Graefes Archiv
Albrecht yon GraefesArch. klin. exp. Ophthal. 211, 67--84 (1979)
f~r klinische und experimentene
Ophthalmologie 9 by Springer-Verlag1979
Nachweis yon Glykosaminoglykanen am Corneaendothel* Michael Hornung und Josef Wollensak** Augenklinik des KlinikumWestend der Freien Universit~itBerlin (Direktor: Prof. Dr. med. JosefWollensak), Klinikum Charlottenbnrg, Spandauer Damm 130, D-1000Berlin 19
Proof of Glycosaminoglycans in the Corneal Endothelium Summary. The corneal endothelium of three species (man, dog, and guinea pig) was examined for glycosaminoglycans by using TEM, REM, and EDAX (energy-dispersive analysis of X-rays). Since no clear results can be determined by using ruthenium red (RR) alone, a testicular hyaluronidase was used to digest the glycocalyx. After incubation with hyaluronidase, the dark RR borderline of the outer leaflet of the cell membrane became more fluffy when examined by using TEM and REM. When EDAX was applied, the Ru peak became smaller compared with the S peak. These impressive results had not been found when the material was fixed in glutaraldehyde for 24 h before incubation. Considering the individual results, it can be concluded that RR, even without OsO4, marks the acid groups of glycosaminoglycans that might be in the cell membrane, as well as other acid groups. There was no difference in the results among the three species used in this experiment. Some pictures showed that RR/OsO4 penetrates through the intercellular space into the Descemet's membrane.
Zusammenfassung. Das Corneaendothel dreier Spezies (Mensch, Hund, Meerschweinchen) wird mit dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM), dem Rasterelektronenmikroskop (REM) und der energiedispersiven R6ntgenmikroanalyse auf Glykosaminoglykane untersucht. Da die angewendete Ruthenium-Rot-Fgrbemethode (RR) allein keine eindeutigen Aussagen zulgl3t, wird zus/itzlich eine testikulfire Hyaluronidase zur enzymatischen Andauung der Glycocalyx verwendet. Nach der Inkubation in Hyaluronidase erscheint der RR-kontrastreiche Saum auf der ~iul3eren Lamelle der Zellmembran im TEM und REM aufgelockerter. Bei der energiedispersiven R6ntgenmikroanalyse wird die Ru-Zacke kleiner als die S-Zacke. * Herrn Prof. Dr. H. Harms zum 70. Geburtstag gewidmet ** Adresse fiir Sonderdruckanforderungen
0065-6100/79/0111/0067/$03.60
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M. Hornung und J: Wollensak Diese eindeutigen Ergebnisse erh/ilt man nicht, wenn die Prfiparate vor ihrer spezifischen Behandlung 24 h in Glutaraldehyd fixiert werden. Die Gesamtwfirdigung der einzelnen Ergebnisse lgl3t den Schlul3 zu, dab R R auch ohne OsO4 neben anderen sauren Gruppen in der Zellmembran diejenigender m6glicherweise vorhandenen Glykosaminoglykane markiert. Bei den drei untersuchten Spezies fanden sich keine unterschiedlichen Ergebnisse. Einige Aufnahmen zeigen, dab RR/OsO4 durch den Interzellularspalt in die Descemetsche Membran vorzudringen vermag.
Aus der gesamten Literatur der letzten 15 Jahre geht hervor, dab das Endothel entscheidende Funktionen austibt, die ffir den Wassertransport aus dem Stroma und damit ffir die Transparenz der Cornea die Voraussetzung bilden. Die Transparenz der Cornea ist nach Maurice (1960, 1968) abhfingig yon der Anordnung der Kollagenfibrillen im Stroma, v o n d e r Konzentration und der Zusammensetzung der Glykosaminoglykane, deren Wassergehalt und von der Energieproduktion der einzelnen Zellen. Die Abs~ittigung der negativen Valenzen der Glykosaminoglykane mit Natriumionen hat einen wesentlichen Einflul3 auf das Quellungsverm6gen der Cornea. Dabei spielen energieabhfingige Stoffwechselpumpen im Endothel und Epithel wahrscheinlich eine bedeutende Rolle (Fischbarg et al., 1974; Klyce, 1975; Hodson et al., 1976; Reim, 1972; Maurice, 1968, 1969; D o n n e t al., 1959). Das einschichtige, flache Corneaendothel trennt das Corneaparenchym vom Kammerwasser. Die elektronenmikroskopische Definition der Interzellularkontakte des Corneaendothels bereitet immer noch Schwierigkeiten, da mehrere Autoren zu unterschiedlichen Ergebnissen kommen und verschiedene Terminologien benutzt werden (Kaye et al., 1962; Mishima et al., 1967; Wulle et al., 1974; Staehelins, 1974; Shabo et al., 1973; Symposium on the Cornea, 1972; Ottersen et al., 1977). Bltimcke et al. (1966, 1977) konnten nachweisen, dal3 es sich bei den oberen Membranverbindungen um punktf6rmige desmosomale Interzellularkontakte handelt, die kein ,,Schlul31eistennetz" bilden, wfihrend die unteren Membranverschmelzungen (,,Attachment zones, type I") darstellen. Eine Beschreibung des Endothels als Schutzbarriere zwischen Kammerwasser und Stroma bliebe aber unvollstfindig, ginge sie nicht auf die Strukturen ein, die zur Zellmembran geh6ren. Frtihe Experimente fiber den Einflul3 testikulfirer Hyaluronidase auf den AusfluBwiderstand im vodereren Kammerwinkel lassen darauf schliel3en, dab im Interzellularspalt Mukopolysaccharide liegen (Barany, 1956; Berggren et al., 1957; Melton et al., 1959). Mehrere Untersucher kamen - vor allem in den sechziger Jahren - zu der Auffassung, dab fast alle von ihnen untersuchten Zellen, auch tierische, yon einem dfinnen Oberfl/ichenmantel bedeckt werden, der nicht Teil der Plasmamembran selbst ist (Bennett, 1963; Rambourg et al., 1967; Cook, 1968; Szubinska et al., 1971; Luft, 1971; Vrabec, 1957). Bennett (1963) hat dann den an Polysacchariden reichen extrazellulfiren Mantel bei Pflanzen- und Tierzellen unter dem Begriff ,,Glycocalyx" (grch. = sfil3e Hfille) zusammengefal3t.
Glykosaminoglykane am Corneaendothel
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Schwarz (1973) hat mit der Ruthenium-Rot-F~irbemethode (RR) einen solchen Glykosaminoglykanfilm am Corneaepithel des Haushuhns nachgewiesen, Harnisch (1976) am Endothel des Trabekelwerkes von Glaukompatienten, Schr6der et al. (1977) am Corneaendothel von verstorbenen Patienten mit normaler Hornhaut. Grierson et al. (1977) wiesen in einer Arbeit, die parallel zu unserer erschien, Glykosaminoglykane mit der RR-Methode innerhalb des Trabekelwerkes yon Affen und Kaninchen nach. Ziel dieser Arbeit ist es, mit Hilfe der RR-F/irbung und elektronenmikroskopischer Untersuchungsmethoden einen Glykosaminoglykanfilm am Corneaendothel verschiedener Spezies nachzuweisen.
Material und Methode 1. Das Endothel Bei der Auswahl des Corneaendothels wurde eine Beobachtung von Melton et al. (1960) ber~cksichtigt, dab n/imlich Hyaluronidase bei Perfusionsversuchen am Meerschweinchen und Kaninchen einen deutlichen Anstieg, bei Hund und Katze jedoch keine statistisch signifikante Yerfinderung der Ausflugleichtigkeit bewirkte. Um die oben erwS,hnten Befunde eines Glykosaminoglykanfilms allgemeingfiltig an allen Endothelzellen zu best/itigen, wurde bei dieser Arbeit das Corneaendothel yon drei Spezies untersucht, n~imlich vom Meerschweinchen (n=13, 1/4 J.), vom Hund (Beagle, 3 1/z J.) und vom Menschen ( n = 4 ; Enukleationen bei Retinoblastom (3 J.), absolutem Glaukom (68 J.), Aderhautmelanom (72 J.) und Amaurose bei intakter Cornea (74 J.)).
2. Fiirbung mit Ruthenium-Rot (RR) Die Anf~irbung des Materials erfolgte auf der Basis der Arbeiten yon Luft (1971) und Schwarz (1973). Als Einbettungsmittel wurde das aliphatische Epoxydharz Epon 812 (Fa. Serva, Heidelberg) wegen seiner Dfinnfltissigkeit und damit guten Durchdringungsf~ihigkeit gewfihlt. Einige Pr/iparate ffir das Rasterelektronenmikroskop und die energiedispersive R6ntgenmikroanalyse wurden nicht mit Osmium nachfixiert, sondern gleich der Entw/isserungsreihe unterworfen und danach aus dem 96,8% Athanol in Aceton gebracht. Mit der Critical-Point-Methode wurden die Pr/iparate fiir das REM getrocknet (Multier, 1974). Eine andere Prftparategruppe wurde vor der RR-Behandlung und vor der enzymatischen Behandlung erst 24 h in einem Gemisch aus 1,4% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7.4) fixiert (Hfindgen et al., 1971 ; Grierson et al., 1975).
3. Vorbehandlung mit Hyaluronidase Bei allen Versuchen wurden Corneapr/iparate in einer testikulfiren Hyaluronidase inkubiert. Hier wurde Kinetin| (Fa. Schering, Berlin) benutzt, ein Enzym, das Barany (1954) bei seinen Perfusionsversuchen und Buddecke et al. (1966) an der Cornea benutzt haben. Kinetin| ist das Prfiparat mit den geringsten Verunreinigungen dutch weitere Glykosaminoglycano-Hydrolasen (Platt, 1970). Im Vergleich mit den anderen untersuchten Enzympr~iparaten ist die Aktivitfit ffir Chondroitin und Chondroitin-6-sulfat bei diesem Enzym am gr6Bten. Die zun/ichst unfixierten Pr/iparate wurden bei Raumtemperatur 20rain in Kinetin | (300-1500 I.E.) inkubiert, das mit Tris-HC1-Puffer (pH 7.2) gel6st war. Die in Anlehnung an Grierson et al. (1975) vorher fixierten Prfiparate wurden 24 h bei Raumtemperatur in Kinetin| (1500 I.E.) inkubiert. Danach folgte die Weiterverarbeitung, wie unter 2. (s.o.) angegeben (F/irbung mit RR).
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4. Nachfixierung mit Osmiumsiiure ohne Ruthenium-Rot Die Prfiparate wurden entsprechend Abschnitt 2 behandelt, jedoch wurde RR weggelassen. Somit wurde ein Kontrollversuch aufgebaut, der eine ausschlieBliche Anffirbung der Glykosaminoglykane durch Osmiumsfiure verhindern sollte. Da bei dieser Serie keine Glykosaminoglykane angeffirbt werden sollten, konnten die Prfiparate gleichzeitig als Bezugspunkte zur Auswertung der Wirkung der Hyaluronidase auf den evtl. vorhandenen Glykosaminoglykanfilm herangezogen werden.
5. Kontrolle zur Enzymbehandlung Hier wurden die Prfiparate wie in Abschnitt 3 (Vorbehandlung der Cornea mit Hyaluronidase) behandelt, jedoch wurde nut das L6sungsmittel Tris-HC1-Puffer ohne das Enzym verwendet. Damit sollten unspezifische Wirkungen des Tris-HC1-Puffers, z.B. im Sinne eines Auswaschungseffektes (Barany, 1954b), ausgeschlossen werden.
6. Fixierung der Cornea vor der Fiirbung mit Ruthenium-Rot und Inkubation in Hyaluronidase Da Grierson et al. (1975) bei ihren Untersuchungen die PrS.parate mit Glutaraldehyd vorbehandelten, wnrden bier einige der Corneae ebenfalls vorher fixiert (1,4% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer). Dabei sollte untersucht werden, ob die vorangegangene lange Fixierung andere Ergebnisse bringt als die zun/ichst unfixiert verarbeiteten Corneae.
7. Vorbereitung der Cornea fiir das Transmissionselektronenmikroskop Die mit dem LKB Ultrotome 4800 hergestellten U1tradfinnschnitte wurden mit Ura•yiacetat (Fa. Merck, Darmstadt) und Bleiacetat kontrastiert (Reynolds, 1963). Die Fotos wurden mit dem AEI Elektronenmikroskop Corinth 275 aufgenommen.
8. Rasterelektronenmikroskop (REM) Um Zufallsergebnisse bei der Beurteilung von Endothelquerschnitten im Transmissionselektronmikroskop zu vermeiden und um einen Uberblick fiber das Verteilungsmuster der RR-Auflagerungen auf der Endotheloberfl/iche zu erhalten, wurden Aufnahmen mit dem Rasterelektronenmikroskop hergestellt (REM Stereoscan MK II, Cambridge).
9. Energiedispersive R6ntgenmikroanalyse (EDAX) Diese Methode wurde benutzt, um in den grobk6rnigen Auflagerungen, die mit dem REM gefunden wurden, das Element Ru zu verifizieren. Denn ffir die schnelle qualitative Analyse von Oberfl/ichen ist die energiedispersive R6ntgenmikroanalyse das ideale Verfahren. Dazu wurde die Anlage der Fa. Ortec in Verbindung mit dem oben genannten REM benutzt.
Ergebnisse 1. N u r m i t R u t h e n i u m - R o t gefdrbte P r @ a r a t e D i e R e s u l t a t e n a c h d e n v e r s c h i e d e n e n B e h a n d l u n g s m e t h o d e n z e i g t e n bei d e n e i n z e l n e n S p e z i e s k e i n e U n t e r s c h i e d e , so d a b sie bei d e n f o l g e n d e n E r g e b n i s s e n nicht mehr differenziert zu werden brauchen.
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Abb. 1 u. 2. Corneaendothel vom Hund (Beagle, 3,5 J.). Die Cornea wurde sofort nach der Trepanation in 1,4% Glutaraldehyd in 0,1 M Cadodylatpuffer und sp[iter in cacodylatgepufferter 2% Osmiums[iure fixiert. Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat. Die Zellmembran (M) hebt sich nicht wesenttich yore Cytoplasma ab. E encloplasmatisches Retikulurn, N Zellkern, P Kernpore, D Descemetsche Membran
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Abb. 3 u. 4. Corneaendothel vom Hund (Beagle, 3,5 J.). Fftrbung und Fixierung in Ruthenium-Rot (RR) (1 500 ppm), dann in Ruthenium-Rot (800 ppm) mit 2% Osmiumtetroxyd(RR/OsO4). Kontrastierung mit Uranylacetat urld t~leicitrat. Auf der /iuI?ererl Lamelle der Zellmembran findet sich ein homogenerund grobk6rniger, kontrastreicher Saum
Das mit R R markierte Material zeigt als auffallendstes Charakteristikum im Transmissionselektronenmikroskop einen nach aul3en und innen scharf abgrenzbaren, nicht immer gleichmfiBig breiten, dunklen Saum (Abb. 3, 4, 7, 11). In dem relativ homogenen Band fallen vereinzelt grobk6rnige Strukturen auf (Abb. 4). Die kontrastreichen Niederschlfige lassen sich teilweise auch im Interzellularspalt nachweisen, z.T. sogar zwischen dem basalen Teil der Endothelzelle und der Descemetschen Membran und in dieser selbst (Abb. 11). Auch in den Mikropinocytosevesikeln findet man elektronendichte Einlagerungen.
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Abb. 5 u. 6. Corneaendothel vom Hund (Beagle, 3,5 J.). Nach der Trepanation wurde die Hornhaut znn/ichst 30 Minuten in Hyaluronidase inknbiert (150 I.E./ml). F/irbung und Fixierung mit RR/OsO~ wie bei Abbildungen 3, 4. Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat. Im Vergleich zum vorhergehenden Pr~iparat hier ein aufgelockerter, schmaler Saum geringer Dichte und mit vereinzelten grobk6rnigen Strukturen. Innerhalb der Zelle finden sich gr6Bere, postmortal entstandene cytoplasmafreie Bezirke (V)
I m R a s t e r e l e k t r o n e n m i k r o s k o p sieht m a n s o w o h l bei den zunfichst nicht fixierten als a u c h bei den 24 h lang fixierten, RR-gefS.rbten P r / i p a r a t e n p l a n e E n d o t h e l z e l l e n m i t g r o b k 6 r n i g e n A u f l a g e r u n g e n ( A b b . 13). D i e Oberfliichens t r u k t u r der Zellen ist n u r schwer zu erkennen. Es scheint, als o b ein dicker M a n t e l die Zelloberflfiche z u d e c k t ( A b b . 13). Dieser E i n d r u c k entsteht b e s o n ders, w e n n nicht n u r R R , s o n d e r n R R / O s O 4 als FS~rbemethode a n g e w a n d t wurde. B e s o n d e r s im Bereich der I n t e r z e l l u l a r s p a l t e n finden sich gr6Bere, b i z a r r e
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Abb. 7-9. Corneaendothel vom Meerschweinchen: Alle Pr/iparate wurden vor der weiteren Behandlung 24 h in 1,4% Glutaratdehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer fixiert. Abbildung 7: Behandlung mit RR/OsO4. Auf der Zellmembran findet sich ein dicker, homogener, kontrastreicher Saum, der sich auch in dem Mikropinozytosevesikel (V) fortsetzt. Abbildung 8: Behandlung der Cornea mit Tris-HCl-Puffer (L6sungsmittel des Enzyms), dann F/irbung mit RR/OsO4. Keine wesentlichen Ver/inderungen des RR-Saumes im Vergleich mit Abb. 12. Abbildung 9: Nach Inkubation in Hyaluronidase (1500 I.E., 24 h) und Kontrastierung mit RR/OsO4 findet man einen aufgelockerten, flauschigen, RR-positiven Saum mit einzelnen grobk6rnigen Auflagerungen. Kontrastierung: Uranylacetat und Bleicitrat A u f l a g e r u n g e n , w/ihrend a u f der Zelloberflfiche n u r kleinere G e b i l d e liegen ( A b b . 13). Bei d e r energiedispersiven R 6 n t g e n m i k r o a n a l y s e g a n z e r Zelloberflfichen, die v o r ihrer spezifischen B e h a n d l u n g nicht fixiert w o r d e n sind, finden sich verschieden h o h e Z a c k e n ffir die E l e m e n t e P h o s p h o r (P), Schwefel (S) u n d R u t h e n i u m (Ru). D a b e i ist die R u - Z a c k e i m m e r h 6 h e r als die S - Z a c k e ( A b b . 14b),
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Abb. 10 u. 11. Corneaendothel vom Menschen. Sowohl nach Hyaluronidasebehandlung (600 I.E., Abb. 10) als auch ohne enzymatische Behandlung (Abb. 11) finden sich im Interzellularspalt und in der Descemetschen Membran kontrastgebende fein- und grobk6rnige Einlagerungen, die auf die Fiirbung mit RP,-/OsO4 zurfickzuftihren sind. Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat
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Abb. 12 u. 13. REM-Aufnahmen der Endotheloberfl/iehe der Cornea vom Menschen (3 J., Retinobla-
store). Alle Pr/iparate wurden zun/iehst 24 h fixiert, bevor sie ihrer spezifischen Behandlung zugef/ihrt wurden. Abbildnng 12 : Nach Fixierung nochmals in Glutaraldehyd ohne OsO~ (24 h). Abbildung 13 : F/irbung mit R R ohne OsO4. Die Endotheloberflfiche ist ohne RR-Ffirbung fast glatt. Ein Zellkern (N) w61bt die Zellmembran vor. Trotz Critical-Point-Trocknung bier artifizell entstandene Bruchlinien (--*) am Zellrand (Abb. 12). Nach RR-Ffirbung massenhaft klumpige Gebilde auf der Zelloberflfiche (Abb. 13)
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f~r klinische und experimentene
Ophthalmologie 9 by Springer-Verlag1979
Nachweis yon Glykosaminoglykanen am Corneaendothel* Michael Hornung und Josef Wollensak** Augenklinik des KlinikumWestend der Freien Universit~itBerlin (Direktor: Prof. Dr. med. JosefWollensak), Klinikum Charlottenbnrg, Spandauer Damm 130, D-1000Berlin 19
Proof of Glycosaminoglycans in the Corneal Endothelium Summary. The corneal endothelium of three species (man, dog, and guinea pig) was examined for glycosaminoglycans by using TEM, REM, and EDAX (energy-dispersive analysis of X-rays). Since no clear results can be determined by using ruthenium red (RR) alone, a testicular hyaluronidase was used to digest the glycocalyx. After incubation with hyaluronidase, the dark RR borderline of the outer leaflet of the cell membrane became more fluffy when examined by using TEM and REM. When EDAX was applied, the Ru peak became smaller compared with the S peak. These impressive results had not been found when the material was fixed in glutaraldehyde for 24 h before incubation. Considering the individual results, it can be concluded that RR, even without OsO4, marks the acid groups of glycosaminoglycans that might be in the cell membrane, as well as other acid groups. There was no difference in the results among the three species used in this experiment. Some pictures showed that RR/OsO4 penetrates through the intercellular space into the Descemet's membrane.
Zusammenfassung. Das Corneaendothel dreier Spezies (Mensch, Hund, Meerschweinchen) wird mit dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM), dem Rasterelektronenmikroskop (REM) und der energiedispersiven R6ntgenmikroanalyse auf Glykosaminoglykane untersucht. Da die angewendete Ruthenium-Rot-Fgrbemethode (RR) allein keine eindeutigen Aussagen zulgl3t, wird zus/itzlich eine testikulfire Hyaluronidase zur enzymatischen Andauung der Glycocalyx verwendet. Nach der Inkubation in Hyaluronidase erscheint der RR-kontrastreiche Saum auf der ~iul3eren Lamelle der Zellmembran im TEM und REM aufgelockerter. Bei der energiedispersiven R6ntgenmikroanalyse wird die Ru-Zacke kleiner als die S-Zacke. * Herrn Prof. Dr. H. Harms zum 70. Geburtstag gewidmet ** Adresse fiir Sonderdruckanforderungen
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M. Hornung und J: Wollensak Diese eindeutigen Ergebnisse erh/ilt man nicht, wenn die Prfiparate vor ihrer spezifischen Behandlung 24 h in Glutaraldehyd fixiert werden. Die Gesamtwfirdigung der einzelnen Ergebnisse lgl3t den Schlul3 zu, dab R R auch ohne OsO4 neben anderen sauren Gruppen in der Zellmembran diejenigender m6glicherweise vorhandenen Glykosaminoglykane markiert. Bei den drei untersuchten Spezies fanden sich keine unterschiedlichen Ergebnisse. Einige Aufnahmen zeigen, dab RR/OsO4 durch den Interzellularspalt in die Descemetsche Membran vorzudringen vermag.
Aus der gesamten Literatur der letzten 15 Jahre geht hervor, dab das Endothel entscheidende Funktionen austibt, die ffir den Wassertransport aus dem Stroma und damit ffir die Transparenz der Cornea die Voraussetzung bilden. Die Transparenz der Cornea ist nach Maurice (1960, 1968) abhfingig yon der Anordnung der Kollagenfibrillen im Stroma, v o n d e r Konzentration und der Zusammensetzung der Glykosaminoglykane, deren Wassergehalt und von der Energieproduktion der einzelnen Zellen. Die Abs~ittigung der negativen Valenzen der Glykosaminoglykane mit Natriumionen hat einen wesentlichen Einflul3 auf das Quellungsverm6gen der Cornea. Dabei spielen energieabhfingige Stoffwechselpumpen im Endothel und Epithel wahrscheinlich eine bedeutende Rolle (Fischbarg et al., 1974; Klyce, 1975; Hodson et al., 1976; Reim, 1972; Maurice, 1968, 1969; D o n n e t al., 1959). Das einschichtige, flache Corneaendothel trennt das Corneaparenchym vom Kammerwasser. Die elektronenmikroskopische Definition der Interzellularkontakte des Corneaendothels bereitet immer noch Schwierigkeiten, da mehrere Autoren zu unterschiedlichen Ergebnissen kommen und verschiedene Terminologien benutzt werden (Kaye et al., 1962; Mishima et al., 1967; Wulle et al., 1974; Staehelins, 1974; Shabo et al., 1973; Symposium on the Cornea, 1972; Ottersen et al., 1977). Bltimcke et al. (1966, 1977) konnten nachweisen, dal3 es sich bei den oberen Membranverbindungen um punktf6rmige desmosomale Interzellularkontakte handelt, die kein ,,Schlul31eistennetz" bilden, wfihrend die unteren Membranverschmelzungen (,,Attachment zones, type I") darstellen. Eine Beschreibung des Endothels als Schutzbarriere zwischen Kammerwasser und Stroma bliebe aber unvollstfindig, ginge sie nicht auf die Strukturen ein, die zur Zellmembran geh6ren. Frtihe Experimente fiber den Einflul3 testikulfirer Hyaluronidase auf den AusfluBwiderstand im vodereren Kammerwinkel lassen darauf schliel3en, dab im Interzellularspalt Mukopolysaccharide liegen (Barany, 1956; Berggren et al., 1957; Melton et al., 1959). Mehrere Untersucher kamen - vor allem in den sechziger Jahren - zu der Auffassung, dab fast alle von ihnen untersuchten Zellen, auch tierische, yon einem dfinnen Oberfl/ichenmantel bedeckt werden, der nicht Teil der Plasmamembran selbst ist (Bennett, 1963; Rambourg et al., 1967; Cook, 1968; Szubinska et al., 1971; Luft, 1971; Vrabec, 1957). Bennett (1963) hat dann den an Polysacchariden reichen extrazellulfiren Mantel bei Pflanzen- und Tierzellen unter dem Begriff ,,Glycocalyx" (grch. = sfil3e Hfille) zusammengefal3t.
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Schwarz (1973) hat mit der Ruthenium-Rot-F~irbemethode (RR) einen solchen Glykosaminoglykanfilm am Corneaepithel des Haushuhns nachgewiesen, Harnisch (1976) am Endothel des Trabekelwerkes von Glaukompatienten, Schr6der et al. (1977) am Corneaendothel von verstorbenen Patienten mit normaler Hornhaut. Grierson et al. (1977) wiesen in einer Arbeit, die parallel zu unserer erschien, Glykosaminoglykane mit der RR-Methode innerhalb des Trabekelwerkes yon Affen und Kaninchen nach. Ziel dieser Arbeit ist es, mit Hilfe der RR-F/irbung und elektronenmikroskopischer Untersuchungsmethoden einen Glykosaminoglykanfilm am Corneaendothel verschiedener Spezies nachzuweisen.
Material und Methode 1. Das Endothel Bei der Auswahl des Corneaendothels wurde eine Beobachtung von Melton et al. (1960) ber~cksichtigt, dab n/imlich Hyaluronidase bei Perfusionsversuchen am Meerschweinchen und Kaninchen einen deutlichen Anstieg, bei Hund und Katze jedoch keine statistisch signifikante Yerfinderung der Ausflugleichtigkeit bewirkte. Um die oben erwS,hnten Befunde eines Glykosaminoglykanfilms allgemeingfiltig an allen Endothelzellen zu best/itigen, wurde bei dieser Arbeit das Corneaendothel yon drei Spezies untersucht, n~imlich vom Meerschweinchen (n=13, 1/4 J.), vom Hund (Beagle, 3 1/z J.) und vom Menschen ( n = 4 ; Enukleationen bei Retinoblastom (3 J.), absolutem Glaukom (68 J.), Aderhautmelanom (72 J.) und Amaurose bei intakter Cornea (74 J.)).
2. Fiirbung mit Ruthenium-Rot (RR) Die Anf~irbung des Materials erfolgte auf der Basis der Arbeiten yon Luft (1971) und Schwarz (1973). Als Einbettungsmittel wurde das aliphatische Epoxydharz Epon 812 (Fa. Serva, Heidelberg) wegen seiner Dfinnfltissigkeit und damit guten Durchdringungsf~ihigkeit gewfihlt. Einige Pr/iparate ffir das Rasterelektronenmikroskop und die energiedispersive R6ntgenmikroanalyse wurden nicht mit Osmium nachfixiert, sondern gleich der Entw/isserungsreihe unterworfen und danach aus dem 96,8% Athanol in Aceton gebracht. Mit der Critical-Point-Methode wurden die Pr/iparate fiir das REM getrocknet (Multier, 1974). Eine andere Prftparategruppe wurde vor der RR-Behandlung und vor der enzymatischen Behandlung erst 24 h in einem Gemisch aus 1,4% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7.4) fixiert (Hfindgen et al., 1971 ; Grierson et al., 1975).
3. Vorbehandlung mit Hyaluronidase Bei allen Versuchen wurden Corneapr/iparate in einer testikulfiren Hyaluronidase inkubiert. Hier wurde Kinetin| (Fa. Schering, Berlin) benutzt, ein Enzym, das Barany (1954) bei seinen Perfusionsversuchen und Buddecke et al. (1966) an der Cornea benutzt haben. Kinetin| ist das Prfiparat mit den geringsten Verunreinigungen dutch weitere Glykosaminoglycano-Hydrolasen (Platt, 1970). Im Vergleich mit den anderen untersuchten Enzympr~iparaten ist die Aktivitfit ffir Chondroitin und Chondroitin-6-sulfat bei diesem Enzym am gr6Bten. Die zun/ichst unfixierten Pr/iparate wurden bei Raumtemperatur 20rain in Kinetin | (300-1500 I.E.) inkubiert, das mit Tris-HC1-Puffer (pH 7.2) gel6st war. Die in Anlehnung an Grierson et al. (1975) vorher fixierten Prfiparate wurden 24 h bei Raumtemperatur in Kinetin| (1500 I.E.) inkubiert. Danach folgte die Weiterverarbeitung, wie unter 2. (s.o.) angegeben (F/irbung mit RR).
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4. Nachfixierung mit Osmiumsiiure ohne Ruthenium-Rot Die Prfiparate wurden entsprechend Abschnitt 2 behandelt, jedoch wurde RR weggelassen. Somit wurde ein Kontrollversuch aufgebaut, der eine ausschlieBliche Anffirbung der Glykosaminoglykane durch Osmiumsfiure verhindern sollte. Da bei dieser Serie keine Glykosaminoglykane angeffirbt werden sollten, konnten die Prfiparate gleichzeitig als Bezugspunkte zur Auswertung der Wirkung der Hyaluronidase auf den evtl. vorhandenen Glykosaminoglykanfilm herangezogen werden.
5. Kontrolle zur Enzymbehandlung Hier wurden die Prfiparate wie in Abschnitt 3 (Vorbehandlung der Cornea mit Hyaluronidase) behandelt, jedoch wurde nut das L6sungsmittel Tris-HC1-Puffer ohne das Enzym verwendet. Damit sollten unspezifische Wirkungen des Tris-HC1-Puffers, z.B. im Sinne eines Auswaschungseffektes (Barany, 1954b), ausgeschlossen werden.
6. Fixierung der Cornea vor der Fiirbung mit Ruthenium-Rot und Inkubation in Hyaluronidase Da Grierson et al. (1975) bei ihren Untersuchungen die PrS.parate mit Glutaraldehyd vorbehandelten, wnrden bier einige der Corneae ebenfalls vorher fixiert (1,4% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer). Dabei sollte untersucht werden, ob die vorangegangene lange Fixierung andere Ergebnisse bringt als die zun/ichst unfixiert verarbeiteten Corneae.
7. Vorbereitung der Cornea fiir das Transmissionselektronenmikroskop Die mit dem LKB Ultrotome 4800 hergestellten U1tradfinnschnitte wurden mit Ura•yiacetat (Fa. Merck, Darmstadt) und Bleiacetat kontrastiert (Reynolds, 1963). Die Fotos wurden mit dem AEI Elektronenmikroskop Corinth 275 aufgenommen.
8. Rasterelektronenmikroskop (REM) Um Zufallsergebnisse bei der Beurteilung von Endothelquerschnitten im Transmissionselektronmikroskop zu vermeiden und um einen Uberblick fiber das Verteilungsmuster der RR-Auflagerungen auf der Endotheloberfl/iche zu erhalten, wurden Aufnahmen mit dem Rasterelektronenmikroskop hergestellt (REM Stereoscan MK II, Cambridge).
9. Energiedispersive R6ntgenmikroanalyse (EDAX) Diese Methode wurde benutzt, um in den grobk6rnigen Auflagerungen, die mit dem REM gefunden wurden, das Element Ru zu verifizieren. Denn ffir die schnelle qualitative Analyse von Oberfl/ichen ist die energiedispersive R6ntgenmikroanalyse das ideale Verfahren. Dazu wurde die Anlage der Fa. Ortec in Verbindung mit dem oben genannten REM benutzt.
Ergebnisse 1. N u r m i t R u t h e n i u m - R o t gefdrbte P r @ a r a t e D i e R e s u l t a t e n a c h d e n v e r s c h i e d e n e n B e h a n d l u n g s m e t h o d e n z e i g t e n bei d e n e i n z e l n e n S p e z i e s k e i n e U n t e r s c h i e d e , so d a b sie bei d e n f o l g e n d e n E r g e b n i s s e n nicht mehr differenziert zu werden brauchen.
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Abb. 1 u. 2. Corneaendothel vom Hund (Beagle, 3,5 J.). Die Cornea wurde sofort nach der Trepanation in 1,4% Glutaraldehyd in 0,1 M Cadodylatpuffer und sp[iter in cacodylatgepufferter 2% Osmiums[iure fixiert. Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat. Die Zellmembran (M) hebt sich nicht wesenttich yore Cytoplasma ab. E encloplasmatisches Retikulurn, N Zellkern, P Kernpore, D Descemetsche Membran
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Abb. 3 u. 4. Corneaendothel vom Hund (Beagle, 3,5 J.). Fftrbung und Fixierung in Ruthenium-Rot (RR) (1 500 ppm), dann in Ruthenium-Rot (800 ppm) mit 2% Osmiumtetroxyd(RR/OsO4). Kontrastierung mit Uranylacetat urld t~leicitrat. Auf der /iuI?ererl Lamelle der Zellmembran findet sich ein homogenerund grobk6rniger, kontrastreicher Saum
Das mit R R markierte Material zeigt als auffallendstes Charakteristikum im Transmissionselektronenmikroskop einen nach aul3en und innen scharf abgrenzbaren, nicht immer gleichmfiBig breiten, dunklen Saum (Abb. 3, 4, 7, 11). In dem relativ homogenen Band fallen vereinzelt grobk6rnige Strukturen auf (Abb. 4). Die kontrastreichen Niederschlfige lassen sich teilweise auch im Interzellularspalt nachweisen, z.T. sogar zwischen dem basalen Teil der Endothelzelle und der Descemetschen Membran und in dieser selbst (Abb. 11). Auch in den Mikropinocytosevesikeln findet man elektronendichte Einlagerungen.
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Abb. 5 u. 6. Corneaendothel vom Hund (Beagle, 3,5 J.). Nach der Trepanation wurde die Hornhaut znn/ichst 30 Minuten in Hyaluronidase inknbiert (150 I.E./ml). F/irbung und Fixierung mit RR/OsO~ wie bei Abbildungen 3, 4. Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat. Im Vergleich zum vorhergehenden Pr~iparat hier ein aufgelockerter, schmaler Saum geringer Dichte und mit vereinzelten grobk6rnigen Strukturen. Innerhalb der Zelle finden sich gr6Bere, postmortal entstandene cytoplasmafreie Bezirke (V)
I m R a s t e r e l e k t r o n e n m i k r o s k o p sieht m a n s o w o h l bei den zunfichst nicht fixierten als a u c h bei den 24 h lang fixierten, RR-gefS.rbten P r / i p a r a t e n p l a n e E n d o t h e l z e l l e n m i t g r o b k 6 r n i g e n A u f l a g e r u n g e n ( A b b . 13). D i e Oberfliichens t r u k t u r der Zellen ist n u r schwer zu erkennen. Es scheint, als o b ein dicker M a n t e l die Zelloberflfiche z u d e c k t ( A b b . 13). Dieser E i n d r u c k entsteht b e s o n ders, w e n n nicht n u r R R , s o n d e r n R R / O s O 4 als FS~rbemethode a n g e w a n d t wurde. B e s o n d e r s im Bereich der I n t e r z e l l u l a r s p a l t e n finden sich gr6Bere, b i z a r r e
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Abb. 7-9. Corneaendothel vom Meerschweinchen: Alle Pr/iparate wurden vor der weiteren Behandlung 24 h in 1,4% Glutaratdehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer fixiert. Abbildung 7: Behandlung mit RR/OsO4. Auf der Zellmembran findet sich ein dicker, homogener, kontrastreicher Saum, der sich auch in dem Mikropinozytosevesikel (V) fortsetzt. Abbildung 8: Behandlung der Cornea mit Tris-HCl-Puffer (L6sungsmittel des Enzyms), dann F/irbung mit RR/OsO4. Keine wesentlichen Ver/inderungen des RR-Saumes im Vergleich mit Abb. 12. Abbildung 9: Nach Inkubation in Hyaluronidase (1500 I.E., 24 h) und Kontrastierung mit RR/OsO4 findet man einen aufgelockerten, flauschigen, RR-positiven Saum mit einzelnen grobk6rnigen Auflagerungen. Kontrastierung: Uranylacetat und Bleicitrat A u f l a g e r u n g e n , w/ihrend a u f der Zelloberflfiche n u r kleinere G e b i l d e liegen ( A b b . 13). Bei d e r energiedispersiven R 6 n t g e n m i k r o a n a l y s e g a n z e r Zelloberflfichen, die v o r ihrer spezifischen B e h a n d l u n g nicht fixiert w o r d e n sind, finden sich verschieden h o h e Z a c k e n ffir die E l e m e n t e P h o s p h o r (P), Schwefel (S) u n d R u t h e n i u m (Ru). D a b e i ist die R u - Z a c k e i m m e r h 6 h e r als die S - Z a c k e ( A b b . 14b),
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Abb. 10 u. 11. Corneaendothel vom Menschen. Sowohl nach Hyaluronidasebehandlung (600 I.E., Abb. 10) als auch ohne enzymatische Behandlung (Abb. 11) finden sich im Interzellularspalt und in der Descemetschen Membran kontrastgebende fein- und grobk6rnige Einlagerungen, die auf die Fiirbung mit RP,-/OsO4 zurfickzuftihren sind. Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat
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Abb. 12 u. 13. REM-Aufnahmen der Endotheloberfl/iehe der Cornea vom Menschen (3 J., Retinobla-
store). Alle Pr/iparate wurden zun/iehst 24 h fixiert, bevor sie ihrer spezifischen Behandlung zugef/ihrt wurden. Abbildnng 12 : Nach Fixierung nochmals in Glutaraldehyd ohne OsO~ (24 h). Abbildung 13 : F/irbung mit R R ohne OsO4. Die Endotheloberflfiche ist ohne RR-Ffirbung fast glatt. Ein Zellkern (N) w61bt die Zellmembran vor. Trotz Critical-Point-Trocknung bier artifizell entstandene Bruchlinien (--*) am Zellrand (Abb. 12). Nach RR-Ffirbung massenhaft klumpige Gebilde auf der Zelloberflfiche (Abb. 13)
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