BIOCHIMIE, 1978, 60, 429-435.

Purification et propridtds d'une mdtalloprotdase de Staphylococcus aureus. Samir A. SAHEB (*).

(25-1-1978).

Ddpartemenl de Pathologie el de Microbiologie, Facultd de m ~ d e c i n e vdtdrinaire, Universit~ de Montreal, case postale 5,000, Saint-Hyacinthe, Quebec, Canada, J2S 7C6.

R6sum6.

Summary.

Une mdtalloprotdase, synthdtisde par la s o u c h e A152 de Staphylococcus aur~eus a dtd purifide. L ' e n z y m e a un poids moldculaire de 26.800 daltons ddtermind par sddimentation d l'dquilibre. Cette protdase poss~de un p H optimal de 7.0 sur la casdine mats est inactive sur l'hdmoglobine. L'E.D.T.A. et I'E.G.T.A. i n h i b e n t c o m p l ~ t e m e n t l ' e n z y m e alors que les rdactifs des sdrylprotdases s o n t sans effel. Comme c'est le cas pour les aulres mdtalloprotdases cette protdase scinde les liaisons p e p t i d i q u e s de la chaine B de l'insuline, dans lesquelles les acides amindes h y d r o p h o b e s particip e n t par leur g r o u p e m e n t amind, mats ne scinde loutefois pas la liaison Phe (2~)-Phe (25). Si par ses propridt~s, celte protdase ressemble gt celle isoIde de la souche V s de S. aureus (Saheb, S.A. (1976) Biochimie, 58, 793), elle en diff~re cependant par une activitd cinq fats plus grande. La corrdlation est [aite entre les activilds de ces d e u x protdases et le t y p e de zone observd aprds croissance des souches A152 et V s sur un m i l i e u contenant de la casdine.

(*) Adresse actuelle : Centre de recherche en bactdriologie, Instilut Armand-Frappier, Unioersil~ du Qudbec, 531 boulevard des Prairies, case poslale 100, Laval-des-Rapides, Qudbec, Canada, H7N /tZ3. Abrdoiations : E.D.T.A. : Acide dthyl~aediamine-ldtra-acdliquc ; Tris : Tris (hydro:rym~thyle)-arninodthane ; D.E.A.E. Didthylaminodthgle ; E.D.T.A. : Ethylene glycot-bis (B-aminoethylether) N,N'-tdtra-acdtique.

The bacteriophage n o n t y p a b l e strains of Staphylococcus aureus can be differentiated in five welld e f i n e d groups, A, B, C, D and E by the zones of proteolysis t h e y produce on caseinate-agar. The differences in the zones types cannot be e x p l a i n e d satisfactorily on the basis of the serine proteases p r o d u c e d by representative strains of each group, since no relation b e t w e e n the e x t e n t of casein h y drolysis and the a c t i v i t y of the e n z y m e s was f o u n d to exist (Beaudet, R., S. A. Saheb ~ G. R. Drapeau (1974) J. Biol. Chem., 249, 6468). The isolation of a neutral prolease w i t h a broad s p e c i f i c i t y (Saheb, S. A. 1976) Biochimie, 58, 793) p r e s e n t in the early phase of the culture of strain V 8 (group C) suggests that the p r o d u c t i o n of neutral proleases m i g h t be responsible for the zone types p r o d u c e d by the various strains of S. aureus. Therefore, the neutral prolease p r o d u c e d by strain A152 (group A) was p u r i f i e d by precipitation w i t h a m m o n i u m sulfate and acetone, f o l l o w e d by c h r o m a t o g r a p h y on D.E.A.E.-cellulose and S e p h a d e x gel filtration. The molecular w e i g h t of the p u r i f i e d e n z y m e is estim a t e d to be 26800 dallons by s e d i m e n t a t i o n equilibrum study. The protease exhibits a m a x i m u m p r o l e o l y t i c a c t i v i t y on casein at p H 7.0. E.D.T.A. and E.G.T.A. c o m p l e t e l y inhibit the protease w h i l e the reagents of serine e n z y m e s are w i t h o u t effect. The e n z y m e hgdrolgses the p e p t i d e bonds, of the insulin B-chain, in w h i c h the amino groups of h y d r o p h o b i c aminoacids are involved, in a similar w a y as the neutral proteases f r o m S. griseus and A. oryzae. H o w e v e r , no h y d r o l y s i s is observed f o r the p e p t i d e bond Phe (2~)-Phe (25). Thus, if this protease and the neutral protease f r o m strain V s s h o w ahnosl similar properties they however) differ m a i n l y by their a c t i v i t y on casein ; the form e r being five times m o r e active. This d i f f e r e n c e in activity of the two e n z y m e s agrees well w i t h the zone types p r o d u c e d on caseinate-agar bg strains of groups A and C.

430

S. A. Saheb.

Introduction. Martley, Jarvis, Bacon et L a w r e n c e [l] out rapport6 u n e 6rude p o r t a n t sur la classification des souches de S. aureus, n o n typables p a r les bact6riophages, selon l'aspect des zones de prot6olyse qu'elles p r o d u i s e n t sur u n m i l i e u h base de ca-

des pr61iminaires out d6nlontr6 que la souche A152 a p p a r t e a a n l au groupe A, p r o d u i s a i t elle aussi une prot6ase extracellulaire (EsA152) dont l'activit6 6tait inhib6e p a r I'E.I).T.A. Les ]urges zones de prot6olyse observ6es dans les groupes C et A p o u v a i e n t donc s ' e x p l i q u e r par la p r o d u c t i o n de cette deuxibme prot6ase. Nous r a p p o r t o n s dans le pr6sent m6moire la purification et la caract6risation partielle de la prot6ase EsA152 et nous comp a r o n s ses propri6t6s h celles de la prot6ase EsV s.

Matdriels et Mdthodes. 1) S o u c h e b a c t d r i e n n e et c o n d i t i o n s de c u l t u r e . La souche A152 de S. a u r e u s ainsi que le milieu de culture AN utilisds out dtd ddcrits prdcddemment [2]. Toutefois la concentration en extrait de levure a ~t6 augmentde & 1,5 p. cent. 2) Dosage de l'activitd prot~ol!Itique.

Fro. 1. - - T g p e s de z o n e s de p r o t d o l g s e f o r m d e s s u r m i l i e u ~ base de casdine, p a r d i f f d r e n t e s s o u c h e s de S, aureus apr~s i n c u b a t i o n ~8 h e u r e s d 37°C.

La mdthode utilisde dgrivait de celle de Kunitz [4] e t a dtd ddcrite prgc~demment [3]. Les substrats utilisds dtaient la casdine (Hammersten Nutritional Biochemicals Corp.) et l'hdmoglobine bovine. Une unitg d'activitd, dans les conditions donndes de dosage, 6tait ddfinie a r b i t r a i r e m e n t comme dtant une a u g m e n t a t i o n de 0,001 de la densitd optique, h 280 rim, par minute. L'activit6 spdcifique dtait le h o m b r e d'unitds par mg de prot6ine. 3) Dosage des p r o t d i n e s .

s6ine. S e l o n c e t t e m 6 t h o d e les d i f f 6 r e n t e s s o u c h e s

6tudi6es se r6partissent en c i n q groupes A, B, C, D et E. Comme on peut le voir sur la figure 1 la zone de prot6olyse la plus grande est celle du groupe A e t d6croit successivement pour les groupes B, C et D. Les souches du groupe E (non repr~sent6) ne p r o d u i s e n t aucune zone de prot6olyse. Une c o m p a r a i s o n de la protTase h s6rine p r o d u i t e par des souches repr6sentatives de c h a c u n des groupes A, B, f i e t D nous a p e r m i s de mettre en 6vidence qu'elles ont, entre autres, la m6,me sp6cificit6 mats qu'elles diff6rent p a r leur aetivit6 sp6eifique mesur6e sur eas6ine [2]. Les activit6s sp6eifiques sont r e s p e c t i v e m e n t de 223, 581, 419 el 349 u n i t 6 s p a r m g d e p r o t 6 i n e p o u r les p r o t 6 a s e s d e s s o u c h e s A, B, C et D, Ces d i f f 6 r e n t e s v a l e u r s ne c o r r e s p o n d e n t p a s au t y p e de z o n e de p r o t ~ o l y s e o b s e r v 6 p o u r c h a c u n des g r o u p e s . D a n s u n e ~ t u d e p o r t a n t s u r la s o u c h e V s d e S. a u r e u s a p p a r t e n a n t a u g r o u p e C n o u s a v o n s d 6 m o n t r ~ [3] q u e le s y s t ~ m e p r o t 6 o l y t i q u e de c e t t e s o u e h e c o m p o r tait, au m o i n s , u n e d e u x i ~ m e p r o t 6 a s e (EsVs) app a r t e n a n t au g r o u p e d e s m 6 t a l l o p r o t 6 a s e s et d o n t la s p 6 e i f i e i t 6 est p l u s l a r g e q u e c e l l e d e la p r o t6.ase h s 6 r i n e isol6e d e la m 6 m e s o u c h e . D e s 6tuB I O C H I M I E , 1978, 60, n ° 4.

I,es prot6ines out ~t6 dosges par la m6thode de Lowry et coll. [5] en u t i l i s a n t la s6rum a l b u m i n e de hceuf (fraction V, Sigma) comme r6fdrence. 4) P u r i f i c a t i o n de lu protdase. La protdase a dr6 purifi6e par la m6thode ddcrite pr6cddemment [3]. Les ~tapes successives 6taient la prdcip i t a t i o n par le sulfate d ' a m m o n i u m , la prdcipitation par l'acdtone et une c h r o m a t o g r a p h i c sur D.E.A.E. cellulose. Deux dtapes suppldmentaires, darts le cas de cette protdase out 6t~ n6eessaires. La premi6re comportait une pr6cipitation par l'ac6tone froid ( I 15oC, h n n e concentration finale, de 60 p. cent, v/v) des fractions doudes d'activit6 prot6olytique. Le pr6cipit6 dtait redissous darts quatre h six ml de t a m p o n Tris-Ca (Tris-HC1, 50 mM, pH 7.4, CaC12 l raM) et ensuite chromatographid sur une colonne de Sephadex G75 (2.5 × 120 cm) pr6alablement dquilibrde avec le t a m pon Tris-Ca. La deuxibme consistait h r a s s e m b l e r les fractions c o n t e n a n t l'activit6 protdolytique qui, aprbs prdcipitation par l'acStone, dtaient chromatographi6es h nouveau sur la colonne de Sephadex G75. Les fractions c o n t e n a n t l'activit~ protdolytique dtaient rassembl6es et eongel~es. 5) E s t i m a t i o n de la p u r e l d . Le degr6 de purer6 des prdparations 6tait estim6 par la mdthode de Davis [6] et Ornstein [7] et les prot~ines 6taient r6v616es par coloration au bleu de Coomassie selon la technique ddcrite par Weber et Osborn

E83.

Une mdlalloprotdase de

431

S. a u r e u s .

[3!. Aucune correction n'a 6t6 apporl6e pour la destruction de certains acides amin6s au cours de l'hydrolyse acide des peptides.

6) Ddlerminalion du poids moldculaire. Le poids mol6culaire a 6t6 d6termin6 par s6dimentation h l'6quilibre telle que d6crite pr6c6demment [3]. 7) Sp~cificitd d'action sur des substrals synthdliques. L'aetivit~ sur les esters 6thyliques de la a-N-benzoyl-arginine (BAEE) et de la N-benzoyl-tyrosine (BTEE) (Nutritional Bioehemieals Corp.) 6tait d6termin6e selon les m6thodes spectrophotom6triques d6crites pour la t r y p s i n e [9] e t l a e h y m o t r y p s i n e [10]. Dans le cas de Fester a - p h 6 n y l i q u e du N-beuzyloxycarbonyl-L-glutamate (Z-Glu-Ph) l'aetivit6 ~tait dos6e selon la m6thode speetrophotom6trique de H o u m a r d [11].

R6sultats~ I. PURIFICATION ET HOMOGEN/~ITE. Les 6 t a p e s d e p r 6 c i p i t a t i o n s p a r le s u l f a t e d ' a m m o n i u r n et l ' a c 6 t o n e p e r m e t t e n t d e r 6 c u p 6 r e r 76 p. c e n t d e l ' a c t i v i t 6 i n i t i a l e . Les p i g m e n t s e n t r a l n 6 s l o r s d e c e s p r 6 c i p i t a t i o n s s o n t 61imin6s a u c o u r s de la c h r o m a t o g r a g h i e s u r D.E.A.E. c e l l u l o s e (fig. 2). Les d e u x c h r o m a t o g r a p h i e s s u c c e s s i v e s s u r S e p h a d e x G75 (fig. 3 et 4) d e s f r a c t i o n s d o u 6 e s

8) Spdcificit6 d'action sur un polgpeplide nalurel de sdquence connue. Le s u b s t r a t utilis6 6tait la chaine B de l'insuline bovine. L ' i n s u l i n e (Zinc I n s u l i n Crystals, Beef, Connaught Laboratories, Toronto) 6tail oxyd6e selon la

1.00!

1

/ 075

°"

o_

075 F0.50 o

05C

o

o_ 0.25

0.25

F-

i 0 0¢

I0

O.00 20

30

40

50

60

70

FRACTIONS

FIG. 2. - - Chromalographie

sur D.E.A.E.-cellulose.

Colonne : 25 × 5 cm. Volume de l'6chantillon : 100 ml. D6bit : 69 m l / h . Volume des fractions : 23 ml. Colonne 6quilibr6e en t a m p o n Tris-Ca. Elution par gradient de KC1 0 h 0,4 M. --.© : D.O. h 280 nm. --.lI : Aetivit6 prot6olytique avant par I'E.D.T.A. : Aetivit6 prot6olytique apr~s par I'E.D.T.A. ÷ + : Fractions r6unis.

m6thode de Sanger [12] et les chaines A e t B s6par6es selon la technique de Humbel et coll. [13]. La digestion prot6olytique, la purification des peptides et l'analyse des aeides amin6s ont ~t6 d6erits pr6e6demment BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 4.

traitement traitement

d'activit6 prot6olytique permettent d'obtenir une p r o t 6 i n e h a u t e m e n t p u r i f i 6 e . E n effet l ' 6 1 e c t r o p h o r b s e en gel d e p o l y a c r y l a r n i d e n e r6vble q u e la

432

S. A. Saheb. TABLEAU

I.

Purification de la protdase EsA152. Fraction

Volume ml

A¢tivit6 totate unit~s × t0 4

Pmteine mg

Activit6 sp6cifique unit~s/mg

Rendemeut p. cent

Surnageant Precipitation par lc sulfate d'ammonium Precipitation par l'ac~tone Chromatographic sur D.E.A.E.cellulose Premi6re filtration sur sephadex G-75 Deuxi6me filtration sur sephadex G-75

5.000 175

27 24,8

49,500 5,300(*}

5,5 46,7

100 91,4

100 135

20,6 13,6

1,820 32,9

113 4,140

76,3 50,3

56

8,6

15,1

5,700

31,7

44

4,3

3,1

14,000

15,9

(*) Valeur d6termin~e sur u n dehantillon dialysd contre de l'eau distill~e pour ~liminer le sulfate d ' a m m o n i u m .

020 L

2.0

0.15

o p-

0.10

1.0

005

3.5

0.00

? _o

45

50

55 60 FRACTIONS

65

70

3.0

FIG. 3. - - Premiere filtration sur Sephadex G75. Colonne : 120 × 2,5 cm. Volume de l'dchantillon : 6 ml. D6bit : 19,5 m l / h . Volume des fractions : 6,5 ml. Colonne dquilibr6e en t a m p o n Tris-Ga. © : D.O. h 280 nm. ---B : Activit6 prot~olytique avant t r a i t e m e n t par I'E.D.T.A. : Activit~ prot~olytique apr6s t r a i t e m e n t par I'E.D.T.A. + + : Fractions r~unies.

pr6sence d'une bande de prot6ine. Les diff6rentes 6 t a p e s d e la p u r i f i c a t i o n s o n t r 6 s u m 6 e s d a n s le t a b l e a u I. I1 e n r e s s o r t q u ' o n p e u t o b t e n i r , a v e c u n r e n d e m e n t de 16 p. c e n t , u n e p r o t 6 a s e p u r i f i 6 e 2.600 f o i s et q u i p o s s 6 d e u n e a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e d e 14.000 u n i t 6 s p a r m g d e p r o t 6 i n e .

BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 4.

II. PnOPni~T~S. 1) Poids mol~culaire. La p r o t 6 a s e a 6t6 s o u m i s e h d e u x u l t r a c e n t r i f u g a t i o n s : l ' u n e h 30.000 d u r a n t 70 h e u r e s et l ' a u t r e 36.000 r p m d u r a n t 94 h e u r e s . E n se b a s a n t s u r

Une mdtalIoprotdase de S. a u r e u s . un v o l u m e sp6cifique m o y e n p o u r les prot6ines de 0,71, ceci nous a p e r m i s de c a l c u l e r un p o i d s mo16culaire de l ' o r d r e de 26.800 daltons p o u r celte prot6ase.

433

ions calcium. Cette i n h i b i t i o n est r6versible p a r l ' a d d i t i o n de c h l o r u r e de c a l c i u m ~ une c o n c e n t r a t i o n de 5 mM qui p e r m e t de r 6 a c t i v e r complbtement la prot6ase.

2,0

0,2

? o

E c cv

0,1 6 c~

W

T-

O,OC -

S'

-

~ 7 80

:

"

85 =

0,O

-

90

sur S e p h a d e x

G75

FRACTIONS

FIG.

4.

--

Deuxi~me

filtration

Colonne : 120 X 2,5 cm. Volume de l'6chantillon : 4 ml. D6bit : 16,5 ml/h. Volume des fractions : 5,5 ml. Colonne 6quilibr~e en tampon Tris-Ca. Elution par tampon Tris-Ca. --© : D.O. h 280 nm. - - I I : Aetivit6 prot~olytique avant traitement par I'E.D.T.A. - : Aetivit6 prot~olytique apr~s traitement par ]'E.D.T,A. ~' + : Fractions r6unies.

2), Influence du pH. La figure 5 m o n t r e que l'activit6 p r o t 6 o l y t i q u e de la prot6ase sur la cas6ine a u n m a x i m u m pH 7,0. P a r contre, cette prot6ase n'a aucune action sur l'h6moglobine. 3) Effets de diff~rents inhibileurs de l'activil~

prot~olytique. L o r s q u c la prot6ase est test6e en pr6sence de nb u t y l i s o c y a n a t e et de n - o c t y l i s o c y a n a t e , c o m m e d6crit p a r B r o w n et W o l d [14] on n ' o b s e r v e aur u n c h a n g e m e n t de l'activit6. De m6me, un traitem e n t p a r le fluorure de In6thane sulfone et de fluorure de p h 6 n y l - m 6 t h y l sulfone, c o m m e d6crit p a r F a h r n e y et Gold [15], n'affecte pas l'activit6 de la prot6ase. Nous avons d6j& m e n t i o n n 6 que l'activit6 de cette prot6ase peut 6ire c o m p l b t e m e n t inhib6e en p r 6 s e n c e d'E.D.T.A. & une c o n c e n t r a t i o n de 1 raM. I1 est int6ressant de m e n t i o n n e r q u ' u n e m6me inhib i t i o n est observ6e avec I'E.G.T.A. sp6cifique des

BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 4.

4) Sp~cificit&

a) Action sur les esters synth~tiques. La prot6ase ne poss~de aucune activit6 d6celable dans nos conditions, sur les substrats synth6tiques BAEE, B T E E et Z-Glu-Ph. Ceci s e m b l e r a i t donc i n d i q u e r que cette prot6ase est d 6 p o u r v u e d'activit6 est6rolytique. b) Action sur la chaine B d'insuline bovine oxy-

d~e. Les r a p p o r t s m o l a i r e s des acides amin6s dans les diff6rents peptides obtenus p a r t r a i t e m e n t de la c h a i n e B d ' i n s u l i n e b o v i n e oxydbe p a r la prot6ase sont indiqu6s dans le tableau II. D'aprbs ]es r6sultats obtenus, (l'6valuation de l ' a c i d e cyst4ique dans les p e p t i d e s n'a 6t6 que qualitative) il apparait que cette prot6ase ne s c i n d e que les seuls liens p e p t i d i q u e s dans lesquels les r6sidus h y d r o p h o b e s , leucine, valine, t y r o s i n e et p h 6 n y l a l a n i n e , sont engag6s p a r leur g r o u p e m e n t amin6.

S. A . S a h e b .

434

TABLEAU II. C o m p o s i t i o n en acides a m i n d s des p e p t i d e s o b t e n u s p a r digestion de la c h a f n e B d ' i n s u l i n e b o v i n e o x y d ~ e p a r la protdase EsA152. Peptides Acide amin6

I

II

lll

IV

V

VI

VII

(Rapports molaires des aeides amin6s constituants) Cys. S0:tH Asp

(a)

Glu

(a)

1,01 (1)

Ser Thr Gly Ala Val Leu Pro Phe Tyr His Lys Arg N. terminal (b) R~sidus nos

(a)

1,07 ([) 0,86 (1)

1,05 (1) 2,35 (2)

1,13 (1)

2 ,.15 (2)

0,98 (1)

0,58 (1) 0,90 (1)

0,68 (1)

1,42 (1) 0,60 (1) 1,95 (2)

0,95 (1) 1,02 (1)

0,96 (1) 2,00 (2)

0,93 (1)

1,02 (1) 0,96 (1)

0,94 (1)

1 , l l (1)

0,99 (1) Leu 6 - 10

18 - 23

17 - 23

a -- ddtermination qualitative

Leu 11 - 15

24 - 25

2 - 5

26 - 30

b - - d6termin6 p a r d a n s y l a t i o n .

Discussion.

IO0 #

¢ •

t%

,% % %

0 (M W IM D 0 l---

0,99 (1) 1,13 (l)

1,03 (1)

#I

#

J ##

%

% ~ I I I

h

I

0

-W 5C

\

0 n,," - l.i.l I--

\ \

I-LJ

\

pH Fro. 5. - - Influence du pH sur l'activil~ de l(l prot~ase EsA 152. Le m61ange r6actionnel de 5 nal, incub6 h 37°C, cont e n a i t 0,1 h 0,5 ml de solution e n z y m a t i q u e et 1 p. cent de s u b s t r a t dans diff~rents t a m p o n s 50 nM, c o n t e n a n t du CaC12 4 mM. Tampon : Ac6tate de sodium (pH 3,0- 5,0). Tris-rBal6ate (pH 4,0- 8,5). Tris-HC1 (pH 7,5- 9,5). Substrats : - casdine. - . . . . hdmoglot)ine.

BIOCHIMIE, 1978, 60, n o 4.

D e s r 6 s u l t a t s p r 6 c 6 d e n t s il a p p a r a i t q u e la s o u c h e A152 d e S. aureus p r o d u i t u n e p r o t 6 a s e q u i appartient au groupe des prot6ases neutres inhib6,es p a r les c h 6 1 a t e u r s d e m 6 t a u x [15]. L e s p r o pri6t6s de cette prot6ase rappellent en g6n6ral c e l l e s d 6 c r i t e s p o u r la p r o t 6 a s e n e u t r e d e la souc h e V s [3]. D ' u n p o i d s m o l 6 c u l a i r e s e n s i b l e m e n t identique, ces deux prot6ases diff6rent principalem e n t p a r l e u r a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e . E n effet il est i n t 6 r e s s a n t de n o t e r q u e c e l l e d e l a p r o t 6 a s e d e l a s o u c h e A152 (14.000 u n i t 6 s p a r nag d e prot6,ine) est c i n q fois s u p 6 r i e u r e h c e l l e d e la prot6ase de la s o u c h e V s (2.820 u n i t 6 s p a r nag d e p r o t 6 i n e ) . A l o r s q u e ces d e u x p r o t 6 a s e s n e s o n t p a s i n h i b 6 e s p a r les r 6 a c t i f s d e s 6 r y l - p r o t 6 a s e s , les c h 6 1 a t e u r s de m 6 t a u x q u e s o n t I'E.D.T.A. et I'E.G.T.A. i n h i b e n t c o m p l 6 t e m e n t l ' a c t i v i t 6 p r o t 6 o l y t i q u e . Cela, j o i n t a u fair q u e c e t t e i n h i b i t i o n peut 6tre c o m p l 6 t e m e n t r6.serv6e p a r l ' a d d i t i o n d ' i o n s c a l c i u m , d6m o n t r e le b e s o i n de la p r o t 6 a s e d e la s o u c h e A152 e n c e s i o n s p o u r s o n a c t i v i t 6 . C o r n m e c ' e s t le c a s p o u r la p r o t 6 a s e d e l a s o u c h e Vs, celle de la souc h e A152 a u n p H o p t i m u m d e 7,0 s u r la c a s 6 i n e et p o s s 6 d e u n e s p 6 e i f i c i t 6 c o m p a r a b l e . D 6 n u 6 e d ' a c t i v i t 6 e s t 6 r o l y t i q u e s u r les e s t e r s s y n t h 6 t i q u e s B T E E , B A E E et Z - G I u - P h la p r o 1 6 a s e E s A I 5 2 s c i n d e la c h a i n e B d ' i n s u l i n e b o v i n e o x y d 6 e d ' u n e m a -

Une mdtalloprotdase de S. a u r e u s . n i b r e s e m b l a b l e a u x m 6 t a t l o prot6.ases p r o d u i t e s p a r S. g r i s e u s et A. o r y z a e I e t II, s a n s q u ' i l air 6t6 toutefois possible de d6terminer une scission 6 v e n t u e l l e d u l i e n p e p t i d i q u e P h e ( 2 4 ) - P h e (25). I1 a p p a r a l t d o n c q u e les d i f f 6 r e n c e s d e z o n e s de p r o t 6 o l y s e o b s e r v 6 e s s u r la c a s 6 i n e a v e c les s o u c h e s de S. a u r e n s s e r a i e n t d u e s p r i n c i p a l e m e n t fi la p r o d u c t i o n d e m 6 i a l l o p r o t 6 a s e s d e m 6 m e s p 6 c i ficit6 m a i s q u i d i f f 6 r e r a i e n t p a r l e u r a c t i v i t 6 .

Remerciements. L ' a u t e u r tient it remercier le docteur G. R. Drapeau, du d ~ p a r t e m e n t de Microbiologie et d ' I m m u n o l o g i e de t'Universitd de Montrdal, chez lequel une p a t t i e de ce travail a dt~ effectude, le docteur Jean H o u m a r d , qui lui a gdn~reusement f o u r n i un dchantillon de Z-Gla-Ph, et te docteur A.-G. Borduas, p o u r ses conseils au cours des c e n t r i f u g a t i o n s analytiques.

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