Planta (Berl.) 92, 235--239 (1970)
Synth6se et translocation de RNA dans les cellules radiculaires de Zea mays au d6but de la germination R. DELTOUR D6partement de Botanique, Laboratoire de Physiologie, Universit6 de Libge Regule 14 mars 1970 R N A Synthesis a n d T r a n s l o e a t i o n in Root Cells of Zea mays d u r i n g E a r l y Stages of G e r m i n a t i o n Summary. RNA synthesis in root of germinating corn during the period extending from the 4th to the 8th hr after soaking is localized exclusively in the chromatin. This unusual situation allowed us to follow easily by section autoradiography the fate of the chromatin-syathesized RNA. The embryo was pulse-labeled with 3H-uridine from the 6th to the 8th hr after soaking and chased with cold uridine (2 hr) and then left in water (40 hr). It was found that during the chase a large amount of the chromatin-synthesized RNA moves to the nucleolus, where it is accumulated, and that a small amount finally reaches the cytoplasm. Introduction D a n s les cellules des organismes sup6rieurs en 6tat de vie active, la c h r o m a t i n e et l'appareil nucl6olaire sont les deux sites nucl6aires fonctionnels de synth&se d u RNA. Apr6s u n m a r q u a g e s l'uridine-aH, le n o y a u t o u t entier est g6n6ralement radioaetif. C o n t r a i r e m e n t s eette s i t u a t i o n habituelle, dans les cellules de l ' c m b r y o n de Zea mays au cours des premieres heures de la g e r m i n a t i o n , la e h r o m a t i n e seule synth6tise le R N A t a n d i s que le nuelSole est inactif (Van de Walle et Bernier, 1969). D a n s la pr6sente note, en premier lieu, nous confirmons que ehez le mais il existe bien, au d 6 b u t de la g e r m i n a t i o n , u n e phase transitoire d u r a n t laquelle seule la e h r o m a t i n e synth6tise du R N A et, en second lieu, nous d6crivons la t r a n s l o c a t i o n du R N A synth6tis6 au n i v e a u de la ehromatine. Mat6riel et mgthodes Des caryopses de Zea mays var. INRA 258 sont mis s germer dans une 6tuve la temp6rature de 16~ durant des p6riodes croissantes (0 s 36 heures). Les embryons exeis6s sont mis ~ tremper 2 heures dans une solution d'uridine-SH (The Radiochemical Centre, England, 250 ~C/ml; activit6 sp6cifique: 4,25 C/raM) puis fix6s au FAA, lav6s 24 heures dans l'eau courante, inclus dans la paraffine et sectionn6s s 5~. Les sections sont 6galement lav6es 24 heures dans un courant d'eau puis recouvertes d'une 6mulsion photographique (Stripping-film Kodak AR. 10). Aprbs 14 jours d'exposition, les films sont r6v616s et fix6s; les sections sont color~es au bleu de toluidine/~ 0,2 %.
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R. Deltour:
Fig. 1 a - - d . Autoradiographies de cellules de la racine embryonnaire de Zea mays marqu6es par l'uridine-~I-I. G X 1700. Le trempage des embryons dans la solution radioactive a lieu de la 6~me ~ la 8~me heure et est suivi d ' u n chassage de 2 heures
RNA dans les cellules radiculaires
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Un traitement de 4 heures & 37~ C par une solution de l~Nase (0,05 % ; pH 6,8) enlbve route la radioactivit6 des sections. L'uridine-3H est done un pr6eurseur sp6cifique du RNA dans le syst~me utflis6. Les observations d6crites se rapportent uniquement aux cellules de la racine primaire. R~sultats Lorsque les embryons sont plong6s dans l'uridine-~H apr~s des temps croissants de germination, les images autoradiographiques permettent de suivre les modifications de la localisation des synthbses de RNA dans les cellules radiculaires passant progressivement de l'6tat de vie latente l'6tat de vie active. On peut distinguer 4 phases : Phase 1 : de 0 & 4 heures de germination; il n ' y a pas d'incorporation d'uridine-SH. Phase 2: de 4 ~ 8 heures de germination; la chromatine est le site unique d'incorporation d'uridine-SI-I (fig. 1 a). Phase 3 : de 8 ~ 38 heures de germination; des grains d'argent r6duit apparaissent 6galement au-dessus du nucl6ole. A la fin de cette phase, le nucl6ole est fortement radioactif. Phase 4: au-del~ de 38 heures de germination; la cellule enti6re est radioactive. Afin de eonnaitre le destin du I~NA synth6tis6 dans la ehromatine au eours de la phase 2, des embryons mis en germination depuis 6 hem'es sont plong6s 2 heures clans l'uridine-aH; fls sont ensnite transf6r6s dans une solution de ehassage eonstitu6e d'uridine non radioactive (1,4 g/100 ml) durant 2 heures, pnis plac6s dans l'eau pendant des p6riodes allant de 5 & 40 heures. Les embryons pr61ev6s directement apr~s trempage dans l'uridine-aH montrent un marquage exelusivement chromatinien (fig. I a). Les images obtenues avee les embryons pr61ev~s apr6s 2 heures de chassage dans l'uridine non radioactive montrent toujours un marquage localis6 & la chromatine, mais quelques grains d'argent r6duit sont visibles au-dessus du nucl6ole; le cytoplasme est aussi tr@s 16g6rement radioactif (fig. 1 b). Pour des p6riodes de chassage plus longues (7 ~ 42 heures), on obtient
dans l'trridine froide puis de 40 heures darts l'eau, a, Cellules pr61evSes dh'eetement apr@s le contact avec l'uridine-3I-L La chromatine seule est radioactive, b, Cellules pr61ev6esdirectement apr~s les 2 heures de s6jour clans l'uridine froide. La ehromatine est marqu6e mais qtmlques grains d'argent r6duit sont visibles au-dessus des nuel6oIes, c, Cellules pr61ev6es aprgs 5 heures de sgjour dans l'eau. La ehromatine est radioactive, des grains d'argent r6duit sont pr6sents au-dessus du nucl6ole; le cytoplasme est 16gbrement radioactif, d, Cellules pr61ev~es apr6s 40 heures de s6jour dans l'eau. La radioactivi$6 est r@par~ie comme dans la fig. lc mais les nucl6oles sont nettement plus radioactifs 17
Planta (~Berl.), Bd. 92
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I~. Deltour:
une radioaetivit6 croissante du nucl~ole ainsi que du cytoplasme; la chromatine reste toujours radioactive (fig. 1 e et d).
Discussion L'6tude de la translocation intracellulaire du R N A se heurte trbs souvent au fair que dans les cellules en vie active, la chromatine et l'appareil nucl6olaire sent simultan6ment actifs, quoique parfois le renouvellement du R N A peut ~tre nettement plus rapide dans l'un ou l'autre site (Sirlin, 1962). Id6alement, cette 6rude devrait se r6aliser sur un systbme oh seul chromatine ou nucl&ole serait actif clans la synth~se du RNA. De tels syst~mes sent naturellement rares; ils ne peuvent ~tre obtenus g6n6ralement que par l'utilisation d'inhlbiteurs sp6cifiques (Perry, 1963; Sirlin et Jacob, 1964; Sirlin et Coll., 1965). Les r6sultats ant6rieurs obtenus par Van de Walle et Bernier (1969) et ceux d6crits ici montrent que les eellules de la racine embryonnaire ehez le ma~s ineorporent l'uridine.3H exelusivement dans la chromatine de la 4&me & la 8&me heure de germination. l~ous avons profit6 de cette situation physiologique particulibre pour suivre, par une exp6rience de chassage, le devenir du R N A synth6tis6 dans la chromatine. Nous avons observ6, d'une part, un passage de R N A de la chromatine vers le nucl6ole oh une nettc accumulation de la radioactivit6 se produit et, d'autre part, un passage de R N A vers le eytoplasme. Cette accumulation nucl6olaire de RNA explique, au moins partiellement, l'apparition progressive de radioactivit6 dans le nucl6ole au cours des phases 3 et 4 de la germination. I1 appartiendra ~ des recherches ult6rieures de d6terminer la part de radioaetivit6 qui revient la synth~se i n situ du RNA nucl6olaire et la p a r t qui revient s du R N A en provenance de la ehromatine. Comme la radioaetivit6 croissante du nucl6ole et du cytoplasme durant la p6riode de ehassage apparait de mani6re simultan6e, fl n'est pas possible de pr6eiser si le R N A radioaetif finalement pr6sent dans le cytoplasme est dfi s un passage ehromatine-eytoplasme via le nuel6ole ou encore si les deux modes de passage se r6alisent simultan6ment. Des essais en cours viendront pr6eiser ce point.
Bibliographic Perry, R. P.: Selective effects of actinomycin D on the intracellular distribution of I~NA synthesis in tissue culture cells. Exp. Cell Res. 29, 400--406 (1963). Sirlin, J. L. : The nucleolus. In: Progress in biophysics and biophysical chemistry, vol. 12, p. 25--66 (J. A. V. Butler et al., eds.). Oxford: Pergamon Press 1962.
RNA dans les cellules radiculaires
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Sirlin, J. L., Jacob, J. : Sequential and reversible inhibition of synthesis of ribonucleic acid in the nucleolus and chromosomes: effect of benzamide and substituted benzimidazoles on dipteran salivary glands. Nature (Lond.) ~04, 545--547 (1964). - - - - Birns~iel, M. L. 9 Synthesis of different species of nueleolar ribonucleie acid. Biochim. biophys. Acta (Amst.} 108, 716--718 (1965). Walle, C. van de, Bernier, G.: The onset of cellular synthetic activity in roots of germinating corn. Exp. Cell Res. 55, 378--384 (1969). R. De]tour Ddpartement de Botaniquo Laboratoire de Physiologio Universit6 de Li6ge Rue Fuseh 3 B-4000, Liege, Belgique
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Synth6se et translocation de RNA dans les cellules radiculaires de Zea mays au d6but de la germination R. DELTOUR D6partement de Botanique, Laboratoire de Physiologie, Universit6 de Libge Regule 14 mars 1970 R N A Synthesis a n d T r a n s l o e a t i o n in Root Cells of Zea mays d u r i n g E a r l y Stages of G e r m i n a t i o n Summary. RNA synthesis in root of germinating corn during the period extending from the 4th to the 8th hr after soaking is localized exclusively in the chromatin. This unusual situation allowed us to follow easily by section autoradiography the fate of the chromatin-syathesized RNA. The embryo was pulse-labeled with 3H-uridine from the 6th to the 8th hr after soaking and chased with cold uridine (2 hr) and then left in water (40 hr). It was found that during the chase a large amount of the chromatin-synthesized RNA moves to the nucleolus, where it is accumulated, and that a small amount finally reaches the cytoplasm. Introduction D a n s les cellules des organismes sup6rieurs en 6tat de vie active, la c h r o m a t i n e et l'appareil nucl6olaire sont les deux sites nucl6aires fonctionnels de synth&se d u RNA. Apr6s u n m a r q u a g e s l'uridine-aH, le n o y a u t o u t entier est g6n6ralement radioaetif. C o n t r a i r e m e n t s eette s i t u a t i o n habituelle, dans les cellules de l ' c m b r y o n de Zea mays au cours des premieres heures de la g e r m i n a t i o n , la e h r o m a t i n e seule synth6tise le R N A t a n d i s que le nuelSole est inactif (Van de Walle et Bernier, 1969). D a n s la pr6sente note, en premier lieu, nous confirmons que ehez le mais il existe bien, au d 6 b u t de la g e r m i n a t i o n , u n e phase transitoire d u r a n t laquelle seule la e h r o m a t i n e synth6tise du R N A et, en second lieu, nous d6crivons la t r a n s l o c a t i o n du R N A synth6tis6 au n i v e a u de la ehromatine. Mat6riel et mgthodes Des caryopses de Zea mays var. INRA 258 sont mis s germer dans une 6tuve la temp6rature de 16~ durant des p6riodes croissantes (0 s 36 heures). Les embryons exeis6s sont mis ~ tremper 2 heures dans une solution d'uridine-SH (The Radiochemical Centre, England, 250 ~C/ml; activit6 sp6cifique: 4,25 C/raM) puis fix6s au FAA, lav6s 24 heures dans l'eau courante, inclus dans la paraffine et sectionn6s s 5~. Les sections sont 6galement lav6es 24 heures dans un courant d'eau puis recouvertes d'une 6mulsion photographique (Stripping-film Kodak AR. 10). Aprbs 14 jours d'exposition, les films sont r6v616s et fix6s; les sections sont color~es au bleu de toluidine/~ 0,2 %.
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Fig. 1 a - - d . Autoradiographies de cellules de la racine embryonnaire de Zea mays marqu6es par l'uridine-~I-I. G X 1700. Le trempage des embryons dans la solution radioactive a lieu de la 6~me ~ la 8~me heure et est suivi d ' u n chassage de 2 heures
RNA dans les cellules radiculaires
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Un traitement de 4 heures & 37~ C par une solution de l~Nase (0,05 % ; pH 6,8) enlbve route la radioactivit6 des sections. L'uridine-3H est done un pr6eurseur sp6cifique du RNA dans le syst~me utflis6. Les observations d6crites se rapportent uniquement aux cellules de la racine primaire. R~sultats Lorsque les embryons sont plong6s dans l'uridine-~H apr~s des temps croissants de germination, les images autoradiographiques permettent de suivre les modifications de la localisation des synthbses de RNA dans les cellules radiculaires passant progressivement de l'6tat de vie latente l'6tat de vie active. On peut distinguer 4 phases : Phase 1 : de 0 & 4 heures de germination; il n ' y a pas d'incorporation d'uridine-SH. Phase 2: de 4 ~ 8 heures de germination; la chromatine est le site unique d'incorporation d'uridine-SI-I (fig. 1 a). Phase 3 : de 8 ~ 38 heures de germination; des grains d'argent r6duit apparaissent 6galement au-dessus du nucl6ole. A la fin de cette phase, le nucl6ole est fortement radioactif. Phase 4: au-del~ de 38 heures de germination; la cellule enti6re est radioactive. Afin de eonnaitre le destin du I~NA synth6tis6 dans la ehromatine au eours de la phase 2, des embryons mis en germination depuis 6 hem'es sont plong6s 2 heures clans l'uridine-aH; fls sont ensnite transf6r6s dans une solution de ehassage eonstitu6e d'uridine non radioactive (1,4 g/100 ml) durant 2 heures, pnis plac6s dans l'eau pendant des p6riodes allant de 5 & 40 heures. Les embryons pr61ev6s directement apr~s trempage dans l'uridine-aH montrent un marquage exelusivement chromatinien (fig. I a). Les images obtenues avee les embryons pr61ev~s apr6s 2 heures de chassage dans l'uridine non radioactive montrent toujours un marquage localis6 & la chromatine, mais quelques grains d'argent r6duit sont visibles au-dessus du nucl6ole; le cytoplasme est aussi tr@s 16g6rement radioactif (fig. 1 b). Pour des p6riodes de chassage plus longues (7 ~ 42 heures), on obtient
dans l'trridine froide puis de 40 heures darts l'eau, a, Cellules pr61evSes dh'eetement apr@s le contact avec l'uridine-3I-L La chromatine seule est radioactive, b, Cellules pr61ev6esdirectement apr~s les 2 heures de s6jour clans l'uridine froide. La ehromatine est marqu6e mais qtmlques grains d'argent r6duit sont visibles au-dessus des nuel6oIes, c, Cellules pr61ev6es aprgs 5 heures de sgjour dans l'eau. La ehromatine est radioactive, des grains d'argent r6duit sont pr6sents au-dessus du nucl6ole; le cytoplasme est 16gbrement radioactif, d, Cellules pr61ev~es apr6s 40 heures de s6jour dans l'eau. La radioactivi$6 est r@par~ie comme dans la fig. lc mais les nucl6oles sont nettement plus radioactifs 17
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I~. Deltour:
une radioaetivit6 croissante du nucl~ole ainsi que du cytoplasme; la chromatine reste toujours radioactive (fig. 1 e et d).
Discussion L'6tude de la translocation intracellulaire du R N A se heurte trbs souvent au fair que dans les cellules en vie active, la chromatine et l'appareil nucl6olaire sent simultan6ment actifs, quoique parfois le renouvellement du R N A peut ~tre nettement plus rapide dans l'un ou l'autre site (Sirlin, 1962). Id6alement, cette 6rude devrait se r6aliser sur un systbme oh seul chromatine ou nucl&ole serait actif clans la synth~se du RNA. De tels syst~mes sent naturellement rares; ils ne peuvent ~tre obtenus g6n6ralement que par l'utilisation d'inhlbiteurs sp6cifiques (Perry, 1963; Sirlin et Jacob, 1964; Sirlin et Coll., 1965). Les r6sultats ant6rieurs obtenus par Van de Walle et Bernier (1969) et ceux d6crits ici montrent que les eellules de la racine embryonnaire ehez le ma~s ineorporent l'uridine.3H exelusivement dans la chromatine de la 4&me & la 8&me heure de germination. l~ous avons profit6 de cette situation physiologique particulibre pour suivre, par une exp6rience de chassage, le devenir du R N A synth6tis6 dans la chromatine. Nous avons observ6, d'une part, un passage de R N A de la chromatine vers le nucl6ole oh une nettc accumulation de la radioactivit6 se produit et, d'autre part, un passage de R N A vers le eytoplasme. Cette accumulation nucl6olaire de RNA explique, au moins partiellement, l'apparition progressive de radioactivit6 dans le nucl6ole au cours des phases 3 et 4 de la germination. I1 appartiendra ~ des recherches ult6rieures de d6terminer la part de radioaetivit6 qui revient la synth~se i n situ du RNA nucl6olaire et la p a r t qui revient s du R N A en provenance de la ehromatine. Comme la radioaetivit6 croissante du nucl6ole et du cytoplasme durant la p6riode de ehassage apparait de mani6re simultan6e, fl n'est pas possible de pr6eiser si le R N A radioaetif finalement pr6sent dans le cytoplasme est dfi s un passage ehromatine-eytoplasme via le nuel6ole ou encore si les deux modes de passage se r6alisent simultan6ment. Des essais en cours viendront pr6eiser ce point.
Bibliographic Perry, R. P.: Selective effects of actinomycin D on the intracellular distribution of I~NA synthesis in tissue culture cells. Exp. Cell Res. 29, 400--406 (1963). Sirlin, J. L. : The nucleolus. In: Progress in biophysics and biophysical chemistry, vol. 12, p. 25--66 (J. A. V. Butler et al., eds.). Oxford: Pergamon Press 1962.
RNA dans les cellules radiculaires
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Sirlin, J. L., Jacob, J. : Sequential and reversible inhibition of synthesis of ribonucleic acid in the nucleolus and chromosomes: effect of benzamide and substituted benzimidazoles on dipteran salivary glands. Nature (Lond.) ~04, 545--547 (1964). - - - - Birns~iel, M. L. 9 Synthesis of different species of nueleolar ribonucleie acid. Biochim. biophys. Acta (Amst.} 108, 716--718 (1965). Walle, C. van de, Bernier, G.: The onset of cellular synthetic activity in roots of germinating corn. Exp. Cell Res. 55, 378--384 (1969). R. De]tour Ddpartement de Botaniquo Laboratoire de Physiologio Universit6 de Li6ge Rue Fuseh 3 B-4000, Liege, Belgique
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