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Microbiology

Arch. Microbiol. 107, 353-356 (1976)

9 by Springer-Verlag 1976

Uber das/itherische O1 von Grfinalgen I. Die Ole der Gattung Chlorella R E I N H A R D LIERSCH Institut ffir Botanik und Pharmazeutische Biologie der Universit/it Erlangen-Nfirnberg, SchloBgarten 4, D-8520 Erlangen, Bundesrepublik Deutschland

On the Essential Oil of Green Algae I. The Oils of the Genus Chlorella

Abstract. Unicellular green algae of the genus Chlorella

are able to synthesize essential oils. Some guajanolides (i.e., proazulenes) were shown to be its main components. Certain species produce as much oil as do higher plants. Formation of essential oils can serve as a taxonomic character in the genus Chlorella. Zusarnmenfassung. Einzellige Griinalgen der Gattung Chlorella bilden /itherische Ole. Die in einem Teil

dieser Ole vorkommenden Guajanolide (Proazulene) haben sich als brauchbares taxonomisches Merkmal erwiesen. Einzelne Arten bilden gr6Benordnungsm/iBig ebenso viel ~itherisches O1 wie h6here Pflanzen. Key words: Essential oils - Green algae - Chlorella -

Kessler et al., 1968; Kessler u. Zweier, 1971; Hellmann u. Kessler, 1974), die auch durch morphologische Untersuchungen von Fott u. Novfikov~ (1969) best/itigt wurde.

MATERIAL U N D METHODEN Versuchsobjekte und Kulturbedingungen. Es wurden 88 St/imme yon Chlorella, die bei Kessler (1967), Kessler et al. (1968) und Kessler u. Zweier (1971) angegeben sind, untersucht. Die Algen wurden unter sterilen Bedingungen im Dauerlicht (4000 Lux) bei 25~ unter Begasung mit PreBluft, der 2,5 ~ COz beigemischt wurde, in modifizierten Erlenmeyer-Kolben angezogen. Die Zusammensetzung der N/ihrmedien findet sich bei Kessler u. Czygan (1970) und Kessler u. Zweier (1971). Chlorella homosphaera und C. sorokiniana 211-18 wuchsen in der normalen N~ihrl6sung nach Kessler u. Czygan (1970) unter Zusatz von 0 , 2 ~ Hefeextrakt (Merck). Die Kulturdauer betrug etwa 10 Tage.

Biochemical taxonomy. Ernte und Gewinnung der githerischen Ole. 250 ml der Algensuspen-

Sirenko u. Sakevich (1967) konnten bei Blaualgen /itherisches O1 mit monoterpenoiden Inhaltsstoffen nachweisen. Zolotovich et al. (1971) fanden auch in Griinalgen ~ihnliche Verbindungen. Als Hauptkomponente stellten sie im Dfinnschichtchromatogramm Proazulene fest. Die hRs-Werte liegen im Bereich der Prochamazulene des Kamillen61s. Bei den Proazulenen der Algen handelt es sich offensichtlich nicht um die bekannten Azulen-Vorstufen wie z.B. Matrizin. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dab die Bildung von /itherischen Olen und ,,Algen-Proazulenen" ebenso wie bei h6heren Pflanzen (Oswiecimska, 1974) als chemotaxonomisches Merkmal benutzt werden kann (Herout, 1966, 1971; Herz, 1973). Die Ergebnisse bilden eine weitere Stiitze ffir die Einteilung der Gattung Chlorella aufgrund physiologisch-biochemischer Merkmale in 12 Taxa (Kessler, 1967, 1976;

sion wurden durch Abzentrifugieren in einer Kiihlzentrifuge geerntet und das Pellet 3mal mit aqua dest. gewaschen. Zur Gewinnung der ~itherischen Ole wurden die Algen einer Hydrodestillation nach dem Deutschen Arzneibuch (1968) unterworfen. Die DestiUationsdauer betrug 2 h. Als Vorlage wurde 0,5 ml n-Hexan (Uvasol, Merck) benutzt. Aus Grfinden der Zeitersparnis wurde die Quantit/it der destillierten Ole nicht, wie vom Arzneibuch vorgeschrieben, volumetrisch, sondern gravimetrisch bestimmt.

Dfmnschichtchromatographische Untersuchung der Ole. Es wurden Kieselgel 60-Fertigplatten (Merck) ohne Fluorescenzindicator verwendet. Laufmittel: Benzol/Essigs~iure~ithylester (80/20); Spriihreagens: p-Dimethylaminobenzaldehyd in Eisessig/Phosphors/iure (Stahl, 1967; Oswiecimska, 1974).

Gaschromatographie. Es wurde ein Carlo Erba-Gaschromatograph, Mod. 2101, mit Flammenionisationsdetector (FID) und als Glassystem benutzt; S/iulenl~inge 2m, innerer Durchmesser 3 mm; Trennphase 5 ~ SE-30 auf Chromosorb W-AW; Tr/igergas Nz, DurchfluB 28 ml/min; Brenngase: Wasserstoffund synthetische Luft. Alle Gase sind nachgereinigt und stammen vonder Fa. Linde AG. Die Injektor- und Detektor-Temperatur betrug 200~ Zur Verbesserung der Trennung wurde ein lineares Temperaturprogramm von 50~176 mit einer Rate von 5~ gew~ihlt.

354 Gaschromatographisch-massenspektroskopische

Arch. Microbiol., Vol. 107 (1976)

Untersuchungen.

Massenspektrometer 270 (Perkin Elmer); 2 m Metallsiiule, innerer Durchmesser 2,5 ram; Carbowax 20 M, 1 0 ~ auf Chromosorb WAW. Tr~igergas Helium, 20 ml/min; Empfindlichkeit Totalionenstrom 100, Elektronenenergie 70 eV, Ionenquelle 150 ~C. Die fibrigen Gaschromatographie-Bedingungen entsprechen den oben genannten.

Tabelle 1. Gehalt an ~itherischem O1 ( - = < 0,1 ~ ) und Bildung von Proazulenen [(+) = schwache Farbreaktion] bei 88 ChlorellaSt/immen Art

Stature

C. fusca var. vacuolata Shihira et Krauss

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die yon Zolotovich et al. (1971) und Velev (1973) in einzelligen Grfinalgen gefundenen sesquiterpenoiden Algen-Proazulene sind auch Bestandteile des titherischen ()les verschiedener Chlorella-Arten. Insgesamt zeigen die verschiedenen St/imme der 12 ChlorellaTaxa (vgl. Kessler, 1974, 1976; Hellmann u. Kessler, 1974) jeweils ein recht einheitliches Verhalten hinsichtlich Olgehalt und Proazulen-Vorkommen, so dab sich diese Merkmale als artspezifisch und taxonomisch wertvoll erweisen (Tabelle 1). Bei Chlorellafusca sind die Varietfiten C.fusca vat. fusca und C.Jusca var. rubescens durch das Fehlen von Proazulenen klar gegenfiber C.fitsca var. vacuolata abgesetzt. Innerhalb von C.fusca var. vacuolata fallen die St~imme 211-8g und 211-11m durch einen besonders hohen Olgehalt auf (das gleiche gilt auch fiir den Stamm 398 von C. kessleri). Einige St~imme, die im Basenverh~iltnis ihrer DNS und in anderen Merkmalen (Hellmann u. Kessler, 1974; Kessler, 1974; Vinayakumar u. Kessler, 1975) nicht mit eindeutig definierten Taxa iibereinstimmen, haben sich erneut als abweichend erwiesen. Dies gilt fiJr den Stamm C-1.2.1 yon C. zofingiensis, der zwar auch Proazulene bildet, sich aber durch einen minimalen Olgehalt Von den 3 typischen St/immen dieser Art unterscheidet. Bei C. saccharophila sind die St/imme 211-1a und C-1.3.1 durch das Vorkommen yon atherischen (31en und Proazulenen klar von den 6 typischen St/immen der Art abgegrenzt (vgl. auch Soeder, 1963). Von C. vulgaris, mit der sie sonst in mancher Beziehung fibereinstimmen (Kessler, 1976), sind sie jedoch durch das Vorkommen yon Proazulenen gleichfalls deutlich verschieden. Eine gewisse Uneinheitlichkeit im Verhalten der St/imme besteht bei C. vulgaris und insbesondere bei C. sorokiniana ( = C. vulgaris f. tertia) und C.protothecoides. Diese drei Arten sind offenbar nahe miteinander verwandt (,,C. vulgaris-Gruppe": Kessler, 1976). Manches deutet darauf bin, dab sich gerade diese Gruppe von Arten im Zustand einer lebhaften Differenzierung befindet (Hellmann u. Kessler, 1974; Kessler, 1976). Diese Annahme erfiihrt dureh unsere Befunde eine weitere Untersttitzung. In Tabelle 2 sind die gesamten Ergebnisse noch einreal iibersichtlich zusammengefaBt.

des TGW

ProazulenVorkommen

0,6 1,0 0,2 0,4

+ + + +

211-8g 211-8h 211-llm 211-1In 211-15 C-1.1.10

1,5 0,4 1,8 0,6 0,I 0,1

+ + + + + (+)

343

211-8a 211-8b 211-8c 21I-8e

Ol

(G6tt.)

C. fusca var. fusca

0,4

--

Shihira et Krauss C. fusca vat. rubescens 232/1 (Dangeard) Kessler et al.

0,3

-

C. homosphaera Skuja

0,3

(+)

0,7 0,9 0,3

+ + +

21I-8e

(Cambr.) C. zofingiensis

D6nz

211-14a 211-14b 211-14c

+

C-L2.1

minutissima

C.

C-1.1.9

Fott et Novfikov~ C.

saccharophila (Krfiger) Migula

C. luteoviridis

Chodat

C. kessleri

Fott et Novb.kov~t

C.

sorokiniana Shihira et Krauss ( = C. vulgarisf tertia Fott et Nov~kovfi

211-1b 211-1c 211-1d 211-1f 211-9a 211-9b

-

-

211-1a C-1.3.1

0,2 0,3

+ +

211-2a 211-2b 211-3 211-4 211-5a 211-5b

0,1

+

211-11g 211-11h

0,1

+

0,2 0,2 0,2 0,1

+ + + +

397

0,2 0,9 0,5

+ + +

398 C-1.1.1 C-1.1.12 C-1.2.2

1,5

+

0,9 0,9 0,3

+ + + (+) +

211-Sk 211-11d 211-11k 211-32 211-33 211-34 C-1.1.8 C-1.6.7 Sless 1 Sless 2

--

0,! -

+

0,7 0,3 0,5

+ +

-

+

0,6 -

+ +

R. Liersch: Das/itherische O1 von Grfinalgen. I. Tabelle i

(Fortsetzung)

Art

C. sorokiniana

(Fortsetzung)

Stamm

O1 des TGW

ProazulenVorkommen

211-31

-

-

1-9-30

-

-

211-18

-

-

Prag

211-40a

0,5 0,2

-

211-40e

-

-

A 14

355

Chlorella

Tabelle 2 Vorkommen und Menge des ~itherischen Ols bei 12 ( + / , ) = nur bei einigen St~imrnen vorkommend Art

C. fusca C. fusca C. fusea

Proazulen- Mittleres Vorkommen Olgewicht in ~ des TGW var. v a c u o l a t a var. f u s c a var. r u b e s e e n s

Beijerinck

-

0,8 0,4 0,3 0,3 0,6

10 1 1 1 3

-

-

C. zofingiensis

211-81

0,2 0,1

--

C. minutissima

-

-

1

C. saeeharophila

-

-

6

+ +

0,2 0,7

6 7

+/-

+/-

+/-

+/+ /-

16 19 14

211-11b

Krfiger

-

211-1e 211-8m

C. protothecoides

+

Anzahl der St~imrne

(+) +

C. homosphaera C. vulgaris

Chlorella-Taxa.

-

C. luteoviridis

211-11e

-

-

C. kessleri

211-11f

--

--

C. sorokiniana

211-11j

-

--

( = C.

211-11l

--

--

C. vulgaris

211-11p

--

--

C. prototheeoides

211-11q

--

-

211-11s

--

--

21l-llt 211-12

0,2 0,2

--

211-19

--

-

211-21

--

--

395

0,1

-

396

-

-

2ll-llr

--

--

211-30

--

--

211-7a

0,2

+

211-7b

-

+

211-7c

-

+

211-7d

-

+

211-8d

-

-

211-10a

0,4 0,2 0,9 0,4

+ +

211-10b 211-10c 211-10d 211-10e

-

+

211-11a

0,3 0,1 0,5 0,4

+ + § --

211-11i 211-13 211-17

vulgaris f

tertia)

gewichtes. Auch Bergamott61 wird nur in etwa 0,5 ~ iger Ausbeute aus Citrus aurantium subspec, bergamia (= Citrus bergamia) gewonnen (Merkel, /972). Die gebildete Olmenge ist bei h6heren Pflanzen ein artspezifisches Merkmal. Die Hinweise von Sirenko u. Sakevich (1967) und Zolotovich et al. (1971) auf das Vorkommen von sekund~iren Stoffwechselprodukten in Blau-, Grfin- und Braunalgen (Fenical et al., 1972) deuten darauf hin, dab die Verbindungen auch bei diesen Organismen artspezifisch sind. Herrn Professor Dr. E. Kessler danke ich for die Anregung zu dieser Arbeit und stete Unterstfitzung. Ffir sorgf~iltige und zuverlfissige technische Assistenz d a n k e i c h besonders Frl. Gudrun Schneider und Frau Doris Liersch. Den Herren H. Brandauer und E. Ziegler (Fa. Aromachemie, Aufsel3) danke ich ffir die Aufnahme der Massenspektren und Unterstfitzung bei der Auswertung. Dem Bundesminister ffir Forschung und Technologie bin ich ffir die Unterstiitzung mit Personal- und Sachmitteln zu Dank verpflichtet.

LITERATUR

Bei C. homosphaera 21I-8e (Cambridge) konnten mit Hilfe gaschromatographisch-massenspektrometrischer Untersuchungen die Monoterpen-Kohlenwasserstoffe Limonen und Myrcen nachgewiesen werden. Im O1 von C. sorokiniana 211-8k fanden sich Limonen und der Monoterpen-Alkohol Eukalyptol (Liersch, 1975). Einige Algenarten, wie z.B.C.fusca, C. kessleri und C. zofingiensis, bilden Ole in fihnlichen Mengen wie h6here Pflanzen. Schilcher (1973) findet bei Kamillenpflanzen unterschiedlicher geographischer Herkunft Olgehalte von 0 , 4 - 1 ~ des Trocken-

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