Planta (Berl.) 122, 303--305 (1975) 9 by Springer-Verlag 1975
Short Communication Poly- und Metaphosphate in h6heren Pflanzen (Lemnaceae) Rainer Niemeyer Institut fiir Botanik der Teehnisehen Universit~t tIannover, HerrenhauserstraBe 2 D-3000 Harmover, Federal Republic of Germany Eingegangen am 17. Dezember 1974; angenommen am 15. ganuar 1975 Poly- and Metaphosphates in Higher Plants (Lemnaceae)
Summary. After pulse-labelling with [3~P]orthophosphate of higher plants (Lemna perpusilla (Torrey) and ;Lemna gibba (L.)) which were previously grown in a P-free medium for 24 h, the [3~P]-ra~lioactivityis partially incorporated into condensed inorganic phosphates. The isolation of the latter was achieved by joint extraction with the nucleic acids and ffactionation on methylated serum albumin and Kieselgur (MAK). Two-dimensional thin layer chromatography on a mixture of cellulose and microcrystalline cellulose revealed that asp. radioactivity was present in linear oligophosphates with 2 to 7 residues as well as in cyclic tri-, tetra-, penta- and hexametaphosphates. Among the low-molecular condensed inorganic phosphates the trimetaphosphate contained significantly more radioactivity than the other compounds. It is supposeded that the condensed phosphates are involved in the regulation of the ATP-ADP-Pi-system.
Untersuchungen zum Phosphatstoffwechsel yon Blaualgen (Niemeyer und Richter, 1969) und Griinalgen (Niemeyer und Richter, 1972) hatten ergeben, daf3 nach 82P-Markierung neben linear kondensierten Polyphosphaten auch cyclisch kondensierte Metaphosphate in metabolisch aktiver Form vorhanden sind. Diese Ergebnisse wurden nach einer gemeinsamen Extraktion yon Nucleins/iuren und kondensierten Phosphaten nebst anschliei3ender Trennung beider Makromolekiilgruppen erzielt (Niemeyer, 1969). Neben Blau- und Griinalgen wurden aueh andere Algengruppen auf ihren Gehalt an kondensierten Phosphaten untersucht (Niemeyer, unver6ffentlicht). Nach diesen Befunden konnte man davon ausgehen, dab auch in anderen Organismen Metaphosphate zu linden sind, bisher aber aus methodischen Grtinden nicht m i t Sicherheit als solche angesprochen werden konnten. Friihere Berichte fiber das Vorkommen yon Trimetaphosphat aus niederen Pflanzen bedurften der Uberpriifung, da inzwisehen nachgewiesen wurde, dal3 bei der Extraktion yon anorganischen Phosphaten mit starken S/iuren und Laugen aus hochmolekularem Phosphat das Trimetaphosphat infolge hydrolytischer Spaltung als Abbauprodukt entsteht (Niemeyer und Richter, 1972). Andere Autoren fanden allerdings Polyphosphate in hSheren Pflanzen (Klein, 1952; Miyaehi, 1961; Vagabov und Kulaev, 1964; Tewari und Singh, 1964), obwohl man weil3, dab in hSheren Pflanzen die Phytins/iure am Phosphatpool betefligt ist. Daher schien es angezeigt, hShere Pflanzen auf ihren Gehalt an kondensierten Phosphaten, besonders yon Metaphosphaten, zu untersuchen.
304
R. Niemeyer
Die Anzueht yon Lemna perpusilla Tomey und Lemna gibba L. erfolgte in Klimakammern bei 27 ~ C u n t e r Dauerlicht (WeiBlicht 1200 lx, Osram L-15 und L-25). Die Pflanzen wuchsen in 100 ml Erlenmeyer-Kolben mit 50 ml N~hrlSsung (Pirson und Seidel, 1950), der 1% Glucose und Eisen als EDTA-Komplex zugesetzt wurde (Kuhl, 1962). Fiir die Untersuchungen wurden 8 Tage alte Pflanzen fiir 24 h auf phosphatfreies Medium iibertragen und mit 20 ~zCi [3zp] Orthophosphat pro ml N~hrlSsung 3 h markiert. Die Extraktion der kondensierten Phosphate erfolgte zusammen mit den Nueleins~uren (5~iemeyer und Richter, 1969) nach vorangegangener Homogenisierung des Materials im Ultra-Turrax (Fa. Janke und Kunkel, Staufen i.Br.) fiir 4 rain mit einem Phenol-Tris-Puffer-SDS-Gemisch (0,05M Tris-I=[C1; pH 7,5; 2 mM MgSo4; 1% SDS). Die beiden Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 3 000 g ftir 2 min getrennt und die obere wi~Brige Phase durch Abhebern gewonnen. AnschlieBend wurde die Phenolphase nochmals mit dem gleichen Puffer nachextrahiert. Die Nucleinsi~uren und die anorganischen Phosphate warden aus den vereinigten w~Brigen ~Jbersti~nden bei --20~ mit Athanol ausgef~llt. Ffir die Abtrennung der Phosphate von den Nueleins~uren reiehte bei beiden Lemnaarten die Ss am MAK-Ionenaustauscher. Die Identifizierung der versehiedenen Kondensationsgrade yon Polyund Metaphosphaten effolgte nach der zweidimensionalen Diinuschichtchromatographie an einem Gemiseh yon Cellulose und mikrokristalliner Cellulose (Niemeyer u. Richter, 1969). Bei den beiden untersuchten Pflanzen wurden sowohl lineare Polyphosphate (alle OIigophosphate mit 2--7 Phosphatresten sowie hoehmolekulares Phosphat, das am Startfleek blieb) als auch ringfSrmig kondensierte Metaphosphate (Tri-, Tetra-, Penta- und Hexametaphosphat) radioaktiv markiert gefunden. Diese Ergebnisse erbrachten erstmals den Naehweis, dab auch in hSher organisierten Pflanzen cyclische Metaphosphate vorhanden sind. Besonders auff&llig war die besonders intensive Markierung des Trimetaphosphates, die ebeufalls bei allen anderen untersuchten Objekten auftrat und wahrseheinlich eine Schliisselstellung im Phosphatstoffwechsel anzeigt. Nach diesen Befunden ist damit zu reehnen, dab auch in anderen hSheren Pflanzen - - besonders in denen man schon Polyphosphate land - - Metaphosphate vorkommen und eine funktionell wiehtige Rolle im Intermedis spielen. In diesem Zusammenhang ist es auch zu verstehen, dab bereits friiher in Eukaryoten die entspreehenden Enzyme, Poly- und Metaphosphatasen, gefunden wurden. Diese Enzyme wurden aus Gerste (Rothenbach u. Hinkelmann, 1954), aus Erbsenextrakten (Pierpoint, 1957a, b) sowie aus Bls yon Manihot utilissima (Agrawal u. Krishnan, 1959) gewonnen, obwohl zu dieser Zeit so gut wie nicht bekannt war, dab aueh h5here Pflanzen Poly- und Metaphosphate synthetisieren kSnnen (vgl. dazu Klein, 1952). Da allgemein angenommen wird, dab der Phosphatpool bei hSheren Pflanzen fiber die Phytins~ure gespeist wird, kann man aueh hier vermuten, dab kondensierte Phosphate wohl primi~r mit dem ATP-ADP-PrSystem zusammenh~ngen und somit gleichermaBen die Bereitstellung yon ATP und anderen energiereichen I~ueleotiden regularly beeinflussen kSnnen wie man es bei Mikroorganismen nanimmt (Weinberg u. Orton, 1965 ; Harold, 1966; Eigener u. Bock, 1972).
Poly- und Metaphosphate in h5heren Pftanzen (Lemnaceae)
305
Die Untersuchungen wurden durch eine groBziiglge Sachbeihilfe der Deutschen Forschungsgemeinschaft ermSglicht. Frl. H. Brauer und Frau D. Horn sei ffir ihre Mitarbeit gedankt. Literatur Agrawal, M., Krishnan, P. S.: An unspecific metaphosphatase from the leaves of the topioca plant (Manihot utilissima) Enzymologia 21, 18--22 (1959) Eigener, U., Book, E. : Auf- und Abban der Polyphosphatfraktion in Zellen yon Nitrobacter winogradskyi Buch. Mikrobiol. 81, 367--378 (1972) Harold, F, M.: Inorganic polyphosphates in biology: Structure, metabolism and function. Bact. l~ev. 30, 772 794 (1966) Klein, R. M. : Nitrogen and phosphorus fractions, respiration and structure of normal and crown gall tissues of tomato. Plant Physiol. 27, 335--354 (1952) Kuhl, A.: Inorganic phosphorus uptake and metabolism. In: Physiology and biochemistry of algae, ed. 1%.A. Lewin, p. 211--299. New York: Academic Press 1962 Miyachi, S. : Inorganic polyphosphate in spinach leaves. J. Biochem. 50, 367--371 (1961) Niemeyer, R.: Isolierung und Reinigung der Poly- und Metaphosphate ans der Blanalge Anacystis nidulans. Diss. Tfibingen (1969) Niemeyer, R., Richter, G.: Schnellmarkierte Polyphosphate und Metaphosphate bei der Blanalge Anacystis nidulans. Arch. Mikrobiol. 69, 54---59 (1969) Niemeyer, 1~., Richter, G.: Rapidly labelled polyphosphates in acetabularia. In: Biology and radiobiology of anucleate systems II. Plant cells. Ed. S. Bonotto, R. Goutier, l~.Kirchmann and J.-R. Maisin, p. 225--236. New York: Academic Press 1972 Pirson, A., Seideh Zell- und Stoffwechselphysiologische Untersuchungen an der Wurzel yon Lemna minor L. unter besonderer Berficksichtigtmg von Kalium- und Calziummangel. Planta (Berl.) 88, 431 (1950) Pierpoint, W. S. : The phosphatases and meta-phosphatase activities in pea extracts. Biochem. J. 65, 67--76 (1957a) Pierpoint, W. S.: The phosphoesterase of pea plants (Pisum sativum L.). Biochem. J. 67, 466--472 (1957b) Rothenbach, E. F., Hinkelmann, St. : Uber Poly- und Metaphosphatasen der Gerste. Naturwissenschaf~en 41, 555 (1954) Tewari, K . K . , Singh, M.: Acid soluble and acid insoluble inorganic polyphosphates in Cuscuta re]lexa. Phytochemistry 3, 341--347 (1964) Vagabov, U. M., Kulaev, J. S. : Inorganic polyphosphates in corn roots. Dokl. Akad. Nauk. SSSI~ 158, 218--220 (1964) Weinberg, l~., Orton, W. L. : Synthesis and breakdown of the polyphosphate fraction and acid phosphomonoesterase o~ Saccharomyces mellis and their location in the cell. J. Bact. 89, 746--747 (1965)
Short Communication Poly- und Metaphosphate in h6heren Pflanzen (Lemnaceae) Rainer Niemeyer Institut fiir Botanik der Teehnisehen Universit~t tIannover, HerrenhauserstraBe 2 D-3000 Harmover, Federal Republic of Germany Eingegangen am 17. Dezember 1974; angenommen am 15. ganuar 1975 Poly- and Metaphosphates in Higher Plants (Lemnaceae)
Summary. After pulse-labelling with [3~P]orthophosphate of higher plants (Lemna perpusilla (Torrey) and ;Lemna gibba (L.)) which were previously grown in a P-free medium for 24 h, the [3~P]-ra~lioactivityis partially incorporated into condensed inorganic phosphates. The isolation of the latter was achieved by joint extraction with the nucleic acids and ffactionation on methylated serum albumin and Kieselgur (MAK). Two-dimensional thin layer chromatography on a mixture of cellulose and microcrystalline cellulose revealed that asp. radioactivity was present in linear oligophosphates with 2 to 7 residues as well as in cyclic tri-, tetra-, penta- and hexametaphosphates. Among the low-molecular condensed inorganic phosphates the trimetaphosphate contained significantly more radioactivity than the other compounds. It is supposeded that the condensed phosphates are involved in the regulation of the ATP-ADP-Pi-system.
Untersuchungen zum Phosphatstoffwechsel yon Blaualgen (Niemeyer und Richter, 1969) und Griinalgen (Niemeyer und Richter, 1972) hatten ergeben, daf3 nach 82P-Markierung neben linear kondensierten Polyphosphaten auch cyclisch kondensierte Metaphosphate in metabolisch aktiver Form vorhanden sind. Diese Ergebnisse wurden nach einer gemeinsamen Extraktion yon Nucleins/iuren und kondensierten Phosphaten nebst anschliei3ender Trennung beider Makromolekiilgruppen erzielt (Niemeyer, 1969). Neben Blau- und Griinalgen wurden aueh andere Algengruppen auf ihren Gehalt an kondensierten Phosphaten untersucht (Niemeyer, unver6ffentlicht). Nach diesen Befunden konnte man davon ausgehen, dab auch in anderen Organismen Metaphosphate zu linden sind, bisher aber aus methodischen Grtinden nicht m i t Sicherheit als solche angesprochen werden konnten. Friihere Berichte fiber das Vorkommen yon Trimetaphosphat aus niederen Pflanzen bedurften der Uberpriifung, da inzwisehen nachgewiesen wurde, dal3 bei der Extraktion yon anorganischen Phosphaten mit starken S/iuren und Laugen aus hochmolekularem Phosphat das Trimetaphosphat infolge hydrolytischer Spaltung als Abbauprodukt entsteht (Niemeyer und Richter, 1972). Andere Autoren fanden allerdings Polyphosphate in hSheren Pflanzen (Klein, 1952; Miyaehi, 1961; Vagabov und Kulaev, 1964; Tewari und Singh, 1964), obwohl man weil3, dab in hSheren Pflanzen die Phytins/iure am Phosphatpool betefligt ist. Daher schien es angezeigt, hShere Pflanzen auf ihren Gehalt an kondensierten Phosphaten, besonders yon Metaphosphaten, zu untersuchen.
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R. Niemeyer
Die Anzueht yon Lemna perpusilla Tomey und Lemna gibba L. erfolgte in Klimakammern bei 27 ~ C u n t e r Dauerlicht (WeiBlicht 1200 lx, Osram L-15 und L-25). Die Pflanzen wuchsen in 100 ml Erlenmeyer-Kolben mit 50 ml N~hrlSsung (Pirson und Seidel, 1950), der 1% Glucose und Eisen als EDTA-Komplex zugesetzt wurde (Kuhl, 1962). Fiir die Untersuchungen wurden 8 Tage alte Pflanzen fiir 24 h auf phosphatfreies Medium iibertragen und mit 20 ~zCi [3zp] Orthophosphat pro ml N~hrlSsung 3 h markiert. Die Extraktion der kondensierten Phosphate erfolgte zusammen mit den Nueleins~uren (5~iemeyer und Richter, 1969) nach vorangegangener Homogenisierung des Materials im Ultra-Turrax (Fa. Janke und Kunkel, Staufen i.Br.) fiir 4 rain mit einem Phenol-Tris-Puffer-SDS-Gemisch (0,05M Tris-I=[C1; pH 7,5; 2 mM MgSo4; 1% SDS). Die beiden Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 3 000 g ftir 2 min getrennt und die obere wi~Brige Phase durch Abhebern gewonnen. AnschlieBend wurde die Phenolphase nochmals mit dem gleichen Puffer nachextrahiert. Die Nucleinsi~uren und die anorganischen Phosphate warden aus den vereinigten w~Brigen ~Jbersti~nden bei --20~ mit Athanol ausgef~llt. Ffir die Abtrennung der Phosphate von den Nueleins~uren reiehte bei beiden Lemnaarten die Ss am MAK-Ionenaustauscher. Die Identifizierung der versehiedenen Kondensationsgrade yon Polyund Metaphosphaten effolgte nach der zweidimensionalen Diinuschichtchromatographie an einem Gemiseh yon Cellulose und mikrokristalliner Cellulose (Niemeyer u. Richter, 1969). Bei den beiden untersuchten Pflanzen wurden sowohl lineare Polyphosphate (alle OIigophosphate mit 2--7 Phosphatresten sowie hoehmolekulares Phosphat, das am Startfleek blieb) als auch ringfSrmig kondensierte Metaphosphate (Tri-, Tetra-, Penta- und Hexametaphosphat) radioaktiv markiert gefunden. Diese Ergebnisse erbrachten erstmals den Naehweis, dab auch in hSher organisierten Pflanzen cyclische Metaphosphate vorhanden sind. Besonders auff&llig war die besonders intensive Markierung des Trimetaphosphates, die ebeufalls bei allen anderen untersuchten Objekten auftrat und wahrseheinlich eine Schliisselstellung im Phosphatstoffwechsel anzeigt. Nach diesen Befunden ist damit zu reehnen, dab auch in anderen hSheren Pflanzen - - besonders in denen man schon Polyphosphate land - - Metaphosphate vorkommen und eine funktionell wiehtige Rolle im Intermedis spielen. In diesem Zusammenhang ist es auch zu verstehen, dab bereits friiher in Eukaryoten die entspreehenden Enzyme, Poly- und Metaphosphatasen, gefunden wurden. Diese Enzyme wurden aus Gerste (Rothenbach u. Hinkelmann, 1954), aus Erbsenextrakten (Pierpoint, 1957a, b) sowie aus Bls yon Manihot utilissima (Agrawal u. Krishnan, 1959) gewonnen, obwohl zu dieser Zeit so gut wie nicht bekannt war, dab aueh h5here Pflanzen Poly- und Metaphosphate synthetisieren kSnnen (vgl. dazu Klein, 1952). Da allgemein angenommen wird, dab der Phosphatpool bei hSheren Pflanzen fiber die Phytins~ure gespeist wird, kann man aueh hier vermuten, dab kondensierte Phosphate wohl primi~r mit dem ATP-ADP-PrSystem zusammenh~ngen und somit gleichermaBen die Bereitstellung yon ATP und anderen energiereichen I~ueleotiden regularly beeinflussen kSnnen wie man es bei Mikroorganismen nanimmt (Weinberg u. Orton, 1965 ; Harold, 1966; Eigener u. Bock, 1972).
Poly- und Metaphosphate in h5heren Pftanzen (Lemnaceae)
305
Die Untersuchungen wurden durch eine groBziiglge Sachbeihilfe der Deutschen Forschungsgemeinschaft ermSglicht. Frl. H. Brauer und Frau D. Horn sei ffir ihre Mitarbeit gedankt. Literatur Agrawal, M., Krishnan, P. S.: An unspecific metaphosphatase from the leaves of the topioca plant (Manihot utilissima) Enzymologia 21, 18--22 (1959) Eigener, U., Book, E. : Auf- und Abban der Polyphosphatfraktion in Zellen yon Nitrobacter winogradskyi Buch. Mikrobiol. 81, 367--378 (1972) Harold, F, M.: Inorganic polyphosphates in biology: Structure, metabolism and function. Bact. l~ev. 30, 772 794 (1966) Klein, R. M. : Nitrogen and phosphorus fractions, respiration and structure of normal and crown gall tissues of tomato. Plant Physiol. 27, 335--354 (1952) Kuhl, A.: Inorganic phosphorus uptake and metabolism. In: Physiology and biochemistry of algae, ed. 1%.A. Lewin, p. 211--299. New York: Academic Press 1962 Miyachi, S. : Inorganic polyphosphate in spinach leaves. J. Biochem. 50, 367--371 (1961) Niemeyer, R.: Isolierung und Reinigung der Poly- und Metaphosphate ans der Blanalge Anacystis nidulans. Diss. Tfibingen (1969) Niemeyer, R., Richter, G.: Schnellmarkierte Polyphosphate und Metaphosphate bei der Blanalge Anacystis nidulans. Arch. Mikrobiol. 69, 54---59 (1969) Niemeyer, 1~., Richter, G.: Rapidly labelled polyphosphates in acetabularia. In: Biology and radiobiology of anucleate systems II. Plant cells. Ed. S. Bonotto, R. Goutier, l~.Kirchmann and J.-R. Maisin, p. 225--236. New York: Academic Press 1972 Pirson, A., Seideh Zell- und Stoffwechselphysiologische Untersuchungen an der Wurzel yon Lemna minor L. unter besonderer Berficksichtigtmg von Kalium- und Calziummangel. Planta (Berl.) 88, 431 (1950) Pierpoint, W. S. : The phosphatases and meta-phosphatase activities in pea extracts. Biochem. J. 65, 67--76 (1957a) Pierpoint, W. S.: The phosphoesterase of pea plants (Pisum sativum L.). Biochem. J. 67, 466--472 (1957b) Rothenbach, E. F., Hinkelmann, St. : Uber Poly- und Metaphosphatasen der Gerste. Naturwissenschaf~en 41, 555 (1954) Tewari, K . K . , Singh, M.: Acid soluble and acid insoluble inorganic polyphosphates in Cuscuta re]lexa. Phytochemistry 3, 341--347 (1964) Vagabov, U. M., Kulaev, J. S. : Inorganic polyphosphates in corn roots. Dokl. Akad. Nauk. SSSI~ 158, 218--220 (1964) Weinberg, l~., Orton, W. L. : Synthesis and breakdown of the polyphosphate fraction and acid phosphomonoesterase o~ Saccharomyces mellis and their location in the cell. J. Bact. 89, 746--747 (1965)
