Revue Frangaise de Transfusion et Immuno-h4matologie Tome XVIII. - - N ° 2. - - 1975

177

SOCIETE NATIONALE DE TRANSFUSION SANGUINE

Sdance

spdciale consacrde

h la ddtection de routine dans les organismes

de l'antigbne

de transfusion

HBs

sanguine

o r g a n i s d e p a r J . - P . SOuLtv, a Paris,

19 mars

1975

D~tection de routine de l'antigbne H B s dans les organismes de trans/usion sanguine par J.-P. SOULIER Centre N a t i o n a l de Tranfusion Sanguine, PARIS.

Un arr6t6 en d a t e du 29 s e p t e m b r e 1971 (Journal Officiel du 7 octobre 1971) p r e s c r i v a i t la d6tection obligatoire de l'antig~ne Au (HBs) h chaque don du sang sans i m p o s e r une technique p a r t i c u l i ~ r e ; toutefois l'61ectroimmunodiffusion (E.I.D.) 6tait conseill6e p a r la Soci6t6 Nationale de Transfusion. Depuis 1971, nos Connaissances c o n c e r n a n t l'antig6ne A u s t r a l i a (que l'on d6signe a c t u e l l e m e n t du nora d'antig~ne de surface de l'h4patite B (HBs) ont fait de trbs i m p o r t a n t s progr~s. De nouvelles techniques ont v u l e j o u r qui doivent 6tre c o m p a r 6 e s avec une technique d6j~t ancienne qui d e m e u r e la plus sensible, /t savoir la technique radio-immunologique. I1 s'agit donc, 5 prdsent, en 1975, de savoir si l'41ectro-immunodiffusion demeure une m 6 t h o d e suffisantb de d6tection ou s'il faut r e c o m m a n d e r une ou p l u s i e u r s nouvelles techniques p o u r la d6tection de r o u t i n e de l'antig6ne HBs. Dans le choix d'une technique de routine, interviennent de n o m b r e u x 616ments : sp6cificit6, sensibilit6, r a p i d i t 6 ; capacit6 de d6tecter l'antig~ne

178

S O U L I E R AP.

et l ' a n t i c o r p s ; complexit6 et coflt du rnat6riel; prix du r 6 a c t i f ; facilit6 d ' o b t e n t i o n du rdactif (d6pendance h l'6gard d'un f o u r n i s s e u r de l'6trang e t ) ; enfin, certains aspects p r a t i q u e s doivent 6tre pris en consid6ration, tels que la possibilit6 ou n o n d ' a u t o m a t i o n , la possibilit6 ou non d'employer i n d i f f 6 r e m m e n t le p l a s m a ou le sdrurn p o u r la ddtection. P a r m i tous ces 616ments, de toute 6videnee les deux plus i m p o r t a n t s sont la sp6cificit6 et la sensibilit6, ce sont des conditions n6cessaires mais non suffisantes h l ' a d m i s s i o n d ' u n test en routine. Si la sp6cificit6 peut 6tre jug6e de fa~on assez satisfaisante en cornparant les diff6rentes mdthodes entre elles, la sensibilit6 est plus difficile h appr6cier de fa~on objective. C'est ainsi que l o r s q u e les a u t e u r s c o m p a r e n t u n e t ech n i q u e r a d i o - i m m u n o l o g i q u e avec l'61ectro-immunodiffusion, ils consid~rent le radio-immuno-essai c o m m e 20, 100 ou m 6 m e 1.000 fois plus sensible que l'61ectro-irnmunodiffusion. Ceci peut s'expliquer du fait que plusieurs techniques r a d i o - i m m u n o l o g i q u e s p e u v e n t 6tre de sensibilit6 diffdrente, en fait leurs r6sultats ne v a r i e n t gu6re. P a r contre, l'61ectro-immunodiffusion est susceptible de donner des r6sultats de sensibilit6 e x t r 6 m e m e n t variables selon les r6actifs qui sont utilis6s et selon l'exp6rience d'un l a b o r a t o i r e donn6. Pour d o n n e r un e x e m p l e pr6cis, nous p r e n d r o n s celui du Centre National de T r a n s f u s i o n S a n g u i n e : M m~ COUROUCI~ a mis au p o i n t darts son l a b o r a t o i r e u n e d6tection p ar dlectro-immunodiffusion faisant appel soit h u n seul rdactif s61ectionn6, soit h deux r4actifs. M6rne avec un seul r6actif sdlectionn6 sur un panel c o m p r e n a n t des antig6nes forts et des antig6nes faibles, elle p a r v i e n t ddtecter un n o m b r e d'antig6nes H B s n e t t e m e n t supfirieur h ceux qui sont

t--(ANTI

HBc)

I

FLAT~X3EG~N~RATION ~ ~, HAREVERSE 168 (93%) FC (CITS)

00%~ 181_

it"

T- i

I---F',.

1

I I

,

I

II,

I,

r

II II I (Jl

I I

, I

~

70%1 , ~ i

~; II

I I I |~ I

I ~-'Ii I

IO_i ! !

I !

|

I |

|

1 FIG. 1 . -

2

3

137

'

I ~I

'

i~_i

I I 'I

I _~I i t

ic~i I LUl I I

I ~I IUJI

4

5

6

7

(76%)

i

I ~_I

| !

I !

,

I ~1 I I NI ' ,

8

9

i0

Unit~s AntigOne HBs

Comparaison des sensibilit6s des diffdrentes techniques de d6tection de FAg HBs au C.N.T.S. (98.476 donneurs 6tudi6s parall~lelnent par EID et DRI : 181 positifs := 100 %. Evaluation de la sensibilit6 des autres techniques par l'6tude d'un panel.

DETECTION DE ROUTINE HBs

179

d6tectds dans b e a u c o u p de laboratoires. Cette sensibilit6 est encore accrue par l'utilisation syst6matique de deux r6actifs, un r6actif anticorps de titre dlev6 et un r6actif anticorps faible, p e r m e t t a n t de d6tecter des antig6nes tr6s faibles. Dans ces conditions optima, l'61ectro-immunodiffusion au Centre N a t i o n a l a p p a r a i t capable de d6tecter 87 % des antig6nes qui sont d6tectables p a r les m6thodes les plus sensibles telles que le ddpistage r a d i o - i m m u n o l o g i q u e en phase soluble (FIG. 1). Mais nous pensons que darts l'ensemble de la France off un seul rdactif est utilis6, qui est loin d'6tre t o u j o u r s standardisd, le p o u r c e n t a g e d'antig~nes n o n d d p i s t d s en 61ectro-immunodiffusion est tr6s sup6rieur ~ 13 % et peut at t ei n d r e 50 %. Si l'on veut que les r6sultats soient c o m p a r a b l e s d'un l ab o r at o i r e h un autre, d'un c e n t r e de t r a n s f u s i o n h u n autre, et d'un pays h u n autre, il serait n6cessaire de p o u v o i r utiliser des panels de r6f6rence identiques et des s6rums de r6f6rence 6galement p a r f a i t e m e n t standardis6s. I1 y aurait lieu de d 6 f i n i r un seuil de d6tection. En ce qui nous concerne, nous avons considdr6 c o m m e 6tant le seuil de d6tection l'antig~ne le plus faible qui p o u v a i t 6tre ddtect6 en radio-immuno-essai en phase soluble. Par convention, nous avons d6sign6 cette sensibilit6 c o m m e c o rr es p o n d an t h 1 unitd C.N.T.S. I1 sera possible ult6rieurement, lorsqu'on se sera en t en d u s u r les s6rums de rdf6rence, de c o n v e r t i r en nanogramrues d'antig6ne HBs purifi6 cette unit6 C.N.T.S. Si nous prenons, /t l'inverse, un antigone qui est d6tectable en 61ectro-immunodiffusion, il est possible de le diluer et de r e c h e r c h e r j u s q u ' h quelle dilution il est d6tectable p a r les autres m6thodes et en p a r t i c u l i e r p ar une technique radio-immunologique. Toutefois, il faut savoir que de grandes variations peuvent s ' o b s e r v e r en fonction du diluant. La m 6 t h o d e la plus objectix~e, celle que nous employons, est de diluer avec un p l a s m a dont on est certain qu'il est n6gatif ~t l'dgard de l'antig~ne HBs. Les diffdrents l a b o r a t o i r e s du C.N.T.S. ont, associ6 leurs efforts p o u r c o m p a r e r sur de n o m b r e u x 6chantillons la d6tection p ar un certain n o m b r e de m6thodes co u r a n t e s en l ' e x p r i m a n t en unitds C.N.T.S. et en faisant ressortir le p o u r c e n t a g e de ddtection d'antigbne HBs en consid6rant c o m m e 100 % de d6tection les r6sultats du radio-immuno-essai en phase soluble. Les r6sultats sont indiqu6s dans la figure 1. En dehors de la sensibilit6, bien d'autres 61dments sont h consid6rer dans le choix d'une t e c h n i q u e de routine, en p a r t i c u l i e r la rapidit6 des r6sultats obtenus et les probl~mes financiers ne p eu v en t 6tre n6glig6s (1). Nous avons groupd dans le tableau I un certain n o m b r e de techniques qui sont candidates p o u r se s u b s t i t u e r h l'61ectro-immuno-diffusion et nous avons indiqud leurs diverses qualit6s et inconv6nients. I1 ne faut pas perdre de vue, de plus, l ' i m p o r t a n c e d'un a p p r o v i s i o n n e m e n t en rdactifs assurd h l'6chelle nationale et 1'importance de p o u r s u i v r e la d6tection des anticorps, qui est ndcessaire non s e u l e m e n t p o u r p r 6 p a r e r les r6actifs de laboratoire, mais p o u r f r a c t i o n n e r des immuno-globulines sp6cifiques qui jouent dans la pr6vention de l'h6patite B u n r61e croissant. (1) Nous avons dans le tableau I fait une estimation tr6s approximative du coflt par test en faisant abstracti0n de l'invesfisscgLent err raat~riel.

~

~ ~

+

~~

+

+

~~

+l

~

+k

+

+

+

+

,~

+

+

+

+

+

,+

+

+

+

+

+

+

V

~ .~

V

~ .~

~

4-

4-

+

"~

V

o

+

+

+

+

%.

~,~

~

V 4-F -F

V 4-F 4-

-H

+,

~

V

4-I4-44-h

8

-H

+ 4+ 44-

~5

~5

=

5

+l

+l

+

+

4-

4-

+4_

-H

+

+i

"~-

,q

V

"F + 444-4-

-F

-F -F 4-

-F

+

~

4-4-

4-

-F

DETECTION DE ROUTINE HBs

181

En faisant la synth6se de tous ces 616ments, quelques techniques m~ritent plus p a r t i c u l i b r e m e n t consid6ration : Tout d'abord, les techniques radio-immunologiques d6j~ au point en 1971, en ce qui concerne les m6thodes en phase soluble, ont subi une 6volution en ce qui concerne les m6thodes en phase solide o/1 la sp6cificit6 des tests a 6t6 am61ior6e. I1 p a r a i t r a i t a priori logique d ' a b a n d o n n e r I'E.I.D. pour une t e c h n i q u e r a d i o - i m m u n o l o g i q u e en phase soluble p o u r les gros centres, en phase solide p o u r les centres de m o y e n n e i m p o r t an ce, 6tant donn6 que tous les auteurs s ' a c c o r d e n t sur la tr6s h au t e sensibilit6 de cette m6thode. Toutefois, il ne faut pas se dissimuler un certain n o m b r e d'inconv6nients p r a t i q u e s ; les utilisateurs doivent avoir une autorisation sp6ciale d'utilisation d'isotopes ; lorsqu'ils p r a t i q u e n t des recherches sur une grande 6chelle, se pose un p r o b l 6 m e d'6vacuation des d6chets radioactifs ; en phase liquide, le mat6riel est coflteux. En phase solide, on peut utiliser des c o m p t e u r s manuels et l'on dispose de r6actifs tout pr6pards, commerciaux. Toutefois, si l'on d6cidait de r e n d r e obligatoire la d6tection radio-immunologique, cela Signifierait une a u g m e n t a t i o n tr6s i m p o r t a n t e du c o f l t du ddpistage de l'antig~ne HBs et jusqu'~ nouvel o r d r e une d~pendance 6trang~re p o u r la f o u r n i t u r e des r6actifs n6cessaires. On en vient donc g se d e m a n d e r s'il n'y a pas lieu de faire appel g des techniques moins complexes n'utilisant pas d'isotopes, et moins coflteuses.

L'inhibition de l'hdmaggtutination utilisant des h6maties humaines rev~tues d'antig~ne H B s purifi6 repr6sente une m 6 t h o d e tr~s sensible, capable de d6tecter en m o y e n n e trois g q u a t r e unitds d'antig~ne HBs. L ' a u t o m a t i s a t i o n est possible, elle a 6t6 r6alis6e au Centre National de Transfusion Sanguine sur Groupamatic. Un inconv6nient p o u r la g6ndraliser est qu'il n'existe pas encore de r6actif commercialis6, mais on peut envisager une telle f a b r i c a ti o n p o u r l ' e n s e m b l e des centres de transfusion franqais. Les techniques du type , Reverse hemagglutination,, ont l'avantage d'offrir des r6actifs c o m m e r c i a l i s d s ; il s'agit d'h6maties de m o u t o n ou d'hdmaties h u m a i n e s r e c o u v e r t e s d ' a n t ic o r p s anti-HBs. Ces techniques ont une sensibilit6 voisine de l'inhibition de l ' h 6 m a g g l u t i n a t i o n ; lg encore toutefois on d6pend de r6actifs commercialis6s ~t l'6tranger, r e l a t i v e m e n t on6reux et r e p r 6 s e n t a n t une d6pendance 6trang~re. Certains r6actifs utilisant du latex sont e x t r ~ m e m e n t s6duisants en raison de l'extr~me simplicit6, et de la rapidit6 du test. M a l h e u r e u s e m e n t la p l u p art des r6actifs au latex, qui ont dt6 mis sur le march6, ont une sensibilit6 qui varie avec les diff6rents lots et avec les diff6rentes marques et b e a u c o u p d ' e n tr e eux d o n n e n t un h o m b r e beaucoup trop i m p o r t a n t de fausses rdactions positives. Toutefois, ces r6actifs s'amdliorent et c'est ainsi q u ' u n e grande f i r m e a pr6par6 sous le n o m d'Antigex un rdactif au latex utilisant un anticorps tr~s p u r i f i 6 ; cet anticorps a 6t6 6tudid au C.N.T.S_ et le d e r n i e r des lots en p ar t i cu l i er s'est av6r6 e x t r~ m em en t sensible, aussi bien de fa~on m a n u e l l e que sur Groupamatic. Mais lh encore, il serait p r 6 m a t u r 6 de conclure car il reste ~ s'assurer

182

S O U L I E R J.P,

de la reproductibilit6 f u t u r e des lots et h connattre le prix du r6actif ainsi que l a s6curit6 de l ' a p p r o v i s i o n n e m e n t ,d'origine 6trang6re. En ce qui m e concerne, il m ' a p p a r a i t r a i t p r 6 m a t u r 6 d ' i m p o s e r l'ensemble des centres de t r a n s f u s i o n sanguine telle ou telle m6thode. Au stade o/~ nous s o m m e s , la conclusion p r a t i q u e ne p o u r r a i t 6tre que de r e c o m m a n d e r aux centres de t r a n s f u s i o n sanguine d ' a b a n d o n n e r l'61ectro-immunodiffusion p o u r une m 6 t h o d e franchernent plus sensible, capable de d6tecter trois ou cinq unit6s C.N.T.S. c'est-h-dire une m 6 t h o d e d ' h 6 m a g g l u t i n a t i o n passive ou de ,, Reverse h 6 m a g g l u t i n a t i o n ,, 6ventuell e m e n t une m 6 t h o d e au latex si celle-ci est susceptible de faire ses preuves. Au lieu de ne d6tecter que 50 % e n v i r o n des antig~nes HB, l'utilisation de m6thodes aussi sensibles p e r m e t t r a d'61ever le seuil de d6tection de 85 ~ 95 % selon la m 6 t h o d e employ6e, voire h 99 % de la t e c h n i q u e radioi m m u n o l o g i q u e . N a t u r e l l e m e n t , t o u s l e s centres qui seront susceptibles d'utiliser une t e c h n i q u e r a d i o - i m m u n o l o g i q u e le f e r o n t avec le plus grand profit. Nous pensons que dans un an environ, avec l'exp6rience de l'ensemble des centres sur ces m6thodes plus sensibles, une m ei l l eu r e c o m p a r a i s o n des r6sultats sera possible et s u r t o u t une m ei l l eu r e c o m p a r a i s o n de la charge financi6re que devrait s u p p o r t e r la Sant6 publique. La r6union de c o n f r o n t a t i o n qui a lieu a u j o u r d ' h u i repr6sente donc une 6tape indispensable p o u r les choix de demain.

J.-P. SOULIER, Centre National de T r a n s f u s i o n Sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel - PARIS (15 ~)