hornhaut eines verstorbenen Spenders. Dies ist jedoch nicht immer möglich, und es gibt praktische Gründe, die die Verwendbarkeit von Spenderhornhäuten limitieren. Spenderhornhäute unterscheiden sich insbesondere hinsichtlich ihrer Qualität, und in ca. 18 % kommt es in Folge einer immunologischen Abstoßungsreaktion zum Transplantatversagen [2, 3]. Da die Entwicklung von Ersatzgeweben einen vielversprechenden Ansatz darstellt, um den bei Spendermangel erhöhten Bedarf an Gewebe- und Organtransplantaten zu decken, haben bereits einige Gruppen versucht, ein Hornhautäquivalent in vitro und in der typischen Art der Gewebeherstellung zu konstruieren [4–6]. Korneales Ersatzgewebe dient der Kultivierung kornealer Zellen und imitiert die verschiedenen Hornhautschichten auf synthetischen Modelloberflächen [7–9]. Matrizen, als Schlüsselelement dieses Ansatzes, bieten ein Grundgerüst für die ausgesäten Zellen. Sie sollten bioabbaubar und biokompatibel sein sowie chemische und optische Eigenschaften besitzen, die für den Hornhautersatz geeignet sind. Im Falle des Hornhautstromas mit seiner einzigartigen Struktur aus parallel angeordneten Lamellen aus Kollagenfibrillen Typ I und Typ V mit einem einheitlichen Durchmesser von 32 nm sollten die Matrizen ebenso aufgebaut werden, um alle Charakteristika des Hornhautstromas nachzuahmen. Die regelmäßige Anordnung der 300–500 Stromalamellen bedingt eine hohe mechanische Stabilität und ist Voraussetzung für die Transparenz der Hornhaut. Verschiedene Spendermaterialien wurden als Hornhautersatzgewebe in Erwägung gezogen und genutzt; die Ergebnisse der meisten neueren Studien stimmen jedoch überein, dass Matrizen aus parallelen Nanofasern die beste Alternative darstellen, um die Struktur des kornealen Stromas zu imitieren. In unserer Studie stellten wir mittels Elektrospinnen eine transparente Matrix aus parallelen Nanofasern aus Poly(glycerolsebazinsäure)(PGS)/Poly(ε-Caprolakton)(PCL)-Gemisch her. Dies wurde durch eine Modifikation des etablierten Verfahrens möglich. Nach der Produktion von Matrizen mit brauchbaren physikalischen Eigenschaften [10], untersuchten wir die Morphologie und die Biokompatibilität der gesponnenen PGS/PCL-Nanofasern im Hinblick auf ihre Anwendbarkeit als Hornhautersatz.
einem Rasterelektronenmikroskop (REM) (HITACHI; S-3400N, Deutschland) untersucht. Zwei PGS/PCL-Nanofaser-Matrizen wurden in eine 24-Well-Platte gelegt, sterilisiert und anschließend mit humanen kornealen Endothelzellen (HCECs) mit einer Dichte von 104 Zellen/cm2 besät. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert und das Kulturmedium alle 48 Stunden gewechselt. Als Negativkontrolle dienten Zellen, die lediglich mit Kulturmedium inkubiert wurden. Die Stoffwechselaktivität der an die Matrix gebundenen Zellen wurde nach 3,5 und 7 Tagen Kulturdauer mittels kolorimetrischem MTT- (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolbromid)-Test bestimmt. Die Absorption wurde mithilfe eines Mikroplattenlesers (TECAN, Schweiz) bei einer Wellenlänge von 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 650 nm gemessen. Es wurden Immunfärbungen mit DAPI und Phalloidin CF™543 (Biotium, Hayward CA, USA) angefertigt und mithilfe eines konfokalen Leica DM IRE2-Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) visualisiert, um die Organisation des Zytoskeletts (beta-Aktin) der HCECs auf der Nanofasermatrix zu beurteilen. Um eine potentielle, gegen die Matrix gerichtete immunologische Reaktion zu untersuchen, wurden verschiedene Matrixproben frisch isolierten mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) gesunder Probanden ausgesetzt. Zudem wurde getestet, ob die Matrixproben einen Effekt auf schon immunologisch aktivierte PBMCs ausüben, indem man einen Teil der naiven PBMCs mit anti-CD3 (200 ng/ml, Biozol) oder IL2 (200 U/ml, Immunotools) vor-stimulierte. Die Negativkontrolle bestand aus den parallel kultivierten unbehandelten Zellen. Diese Ansätze wurden jeweils mit und ohne Matrix in 24-Well-Platten für 3 Tage in einem Zellinkubator kultiviert (37 °C, 5% CO2). Nach der Inkubation wurden die Zellen geerntet und mit Hilfe einer Annexin-VFITC/Propidiumjodid-Färbung durch durchflusszytometrische Messung in einem FACScalibur (Becton Dickinson) auf Apoptose und Veränderung der Zellgröße und ‑granularität gemessen. Der Anteil der vitalen Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt und in Histogrammen veranschaulicht. Für alle Daten wurden Mittelwerte und Standardabweichungen (standard deviation, SD) berechnet. Die statistische Signifikanz wurde mittels univariater Varianzanalyse mit anschließendem Tukey-Test mithilfe der Graphpad, Prism Software (V.5) bestimmt. Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 wurden als signifikant gewertet.
Material und Methoden
Ergebnisse
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PGS/PCL-Nanofaser-Matrizen wurden mittels eines modifizierten Elektrospinnverfahrens hergestellt. Die Morphologie der gesponnenen 300–550 nm dünnen PGS/PCL-Nanofasern wurde mit
Wir konnten erfolgreich PGS/PCL-Gemisch-Fasern mit einem Durchmesser unter 500 nm und exakt paralleler Orientierung " Abb. 1 a). Die Endprodukte waren transparent und herstellen (l
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Experimentelle Studie
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Abb. 1 a Die Aufnahme mit dem Rasterelektronenmikroskop zeigt die parallele Anordnung der Fasern. b Ausrichtung der mit DAPI (blau, Zellkerne) und Phalloidin (gelb, F-Actin) gefärbten HCECs nach 3 Tagen Kultivierung auf der Matrix.
hatten eine dem natürlichen kornealen Stroma entsprechende Struktur [10]. Die Beurteilung des Aktin-Zytoskelett-Aufbaus und der Morphologie der HCECs auf den durch Elektrospinnen erzeugten Matrizen nach 72 Stunden zeigte, dass die Morphologie und die Aktinfilamente der Zellen signifikant durch die strukturellen Eigenschaften der Matrizen beeinflusst wurden. Auf den Fluoreszenzbildern war eine Ausrichtung und Filopodienbildung entlang der " Abb. 1 b). Faserrichtung der Matrix erkennbar (l Zudem konnten wir zeigen, dass eine Kultivierung kornealer Endothelzellen auf PGS/PCL-Matrizen möglich war. Im Vergleich zu Tag 3 konnte nach 7 Tagen Kultivierung eine signifikant höhere Zelldichte mittels Mikroplattenabsoprtion gemessen werden " Abb. 2). Entsprechend der MTT-Daten sind die (p < 0,001) (l PGS/PCL-Matrizen für Endothelzellen nicht toxisch und die Zellviabilität ist mit der Negativkontrolle vergleichbar. Unsere durchflusszytometrischen Analysen zeigten, dass die verschiedenen PGS/PCL Matrixproben Apoptose in naiven und akti" Abb. 3). In vierten PBMCs weder auslösten noch verhinderten (l den PGS/PCL behandelten, naiven PBMCs zeigte sich keine Veränderung der Zellgöße und der Zellgranularität, beides verlässliche Marker einer Lymphozytenaktivierung (Ergebnisse nicht gezeigt). In anti-CD3 und IL2 vor-behandelten PBMCs zeigte sich die Zellgröße und der Zellgranularität signifikant erhöht wobei die Gegenwart der Matrixproben wiederrum keinen Einfluss auf diese beiden Parameter hatte.
Diskussion !
Die physikalischen, chemischen und optischen Eigenschaften sowie die Abbaubarkeit der PGS/PCL-Nanofaser-Matrizen wurden bereits in einer unserer früheren Studien analysiert und publiziert [10]. Es konnte gezeigt werden, dass die Kombination dieser beiden Polymere in Form von Nanofaser-Matrizen die grundlegenden Voraussetzungen erfüllt, um als bioabbaubarer Hornhautstromaersatz (ähnlich einer Amnionmembran) zu dienen. " Abb. 1 a dargestellt, weisen die Nanofaser-Matrizen eine Wie in l Struktur auf, die dem aus parallelen Kollagen-Nanofibrillen aufgebauten Hornhautstroma ähnelt [11–13]. Allerdings galt es weiterhin, die Bio- und Immunkompatibilität der gesponnenen 300– 550 nm dünnen PGS/PCL-Nanofasern in der vorliegenden Studie zu überprüfen [14–17]. Ähnlich dem Verhalten von HUVEC-Zellen in Kontakt zu PGS und PCL [16] binden, wachsen und proliferieren ebenfalls HCEC auf PGS/PCL-Matrizen ihrem physiologischen Verhalten entsprechend [16]. Die hydrophilen Eigenschaften der Matrix begünstigen das Wachstum von HCEC [10]. Gewebezellen reagieren auf die Topografie ihres Trägermaterials, das außerdem auch als Stimulus für Zellfunktionen wirken kann [18]. Durch Färbung und durch konfokale Mikroskopie von Zellen im " Abb. 1 b), konnte Kontakt mit den Nanofaser-Matrizen (siehe l Salehi S et al. Eine neue Nanofaser-Matrix …
Abb. 2 Die zelluläre Stoffwechselaktivität der HCECs nach 7 Tagen Kultivierung auf einer PGS/PCL-Matrix (gemessen mit dem Tatrazol [MTT]-Test). Die Absorptionswerte wurden basierend auf der Absorption am ersten Tag normalisiert.
diese Beobachtung in unseren Daten bestätigt werden. Des Weiteren weist die Proliferation der Zellen je nach Faserausrichtung verschiedene Charakteristika auf (zufällig oder gerichtet) [19]. In Anbetracht dessen, dass die Matrizen in direktem Kontakt zum natürlichen Gewebe stehen sollen, muss zusätzlich zur Biokompatibilität auch eine Immunneutralität gegeben sein. Unsere Kompatibilitätsuntersuchungen zeigten, dass PGS/PCL-Nanofaser-Matrizen sowohl unschädlich als auch inert sind. In vitro wiesen sie eine gute Kompatibilität mit Endothel- und Blutzellen auf. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die PGS/PCL-Nanofasern für den kornealen Gewebeersatz analysiert. PGS als pures Polymer wurde bereits für die Geweberekonstruktion der Retina [20] und anderer, extraokulärer Weichgewebe, wie kardiales [21], vaskuläres [22] und nervales [23] Gewebe eingesetzt. Dabei zeigte es aufgrund seiner modifizierbaren mechanischen und physikalischen Eigenschaften ein gutes Potenzial. Das reine PGS hat schlechte mechanische Eigenschaften, die durch Mischen mit anderen Polymeren wie PLLA [24] oder PCL [16] verbessert werden können. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass die Mischung als PGS und PCL eine ausreichende mechanische Stabilität aufweist, um als kornealer Gewebeersatz zu dienen [25]. Aufgrund seiner Hydrophilie weist dieses Polymer außerdem eine gute Interaktion mit Zellen auf [15]. Dessen Abbaurate kann durch Modifikation der PGS/PCL-Zusammensetzung gesteuert werden, die Abbauprodukte sind nicht toxisch und werden leicht aus dem Körper entfernt [26, 27]. Andere Gruppen, die auf den Gebrauch von Nanofasern zur kornealen Geweberekonstruktion fokussiert sind, nutzen eben-
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Abb. 3 Der Anteil der vitalen, durch CD3 und IL2 stimulierten mononukleären Zellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs). Als Kontrollen dienen unstimulierte PBMCs. Nach 3 Tagen wird der höchste Viabilitätsanteil bei den unstimulierten PBMCs und bei den durch IL2 stimulierten PBMCs beobachtet.
Schlussfolgerungen !
PGS/PCL-Matrizen eignen sich gut für die Kultivierung kornealer Endothelzellen. Die Matrizen verursachen in vitro weder einen vorzeitigen Zelltod bei HCEC noch lösen sie Immunreaktionen aus. Weitere Studien zu Zell-Matrix-Interaktionen werden zur weiteren Charakterisierung derzeit unternommen.
Interessenkonflikt !
Nein.
Institute 1
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Deutsches Textilforschungszentrum Nord-West gGmbH, Universität Duisburg-Essen, Krefeld Augenklinik, Universitätsklinikum Düsseldorf, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf Physical Chemistry & CENIDE, Universität Duisburg-Essen, Essen Klinik für Erkrankungen des vorderen Augenabschnitts, UniversitätsAugenklinik, Essen Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Essen, Universität Duisburg-Essen, Essen
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falls das Elektrospinnen als die einfachste Methode, Nanofasern aus natürlichen und synthetischen Bipolymeren herzustellen. Nachdem festgestellt wurde, dass natürliche Polymere wie Kollagen schlechte mechanische Eigenschaften haben und durch Abbauprozesse schrumpfen [28–30], wurden zunehmend synthetische Polymere wie Poly (L-Laktidsäure) [31], Poly D,L-Laktid-CoGlykolid (PLGA) [32] oder deren Mischungen wie Gelatine/PLLA [33] eingesetzt. Dennoch erwähnten alle Gruppen, dass die Nachbildung des Hornhautstromagewebes den herausforderndsten Schritt bei der Herstellung einer künstlichen menschlichen Hornhaut darstellt. Die Herstellung einer solchen Mikrostruktur, Hauptschlüssel für biomechanische Eigenschaften und optische Transparenz des Gewebes, ist schwierig. Parallel ausgerichtete Fibrillen werden aufgrund ihrer Ähnlichkeiten zum Aufbau des Hornhautstromas, ihres großen Oberfläche:Volumen-Verhältnisses sowie ihrer anistropen mechanischen Eigenschaften als vorteilhaft für die Geweberekonstruktion angesehen [34, 35]. Auf verschiedene Art und Weise wird versucht, das Hornhautstroma zu rekonstruieren [4–6]. Dennoch verfolgen alle Ansätze das gleiche Ziel, die Struktur und die mechanischen Eigenschaften des natürlichen Gewebes so gut wie möglich zu imitieren. Da der Gebrauch von aus Schweinen gewonnenen, azellulären Substraten [36, 37] oder menschlicher Amnionmembran [38] als korneales Grundgerüst problematisch bzw. kaum standardisiert ist, wurden hydrogelbasierte, mit Epithel- und Stromazellen kokultivierte [39, 40] korneale Implantate aus Kollagen – der Grundsubstanz des kornealen Stromas – entwickelt. Griffith et al. haben umfangreich Kollagen in verschiedenen Formen und Strukturen wie z. B. rekombinantes humanes Kollagen [41], Hydrogel-Kollagen [42] und quervernetzte Kollagengele [43] analysiert, um bessere mechanische und physikalische Eigenschaften zu erhalten [44].
Experimentelle Studie
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