EMBRYONIC STEM CELLS/INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS        

1

Graduate  School  of  Frontier  Biosci‐ 2 ences,  Department  of  Pathology,  5 Department  of  General  Thoracic  Sur‐ 6 gery,  Medical  School,  Research  Insti‐ tute  for  Microbial  Diseases,  Osaka  University,  2‐2  Yamada‐oka,  Suita,  Osaka  565‐0871, Japan;  3Laboratory of  4 Molecular  Embryology,  Laboratory  of  Stem  Cell  Biology,  Kitasato  University  School  of  Science,  1‐15‐1,  Kitasato,  Minami‐ku,  Sagamihara,  Kanagawa  252‐0373,  Japan;  7Technology  and  Development  Team  for  Mammalian  Genome Dynamics, RIKEN BioResource  Center,  3‐1‐1  Koyadai,  Tsukuba  City,  8 Ibaraki  305‐0074,  Japan;  Core  Re‐ search  for  Evolutional  Science  and  Technology (CREST), Japan Science and  Technology  Agency  (JST),  7  Gobancho,  Chiyoda‐ku, Tokyo 102‐0075, Japan.     Correspondence:  Tohru  KIMURA,  PhD,  Laboratory  of  Molecular  Embryology,  Laboratory  of  Stem  Cell  Biology,  De‐ partment  of  Biosciences,  Kitasato  Uni‐ versity  School  of  Science,  1‐15‐1,  Kitasato,  Minami‐ku,  Sagamihara,  Kanagawa  252‐0373,  Japan,  Tel:  +81‐ 042‐778‐8864;  Fax: +81‐042‐778‐8864,  E‐mail:  tkimura@  kitasato‐u.ac.jp;  Grant  support:  Supported  in  part  by  the  Ministry  of  Education,  Science,  Sports  and  Culture,  and  by  CREST  of  JST;  The  English  in  this  document  has  been  checked  by  at  least  two  profes‐ sional  editors,  both  native  speakers  of  English    Received  August  30,  2013;  accepted  for publication August 18, 2014    ©AlphaMed Press   1066‐5099/2014/$30.00/0    This article has been accepted for pub‐ lication and undergone full peer review  but has not been through the copyedit‐ ing,  typesetting,  pagination  and  proof‐ reading  process  which  may  lead  to  differences  between  this  version  and  the  Version  of  Record.  Please  cite  this  article as doi: 10.1002/stem.1838 

Pluripotent Stem Cells Derived From Mouse  Primordial Germ Cells By Small Molecule Com‐ pounds    TOHRU KIMURA1,2,3,4, YOSHIAKI KAGA1, YOICHI SEKITA2, KEITA  FUJIKAWA3,4, TSUNETOSHI NAKATANI2, MIKA ODAMOTO3,4, SOICHIRO FUNAKI2,5, MASAHITO IKAWA6, KUNIYA ABE7, AND  TORU NAKANO1,2,8    Key words. Primordial Germ Cells • Embryonic Germ Cells • Small Molecule  Compund • induced Pluripotent Stem Cells • DNA Methylation • Ep‐ igenetic Memory    ABSTRACT    Primordial germ cells (PGCs) can give rise to pluripotent stem cells known  as embryonic germ cells (EGCs) when cultured with basic fibroblast growth  factor  (bFGF),  stem  cell  factor  (SCF),  and  leukemia  inhibitory  factor  (LIF).  Somatic cells can give rise to induced pluripotent stem cells (iPSCs) by in‐ troduction of the reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, and Klf4.  The effects of Sox2 and Klf4 on somatic cell reprogramming can be repro‐ duced using the small molecule compounds, transforming growth factor‐β  receptor (TGFβR) inhibitor and Kempaullone, respectively. Here we exam‐ ined  the  effects  of  TGFβR  inhibitor  and  Kempaullone  on  EGC  derivation  from  PGCs.  Treatment  of  PGCs  with  TGFβR  inhibitor  and/or  Kempaullone  generated pluripotent stem cells under standard embryonic stem cell (ESC)  culture conditions without bFGF and SCF, which we termed induced EGCs  (iEGCs). The derivation efficiency of iEGCs was dependent on the differen‐ tiation stage and sex. DNA methylation levels of imprinted genes in iEGCs  were reduced, with the exception of the H19 gene. The promoters of genes  involved in germline development were generally hypomethylated in PGCs,  but  three  germline  genes  showed  comparable  DNA  methylation  levels  among  iEGs, ESCs, and iPSCs.  These results  show  that  PGCs  can  be  repro‐ grammed into pluripotent state using small molecule compounds, and that  DNA methylation of these germline genes is not maintained in iEGCs. STEM  CELLS 2014; 00:000–000 

 

INTRODUCTION    Primordial  germ  cells  (PGCs)  are  embryonic  germ  cell  precursors  of  all  gametes  [1,  2].  PGCs  are  regarded  as  STEM CELLS 2014;00:00‐00 www.StemCells.com 

unipotent  because  they  eventually  differentiate  into  only  sperm  or  oocytes,  depending  on  the  sex,  in  vivo.  However, when cultured in the presence of basic fibro‐ blast  growth  factor  (bFGF),  stem  cell  factor  (SCF),  and  ©AlphaMed Press 2014 

The EG cells induced by small molecule compounds 

2  leukemia  inhibitory  factor  (LIF),  PGCs  can  give  rise  to  pluripotent  stem  cells  known  as  embryonic  germ  cells  (EGCs) [3, 4]. EGCs have developmental potency equiva‐ lent  to  embryonic  stem  cells  (ESCs)  derived  from  epiblast cells of blastocysts. EGCs form three germ layer  tissues upon graft into nude mice, as well as contribute  to  the  cells  of  the  germ  layers  and  germ  cells  upon  transfer  into  blastocysts.  In  contrast  to  EGCs,  PGCs  do  not  exhibit  such  broad  differentiation  potency  before  culture [5, 6]. In addition, PGCs are originators of testic‐ ular  teratomas  [7].  These  facts  demonstrate  that  PGCs  can  de‐differentiate  or  can  be  reprogrammed  into  pluripotency under appropriate conditions.   Somatic cells can be reprogrammed into pluripotent  stem  cells  known  as  induced  pluripotent  stem  cells  (iPSCs)  when  the  reprogramming  transcription  factors  Oct4, Sox2, and Klf4 are introduced into cells [8]. Small  molecule  compounds,  including  histone  deacetylase  inhibitors,  can  augment  the  efficiency  of  iPSC  produc‐ tion by these transcription factors [9]. In addition, it has  been  demonstrated  that  the  effects  of  Sox2  and  Klf4  can  be  reproduced  by  the  small  molecule  compounds  SB431542  [transforming  growth  factor‐β  receptor  (TGFβR) inhibitor] and Kempaullone [inhibitor of glyco‐ gen  synthase  kinase‐3  (GSK3)  and  cyclin‐dependent  kinases  (CDKs)]  [10‐12],  respectively.  Furthermore,  a  recent report showed that iPSCs could be derived from  mouse somatic cells by treatment with these small mol‐ ecule  compounds  alone,  without  introduction  of  Oct4,  Sox2, or Klf4 [13].   Comprehensive  genetic  and  epigenetic  analyses  of  iPSCs  revealed  some  characteristic  features  of  iPSCs.  One of the epigenetic features common to iPSCs is “epi‐ genetic  memory”,  which  is  characterized  by  mainte‐ nance of residual DNA methylation patterns of the orig‐ inal  cells  during  early  passages  of  iPSC  clones  [14‐16].  Therefore, there is a tendency for iPSCs to differentiate  preferentially into lineage‐related original cell types, but  not  into  other  lineages,  under  differentiation  condi‐ tions.   Global DNA demethylation occurs during PGC differ‐ entiation [17‐22]. CpG methylation is decreased in short  interspersed nuclear elements (SINEs) in migrating PGCs  around  embryonic  day  8.5  (E8.5).  In  contrast,  demethylation of germline genes, imprinted genes, and  long interspersed nuclear elements (LINEs) commences  in  gonadal  PGCs  after  E10.5‐E11.5.  The  differentially  methylated  regions  (DMRs)  of  imprinted  genes  as  well  as  the  promoters  of  germline  genes  are  completely  demethylated until E13.5.   Accumulating  evidence  has  shown  that  the  DNA  methylation status of imprinted genes is to some extent  maintained  in  EGC  lines.  For  example,  EGCs  derived  from E8.5 PGCs showed relatively higher, but heteroge‐ neous,  methylation  levels  of  the  imprinted  genes,  whereas EGCs derived from gonadal PGCs showed low‐ er methylation levels [23‐26]. It has also been reported  that  repetitive  elements,  such as intracisternal  A  parti‐ cle  (IAP)  and  minor  satellite  repeats,  are  www.StemCells.com 

hypomethylated  in  EGCs  [25].  Taken  together,  these  data  suggest  that  EGCs  may  be  a  good  source  for  in  vitro generation of germ cells, based on their “epigenet‐ ic memory”. However, it remains unknown whether the  methylation status of germline genes is maintained dur‐ ing EGC derivation from PGCs.   In  this  study,  we  first  showed  that  PGCs  could  give  rise  to  pluripotent  stem  cells,  which  we  designated  in‐ duced  EGCs  (iEGCs),  using  the  Sox2  replacement  SB431542  and  the  Klf4  replacement  Kempaullone.  iEGCs could be derived under standard ESC culture con‐ ditions  using  mouse  embryonic  fibroblasts  (MEFs)  and  LIF,  but  not  bFGF  and  SCF,  which  are  essential  growth  factors for derivation of standard EGCs. In addition, we  showed  that  the  DNA  methylation  levels  of  some  im‐ printed  and  germline  genes  in  PGCs  were  not  main‐ tained in cultured iEGCs.    

MATERIALS AND METHODS   

Animals  Oct4‐EGFP transgenic mice were maintained in a mixed  background of the DBA2 and C57BL/6 strains [27]. Oct4‐ EGFP  transgenic  mice  were  crossed  to  C57/BL6  mice  (SLC, Shizuoka, Japan) to isolate two‐cell embryos, germ  cells,  and  mouse  embryonic  fibroblasts  (MEFs).  Animal  care  was  in  accordance  with  the  guidelines  of  Osaka  University.    

Derivation of induced embryonic germ cells  (iEGCs)  Germ cells from Oct4‐EGFP transgenic mice were seed‐ ed  onto  mitomycin  C‐treated  MEFs  and  cultured  with  Dulbecco’s  Modified  Eagle’s  Medium  (DMEM;  Gibco,  Gaithersburg,  MD,  USA)  supplemented  with  15%  knockout serum replacement (Gibco), 1% non‐essential  amino acids solution (NEAA) (Gibco), 1 mM sodium py‐ ruvate (Gibco), and 1,000 U/ml LIF. To induce iEGC lines,  the  media  was  supplemented  with  25  μM  of  the  Sox2  replacement  SB431542  (Wako  Pure  Chemical,  Osaka,  Japan)  and/or  5  μM  of  the  Klf4  replacement  Kempaullone  (Wako  Pure  Chemical).  Unlike  standard  EGC‐derivation culture, bFGF and SCF were not supple‐ mented  in  the  iEGC‐derivation  media.  Oct4‐EGFP– positive iEGC colonies were picked 5–7 days after seed‐ ing and passaged into secondary culture. After second‐ ary  cultures,  the  iEGCs  were  maintained  on  MEFs  in  ESC‐maintenance  media  without  SB431542  and  Kempaullone.  ESC‐maintenance  media  was  Glasgow  Minimum  Essential  Medium  (Sigma  Aldrich,  St.  Louis,  MO)  supplemented  with  10%  fetal  calf  serum  (FCS)  (JRH, Lenexa,  KS), 1% NEAA, 1 mM sodium pyruvate, 1  μM 2‐mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF.    

Derivation of embryonic stem cells (ESCs)  ESC lines were established as described previously [28].  Briefly,  Oct4‐EGFP  transgenic  two‐cell  embryos  were  cultured to the blastocyst stage. Blastocysts were trans‐ ©AlphaMed Press 2014 

The EG cells induced by small molecule compounds 

3  ferred  onto  mitomycin  C‐treated  MEFs  and  cultured  with  ESC‐derivation  media.  ESC‐derivation  media  was  DMEM  supplemented  with  10%  knockout  serum  re‐ placement, 0.3% FCS, 1% NEAA, 1 mM sodium pyruvate,  1  μM  2‐mercaptoethanol,  1,000  U/ml  LIF,  and  two  in‐ hibitors  (2i;  1  μM  MEK  inhibitor  PD0325901  and  3  μM  GSK3 inhibitor CHIR99021) (Stemgent, Cambridge, MA).  Primary ESC colonies were picked and cultured on MEFs  in the ESC‐maintenance media described above.    

Derivation of induced pluripotent stem cells  (iPSCs)  iPSC  lines  were  established  from  MEFs  prepared  from  the  E13.5  Oct4‐EGFP  transgenic  embryos  as  described  previously  [29].  After  retroviral  transduction  of  Oct4,  Sox2, Klf4, and c‐Myc, iPSCs were derived using the ESC‐ maintenance  media.  iPSC  colonies  were  picked  2–3  weeks  after  retrovirus  transduction  and  were  cultured  on MEFs in the ESC‐maintenance media.    

qRT‐PCR  Total  RNA  was  isolated  using  the  RNeasy  Mini  Kit  (Qiagen,  Valencia,  CA).  Reverse  transcription  (RT)  was  performed using the Thermo Script RT‐PCR system (Invi‐ trogen,  Carlsbad,  CA).  Quantitative  polymerase  chain  reaction  (qPCR)  was  performed  with  an  ABI  7900HT‐3  (SDS 2.3) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Expres‐ sion levels of each gene were normalized to expression  of  the  housekeeping  gene  Rplp0  (Arbp:  ribosomal  pro‐ tein  large  P0).  Primer  sequences  are  listed  in  Supple‐ mentary Table S1.    

Microarray  Global gene expression profiles of the cell samples were  analyzed  by  using  Agilent  SurePrint  G3  8x60K  microar‐ ray (Agilent Technologies). The microarray experiments  were  performed  using  biologically  duplicated  samples.  Qualities of total RNA isolated by RNAeasy kit (Qiagen)  were  checked  by  Agilent  BioAnalyzer,  and  the  RNAs  were  labelled  with  Cy3‐CTP  using  a  Low  Input  Quick  Amp  Labeling  Kit,  One  Color  (Agilent  Technologies).  Microarray  hybridization  was  performed  according  to  the  protocol  suggested  by  the  supplier.  After  washing,  the  hybridized  slides  were  scanned  using  an  Agilent  microarray scanner (Agilent Technologies), and numeric  data  of  hybridization  signals  were  obtained  with  the  Feature Extraction software ver. 10.5.1.1 (Agilent Tech‐ nologies). The processed hybridization signal data were  normalized  and  analysed  by  the  Gene  Spring  GX11.5  software (Agilent Technologies).    

Teratoma formation  iEGCs,  ESCs,  and  iPSCs  (100,000  cells)  were  injected  subcutaneously into nude mice (SLC). After 3–4 weeks,  teratomas were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in  phosphate  buffered  saline  (PBS),  embedded  in  OCT  compound,  frozen,  and  sectioned  at  7  µm  using  a  CM3050 cryostat (Leica Microsystems, Wetzlar, Germa‐ www.StemCells.com 

ny). Sections were subjected to histologic staining with  hematoxylin  and  eosin,  and  observed  under  an  AX80  microscope (Olympus, Tokyo, Japan).    

Production of chimera mice  The  iEGCs  were  injected  into  the  blastocysts  isolated  from ICR mice. The embryos were transferred into uter‐ us  of  the  foster  mothers.  The  chimeric  embryos  were  analyzed at E13.5. The chimeras were also delivered by  a Caesarean section.    

Combined bisulfite restriction analysis  (COBRA)  Genomic DNAs were bisulfite‐treated using the EpiTecht  Bisulfite Kit (Qiagen). Fully or semi‐nested PCR was per‐ formed to amplify the differentially methylated regions  (DMRs)  of  imprinted  genes.  The  first  and  second  PCR  rounds were performed using Advantage Taq (Clontech,  Palo  Alto,  CA).  PCR  conditions  were:  a  first  round  of  1  min at 94°C followed by 30 cycles of 30 s at 94°C, 30 s at  60°C, and 30 s at 68°C, and the second round of 2 min  at  95°C  followed  by  15  cycles  of  30  s  at  95°C,  30  s  at  50°C,  and  30  s  at  68°C.  PCR  amplification  of  germline  gene  promoters  was  conducted  using  Advantage  Taq  under the following conditions: 1 min at 94°C followed  by 35 cycles of 30 sec at 94°C, 30 sec at 60°C, and 30 sec  at  68°C.  The  second  round  of  PCR  was  performed  for  the PGC samples as follows: 2 min at 95°C followed by  15 cycles of 30 sec at 95°C, 30 sec at 50°C, and 30 sec at  68°C.  PCR  products  were  purified  using  the  QIAquick  Gel  Extraction Kit (Qiagen),  digested  with  the  methyla‐ tion‐sensitive  restriction  enzymes  BstUI  or  Taq I  (New  England  BioLabs,  Ipswich,  MA),  and  applied  to  2%  agarose  gels.  Band  intensity  of  digested  (methylated)  and  undigested  (unmethylated)  DNA  fragments  was  quantified  using  the  ImageJ  software  (NIH,  Bethesda,  MD). Sequences of the PCR primers and restriction en‐ zymes used are listed in Table S2.    

RESULTS   

Derivation of iEGCs from PGCs  SB431542  and  Kempaullone  can  reproduce  the  effects  of Sox2 and Klf4, respectively, in terms of inducing iPSCs  from  somatic  cells  [10‐12].  To  examine  the  effects  of  the  small  molecule  compounds  on  iEGC  derivation,  gonadal  PGCs  from  E11.5  Oct4‐GEFP  embryos  were  seeded  onto  mitomycin  C‐treated  MEFs  and  cultured  using  standard  ESC  culture  media  supplemented  with  knockout  serum  replacement  and  LIF.  Because  bFGF  and SCF are required for EGC derivation, no Oct4‐GEFP‐ positive  colonies  emerged  under  these  culture  condi‐ tions  (Table  1).  When  the  media  were  supplemented  with  Kempaullone,  no  Oct4‐GEFP‐positive  colonies  emerged. However, when the PGCs were cultured with  SB431542,  we  detected  a  small  number  of  Oct4‐GEFP‐ positive  colonies  5–7  days  after  seeding.  Furthermore,  the  number  of  Oct4‐GEFP‐positive  colonies  increased  ©AlphaMed Press 2014 

4  upon  the  simultaneous  addition  of  SB431542  and  Kempaullone  (Table  1,  Fig.  1A).  The  iEGC  colonies  gen‐ erated  by  SB431542  alone  and  the  combination  of  SB431542  and  Kempaullone  could  be  passaged  to  sec‐ ondary  cultures  and  maintained  in  ESC‐maintenance  media (without compounds) after secondary culture.   In  contrast  to  E11.5  PGCs,  male  PGCs  from  E13.5  embryonic testes gave rise to iEGC lines in response to  Kempaullone  alone  (Table  1,  Fig.  1B).  In  addition,  the  combination  of  SB431542  and  Kempaullone  decreased  the efficiency of iEGC derivation from E13.5 male PGCs  (p