BIOCHIMIE, 1975, 57, 29-34.
Purification des
-lactamases par chromatographie d'affinitd.
F r a n g o i s LE GOFFIC ~>, Jane ANDRILLON-SPIEGEL et Robert LETARTE.
Laboratoire de Biooryanique, E.R. 156 du CNRS, Ecole Normale Supdrieure, 2¢, rue Lhomond, 75231 Paris Cedex 05. (25-10-7~).
Summarg. - - Affinity columns able to purifie [3-1actamases have been prepared either by linking eovalently reversible inhibitors or substrates to agarose beds. The enzyme is eluted with a gradient of sodium chloride or released with the substrate. This method is a pertinent one for the purification of these enzymes and for the study of bacteria harbouring more than one ~qaetamase.
INTRODUCTION.
MATERIEL E T METHODES.
La c h r o m a t o g r a p h i c d'afflnit6 est m a i n t e n a n t u n e t e c h n i q u e l a r g e m e n t utilis6e dans de nomb r e u x laboratoires. Elle a souvent prouv6 son efficacit6 dans la p u r i f i c a t i o n de n o m b r e u x enzymes ou r6cepteurs difficiles h o b t e n i r h l'6tat purifi6 p a r les t e c h n i q u e s classiques de la biochimie [1, 2].
1) Souches bacldriennes. La souche d'E. colt K 12 h6bergeant le plasmide R-TEM nous a 6t6 f o u r n i e p a r le Professeur Chabbert (Institut Pasteur). Les souches de Klebsiella pneumoniae et de Proteus rettgeri nous ont 6t6 fournies p a r le Professeur P6ch6re (H6pital de l'H6tel Dieu de Qu6bec, Canada).
Une ~-lactamase de Bacillus licheniformis (penicilline amido l%lactame hydrolase EC 3-5-2.6) a d6jh 6t6 purifi6e p a r cette m6thode [3j. Des fragm e n t s de r6cepteur des p 6 n i c i l l i n e s ont 6galement 6t6 isol6s sur u n e r6sine biosp6cifique E4, 5]. Nous avons p r 6 c 6 d e m m e n t d6crit u n e colonne d'affinit6 off l ' a m p i c i l l i n e est insolubilis6e sur u n eopolym6re d'agarose a c r y l a m i d e [6] p a r l ' i n t e r m6diaire de glutarald6hyde. Cette colonne permet la p u r i f i c a t i o n la p 6 n i c i l l i n a s e R-TEM. Cependant, en r a i s o n de la nature des liaisons mises en jeu (liaison imine), son effi:cacit6 d i m i n u e rapidement. Ceci limite donc c o n s i d 6 r a b l e m e n t son utilisation. Le pr6sent m 6 m o i r e d6crit la p r 6 p a r a t i o n de nouvelles r6sines d'affinitk off I'on utilise le r6sidu 7-ACA (acide amino-7 c6phalosporanique) ou l'acide amino-7 cephalosporoique (fig. 1) comme hame9on p o u r pi6ger l'enzyme. Oeux types de colonnes ont 6t6 d6velopp6s : ]e type I off l'on fixe d i r e c t e m e n t la c~phalosporine C (fig. 1) au polym6re insoluble, et le type II off l ' o n accroche l'acide amino-7 c 6 p h a l o s p o r a n i q u e h la rdsine insoluble p a r l ' i n t e r m 6 d i a i r e d ' u n bras p r 6 a l a b l e m e n t greff6. L'efficacit6 de ces r6sines a 6t6 test~e h court et h long ternle vis-h-vis de diverses ~ lactamases. > est utitis6 comme source d'enzyme. 3) Materiel. L ' i n d u b i o s e A 4 a 6t6 f o u r n i e p a r l ' I n d u s t r i e F r a n g a i s e Biologique, la c6phalosporine C et 1'actde amino-7 c 6 p h a l o s p o r a n i q u e ont 6t6 f o u r n i s par la Soci6t6 Eli Lilly, l ' a m p i c i l l i n e p a r la Soci6t6 Beecham et la e6phalotine p a r la Soci6t6 Eli Lilly. 4) Technique analytique. Le d 6 r o u l e m e n t de la c h r o m a t o g r a p h i c est suivi p a r e n r e g i s t r e m e n t c o n t i n u du spectre ultra-violet (280 nm) de l'61uat. L'activit6 e n z y m a t i q u e est d6tect6e p a r la m6thode m i c r o a c i d i m 6 t r i q u e E7]. L'efficacit6 de la c h r o m a t o g r a p h i c est 6valu6e p a r c o m p a r a i s o n des densit6s optiques fi 280 n m et des activit~s e n z y m a t i q u e s respectives des extraits bruts et purifi6s. Les constantes ein6tiques de Michaelis Menten Km, Vm et Ki des trois enzymes utilis6es sont d6-
F. L e Goffic, J. A n d r i l i o n - S p i e g e l et R . L e t a r t e .
30
termindes par microacidimdtrie couplde h l'ordin a t e u r [7] et s o n t r e l a t d e s d a n s le t a b l e a u I. O-- C --CH 3
A: COOH
TABLEAU l I . Enzyme
.
COOH
.........
P6nieillinase RTEM ............ C~phalosp. de Klebsielle . . . . . . . . C6phalosp. de Proteus . . . . . . . . .
HOOC
O__C_C;qa
COOH
Fro. 1. - - Structures de l'aeide amlno-7 cephalosporanique (a) et de l'aeide amino-7 edphalosporo~'que (b) et de la e~phalosporine C (e). TABLEAU I.
Substrat
100 91 10 --
Km
Km ~
rel. 100 2270 5360
V.~
'
Vm
~M
3 33 130
~
rel- I V~
22 29 147
Pfinieilline G . . . . . . . . . Cdphalotine . . . . . . . . . . C6phalosporine C . . . . . Ampicilline . . . . . . . . . . .
Substrat
Km
~M
P~nieilline G . . . . . . . . . Ampicilline . . . . . . . . . . . C~phalotlne . . . . . . . . . . . Cdphalosporine C . . . . .
Substrat
Vm
am
Km
tel.
V~
tel. 100 50 80 100o
~
.¢
tel
lO0
IOO
1200
IO lO lO0
80O >
a) Constantes enzymatiqu,es o b t e n u e s p o u r la p~nieillin~ase R-TEM. ~ (8) repr6sente la stabilit6 du s u b s t r a t vis-h-vis de l'enzyme. La edphalosporine C est peu ddgradde p a r / ' e n z y m e , (~ trds grand). b) C o n s t a n t e s cin~tiqucs ob~enues pour la e&phalosporinase de KlebsieHe. L ' a m p i e i l l i n e est u n trds m a u v a i s substrat. e) Constantes eindtiques o b t e n u e s p o u r la edphal o s p o r i n a s e de Proteus rettgeri. L ' a m p i e i l l i n e est u n m a u v a i s substrat.
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.
K~ en t~M
cephalosporoiqu~
i
800 100
C o n s t a n t e s d ' i n h i b i t i o n de l'aeide c6phalosporoique o b t e n u avec les p~nicilHnases R-TEM et les c~phalosporinases de Klebsielle et de Proteus. L'aeide cpehalosporoique est u n tr6s m a u v a i s i n h i b i t e u r de la p~nicillinase R-TEM, u n i n h i b i t e u r m o y e n de la c6phalospor i n a s e de Kle~bsieHe et u n assez b o n i n h i b i t e u r de la c6phalosporinase de Proteus retgerri. Les 61ectrophorbses sont conduites comme suit : Une fraction chromatographique contenant Penz y m e p u r i f i d e est d i a l y s d e , c o n c e n t r d e p a r l y o p h y lisation, puis traitde par du dodecyl sulfate de s o d i u m . L ' d l e c t r o p h o r ~ s e est c o n d u i t e e n a p p l i q u a n t n n c o u r a n t d e 10 mA/18,0 V p e n d a n t 4 h h t e m p 6 r a t u r e o r a i n a i r e . Le t a m p o n u t i l i s 6 e s t u n t a m p o n T r i s (0,01 M) g l y e i n e (0,3 M) p H 8,7. L e s prot6ines sont eolordes par du bleu de coumassie h la m a n i 6 r e h a b i t u e l l e . 5) D~roulement des chromatographies. L ' 6 1 u t i o n se f a i t h l ' a i d e d ' u n g r a d i e n t d e c h l o r u r e d e s o d i u m et 6 v e n t u e l l e m e n t h ] ' a i d e d e s o l u t i o n s d e s u b s t r a t d e l ' e n z y m e : s o l u t i o n h 1 000 V d'ampieilline pour l'enzyme R TEM solution h 1 000 V d e c 6 p h a l o t i n e p o u r l a e 6 p h a l o s p o r i n a s e d e Klebsiella p n e u m o n i a e et d e Proteus rettgeri. L a v i t e s s e d ' 6 1 u t i o n est 90 m l / h , et les f r a c t i o n s s o n t d e 13 m l . 6) PrJparation des r~sines biospdci[iques R?sine de t y p e I. A u n e s u s p e n s i o n d ' i n d u b i o s e A 4 (5 g d a n s 100 m l d ' e a u d i s t i l M e ) , o n a j o u t e e n u n e s e u l e fois 5 g de bromure de eyanogbne. La temp6rature du m i l i e u r 6 a c t i o n n e l n e d o l t p a s d 6 p a s s e r 20°C, et s o n p H e s t m a i n t e n u ~ u n e v a l e u r d e 11 p a r a d d i t i o n c o n t i n u e d e s o u d e 8 M. L o r s q u e le p H n e v a r i e p l u s , l ' a d s o r b a n t a c t i v 6 est l a y 6 r a p i d e m e n t a v e c u n t a m p o n ( p H 10) c o n s t i t u 6 d e 8,4 g d e bic a r b o n a t e d e s o d i u m et d e 1fi,6 g d e c a r b o n a t e d e s o d i u m d i s s o u s d a n s I 1 d ' e a u distillde. I1 est e n s u i t e agit6 l e n t e m e n t h 4 ° C p e n d a n t 18 h d a n s 100 m l d u m d m e t a m p o n c o n t e n a n t 1 g d e c d p h a l o s p o r i n e C, p u i s lav6 a b o n d a m m e n t /I l ' e a u d i s t i l 1de. On l ' i n t r o d u i t e n s u i l e d a n s u n e c o l o n n e d e c h r o m a t o g r a p h i e q u i est 6 q u i l i b r d e p a r u n e s o l u t i o n d e c h l o r u r e d e s o d i u m 0,01 M.
31
P u r i f i c a t i o n des P-lactamases par c h r o m a t o g r a p h i e d'affinitd. R~sine du type II. A 5 g d ' i n d u b i o s e A 4 (adsorbant sec) activ6s par le b r o m u r e de cyanogbne comme pr6c6demment, on ajoute 1 g d'6thylbne d i a m i n e et laisse ]e tout agiter d o u c e m e n t h ~- 4°C p e n d a n t 18 h. On lave ensuite la r6sine amin6e ainsi obtenue h ]'eau distill6e et la remet en s u s p e n s i o n dans 100 ml d'eau. L ' a l l o n g e m e n t de la chaine d6jh greff6e est alors r6alis6e par a d d i t i o n d ' a n h y d r i d e s u c c i n i q u e h pH 6. L'agitation est alors p o u r s u i v i e p e n d a n t 18 h /~ -F 4°C. La r6sine ainsi o b t e n u e est enfin trait6e p a r 3,5 mmoles de 7-ACA (.figure 1) dissout dans 150 ml de dim6thyl formamide. Aprbs avoir ajusL6 son pH h 5, on ajoute 25 mmoles de p. tolubne sulfonate de N cyclohexyl N'-(~ (N-m6thyl m o r p h o l i n o ) - e t h y l ) c a r b o d i i m i d e en solution dans 2,0 ml d'eau distill6e. On agite le m61ange o b t e n u p e n d a n t 1 h h temp6rature a m b i a n t e puis on r i n c e a b o n d a m m e n t h l'eau distill6e et 6quilibre la r6sine biosp6cifique ainsi obtenue sur u n e solution de c h l o r u r e de s o d i u m 0,01 M. •
trouve toute ]'activit6 e n z y m a t i q u e dans u n e zone off, dans les c o n d i t i o n s de l'exp6rience, on ne d6tecte a u c u n e a b s o r p t i o n ultraviolette. Une solution m6me concentr6e de c h l o r u r e de s o d i u m ne peut d6crocher 1'enzyme, seule ] ' a m p i c i l l i n e 1 000 m c g / m l peut dissocier le complexe c6phalos p o r i n e i m m o b i l i s 6 e - p 6 n i c i l l i n a s e R TEM. Un seul passage sur cette colonne permet d ' o b t e n i r u n e enzyme purifi6e d ' e n v i r o n 300 fois. Des passages r6p6t6s d'extraits e n z y m a t i q u e s de p 6 n i c i l l i n a s e s R TEM sur eette c o l o n n e c o n d u i s e n t /~ u n e d i m i n u t i o n de sa capacit6 qui devient h peu prbs nulle au bout de quatre c h r o m a t o g r a p h i e s e n v i r o n (fig. 3b). L ' e n z y m e est en effet capable d ' h y d r o l y s e r l e n t e m e n t le n o y a u ~-lactame de la c6phalosporine, ce qui c o n d u i t h l'acide c6phalosporoique immobilis6 qui est inapte h r e t e n i r l ' e n z y m e (tableau II). d.o.
S
280
nm
~
~'~ :,
5
J
~
1
t
1,,
O - C - ~ . ~ - C H - I CH;~) _ C O _ N H OOH
3
OA C
coo~
[]
enz.
let.
La¢tamal~
,t
i
(rel.)
100
I
0
o.COH N~ 'COOH -~"
¢
200
vol. effluent
400
(rdl)
[] d.¢,.
a
280
r~m
==t.
en=.
(,et.)
~E 100 ,i
u
o
COOH
2OO OH
FIG. 2 . Representation schdmatique des rdsines biospdeifiques pr~pardes. La r6sine A est hydrolys6e
effluent
(ml~
b
~OOH
[]
rot.
400
FIG. 3. - - Profil d'dlution de la p~nicillinase R-TEM sur la cdphalosporine C insolubilis~e : ( ) absorption U V h 2,80 nm ; ¢.......... ) activit6 enzymatique. P r e mi6re utilisation
(a), 5" u t i l i s a t i o n
(b).
enzymatiquement en A' at'ors que la '6 lactamase transforme la r6sine B e n B'.
2) Cas RESULTATS. A - - RI~SINES DU TYPE I : Pn~MI~nES UTILISATIONS
DE
LA RESINE.
1) Cas de ]a p 6 n i c i l l i n a s e R TEM. La figure 3a m o n t r e c l a i r e m e n t que cette r6sine est tout ~ fair apte ~ r e t e n i r r e n z y m e p u i s q u e l'on
BIOCHIMIE, 1975, 57, n o 1.
de la
c6phalosporinase
de Klebsiella
pneumoniae. La figure 4a m o n t r e q u ' i c i encore la c6phalos p o r i n a s e de Klebielle est fortement r e t e n u e sur ]a colonne biosp6cifique, p u i s q u ' i l est n6cessaire d'utiliser u n e c o n c e n t r a t i o n r e l a t i v e m e n t i m p o r tante de c6phalotine p o u r ]a relarguer. L ' e n z y m e ainsi obtenue est h a u t e m e n t purifi6e ( e n v i r o n 500 fois).
32
F. Le Goffic, J. Andrillon-Spieyel et R. Letarte.
Les u t i l i s a t i o n s s u i v a n t e s de la c o l o n n e c o n d u i sent h une ouverture e n z y m a t i q u e lente du cycle ~-lactame et d o n n e n t l'acide c6phalosporoique ins o l u b l e d o n t l'affinit6 ( t a b l e a u II) p o u r l ' e n z y m e est c o n s i d 6 r a b l e m e n t affaiblie. C e c i e x p l i q u e l ' a p p a r i t i o n d ' u n p i c e n z y m a t i q u e 61uable p a r u n e s o l u t i o n de c h l o r u r e de s o d i u m , seul p i c q u e l ' o n r e t r o u v e au b o u t de 6 h 10 u t i l i s a t i o n s qui s o n t n 6 c e s s a i r e s p o u r h y d r o l y s e r tout le c y c l e ~-lacl a m e de l ' a n t i b i o t i q u e . Au c o n t r a i r e de la ~-lactamase R TEM, le r e n d e m e n t de la c h r o m a t o g r a p h i e r e s t e q u a n t i l a t i f et te p o u v o i r de s ~ p a r a t i o n de la c o l o n n e reste r e m a r q u a b l e . L ' e n z y m e 61u6e est en effet d ' u n e trbs g r a n d e puret6 comme le m o n t r e le pro~fil d'61ution et l ' a n a l y s e 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e
d,o.
280
nm
act. enz.
(tel.)
]00 m z
4 Z
4
II
u
I' i I
!
t
0
I O'
~00
d...
•
~
vol. effluent
400
2 8 0 nm
act.ont.
(m|)
(tel,)
100
(fig. 6). z
3) Gas
de
la
c6phalosporinase
de
z
o
Proteus
rettyeri. Le profil d'61ution et de purification de cette e n z y m e est s i m i l a i r e h celui de la c6phalosporinase de klebsielle (fig. 5). Les premibres utilisalions de la c o l o n n e c o n d u i s e n t h un profil d'61ud.o. ~ 2 8 0
act. enz.
nm
•
~=
/
.~.
~.
0 200
.0
vol. effluent
400
(ml)
b Fla. 5. - - P r o f i l d ' ~ l u t i o n de la c d p h a l o s p o r i n a s e de P r o t e u s s u r la c d p h a l o s p o r i n e C i n s o l u b i l i s ~ e s u r b i l l e s ) spectre UV ~t 280 n m ; d'indubiose A 4 : (
( ........ ) aetivit6 enzymatique (a) I re utilisation, Co) 3" utilisation.
(tel.)
c
2~ "
:~ o
i00
•
•i
•
•• iii:i• i)71 i i/ iiii,i ! iii
!
\
ii !i,i ii'
0 vol, effluent
u.o.
280
(mI)
400
200
act.enz.
nm
(rot.)
tOO
I:
0 200
400
rot. elf luent
(rnl)
Fro. 4. - - P r o f l l d ' d l u t i o n de la c d p h a l o s p o r i n a s e de K [ e b s i e l l e s u r la c ~ p h a l o s p o r i n e C i n s o l u b i l i s ~ e :
I--) absorption UV h 280 ; ( ........ --) aetivitd enzymatique. Premi6re utiIisation (a), 3~ utilisation (b).
t i o n d a n s l e q u e l u n e g r a n d e p a r t i e de l ' e n z y m e est r e t e n u e (61ulion p a r de la c6pfialotine). Au b o u t de q u e l q u e s u t i l i s a t i o n s , l ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e est e o m p l ~ t e r n e n t d 6 e r o c h 6 e p a r u u e s o l u t i o n de c h l o r u r e de s o d i u m .
BIOCHIM1E,
1975, 57, n ° 1.
Fla. 6. - - P r o f l l d ' ~ l e c t r o p h o r b s e de la c ~ p h a l o s p o r i n a s e de K l e b s i e l l e (technique au SDS). L'dlectrophor6se
es~ eonduite sur des ge~s de polyacrylamide. Les protdines sont col~ordes par du bleu de coumassie.
P u r i f i c a t i o n des ~-lactamases par c h r o m a t o g r a p h i e d'affinitd. Les profils d'61ution m o n t r e que, ici encore, l ' e n z y m e isol6e est h a u t e m e n t purifi6e (300 h 500 fois). La c6phalosporinase de Proteus est 16g6rem e n t plus r e t e n u e que celle de Klebsielle comme le m o n t r e la c o m p a r a i s o n des figures 4b et 5b. Apr6s u n an d'utilisation, cette colonne d'acide c6phalosporoique est encore tout ~ fair apte h p u r i f i e r d ' u n e m a n i 6 r e r e m a r q u a b l e ces deux c6phalosporinases ou d'autres c6phalosporinases h6berg6es p a r d'autres bact6ries. La figure 6 m o n t r e le profil d'61ectrophor6se de la c6phalosporinase de Klebsielle purifi6e apr6s u n e ann6e d'utilisation de la colonne biosp6cifique d'acide c6phalosporoique immobilis6e.
B - - R~sine du type II (fig. 2). Elle a u n c o m p o r t e m e n t tout h fair similaire h celui de la r6sine du p r e m i e r type. C e p e n d a n t sa capacit6 de r6tention d ' e n z y m e est m o i n d r e , ce qui est sans doute dO aux n o m b r e u s e s 6tapes n6cessaires p o u r la synth6tiser. Sa r6sistance h l ' h y d r o l y s e e n z y m a t i q u e semble u n peu plus prononc6e que clans le cas de la r6sine pr6c6dente : ainsi p o u r la p 6 n i c i l l i n a s e R TEM, c'est seulement aprbs 6 h 8 utilisations de la r6sine qu'elle devient inefficace p o u r pi6ger l'enzyme. DISCUSSION. Les 3 ~-laetamases utilis6es pour tester les r6sines biosp6cifiques synth6tis6es sont de deux types : - - le type p d n i c i l l i n a s e h a u t e m e n t actif sur les p6nicHlines et peu actif sur les c6phalosporines et le type c6phalosporinase tr6s actif sur les c6phalosporines et poss6dant u n e faible affinit6 p o u r Ies p6nicillines. Ceci est lout h fait confirm6 par le tableau I. Le tableau II m o n t r e c l a i r e m e n t que l'ouverture, soit chimique, soit enzymatique, du cycle ~-lactame de la c6phalosporine utilis6e, dolt c o n d u i r e h des r6sines g a r d a n t u n e affinit6 p o u r tes c6phalosporinases (Ki = 100 et 800 ~n~o!es) mais a y a n t p e r d u l'aptitude de r e t e n i r les p6nicillinases (Ki ~ 00). Lors des toutes premibres utilisations des colonnes que nous avons dbcrites, il est en effet possible de p u r i f i e r effieacement h peu pros toutes les ~-laetamases, que ce soit p 6 n i c i l l i n a s e ou eephalosporinase, ee qui est compatible avec les donn6es ein6tiques p u i s q u e la c6phalosporine C est substrat, h des degr6s diff6rents certes, de ces trois enzymes. A long terme, l'efficacit6 de ces colonnes se Inodifie : la p 6 n i c i l l i n a s e R TEM n'est plus r e t e n u e
BIOCHIMIE, •975, 57, n ° 1.
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p a r la r6sine alors que les deux c6phalosporinases 6tudi6es sont s6par6es d ' u n e m a n i 6 r e r e m a r q u a b l e de prot6ines et acides nucl6iques parasites. Ces r6su,ltats sont bien stir en excellent accord avec les donn6es cin6tiques (tableau II). On pouvait aussi esp6rer, h l ' a p p u i des constantes d'affinit~ aussi divergentes des deux e6phalosporinases s61ectionn6es vis-h-vis de l'acide c6phalosporoique Ki = 100 et 800 ~moles respectivement) qu'il serait possible de s6parer ces deux enzymes, ce qui a 6t6 r6alis6 : les figures 4 a et 5 b e n r e n d e n t tout ~ fair compte : l ' e n z y m e poss6dant la constante d ' i n h i b i t i o n la plus 61ev6e est 61u6e d ' a b o r d . Un autre int6r6t de ces colonnes d'acides c6phalosporoiques insolubilisdes est son a p p l i c a t i o n la s6parafion ais6e et r a p i d e de p6nicillinases et de c6phalosporinases trbs souvent pr6sentes chez la rn6me bact6rie r6sistante, u n e telle utilisation sera relat6e dans u n p r o c h a i n m6moire. La capacit6 de la r6sine h la c6phalosporine C est bien plus g r a n d e que celle de la r6sine obtenue p a r greffages successifs d ' u n bras puis de l'hameqon. Ce qui est d'ailleurs tout ~ fair logique, cependant cette r6sine p a r a i t r a i t plus avantageuse p o u r p u r i f i e r les p6nici,llinases ~ cause de sa plus grande r6sistance ~ la d6gradation enzymatique, ce qui est sans doute dfi h la n a t u r e diff6rente des deux bras utilis6s. CONCLUSION. La t e c h n i q u e de c h r o m a t o g r a p h i e d'affinit6 que nous venons d't~tudier constitue donc u n e m~thode originale et efficace p o u r p u r i f i e r les p~nicillinases bien que ces enzymes soient capables d ' h y d r o l y s e r r a p i d e m e n t l ' h a m e c o n et de c o n d u i r e h u n e colonne tout h fait inefficace. Ces r6sines hydrolys~es sont c e p e n d a n t extr6m e m e n t utiles et int6ressantes h plus d ' u n p o i n t : -Elles p e r m e t t e n t de p u r i f i e r efficacement et r a p i d e m e n t les c6phalosporinases de plus en plus n o m b r e u s e s que l'on r e n c o n t r e chez les bact6ries r6sistantes isol6es en milieu hospitalier.
--- Elles p e r m e t t e n t lorsque, les donn6es ein6tiques sont favorables, de s6parer deux c6phalosporinases 6ventuellement pr6sentes dans la m6me souehe baet6rienne. - - E l l e s p e r m e t t e n t de s6parer facilement en une seule 6tape u n e p 6 n i c i l l i n a s e d ' u n e c6phalosporinase, enzymes tr6s f r d q u e m m e n t rencontrdes dans des souches b a e t 6 r i e n n e s r6sistantes aux l a c t a m i n e s et ainsi de d6finir c l a i r e m e n t leurs caract6ristiques cin6tiques. 3
F . L e G o f f i c , J. A n d r i I l o n - S p i e g e l
34
et R . L e t a r t e .
E l l e s d e v r a i e n t a u s s i p e r m e t t r e la s 6 p a r a t i o n biospdcifique des r6cepteurs de ces m d d i c a m e n t s . Des e x p 6 r i e n c e s c o n c e r n a n t ce p r o b l d m e s o n t e n c o u r s et les r 6 s u l t a t s o b t e n u s s e r o n t r e l a t 6 s ult6rieurement.
Ces colonnes p e r m e t t e n t 6galement de s6parer des p6nicillinases et des c6phalosporinases, voir mSme deux c6phalosporinases.
Cet o u t i l d e p a r l a s i m p l i c i t 6 d e sa r 6 a l i s a t i o n et de son utilisation d e v r a i t i n c o n t e s t a b l e m e n t trouv e r u n e l a r g e utilis,ation d u n s les l a b o r a t o i r e s i n t 6 r e s s 6 s p a r l ' 6 t u d e b i o e h i m i q u e d e s ~-lactamines.
1. Cuatrecasas, P. (19.71) Methods in enzymology, vol. XXII, 345-385, Academic press New York and London. 2. Le Goffic, F., Baea, B. & Moreau, N. (1974) Febs Letlers, 41, 69-72. 3. Crane, L. J., Bettinger, G. E. & Lampen, J. O. (1~373) Biochem. and Biophys. Res. ~ommun., 50, 2, 220-2~27. 4. Bl~umberg, P. M. & Strominger, J. L. (1972~ Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 69, I2~ 3r751-3755. 5. Blumberg, P. M. (1974) Ann. N.Y. Acad. Sci., 235, 310-25. 6. Le Goffie, F., Labia, R. & Andrillon, J. (1973) Biochim. et Biophys. Acta, 3,15, 439442. 7. Labia, R., Andrillon, J. & Le Goffic, F., (1973.) Febs Letters, 33, 1, 42-44. 8. Labia, R. (1974) C. R. Acad. Sc., 279 D, 109-112.
R~suM~. Des colonnes d'affinit6 p e r m e t t a n t d'e purifier des ~-laetamases ont 6t6 obtenues en fixant soit des inhib i t e u r s r~versibles de ees enzymes h des billes d'ind~ubiose A 4, soit des substrats. La ~-laetamase est 61u6e h l'aide d'un gradient de eblorure de sodium ou h Faide d'une solution d'un de ses substrats. La purification est en g6n~ral excellente.
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.
BIBLIOGRAPHIE.
Purification des
-lactamases par chromatographie d'affinitd.
F r a n g o i s LE GOFFIC ~>, Jane ANDRILLON-SPIEGEL et Robert LETARTE.
Laboratoire de Biooryanique, E.R. 156 du CNRS, Ecole Normale Supdrieure, 2¢, rue Lhomond, 75231 Paris Cedex 05. (25-10-7~).
Summarg. - - Affinity columns able to purifie [3-1actamases have been prepared either by linking eovalently reversible inhibitors or substrates to agarose beds. The enzyme is eluted with a gradient of sodium chloride or released with the substrate. This method is a pertinent one for the purification of these enzymes and for the study of bacteria harbouring more than one ~qaetamase.
INTRODUCTION.
MATERIEL E T METHODES.
La c h r o m a t o g r a p h i c d'afflnit6 est m a i n t e n a n t u n e t e c h n i q u e l a r g e m e n t utilis6e dans de nomb r e u x laboratoires. Elle a souvent prouv6 son efficacit6 dans la p u r i f i c a t i o n de n o m b r e u x enzymes ou r6cepteurs difficiles h o b t e n i r h l'6tat purifi6 p a r les t e c h n i q u e s classiques de la biochimie [1, 2].
1) Souches bacldriennes. La souche d'E. colt K 12 h6bergeant le plasmide R-TEM nous a 6t6 f o u r n i e p a r le Professeur Chabbert (Institut Pasteur). Les souches de Klebsiella pneumoniae et de Proteus rettgeri nous ont 6t6 fournies p a r le Professeur P6ch6re (H6pital de l'H6tel Dieu de Qu6bec, Canada).
Une ~-lactamase de Bacillus licheniformis (penicilline amido l%lactame hydrolase EC 3-5-2.6) a d6jh 6t6 purifi6e p a r cette m6thode [3j. Des fragm e n t s de r6cepteur des p 6 n i c i l l i n e s ont 6galement 6t6 isol6s sur u n e r6sine biosp6cifique E4, 5]. Nous avons p r 6 c 6 d e m m e n t d6crit u n e colonne d'affinit6 off l ' a m p i c i l l i n e est insolubilis6e sur u n eopolym6re d'agarose a c r y l a m i d e [6] p a r l ' i n t e r m6diaire de glutarald6hyde. Cette colonne permet la p u r i f i c a t i o n la p 6 n i c i l l i n a s e R-TEM. Cependant, en r a i s o n de la nature des liaisons mises en jeu (liaison imine), son effi:cacit6 d i m i n u e rapidement. Ceci limite donc c o n s i d 6 r a b l e m e n t son utilisation. Le pr6sent m 6 m o i r e d6crit la p r 6 p a r a t i o n de nouvelles r6sines d'affinitk off I'on utilise le r6sidu 7-ACA (acide amino-7 c6phalosporanique) ou l'acide amino-7 cephalosporoique (fig. 1) comme hame9on p o u r pi6ger l'enzyme. Oeux types de colonnes ont 6t6 d6velopp6s : ]e type I off l'on fixe d i r e c t e m e n t la c~phalosporine C (fig. 1) au polym6re insoluble, et le type II off l ' o n accroche l'acide amino-7 c 6 p h a l o s p o r a n i q u e h la rdsine insoluble p a r l ' i n t e r m 6 d i a i r e d ' u n bras p r 6 a l a b l e m e n t greff6. L'efficacit6 de ces r6sines a 6t6 test~e h court et h long ternle vis-h-vis de diverses ~ lactamases. > est utitis6 comme source d'enzyme. 3) Materiel. L ' i n d u b i o s e A 4 a 6t6 f o u r n i e p a r l ' I n d u s t r i e F r a n g a i s e Biologique, la c6phalosporine C et 1'actde amino-7 c 6 p h a l o s p o r a n i q u e ont 6t6 f o u r n i s par la Soci6t6 Eli Lilly, l ' a m p i c i l l i n e p a r la Soci6t6 Beecham et la e6phalotine p a r la Soci6t6 Eli Lilly. 4) Technique analytique. Le d 6 r o u l e m e n t de la c h r o m a t o g r a p h i c est suivi p a r e n r e g i s t r e m e n t c o n t i n u du spectre ultra-violet (280 nm) de l'61uat. L'activit6 e n z y m a t i q u e est d6tect6e p a r la m6thode m i c r o a c i d i m 6 t r i q u e E7]. L'efficacit6 de la c h r o m a t o g r a p h i c est 6valu6e p a r c o m p a r a i s o n des densit6s optiques fi 280 n m et des activit~s e n z y m a t i q u e s respectives des extraits bruts et purifi6s. Les constantes ein6tiques de Michaelis Menten Km, Vm et Ki des trois enzymes utilis6es sont d6-
F. L e Goffic, J. A n d r i l i o n - S p i e g e l et R . L e t a r t e .
30
termindes par microacidimdtrie couplde h l'ordin a t e u r [7] et s o n t r e l a t d e s d a n s le t a b l e a u I. O-- C --CH 3
A: COOH
TABLEAU l I . Enzyme
.
COOH
.........
P6nieillinase RTEM ............ C~phalosp. de Klebsielle . . . . . . . . C6phalosp. de Proteus . . . . . . . . .
HOOC
O__C_C;qa
COOH
Fro. 1. - - Structures de l'aeide amlno-7 cephalosporanique (a) et de l'aeide amino-7 edphalosporo~'que (b) et de la e~phalosporine C (e). TABLEAU I.
Substrat
100 91 10 --
Km
Km ~
rel. 100 2270 5360
V.~
'
Vm
~M
3 33 130
~
rel- I V~
22 29 147
Pfinieilline G . . . . . . . . . Cdphalotine . . . . . . . . . . C6phalosporine C . . . . . Ampicilline . . . . . . . . . . .
Substrat
Km
~M
P~nieilline G . . . . . . . . . Ampicilline . . . . . . . . . . . C~phalotlne . . . . . . . . . . . Cdphalosporine C . . . . .
Substrat
Vm
am
Km
tel.
V~
tel. 100 50 80 100o
~
.¢
tel
lO0
IOO
1200
IO lO lO0
80O >
a) Constantes enzymatiqu,es o b t e n u e s p o u r la p~nieillin~ase R-TEM. ~ (8) repr6sente la stabilit6 du s u b s t r a t vis-h-vis de l'enzyme. La edphalosporine C est peu ddgradde p a r / ' e n z y m e , (~ trds grand). b) C o n s t a n t e s cin~tiqucs ob~enues pour la e&phalosporinase de KlebsieHe. L ' a m p i e i l l i n e est u n trds m a u v a i s substrat. e) Constantes eindtiques o b t e n u e s p o u r la edphal o s p o r i n a s e de Proteus rettgeri. L ' a m p i e i l l i n e est u n m a u v a i s substrat.
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.
K~ en t~M
cephalosporoiqu~
i
800 100
C o n s t a n t e s d ' i n h i b i t i o n de l'aeide c6phalosporoique o b t e n u avec les p~nicilHnases R-TEM et les c~phalosporinases de Klebsielle et de Proteus. L'aeide cpehalosporoique est u n tr6s m a u v a i s i n h i b i t e u r de la p~nicillinase R-TEM, u n i n h i b i t e u r m o y e n de la c6phalospor i n a s e de Kle~bsieHe et u n assez b o n i n h i b i t e u r de la c6phalosporinase de Proteus retgerri. Les 61ectrophorbses sont conduites comme suit : Une fraction chromatographique contenant Penz y m e p u r i f i d e est d i a l y s d e , c o n c e n t r d e p a r l y o p h y lisation, puis traitde par du dodecyl sulfate de s o d i u m . L ' d l e c t r o p h o r ~ s e est c o n d u i t e e n a p p l i q u a n t n n c o u r a n t d e 10 mA/18,0 V p e n d a n t 4 h h t e m p 6 r a t u r e o r a i n a i r e . Le t a m p o n u t i l i s 6 e s t u n t a m p o n T r i s (0,01 M) g l y e i n e (0,3 M) p H 8,7. L e s prot6ines sont eolordes par du bleu de coumassie h la m a n i 6 r e h a b i t u e l l e . 5) D~roulement des chromatographies. L ' 6 1 u t i o n se f a i t h l ' a i d e d ' u n g r a d i e n t d e c h l o r u r e d e s o d i u m et 6 v e n t u e l l e m e n t h ] ' a i d e d e s o l u t i o n s d e s u b s t r a t d e l ' e n z y m e : s o l u t i o n h 1 000 V d'ampieilline pour l'enzyme R TEM solution h 1 000 V d e c 6 p h a l o t i n e p o u r l a e 6 p h a l o s p o r i n a s e d e Klebsiella p n e u m o n i a e et d e Proteus rettgeri. L a v i t e s s e d ' 6 1 u t i o n est 90 m l / h , et les f r a c t i o n s s o n t d e 13 m l . 6) PrJparation des r~sines biospdci[iques R?sine de t y p e I. A u n e s u s p e n s i o n d ' i n d u b i o s e A 4 (5 g d a n s 100 m l d ' e a u d i s t i l M e ) , o n a j o u t e e n u n e s e u l e fois 5 g de bromure de eyanogbne. La temp6rature du m i l i e u r 6 a c t i o n n e l n e d o l t p a s d 6 p a s s e r 20°C, et s o n p H e s t m a i n t e n u ~ u n e v a l e u r d e 11 p a r a d d i t i o n c o n t i n u e d e s o u d e 8 M. L o r s q u e le p H n e v a r i e p l u s , l ' a d s o r b a n t a c t i v 6 est l a y 6 r a p i d e m e n t a v e c u n t a m p o n ( p H 10) c o n s t i t u 6 d e 8,4 g d e bic a r b o n a t e d e s o d i u m et d e 1fi,6 g d e c a r b o n a t e d e s o d i u m d i s s o u s d a n s I 1 d ' e a u distillde. I1 est e n s u i t e agit6 l e n t e m e n t h 4 ° C p e n d a n t 18 h d a n s 100 m l d u m d m e t a m p o n c o n t e n a n t 1 g d e c d p h a l o s p o r i n e C, p u i s lav6 a b o n d a m m e n t /I l ' e a u d i s t i l 1de. On l ' i n t r o d u i t e n s u i l e d a n s u n e c o l o n n e d e c h r o m a t o g r a p h i e q u i est 6 q u i l i b r d e p a r u n e s o l u t i o n d e c h l o r u r e d e s o d i u m 0,01 M.
31
P u r i f i c a t i o n des P-lactamases par c h r o m a t o g r a p h i e d'affinitd. R~sine du type II. A 5 g d ' i n d u b i o s e A 4 (adsorbant sec) activ6s par le b r o m u r e de cyanogbne comme pr6c6demment, on ajoute 1 g d'6thylbne d i a m i n e et laisse ]e tout agiter d o u c e m e n t h ~- 4°C p e n d a n t 18 h. On lave ensuite la r6sine amin6e ainsi obtenue h ]'eau distill6e et la remet en s u s p e n s i o n dans 100 ml d'eau. L ' a l l o n g e m e n t de la chaine d6jh greff6e est alors r6alis6e par a d d i t i o n d ' a n h y d r i d e s u c c i n i q u e h pH 6. L'agitation est alors p o u r s u i v i e p e n d a n t 18 h /~ -F 4°C. La r6sine ainsi o b t e n u e est enfin trait6e p a r 3,5 mmoles de 7-ACA (.figure 1) dissout dans 150 ml de dim6thyl formamide. Aprbs avoir ajusL6 son pH h 5, on ajoute 25 mmoles de p. tolubne sulfonate de N cyclohexyl N'-(~ (N-m6thyl m o r p h o l i n o ) - e t h y l ) c a r b o d i i m i d e en solution dans 2,0 ml d'eau distill6e. On agite le m61ange o b t e n u p e n d a n t 1 h h temp6rature a m b i a n t e puis on r i n c e a b o n d a m m e n t h l'eau distill6e et 6quilibre la r6sine biosp6cifique ainsi obtenue sur u n e solution de c h l o r u r e de s o d i u m 0,01 M. •
trouve toute ]'activit6 e n z y m a t i q u e dans u n e zone off, dans les c o n d i t i o n s de l'exp6rience, on ne d6tecte a u c u n e a b s o r p t i o n ultraviolette. Une solution m6me concentr6e de c h l o r u r e de s o d i u m ne peut d6crocher 1'enzyme, seule ] ' a m p i c i l l i n e 1 000 m c g / m l peut dissocier le complexe c6phalos p o r i n e i m m o b i l i s 6 e - p 6 n i c i l l i n a s e R TEM. Un seul passage sur cette colonne permet d ' o b t e n i r u n e enzyme purifi6e d ' e n v i r o n 300 fois. Des passages r6p6t6s d'extraits e n z y m a t i q u e s de p 6 n i c i l l i n a s e s R TEM sur eette c o l o n n e c o n d u i s e n t /~ u n e d i m i n u t i o n de sa capacit6 qui devient h peu prbs nulle au bout de quatre c h r o m a t o g r a p h i e s e n v i r o n (fig. 3b). L ' e n z y m e est en effet capable d ' h y d r o l y s e r l e n t e m e n t le n o y a u ~-lactame de la c6phalosporine, ce qui c o n d u i t h l'acide c6phalosporoique immobilis6 qui est inapte h r e t e n i r l ' e n z y m e (tableau II). d.o.
S
280
nm
~
~'~ :,
5
J
~
1
t
1,,
O - C - ~ . ~ - C H - I CH;~) _ C O _ N H OOH
3
OA C
coo~
[]
enz.
let.
La¢tamal~
,t
i
(rel.)
100
I
0
o.COH N~ 'COOH -~"
¢
200
vol. effluent
400
(rdl)
[] d.¢,.
a
280
r~m
==t.
en=.
(,et.)
~E 100 ,i
u
o
COOH
2OO OH
FIG. 2 . Representation schdmatique des rdsines biospdeifiques pr~pardes. La r6sine A est hydrolys6e
effluent
(ml~
b
~OOH
[]
rot.
400
FIG. 3. - - Profil d'dlution de la p~nicillinase R-TEM sur la cdphalosporine C insolubilis~e : ( ) absorption U V h 2,80 nm ; ¢.......... ) activit6 enzymatique. P r e mi6re utilisation
(a), 5" u t i l i s a t i o n
(b).
enzymatiquement en A' at'ors que la '6 lactamase transforme la r6sine B e n B'.
2) Cas RESULTATS. A - - RI~SINES DU TYPE I : Pn~MI~nES UTILISATIONS
DE
LA RESINE.
1) Cas de ]a p 6 n i c i l l i n a s e R TEM. La figure 3a m o n t r e c l a i r e m e n t que cette r6sine est tout ~ fair apte ~ r e t e n i r r e n z y m e p u i s q u e l'on
BIOCHIMIE, 1975, 57, n o 1.
de la
c6phalosporinase
de Klebsiella
pneumoniae. La figure 4a m o n t r e q u ' i c i encore la c6phalos p o r i n a s e de Klebielle est fortement r e t e n u e sur ]a colonne biosp6cifique, p u i s q u ' i l est n6cessaire d'utiliser u n e c o n c e n t r a t i o n r e l a t i v e m e n t i m p o r tante de c6phalotine p o u r ]a relarguer. L ' e n z y m e ainsi obtenue est h a u t e m e n t purifi6e ( e n v i r o n 500 fois).
32
F. Le Goffic, J. Andrillon-Spieyel et R. Letarte.
Les u t i l i s a t i o n s s u i v a n t e s de la c o l o n n e c o n d u i sent h une ouverture e n z y m a t i q u e lente du cycle ~-lactame et d o n n e n t l'acide c6phalosporoique ins o l u b l e d o n t l'affinit6 ( t a b l e a u II) p o u r l ' e n z y m e est c o n s i d 6 r a b l e m e n t affaiblie. C e c i e x p l i q u e l ' a p p a r i t i o n d ' u n p i c e n z y m a t i q u e 61uable p a r u n e s o l u t i o n de c h l o r u r e de s o d i u m , seul p i c q u e l ' o n r e t r o u v e au b o u t de 6 h 10 u t i l i s a t i o n s qui s o n t n 6 c e s s a i r e s p o u r h y d r o l y s e r tout le c y c l e ~-lacl a m e de l ' a n t i b i o t i q u e . Au c o n t r a i r e de la ~-lactamase R TEM, le r e n d e m e n t de la c h r o m a t o g r a p h i e r e s t e q u a n t i l a t i f et te p o u v o i r de s ~ p a r a t i o n de la c o l o n n e reste r e m a r q u a b l e . L ' e n z y m e 61u6e est en effet d ' u n e trbs g r a n d e puret6 comme le m o n t r e le pro~fil d'61ution et l ' a n a l y s e 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e
d,o.
280
nm
act. enz.
(tel.)
]00 m z
4 Z
4
II
u
I' i I
!
t
0
I O'
~00
d...
•
~
vol. effluent
400
2 8 0 nm
act.ont.
(m|)
(tel,)
100
(fig. 6). z
3) Gas
de
la
c6phalosporinase
de
z
o
Proteus
rettyeri. Le profil d'61ution et de purification de cette e n z y m e est s i m i l a i r e h celui de la c6phalosporinase de klebsielle (fig. 5). Les premibres utilisalions de la c o l o n n e c o n d u i s e n t h un profil d'61ud.o. ~ 2 8 0
act. enz.
nm
•
~=
/
.~.
~.
0 200
.0
vol. effluent
400
(ml)
b Fla. 5. - - P r o f i l d ' ~ l u t i o n de la c d p h a l o s p o r i n a s e de P r o t e u s s u r la c d p h a l o s p o r i n e C i n s o l u b i l i s ~ e s u r b i l l e s ) spectre UV ~t 280 n m ; d'indubiose A 4 : (
( ........ ) aetivit6 enzymatique (a) I re utilisation, Co) 3" utilisation.
(tel.)
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200
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400
rot. elf luent
(rnl)
Fro. 4. - - P r o f l l d ' d l u t i o n de la c d p h a l o s p o r i n a s e de K [ e b s i e l l e s u r la c ~ p h a l o s p o r i n e C i n s o l u b i l i s ~ e :
I--) absorption UV h 280 ; ( ........ --) aetivitd enzymatique. Premi6re utiIisation (a), 3~ utilisation (b).
t i o n d a n s l e q u e l u n e g r a n d e p a r t i e de l ' e n z y m e est r e t e n u e (61ulion p a r de la c6pfialotine). Au b o u t de q u e l q u e s u t i l i s a t i o n s , l ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e est e o m p l ~ t e r n e n t d 6 e r o c h 6 e p a r u u e s o l u t i o n de c h l o r u r e de s o d i u m .
BIOCHIM1E,
1975, 57, n ° 1.
Fla. 6. - - P r o f l l d ' ~ l e c t r o p h o r b s e de la c ~ p h a l o s p o r i n a s e de K l e b s i e l l e (technique au SDS). L'dlectrophor6se
es~ eonduite sur des ge~s de polyacrylamide. Les protdines sont col~ordes par du bleu de coumassie.
P u r i f i c a t i o n des ~-lactamases par c h r o m a t o g r a p h i e d'affinitd. Les profils d'61ution m o n t r e que, ici encore, l ' e n z y m e isol6e est h a u t e m e n t purifi6e (300 h 500 fois). La c6phalosporinase de Proteus est 16g6rem e n t plus r e t e n u e que celle de Klebsielle comme le m o n t r e la c o m p a r a i s o n des figures 4b et 5b. Apr6s u n an d'utilisation, cette colonne d'acide c6phalosporoique est encore tout ~ fair apte h p u r i f i e r d ' u n e m a n i 6 r e r e m a r q u a b l e ces deux c6phalosporinases ou d'autres c6phalosporinases h6berg6es p a r d'autres bact6ries. La figure 6 m o n t r e le profil d'61ectrophor6se de la c6phalosporinase de Klebsielle purifi6e apr6s u n e ann6e d'utilisation de la colonne biosp6cifique d'acide c6phalosporoique immobilis6e.
B - - R~sine du type II (fig. 2). Elle a u n c o m p o r t e m e n t tout h fair similaire h celui de la r6sine du p r e m i e r type. C e p e n d a n t sa capacit6 de r6tention d ' e n z y m e est m o i n d r e , ce qui est sans doute dO aux n o m b r e u s e s 6tapes n6cessaires p o u r la synth6tiser. Sa r6sistance h l ' h y d r o l y s e e n z y m a t i q u e semble u n peu plus prononc6e que clans le cas de la r6sine pr6c6dente : ainsi p o u r la p 6 n i c i l l i n a s e R TEM, c'est seulement aprbs 6 h 8 utilisations de la r6sine qu'elle devient inefficace p o u r pi6ger l'enzyme. DISCUSSION. Les 3 ~-laetamases utilis6es pour tester les r6sines biosp6cifiques synth6tis6es sont de deux types : - - le type p d n i c i l l i n a s e h a u t e m e n t actif sur les p6nicHlines et peu actif sur les c6phalosporines et le type c6phalosporinase tr6s actif sur les c6phalosporines et poss6dant u n e faible affinit6 p o u r Ies p6nicillines. Ceci est lout h fait confirm6 par le tableau I. Le tableau II m o n t r e c l a i r e m e n t que l'ouverture, soit chimique, soit enzymatique, du cycle ~-lactame de la c6phalosporine utilis6e, dolt c o n d u i r e h des r6sines g a r d a n t u n e affinit6 p o u r tes c6phalosporinases (Ki = 100 et 800 ~n~o!es) mais a y a n t p e r d u l'aptitude de r e t e n i r les p6nicillinases (Ki ~ 00). Lors des toutes premibres utilisations des colonnes que nous avons dbcrites, il est en effet possible de p u r i f i e r effieacement h peu pros toutes les ~-laetamases, que ce soit p 6 n i c i l l i n a s e ou eephalosporinase, ee qui est compatible avec les donn6es ein6tiques p u i s q u e la c6phalosporine C est substrat, h des degr6s diff6rents certes, de ces trois enzymes. A long terme, l'efficacit6 de ces colonnes se Inodifie : la p 6 n i c i l l i n a s e R TEM n'est plus r e t e n u e
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p a r la r6sine alors que les deux c6phalosporinases 6tudi6es sont s6par6es d ' u n e m a n i 6 r e r e m a r q u a b l e de prot6ines et acides nucl6iques parasites. Ces r6su,ltats sont bien stir en excellent accord avec les donn6es cin6tiques (tableau II). On pouvait aussi esp6rer, h l ' a p p u i des constantes d'affinit~ aussi divergentes des deux e6phalosporinases s61ectionn6es vis-h-vis de l'acide c6phalosporoique Ki = 100 et 800 ~moles respectivement) qu'il serait possible de s6parer ces deux enzymes, ce qui a 6t6 r6alis6 : les figures 4 a et 5 b e n r e n d e n t tout ~ fair compte : l ' e n z y m e poss6dant la constante d ' i n h i b i t i o n la plus 61ev6e est 61u6e d ' a b o r d . Un autre int6r6t de ces colonnes d'acides c6phalosporoiques insolubilisdes est son a p p l i c a t i o n la s6parafion ais6e et r a p i d e de p6nicillinases et de c6phalosporinases trbs souvent pr6sentes chez la rn6me bact6rie r6sistante, u n e telle utilisation sera relat6e dans u n p r o c h a i n m6moire. La capacit6 de la r6sine h la c6phalosporine C est bien plus g r a n d e que celle de la r6sine obtenue p a r greffages successifs d ' u n bras puis de l'hameqon. Ce qui est d'ailleurs tout ~ fair logique, cependant cette r6sine p a r a i t r a i t plus avantageuse p o u r p u r i f i e r les p6nici,llinases ~ cause de sa plus grande r6sistance ~ la d6gradation enzymatique, ce qui est sans doute dfi h la n a t u r e diff6rente des deux bras utilis6s. CONCLUSION. La t e c h n i q u e de c h r o m a t o g r a p h i e d'affinit6 que nous venons d't~tudier constitue donc u n e m~thode originale et efficace p o u r p u r i f i e r les p~nicillinases bien que ces enzymes soient capables d ' h y d r o l y s e r r a p i d e m e n t l ' h a m e c o n et de c o n d u i r e h u n e colonne tout h fait inefficace. Ces r6sines hydrolys~es sont c e p e n d a n t extr6m e m e n t utiles et int6ressantes h plus d ' u n p o i n t : -Elles p e r m e t t e n t de p u r i f i e r efficacement et r a p i d e m e n t les c6phalosporinases de plus en plus n o m b r e u s e s que l'on r e n c o n t r e chez les bact6ries r6sistantes isol6es en milieu hospitalier.
--- Elles p e r m e t t e n t lorsque, les donn6es ein6tiques sont favorables, de s6parer deux c6phalosporinases 6ventuellement pr6sentes dans la m6me souehe baet6rienne. - - E l l e s p e r m e t t e n t de s6parer facilement en une seule 6tape u n e p 6 n i c i l l i n a s e d ' u n e c6phalosporinase, enzymes tr6s f r d q u e m m e n t rencontrdes dans des souches b a e t 6 r i e n n e s r6sistantes aux l a c t a m i n e s et ainsi de d6finir c l a i r e m e n t leurs caract6ristiques cin6tiques. 3
F . L e G o f f i c , J. A n d r i I l o n - S p i e g e l
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et R . L e t a r t e .
E l l e s d e v r a i e n t a u s s i p e r m e t t r e la s 6 p a r a t i o n biospdcifique des r6cepteurs de ces m d d i c a m e n t s . Des e x p 6 r i e n c e s c o n c e r n a n t ce p r o b l d m e s o n t e n c o u r s et les r 6 s u l t a t s o b t e n u s s e r o n t r e l a t 6 s ult6rieurement.
Ces colonnes p e r m e t t e n t 6galement de s6parer des p6nicillinases et des c6phalosporinases, voir mSme deux c6phalosporinases.
Cet o u t i l d e p a r l a s i m p l i c i t 6 d e sa r 6 a l i s a t i o n et de son utilisation d e v r a i t i n c o n t e s t a b l e m e n t trouv e r u n e l a r g e utilis,ation d u n s les l a b o r a t o i r e s i n t 6 r e s s 6 s p a r l ' 6 t u d e b i o e h i m i q u e d e s ~-lactamines.
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R~suM~. Des colonnes d'affinit6 p e r m e t t a n t d'e purifier des ~-laetamases ont 6t6 obtenues en fixant soit des inhib i t e u r s r~versibles de ees enzymes h des billes d'ind~ubiose A 4, soit des substrats. La ~-laetamase est 61u6e h l'aide d'un gradient de eblorure de sodium ou h Faide d'une solution d'un de ses substrats. La purification est en g6n~ral excellente.
BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.
BIBLIOGRAPHIE.
