Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 158, 149--156 (1975) © by J. :F. Bergmann, Mfinchen 1975

Phospholipase D des Getreides Dieter Nolte u n d Ludwig Acker Institut far Lebensmittelchemie tier Universitgt Miinster (BRD) Eingegangen am 15. November 1974 Phospholipase D of Cereals

Summary. Phospholipase D containing water insoluble fraction was isolated from mature barley; the enzym preparation only had weak phospholipase B activity. The phospholipase D of barley was activated by Ca~+, diethyl ether and sodium dodecyl sulphate (SDS) ; EDTA inhibited the enzym to an extent of 10% of the original activity. Diethyl ether and SDS showed an additive effect. Phospholipase D activated by CaCl~, diethyl ether and SDS exhibited a sharp optimum at pH 6.5. Lysophosphatidylcholine was hydrolysed much slower than phosphatidylcholine. Diethyl ether and SDS also increased the breakdown of the lysophosphatidyleholine. Zusammen]assung. Ans reifer Gerste wurde eine Phospholipase D-haltige, wasserunlSsliche Fraktion gewonnen, die weitgehend ffei yon Phospholipase B-Aktivitat war. Die Phospholipase D der Gerste wurde durch Calcinmionen, Di~thyliither und Na-dodecyl-h~drogensulfat (I~a-DHS) aktiviert; EDTA hemmte die Phospholipase D auf 10% der Aktivit~t. ~ther nnd Na:.DHS verst~rkten sich gegenseitig in ihren aktivierenden Eigenschaften. Die durch CaCI2, Ather und Na-DHS aktivierte Phospholipase D der Gerste wies ein ausgcpriigtes pH-Optimum bei pH 6,5 auf. Lysolecithin wurde wesentlich langsamer abgebaut als Lecithin. Zusatz yon Ather und Na-DHS beschleunigte den Abbau des Lysoleeithins.

Einleitung Der enzymatisehe Abbau yon Lecithin bei Einwirkung wiiflriger Cerealienextrakte wurde zunachst ausschlieBlieh der Tatigkeit einer Phospholipase D zugeschrieben [1, 2]. Acker u. Bfikking [3] konnten dann in Ausziigen aus Griinmalz, in denen zuvor die hSchsten ,,Phospholipase D-Aktivit~ten" gefunden worden waren, eine wesentlich aktivere Phospholipase B nachweisen. Nach den Untersuehungen yon Acker u. Mfiller [4] spalten w~13rige Auszfige aus Griinmalz Lecithin wesentlieh sehneller in Fettsauren und Glycerophosphoryleholin als in Phosphatids~uren und freies Cholin. Im Rahmen frfiherer Untersuchungen war es nicht gelungen, die Phospholipase I) aus Cerealienextrakten anzureiehern und somit frei yon Fremdaktivit~ten, insbesondere frei yon Phospholipase B, zu untersuchen. Auch die Frage, ob Phospholipase D in 15slicher Form oder an unlSsliche Zellbestandteile gebunden im Getreide vorliegt, kennte bisher nicht zufriedenstellend gelSst werden.

Methedik Darstellung der Substrate (Lecithin und LysolecithlnJ Hochgereinigtes Lecithin durch Saulenehromatographie an Kieselgel nnd nachfolgend an DEAE-Cellulose aus Eilecithin des Handels nach einer Arbeitsvorsehrift yon Rebmann [5]; Lysolecithin aus gereinigtem Lecithin dnreh Hydrolyse mit Phospholipase A aus Schlangengift (Crotalus atrox, Serva).

Versuche zum Lecithlnabbau Den enzymhaltigen Extrakten oder Suspensionen in einem Zweihalsrundkolben bei 25°C unter meeh~nischem Rfihren mit einem KPG-Riihrer zun~chst die Aktivatoren -- in der Regel CaCI-LSsnng und J k t h e r - und dann das Substrat in Form einer w~Brigen LSsung zusetzen. In bestimmten Zeitabstanden einen aliquoien Tell des Ansatzes entnehmen und in siedendem Isopropanol inaktivieren.

Bestimmung des Cholins I)as im inaktivierten Enzymansatz vorliegende freie Cholin - - nach Abtrennung nnlSslicher Bestandteile dureh Zentrifugieren - - fiber einen Kationenaustauscher, Lewatit S-1O0, abtrennen. Das auf der Austauschers~ule adsorbierte Cholin anschlieBend mit einer KaliumnitratlSsung eluieren. Im Eluat das Cholin im AnsehinB an einen Aufschlul3 mit 20%iger Salpeters~ure nach tier Methode yon Appleton [6], in einer modifizierten Arbeitsweise, photometrisch als Enncajodid bestimmen.

Ergebnisse Z u r G e w i n n u n g eines angereicherten E n z y m p r a p a r a t e s eignet sich Griinmalz aus d e n eingangs sldzzierten Grfinden nicht. A u f g r u n d frfiherer U n t e r s u c h u n g e n b o t e n sich Weizen u n d reife, u n g e k e i m t e Gersto an. I n wal~rigen Auszfigen dieser beiden

150 Getreidearten konnten jedoch unter den angewandten Bedingungen keine mel~baren Phospholipase D-Aktivit~ten ermittelt werden. Dagegen wurden bei Einwirkung w~l~riger Schrotsuspensionen von Weizen und Gerste auf Lecithin zwar geringe, aber gut mel3bare Aktivit~ten gefunden. Die Spaltungsgrade, bezogen auf das im zugesetzten Lecithin gebundene Cholin, iibertrafen die Hydrolyscrate, die sieh aus der Freisetzung der Fettsiiuren errechnet, um ein Mehrfaehes. Die Phospholipase D mul~te an un15sliche Zellbestandteile gebunden sein. Versuche zur tterstellung eines partiell gereinigten und angereicherten Phospholipase D-Pri~parates aus Gctreide mul3ten demnach yon den Suspensionen der Getreidehomogenate ausgehen.

Gewinnung einer Phospholipase D-alctiven 2'ralctiou Nach den Untersuchungen yon Acker u. Geyer [7] hi~ngt das InlSsunggehen der Phospholipase B der Gerste offensichtlich yon der Art und der Intensit~t der Zerkleinerung des Getreides ab. Es wurde deshalb geprfift, ob bei starker mechanischer Einwirkung (Ultra-Turrax-Ger~t, 10000 U/rain) die Phospholipase D an den unlSslichen Zellbestandteflen verbleibt, sieh zwisehen LSsung und unlSsliehem Rfickstand verteilt oder verst~rkt in LSsung geht. Zu diesem Zweck wurde Lecithin mit einem w~flrigen Auszug aus Gerstenschrot, mit einer Suspension des Gerstenhomogenates sowie mit dem Zentrifugat eines Gerstenhomogenates incubiert. Das Zentrifugat wurde insgesamt zweimal mit einer AcetatpufferlSsung, pit 5,6, ausgcwasehen. Bebriitet wurde in acetatgepufferter L..Ssungbei pit 5,6. Als Aktivatoren wurden Calciumionen in Form von CaC12 (0,05 tool/l) und Ather (2 ml pro 50 ml) zugegeben. Das Substrat, hochgereinigtes Eilecithin, wurde in Wasser gelSst und 30 rain mit Ultraschall behandelt.

100

abgespaltenes Cholin in %

2

9O

70 6O

5O

40

2O

10

I

2

4

6

8 Z e i t in S t u n d e n

Abb. 1. Verfolgung der Phospholipase D-Aktivit~ eines w~Brigen Auszuges eincs Gerstenschrotes (1), einer Gerstenschrotsuspension (2) und des Zentrifugats eines Gerstcnhomogenates, zweimal mit Acetatpuffer ausgewaschen (3), angegeben in Prozent des im Substrat gebundenen Cholins (40 mg Lecithin = 7,08 mg Cholinchlorid pro 50 ml)

151 Der weitaus gr6Ste Tefl der Phospholipase D bleibt unter diesen Zerkleinerungsbedingungen an wasserunl6sliche Zellbestandteile gebunden (vgl. Abb. 1). Zentrifugierte w/~Brige Auszfige aus reifer Gerste enthalten zwar eine meSbare, aber im Vergleich zu den Suspensionen wesentlich geringere Aktivit/it.

abgespaltenes 100 - Cholin

in

%

90-

80-

70-

f

A

60-

50-

40-

30-

20-

t0o i

I

1

2

3

4

Z e i t in Stunden

Abb. 2. Verfolgung der Phospholipase D-Aktivit~ nach fraktionierter Siebung eines Gerstenhomogenates, angegeben in Prozent des im zugesetzten Lecithin gebundenen Cholins (46 rag Lecithin = 7,08 mg Cholinchlorid pro 50 ml); pK 5,6; 1 = ausgewaschener Siebrfickstand, 2 = Zentrifugat des Siebdurehlaufs

Da der weitaus grSl~te Tefl der Phospholipase D i m wasserunlSslichen Rfickstand verbleibt, lassen sich F/£11ungen mit Ammoniumsulfat oder Aceton nicht zur Am'eL cherung verwenden. Es muSten somit andere, unkonventione]le Methoden gefunden werden. Die Auftrennung der Schrotpartikel und der Zellfragmente aufgrund untersehiedlieher Dichte, d. h. aufgrund untersehiedliehen Sedimentationsverhaltens, ffihrte zu keinem Erfolg. Dagegen lies sieh durch Nal~siebung einer w/~l~rigen Schrotsuspension eine Fraktionierung naeh PartikelgrSl3e erreichen. Verwendet wurde ein Siebsatz ,,Analysette", der Fa. Fritsch, mit verstellbarer Sehwingungsamplitude, in den insgesamt drei Siebe mit Maschenweiten yon 0,250, 0,125 und 0,063 mm eingespannt wurden. Lecithinabbauversuehe mit den gewonnenen Fraktionen ergaben, dal~ der Siebdurehlauf, eine milchig aussehende Suspension, East die gesamte Phospholipase D-Aktivit/it enthielt. Der Siebrfickstand, bestehend aus Spelzen- und Kleiematerial, lieferte nur einen geringen Beitrag zur Gesamtaktivit/£t (Abb. 2). Dutch die fraktionierte Siebung lieS sieh dieses mehr oder weniger inaktive Zellmaterial vo]lst/£ndig yon den Phospholipase D-haltigen Zellpartike]n abtrennen.

152 Durch Zentrifugieren des Phospholipase D-haltigen Siebdurehlaufs bei 6400 g konnte eine nochmalige Trennung in zwei Fraktionen erreicht werden, und zwar in eine lest zusammengebackene Stgrkeschicht und in eine darfiberliegende graue, in sich homogen erscheinende Schicht. Diese lief~ sich sauber yon der St~rkesehicht abheben. Die Phospholipase D-Aktivit~t dieser Fraktion war vergleichbar mit der eines Gerstenhomogenates aus der gleichen Menge Getreide. Durch Geffiertrocknung liel~ sieh ein Enzympri~parat gewinnen, das weitgehend frei yon Phospholipase BAktivitgt war, eine wichtige Voraussetzung ffir die folgenden Untersuehungen zur Charakterisierung der Phospholipase D der Gerste. Ausgehend yon 100 g Gerstenschrot, bezogen auf Trockensubstanz, wurden 2 0 - 2 3 g des angereicherten Trockenpr~parates gewonnen, das tfir vergleichende Untersuchungen eingesetzt wurde.

Einflufi yon E~elctoren au] den Lecithinabbau Calciumionen: Calcinmionen haben ~fir den Nachweis und fiir die Messung yon Aktivit~ten der wasserlSslichen Phospholipase D unterschiedlicher Provenienzen grol~e Bedeutung [8, 9]. Dagegen kommt man bei Einwirkung yon isolierten Plastiden aus Karotten oder Spinat auf Lecithin auch ohne Zusatz yon Calciumionen - ledig]ich durch Aktivierung mit Di~thyl~ther - zu g~t me]3baren Aktivit~ten. Es wurde deshalb geprfift, ob der Zusatz yon Calciumionen eine Voraussetzung ffir die T~tigkeit der Phospholipase D der Gerste darstellt bzw. ob eine Abh~ngigkeit yon der Calciumionenkonzentration besteht und ob es eine optimale Wirkkonzentration gibt. Wie man aus Tab. 1 sieht, stellt der Zusatz yon Calcinmionen ffir die T~tigkeit der Phospholipase D der Gerste keine unbedingte Voraussetzung dar (Tub. 1). Eine Steigerung der Aktiviti~t wurde jedoch bei Zusatz yon Calciumionen in einer Konzentration yon 1 0 - 3 0 retool/1 beobachtet, wobei die hSchste Steigerungsrate bei einer Konzentration yon 10 retool/1 erreieht wurde. Konzentrationen fiber etwa 30 retool/1 bewirkten gegenfiber den Versuchen ohne CaC12-Zugabe eine schwache Itemmung.

Tabelle 1. Abh~ngigkei~ der Lecithinhydrolyse durc.h Phospholipase D der Gerste yon der Calciumionenkonzentration; pH 5,6; Zusatz yon 2 ml Ather pro 50 ml (40 nag Lecithin ~-- 7,08 mg Cholinchlorid pro 50 ml) Zeit Std

Ca~+-Konzentrationen in retool/1 0 10 20 30 40 abgespaltenes Cholin, ber. als Cholinchlorid in mg

50

1 3

2,27 2,89

1,75 2,09

2,75 3,82

2,49 3,12

2,38 3,12

2,28 2,87

Digthylgther: Diathylather wird bei den meisten Versuchen zum enzymatischen Abbau yon Lecithinen dnrch Phospholipase D als Aktivator zugesetzt. Die Zugabe yon J~ther zur Enzymsuspension f6rdert auch die Leci~hinhydrolyse durch die Phospholipase D der Gerste. Um eine roll wirksame Ak~ivit~tssteigerung zu erzielen, war jedoch ein Zusatz yon mindestens 5 Vol.-% zur Enzymsuspension efforderlich. Da Wasser etwa 7,5 Vol.-% Xther aufnehmen kann, vollzieht sich bei einem Zusatz in dieser Menge der Lecithinabbau noeh in einem Ein-Phasen-System. Interessant ist, dab Xtherzus~tze yon 10 und 20 Vol.-% zu keiner merklichen Erniedrigung der Abbaurate ffihrten, obwohl ein Zwei-Phasen-System (~thergesi~tt. H20/X~her ) vorlag mud das Lecithin wghrend der Incubation sich zwischen Ather- und Wasserphase verteflte. Diese Ergebnisse decken sich mit den meisten Untersuchungen anderer Autoren fiber den EinfiuB des J~thers auf die Phospholipase D-T~tigkeit [10, 11]

153

Na.dodecylhydrogensul]at (Na-DHS): Kates [ 10] sowie Dawson u. Hemington [ l l ] konnten durch Zusatz anionischer Detergentien, insbesondere yon Na-dodeeylsulfat, die AktiviC.i~t sowohl der plastidengebundenen ~ls aueh der 15slichen Phospholipase D wesentlieh steigern. U m den Einflul~ yon Na-DHS auf den Leeith:mabbau dureh die Phospholipase D der Gerste zu bestimmen, wurden 50 und 100 mg N a - D H S zum Substrat bzw. zum Substmt und zur EnzymlSsung hinzugegeben. Na-DHS wurde zusammen mi~ dem Lecithin eingewogen und in Wasser gelSst. Hierbei entstand eine vSllig klare SubstratlSsung. Aufgrund der Ergebnisse dieser Versuche liii~t sieh sagen, dab N a - D H S den Lecithinabbau dureh Phospholipase D der Gerste wesen~lieh besehleunigt. Die Verdoppelung des Zusatzes zum Substrat bewirkte ebenfalls eine Verdoppelung der Abbaurate. Die Steigerung korrelierte jedoch nieht mi~ der absoluten Menge an Na-DHS im Ineubations~nsatz ; vielmehr bewirkte der gleichzeitige Zusatz zur Enzymsuspension gegenfiber denVersuchen, in denen Na-DHS lediglieh dem Substrat zugegeben wurde, eine geringffigige Hemmung. ~ther und Na-DHS: ~ t h e r und Iqa-DHS verst~rkten sich in ihren aktivierenden Eigenschaften. Dies war durchaus zu erwarten, zumal die Wirkung des J~thers dann zur Geltung kommt, wenn er der Enzymsuspension zugesetzt wird, wohingegen N a - D H S zweckm£1~igerweise lediglieh der Substra~lSsung beigegeben wird. Es ist bemerkenswert, daI3 Zus~tze yon 50 mg N a - D H S und 1,25 ml Ather pro Ansatz

t abgespaltenes = =, ~ ~ ~ 5 100 Cholin in %

--=

6

8070

60

.

/

/

o

3

50

40

f ~ ,

2

30

20 10

j

~

J

I

10

2O

30

~

I

40 50 Zeit in Minuten

Abb. 3. Zeitlieher Verlauf der Abspal~ung..von Oholin aus Lecithin durch Phospholipase D der Gerste in AbhEngigkeit untersehiedlieher Ather- und Na-DHS-Zu~tze; Angabe in Prozen~ des

im zugesetzten Lecithin gebundenen Cholins (40 mg Lecithin = 7,08 mg Cholinehlorid pro 50 ml) ; pH 5,6. - - Menge EnzymprEpara~ pro Ansatz (50 ml): Versuch 1--5:2,3 g; Versuch 6:1,25 g. - Aktivatoren: 1 = 1,25 ml J~ther; 2 = 2,5 ml ~_ther; 3 --~ 100 mg Na-D..HS; 4 -~ 1,25 ml ~ther + 50 mg Na-DHS; 5 = 2,5 ml A~her + 50 mg Na-DHS; 6 = 2,5 ml Ather + 50 mg Na-DHS

154 (50 ml), die, fiir sich allein zugegeben, nur eine geringe Abbaur~te bewirkten, zusummen eine vollsti~ndige Abspaitung des Cholins im gleichen Zeitr~um zur Folge batten. Bei Zus~tzen yon 2,5 ml )~ther und 50 mg Na-DttS pro Ansatz (50 ml) warde trotz ttalbierung der eingesetzten Menge an Enzympri~purat das zugesetzte Lecithin nach lstfindiger Incubation vollstgndig gespalten. Hydrolysegrad in% 60

50

40

30

20

10

I

4

5

--

I

I

6

7

pH

Abb. 4. pH-Optimum der Phospholipase D der Gerste, mit CaC12,Ather und ~a-DHS als Aktivatoren; Incubationszeit: 10 rain (40 mg Lecithin = 7,08 mg Cholinchlorid pro 50 ml)

Phospholipase D-Aktivitiit der Gerste in Abhgngigl~eit unterschiedlicher Jl'ther- und Na-DHS-ZusStze Dutch Zusatz yon Dii~thyl£ther und 57a-DtIS als besonders wirksame Aktivatoren konnte der Zeitbed~ff I/ir cine vollst~ndige Aufspaltung des Lecithins yon mehreren Stunden - ffiihere Incubationen nahmen his zu 72 Std in Anspruch - au~ weniger als 1 Std, wie gezeigt wurde, gesenkt werden. Damit lie9 sich der zeitliche Verlauf der Cholinabspaltung in Abhi~ngigkeit unterschiedlicher ~ther- und Na-DItS-Zus~tze veffolgen. Die Proben warden nach 10, 20 und 45 rain bzw. 5, 15 und 30 rain entnommen. Auf einen Blindwert zum Zeitpunkt ~qull konnte verzichtet werden, da das Enzympr~p~rat kein freies Cholin enthielt. Die Ergebnisse sind in Abb. 3 zusammengefal~t. Bemerkenswert ist die erhebliehe Steigerung der Anfangsphase der Lecithinhydrolyse dutch gleichzeitige Zug~be yon J~ther und Na-DHS (Vers. 4 - 6 ) im Vergleich zur Aktivierung lediglich mit ~ t h e r (Vers. I u. 2 ) o d o r Na-DHS (Vers. 3). Bereits nach 20 rain war die Lecithinhydrolyse vollsti~ndig abgeschlossen (Vers. 5).

155 Die Frage, ob Ather und Na-DHS eine Aktivierung des Enzyms oder lediglich ekne bessere Verteilung des Lecithins in der IneubationslSsung bewirken, kann aufgrund diesel" Versuehe nieht beantwortet werden.

pH-Optimum der Phospholipase D der Gerste Versuche zum enzymatischen Abbau yon Lecithin durch Phospholipase D werden im allgemeinen bei p i t 5,6 durchge~fihrt. Das pH-Optimum der Phospholipase D verschiedener Provenienzen liegt n~mlich ziem]ich einheitlich zwischen p H 5 und 6 [12]. Die Versuche zur Bestimmung des Wirkungsoptimums wurden unter Zusatz yon CaC12, -~ther und Na-DHS durchgefiihrt. I m Bereich yon p H 4,0 - 5 , 5 wurde Acetatpuffer und im Bereich yon p H 5,5-7,0 fl, fl'-Dimethylglutarsi~ure/NaOH-Puffer verwendet. Die Incubationsansi~tze wurden nach 10 rain inaktiviert. Die durch Calciumionen, ~ t h e r und Na-DHS aktivierte Phospholipase D der Gerste besitzt ein ausgepr~gtes pH-Optimum bei p H 6,5 (Abb. 4). Unterhalb yon p H 4,5 finder praktisch keine Spaltung start. Vergleicht man das Ergebnis mit den Ang~ben der Literatur zum pH-Optimum der Phospholipase D, so fiillt die relativ hohe Lage des Optimums some der stefle Anstieg der pH-Abh~ngigkeitskurve bis p H 6,5 und der anschliegende rasche Abfall bin zu hSheren pIt-Werten auf. M5glicherweise wird der Verlau~ durch die Aktivatoren, insbesondere yon Na-DI-IS, beeinflugt. So steigt n~mlich der optimale Wirkungsbereich der Phospholipase D aus Wirsing dutch Zugabe yon Na-DtIS oder Phosphatids~ure um etwa 1 - 1 , 5 Einheiten auf pH-~Verte yon 6,5-6,6 bei gleichzeitiger Ausbildung eines schmMen Optimums an [13]. abgesp. Cholin in %

1°° I Y '

°°/ 80

"

• 2

*

50

10 I

I

I

I

1

2

3

4 Zeit

in S t u n d e n

Abb. 5. Hydrolyse yon Lecithin (1) und Lysolecithin (2 u. 3) durch Phospholipase D der Gerste, angegeben in Prozent des im zugesetzten Substrat gebundenen Cholins (40 mg Lecithin = 7,08 mg Cholinchlorid pro 50 ml); pH 5,6. --Aktivatoren: Versuch 1 und 2 = CaC12, _~ther, Na-DHS; Versueh 3 = CaCl~

156

Abbau yon Lysolecithin durch PhosTholipase D der Gerste Chloroplastengebundene Phospholipase D aus Spinat oder K a r o t t e n hydrolysiert Lysoleeithin nicht [14]. Die 15sliehe Phospholipase D aus Kohl baut dagegen auch Lysoleeithin ab, die Cholinabspaltung wird jedoch durch J~ther gehemmt [9]. Die Itydrolyse des Lysolecithins erfolgt wesentlich langsamer als die des Lecithins. Es wurde gepriift, ob ~hnliehe Verh~ltnisse auch ffir die Phospholipase D der Gerste zutreffen. Lysoleeithin wurde dutch Phospholipase D der Gerste ebenfalls aufgespalten. Die Hydrolyse erfolgte unter den gleichen Versuchsbedingungen, d. h. unter Zugabe yon CaC12, Ather und Na-DttS, jedoeh wesentlieh langsamer als die des Lecithins (Abb. 5). W~hrend Lecithin nach etwa 2 0 - 3 0 rain vollst~ndig aufgespalten wurde, war der Abbau des Lysolecithins nach 4 Std erst zn 78,6 % fortgeschritten. Die Aufspaltung des Lysolecithins wurde ebenso wie die des Lecithins dureh Zugabe von ~ t h e r und Na-DHS beschleunigt. Phospholipase D besitzt demnach eine hShere Affinit~t zu Lecithin als zu Lysolecithin. Der Verteilungszustand des Substrates - Lysoleeithin ist aueh ohne Zusatz von ~ t h e r und Na-DItS gut in Wasser 15slich - bestimmt offensiehtlieh nicht die Abbaugeschwindigkeit. Phospholipase B der Gerste b a u t dagegen Lysolecithin wesentlich raseher ab als Lecithin [5]. Glycerophosphoryleholin, eine starker hydrophile Verbindung als Lysolecithin, wurde noch wesentlich langsamer hydrolysiert. Literatur

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

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