Journal de Mycologie Médicale (2011) 21, 28—32
COURTE COMMUNICATION/SHORT COMMUNICATION
Variation saisonnière et géographique de l’activité antifongique des extraits de deux éponges marines récoltées sur le littoral atlantique d’El Jadida, Maroc Seasonal and geographical variation range of antifungal activity of sponge extracts from the Moroccan Atlantic coasts M. El-Wahidi a, B. El-Amraoui a,*, J.-F. Biard b, M.-J. Uriz c, A. Fassouane d, T. Bamhaoud a a
´ des sciences, universite ´ Choua ˆ¨b Faculte ı Doukkali, El Jadida, Maroc ´ de pharmacie, universite ´ de Nantes, France Groupe MMS, faculte c Centre d’Estudis Avanc¸ats de Blanes, Barcelone, Espagne d´ Ecole nationale de commerce et de gestion, El Jadida, Maroc b
Rec¸u le 30 aou ˆt 2010 ; rec¸u sous la forme re´vise ´e 21 November 2010; accepte´ le 23 novembre 2010 Disponible sur Internet le 26 janvier 2011
MOTS CLÉS Spongiaires ; Activité antifongique ; Cinachyrella ; Cliona ; Cryptococcus ; Candida
KEYWORD Antifungal activity; Spongiaires; Candida;
Résumé Actuellement, les organismes marins constituent une source très importante de nouvelles molécules dans la pharmacologie et ainsi dans le développement de nouveaux produits bioactifs. Des extraits organiques et aqueux de deux éponges marines Cinachyrella tarentine récoltée pendant deux saisons différentes (hiver et été) et Cliona viridis récoltée dans deux endroits différents sur le littoral d’El Jadida (Maroc) ont été testés pour leur activité antifongique sur des levures de référence impliquées en pathologie humaine, en utilisant la méthode de diffusion en milieu solide. L’éponge C. tarentine récoltée en hiver présente une activité très importante par rapport à celle récoltée en été. Alors que l’éponge C. viridis récoltée au large d’El Jadida (zone profonde et non polluée) présente une activité fongique faible par rapport à celle récoltée dans le port de Jorf Lasfar (zone moins profonde et polluée). # 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Summary Currently, marine organisms have a very important source of new molecules in pharmacology and thus in the development of new bioactive products. The organic and aqueous extracts of two marine sponges, Cinachyrella tarentine collected during two different seasons, winter and summer, and Cliona viridis collected in two different zones on the coast of El Jadida (Morocco) were tested for their antifungal activity using the diffusion method. The C. tarentine
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (B. El-Amraoui). 1156-5233/$ — see front matter # 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.mycmed.2010.11.005
Variation de l’activité antifongique des extraits de deux éponges marines
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Cryptococcus; Cinachyrella; Cliona
sponge collected in January (winter) has a very important activity compared to that collected in August (summer). While the sponge C. viridis collected from Jorf Lasfar port (shallower and polluted area) has a very important activity compared to that collected from the coast of El Jadida (depth and unpolluted area). # 2010 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
Introduction
recherches scientifiques (Consejo Superior de Investigaciones Científicas [CSIC]) en Espagne [8].
Le besoin de nouveaux médicaments est actuellement aussi grand, du fait de l’évolution des populations et des pathologies. Une des voies d’innovation repose sur la découverte de principes actifs originaux, qui peuvent provenir de la chimie de synthèse, de l’extraction à partir de sources biologiques, enfin, plus récemment, des biotechnologies fondées sur le génie génétique [5]. L’augmentation dramatique de l’incidence des infections fongiques et l’absence de médicaments efficaces nous ont incités à la recherche de puissants agents antifongiques à partir de sources naturelles encore inexploitées [18]. L’attention de la communauté scientifique avait en effet été attirée par les produits marins en 1951, lors de la découverte de nucléosides dans une éponge, puis, en 1969, quand la très forte teneur en prostaglandines d’une gorgone des Caraïbes a été révélée : un organisme marin fabriquait en grande quantité des produits que la chimie de synthèse peinait alors à élaborer. Ce fût le point de départ d’une aventure qui a livré jusqu’à ce jour plus de 15 000 produits originaux d’origine marine [6]. Compte tenu de la grande biodiversité des éponges marines avec l’âge phylogénétique de ces organismes de 600 millions d’année [8,15], une question se pose : comment ces organismes fixés, quasiment immobiles, et dépourvus de toutes défenses actives peuvent-ils se protéger contre leurs prédateurs et autres parasites et comment peuvent-ils s’auto protéger contre les microorganismes qui constituent leur propre nourriture ? La guère chimique semble la solution retenue par les spongiaires et autres invertébrés sessiles, et c’est une panoplie d’antibiotiques, d’antiviraux, d’antitumoraux ou d’antifongiques que va brandir l’animal. Reste à l’homme à trouver comment exploiter ces substances afin d’enrichir sa pharmacopée et trouver de nouvelles solutions à ses maux [13,17].
Préparation des extraits des éponges marines De chaque échantillon d’éponge marine, trois types d’extraits ont été préparés ; l’extrait aqueux (A), l’extrait hydroalcoolique (B) et l’extrait organique (C). Le broyat de l’éponge marine lyophilisée (100 g) a été trois fois extrait par une quantité suffisante d’eau distillée, filtrée et lyophilisée (extrait A). Le culot a été extrait une fois par de l’éthanol à 80 %, puis deux fois par l’éthanol absolu, avec des volumes suffisants pour que le broyat soit en suspension dans le solvant. Les trois filtrats ont été réunis et évaporés sous vide à l’évaporateur rotatif (40 8C) jusqu’à fin de la distillation de l’éthanol. La suspension a été ajustée par de l’eau distillée pour obtenir un volume de 100 ml puis extraite par trois fois 100 ml de dichlorométhane. Les deux phases, aqueuse et organique, ont été séparées à l’aide d’une ampoule à décompter. La phase aqueuse a été lyophilisée et afin d’éliminer les sels minéraux, le résidu a été deux fois repris par de l’éthanol absolu, filtré sur papier et évaporé à sec. La phase organique a été séchée sur du sulfate de sodium anhydre (Na2SO4) durant deux heures, filtrée sur papier et évaporée à sec (extrait B). Ce protocole d’extraction est récapitulé sur la Fig. 2 (extrait C).
Microorganismes pathogènes et préparation d’inoculum Trois levures de référence provenant de la collection de l’Institut Pasteur de Paris (CIP) ont été utilisées pour la
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Matériel et méthodes Matériels biologiques et sites d’échantillonnage Cinachyrella tarentine a été récoltée pendant deux saisons différentes (hiver et été 2009) de la plage « Deville » d’El Jadida (Fig. 1, site D) sur une profondeur de 2 à 4 m. Cliona viridis a été récoltée sur deux sites différents ; le large d’El Jadida-Sidi Bouzid (Fig. 1, site1) à marée basse, sur une profondeur de 10 à 18 m et sous les blocs de brise vagues du port commercial de Jorf Lasfar (Fig. 1, site2) sur une profondeur de 3 à 5 m. L’identification systématique des deux éponges marines a été effectuée par Dr Maria-Jesús Uriz, professeur chercheur au centre d’études avancées de Blanes (Centro de Estudios Avanzados de Blanes [CEAB]) et au Conseil supérieur des
Figure 1 Carte géographique qui montre les sites de récolte des éponges marines. Map showing the sites from which the sponges were harvested.
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M. El-Wahidi et al. Lyophilisat de l’éponge marine (100 g)
− Extraire 3 fois par H2O distillée
Culot
Filtrat aqueux
- Extraire une fois par EtOH 80% - Extraire 2 fois par l’EtOH absolu - Filtrer sur papier filtre
− Lyophiliser − peser Extrait de type A
Culot
Filtrat − − − −
Evaporation totale de l’EtOH au rotavapor Ajuster à 100 ml par l’eau distillée Extraire par 3 x 100ml de CH2CL2 Séparer les deux phases à l'aide d'une ampoule à décanter
Phase aqueuse
Phase organique
− Lyophiliser − reprendre le résidu dans l’EtOH absolu (éliminer les sels minéraux insolubles dans EtOH absolu), − filtrer sur papier et évaporer l’EtOH, − redissoudre le résidu dans EtOH absolu, − filtrer et évaporer, − peser
Extrait de type B
− sécher sur Na2SO4(100 mg pour 100 ml pd 1 à 2 h) − filtrer sur papier, − évaporer à sec, − peser
Extrait de type C
Figure 2 Protocole d’extraction à partir des éponges marines. Diagram of extraction of the marine sponges.
réalisation des tests antifongiques (Candida albicans CIP884.65, Candida tropicalis R2 CIP1275.81 : souche résistante à l’amphotéricine B et à la nystatine, Cryptococcus neoformans CIP960). L’inoculum a été préparé à partir de colonies de levures en phase de croissance exponentielle, à partir d’une culture de 24 heures, à 28 8C, sur milieu de Sabouraud gélosé pour les souches C. albicans et C. neoformans ou sur milieu Gélose Yeast Malt (GYM) pour la souche de C. tropicalis R2. La densité cellulaire de cette suspension a été évaluée par comptage à l’aide d’une cellule de Malassez. Elle est ensuite ajustée par dilution dans de l’eau distillée stérile de façon à obtenir une concentration finale de 104 UFC par millilitre après incorporation en milieu test [17—19,8,13,14].
Test d’activité antifongique Du fait que l’évaporation de l’eau à partir des disques de cellulose est lente et que les solvants organiques sont fongicides, le test de l’activité antifongique a été réalisé par la méthode de diffusion à partir des puits pour les extraits aqueux (A) et à partir des disques de cellulose pour les extraits hydroalcooliques (B) et organiques (C). Pour l’extrait du type A, 500 mg d’extrait solubilisés dans 15 ml d’eau distillée stérile ont été déposés dans des puits creusés à l’aide d’un emporte-pièce dans des boites de Pétri
précoulées avec le milieu Yeast Morphological Agar (YMA) préalablement inoculées avec le germe cible. Pour les extraits du type B et C, des disques de cellulose saturés par 500 mg de chaque extrait ont été déposés sur la surface de boîtes de Pétri précoulées avec le milieu YMA préalablement inoculées avec le germe cible [8]. Après deux heures de prédiffusion à 4 8C, les boîtes de Pétri ont été incubées à 28 8C pendant 24 heures. Des disques de nystatine (100 UI), antifongique utilisé contre les cryptococcoses et contre les candidoses, ont été utilisés comme témoin positif [9]. Le diamètre de la zone d’inhibition est alors mesuré.
Résultats et discussions Les agents antifongiques naturels utilisés actuellement dans la thérapie des mycoses sont principalement des molécules de nature polyéniques et en particulier l’amphotéricine B et la nystatine [13,14], raison pour laquelle l’activité antifongique à été réalisée contre des germes cibles dont la souche C. tropicalis R2 CIP1275.81 : souche résistante à l’amphotéricine B et à la nystatine. Les résultats du test illustrés sur les Tableaux 1 et 2 montrent que tous les extraits purement aqueux (A) sont inactifs sur les levures pathogènes étudiées alors que pour les extraits hydroalcooliques (B), seul celui préparé à partir de
Variation de l’activité antifongique des extraits de deux éponges marines
31
Tableau 1 Activité antifongique saisonnière des extraits de C. tarentine. Seasonal antifungal activity of C. tarentine extracts. Extrait
A B C Nystatine 100 UI
C. albicans
C. tropicalis
C. neoformans
Été
Hiver
Été
Hiver
Été
Hiver
R R T 25
R R 11
R R T R
R R 12
R R T 24
R 9 14
La zone d’inhibition est mesurée en millimètre ; R : Résistante ; T : traces.
Tableau 2 Activité antifongique des extraits de C. viridis. Antifungal activity of C. viridis extracts. Extrait
A B C Nystatine 100 UI
C. albicans
C. tropicalis R2
C. neoformans
Site 1
Site 2
Site 1
Site 2
Site 1
Site 2
R R 8 25
R R 13
R R 10 R
R R 14
R R 10 24
R R 14
La zone d’inhibition est mesurée en millimètre ; R : Résistante.
C. tarentine récoltée en hiver est actif et seulement sur C. neoformans. Les extraits organiques (C) des deux éponges sont tous actifs contre toutes les souches fongiques mais avec des diamètres d’inhibition variable selon la saison de récolte pour C. tarentine et selon la zone de récolte pour C. viridis. L’extrait C de C. tarentine récolté en hiver présente une forte activité sur toutes les levures par rapport à l’extrait de la même éponge récoltée en été. Cette différence dans l’activité antifongique peut s’expliquer par un changement dans les conditions de la zone d’échantillonnage (climat, pollution). Pour C. viridis, l’activité est plus importante pour l’échantillon récolté dans le port de Jorf lasfar que celle des échantillons récoltés au large d’El Jadida (zone ouverte et moins polluée). Le port commercial constitue un bassin où l’échange avec le large marin est très limité, ce qui favorise le développement microbien et par la suite l’éponge se trouve dans l’obligation de synthétiser en grande quantité le métabolite secondaire à activité antifongique ce qui peut expliquer la variation de l’activité antifongique de cette éponge. Plusieurs auteurs ont étudié et discuté la composition biochimique et l’activité biologique des éponges marines [1— 4,6,8,9,10—12,16—18,20—25], dont certains, [4,6,10,16,18] ont indiqué avec précision le lieu, la date et la profondeur de récolte de leurs échantillons. Leur travail est mené sur des activités biologiques des extraits préparés ou des molécules purifiées et identifiées à partir de ces éponges, mais aucun de ces auteurs n’a évoqué une étude de la variation du métabolisme secondaire de ces spongiaires selon le paramètre environnemental du lieu de récolte. Le métabolisme secondaire peut varier avec le cycle de croissance et avec la bioactivité de l’éponge. Les facteurs environnementaux ont un effet très important sur la
bioactivité (culture, croissance et survie) des éponges [7]. Donc selon les conditions physicochimiques et biologiques de leur biotope (température, salinité, pollution microbiologique et chimique, intensité de prédation), les spongiaires peuvent secréter ou non un métabolite secondaire. Par exemple une éponge qui vie dans un lieu où la prédation est absente n’aura pas besoin d’un métabolite toxique alors que la même espèce vivant dans une zone polluée se trouve dans l’obligation de secréter un métabolite pour se défendre ou son sort sera l’extinction. Dans le cas de l’éponge C. viridis, l’échantillon récolté d’une zone peu profonde et polluée (site 2) présente une forte activité antifongique contre les trois levures pathogènes par rapport à l’échantillon récolté d’une zone profonde et non polluée (site 1). Il faut noter que même la morphologie externe des deux échantillons de la même espèce récoltée des deux zones est très différente à tel point que nous les avions pris pour deux espèces différentes avant qu’un systématicien, Maria-Jésus Uriz, nous indique qu’il s’agit de la même espèce. Plusieurs études ont démontré la richesse des genres Cliona et Cynachirella en métabolites secondaires à activité biologique qui peuvent être une source importante de molécules originales [4,6,8,9,16,22,24,26]. L’espèce C. tarentine n’est pas très étudiée ce qui nous a incité à une purification bioguidée du principe antifongique de cette éponge. Pour la purification, il nous a fallu une grande quantité de cette éponge et lors de la récolte estivale (août) nous avions remarqué que l’activité de cet échantillon est très faible par rapport à l’échantillon utilisé pour le screening [8] et qui a été récolté en hiver (Tableau 1). La zone de récolte est la même ; les seuls facteurs qui ont subit un changement sont les conditions climatiques. Il est évident que le développement fongique est très favorisé par la baisse de température en hiver alors qu’il se ralentit par la température élevée en été. Là aussi l’éponge se trouvant dans l’obligation de
32 sécréter en quantité suffisante l’antifongique pour son autodéfense n’en aura pas besoin en été où l’infection fongique est ralentie par l’élévation de la température. C. tropicalis R2, résistante à la nystatine et à l’amphotéricine B, est sensible aux extraits des deux éponges marines étudiées.
Conclusion Malgré le développement et la découverte de différents antifongiques, les infections fongiques représentent une complication et marquent un taux de mortalité très élevé. La recherche de nouveaux antifongiques à large spectre reste une priorité. Vu que les océans présentent 75 % de la surface de la Terre, le milieu marin devient le centre d’intérêt des chercheurs pour accéder à des nouvelles substances naturelles bioactives. Les invertébrés marins peuvent constituer une source alternative pour lutter contre les microorganismes pathogènes résistants. La composition chimique ainsi que le métabolisme secondaire des invertébrés (Spongiaires) peuvent changer selon les facteurs environnementaux de leur biotope.
Conflit d’intérêt Pas de conflits d’intérêt.
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COURTE COMMUNICATION/SHORT COMMUNICATION
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´ des sciences, universite ´ Choua ˆ¨b Faculte ı Doukkali, El Jadida, Maroc ´ de pharmacie, universite ´ de Nantes, France Groupe MMS, faculte c Centre d’Estudis Avanc¸ats de Blanes, Barcelone, Espagne d´ Ecole nationale de commerce et de gestion, El Jadida, Maroc b
Rec¸u le 30 aou ˆt 2010 ; rec¸u sous la forme re´vise ´e 21 November 2010; accepte´ le 23 novembre 2010 Disponible sur Internet le 26 janvier 2011
MOTS CLÉS Spongiaires ; Activité antifongique ; Cinachyrella ; Cliona ; Cryptococcus ; Candida
KEYWORD Antifungal activity; Spongiaires; Candida;
Résumé Actuellement, les organismes marins constituent une source très importante de nouvelles molécules dans la pharmacologie et ainsi dans le développement de nouveaux produits bioactifs. Des extraits organiques et aqueux de deux éponges marines Cinachyrella tarentine récoltée pendant deux saisons différentes (hiver et été) et Cliona viridis récoltée dans deux endroits différents sur le littoral d’El Jadida (Maroc) ont été testés pour leur activité antifongique sur des levures de référence impliquées en pathologie humaine, en utilisant la méthode de diffusion en milieu solide. L’éponge C. tarentine récoltée en hiver présente une activité très importante par rapport à celle récoltée en été. Alors que l’éponge C. viridis récoltée au large d’El Jadida (zone profonde et non polluée) présente une activité fongique faible par rapport à celle récoltée dans le port de Jorf Lasfar (zone moins profonde et polluée). # 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Summary Currently, marine organisms have a very important source of new molecules in pharmacology and thus in the development of new bioactive products. The organic and aqueous extracts of two marine sponges, Cinachyrella tarentine collected during two different seasons, winter and summer, and Cliona viridis collected in two different zones on the coast of El Jadida (Morocco) were tested for their antifungal activity using the diffusion method. The C. tarentine
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (B. El-Amraoui). 1156-5233/$ — see front matter # 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.mycmed.2010.11.005
Variation de l’activité antifongique des extraits de deux éponges marines
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Cryptococcus; Cinachyrella; Cliona
sponge collected in January (winter) has a very important activity compared to that collected in August (summer). While the sponge C. viridis collected from Jorf Lasfar port (shallower and polluted area) has a very important activity compared to that collected from the coast of El Jadida (depth and unpolluted area). # 2010 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
Introduction
recherches scientifiques (Consejo Superior de Investigaciones Científicas [CSIC]) en Espagne [8].
Le besoin de nouveaux médicaments est actuellement aussi grand, du fait de l’évolution des populations et des pathologies. Une des voies d’innovation repose sur la découverte de principes actifs originaux, qui peuvent provenir de la chimie de synthèse, de l’extraction à partir de sources biologiques, enfin, plus récemment, des biotechnologies fondées sur le génie génétique [5]. L’augmentation dramatique de l’incidence des infections fongiques et l’absence de médicaments efficaces nous ont incités à la recherche de puissants agents antifongiques à partir de sources naturelles encore inexploitées [18]. L’attention de la communauté scientifique avait en effet été attirée par les produits marins en 1951, lors de la découverte de nucléosides dans une éponge, puis, en 1969, quand la très forte teneur en prostaglandines d’une gorgone des Caraïbes a été révélée : un organisme marin fabriquait en grande quantité des produits que la chimie de synthèse peinait alors à élaborer. Ce fût le point de départ d’une aventure qui a livré jusqu’à ce jour plus de 15 000 produits originaux d’origine marine [6]. Compte tenu de la grande biodiversité des éponges marines avec l’âge phylogénétique de ces organismes de 600 millions d’année [8,15], une question se pose : comment ces organismes fixés, quasiment immobiles, et dépourvus de toutes défenses actives peuvent-ils se protéger contre leurs prédateurs et autres parasites et comment peuvent-ils s’auto protéger contre les microorganismes qui constituent leur propre nourriture ? La guère chimique semble la solution retenue par les spongiaires et autres invertébrés sessiles, et c’est une panoplie d’antibiotiques, d’antiviraux, d’antitumoraux ou d’antifongiques que va brandir l’animal. Reste à l’homme à trouver comment exploiter ces substances afin d’enrichir sa pharmacopée et trouver de nouvelles solutions à ses maux [13,17].
Préparation des extraits des éponges marines De chaque échantillon d’éponge marine, trois types d’extraits ont été préparés ; l’extrait aqueux (A), l’extrait hydroalcoolique (B) et l’extrait organique (C). Le broyat de l’éponge marine lyophilisée (100 g) a été trois fois extrait par une quantité suffisante d’eau distillée, filtrée et lyophilisée (extrait A). Le culot a été extrait une fois par de l’éthanol à 80 %, puis deux fois par l’éthanol absolu, avec des volumes suffisants pour que le broyat soit en suspension dans le solvant. Les trois filtrats ont été réunis et évaporés sous vide à l’évaporateur rotatif (40 8C) jusqu’à fin de la distillation de l’éthanol. La suspension a été ajustée par de l’eau distillée pour obtenir un volume de 100 ml puis extraite par trois fois 100 ml de dichlorométhane. Les deux phases, aqueuse et organique, ont été séparées à l’aide d’une ampoule à décompter. La phase aqueuse a été lyophilisée et afin d’éliminer les sels minéraux, le résidu a été deux fois repris par de l’éthanol absolu, filtré sur papier et évaporé à sec. La phase organique a été séchée sur du sulfate de sodium anhydre (Na2SO4) durant deux heures, filtrée sur papier et évaporée à sec (extrait B). Ce protocole d’extraction est récapitulé sur la Fig. 2 (extrait C).
Microorganismes pathogènes et préparation d’inoculum Trois levures de référence provenant de la collection de l’Institut Pasteur de Paris (CIP) ont été utilisées pour la
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Matériel et méthodes Matériels biologiques et sites d’échantillonnage Cinachyrella tarentine a été récoltée pendant deux saisons différentes (hiver et été 2009) de la plage « Deville » d’El Jadida (Fig. 1, site D) sur une profondeur de 2 à 4 m. Cliona viridis a été récoltée sur deux sites différents ; le large d’El Jadida-Sidi Bouzid (Fig. 1, site1) à marée basse, sur une profondeur de 10 à 18 m et sous les blocs de brise vagues du port commercial de Jorf Lasfar (Fig. 1, site2) sur une profondeur de 3 à 5 m. L’identification systématique des deux éponges marines a été effectuée par Dr Maria-Jesús Uriz, professeur chercheur au centre d’études avancées de Blanes (Centro de Estudios Avanzados de Blanes [CEAB]) et au Conseil supérieur des
Figure 1 Carte géographique qui montre les sites de récolte des éponges marines. Map showing the sites from which the sponges were harvested.
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M. El-Wahidi et al. Lyophilisat de l’éponge marine (100 g)
− Extraire 3 fois par H2O distillée
Culot
Filtrat aqueux
- Extraire une fois par EtOH 80% - Extraire 2 fois par l’EtOH absolu - Filtrer sur papier filtre
− Lyophiliser − peser Extrait de type A
Culot
Filtrat − − − −
Evaporation totale de l’EtOH au rotavapor Ajuster à 100 ml par l’eau distillée Extraire par 3 x 100ml de CH2CL2 Séparer les deux phases à l'aide d'une ampoule à décanter
Phase aqueuse
Phase organique
− Lyophiliser − reprendre le résidu dans l’EtOH absolu (éliminer les sels minéraux insolubles dans EtOH absolu), − filtrer sur papier et évaporer l’EtOH, − redissoudre le résidu dans EtOH absolu, − filtrer et évaporer, − peser
Extrait de type B
− sécher sur Na2SO4(100 mg pour 100 ml pd 1 à 2 h) − filtrer sur papier, − évaporer à sec, − peser
Extrait de type C
Figure 2 Protocole d’extraction à partir des éponges marines. Diagram of extraction of the marine sponges.
réalisation des tests antifongiques (Candida albicans CIP884.65, Candida tropicalis R2 CIP1275.81 : souche résistante à l’amphotéricine B et à la nystatine, Cryptococcus neoformans CIP960). L’inoculum a été préparé à partir de colonies de levures en phase de croissance exponentielle, à partir d’une culture de 24 heures, à 28 8C, sur milieu de Sabouraud gélosé pour les souches C. albicans et C. neoformans ou sur milieu Gélose Yeast Malt (GYM) pour la souche de C. tropicalis R2. La densité cellulaire de cette suspension a été évaluée par comptage à l’aide d’une cellule de Malassez. Elle est ensuite ajustée par dilution dans de l’eau distillée stérile de façon à obtenir une concentration finale de 104 UFC par millilitre après incorporation en milieu test [17—19,8,13,14].
Test d’activité antifongique Du fait que l’évaporation de l’eau à partir des disques de cellulose est lente et que les solvants organiques sont fongicides, le test de l’activité antifongique a été réalisé par la méthode de diffusion à partir des puits pour les extraits aqueux (A) et à partir des disques de cellulose pour les extraits hydroalcooliques (B) et organiques (C). Pour l’extrait du type A, 500 mg d’extrait solubilisés dans 15 ml d’eau distillée stérile ont été déposés dans des puits creusés à l’aide d’un emporte-pièce dans des boites de Pétri
précoulées avec le milieu Yeast Morphological Agar (YMA) préalablement inoculées avec le germe cible. Pour les extraits du type B et C, des disques de cellulose saturés par 500 mg de chaque extrait ont été déposés sur la surface de boîtes de Pétri précoulées avec le milieu YMA préalablement inoculées avec le germe cible [8]. Après deux heures de prédiffusion à 4 8C, les boîtes de Pétri ont été incubées à 28 8C pendant 24 heures. Des disques de nystatine (100 UI), antifongique utilisé contre les cryptococcoses et contre les candidoses, ont été utilisés comme témoin positif [9]. Le diamètre de la zone d’inhibition est alors mesuré.
Résultats et discussions Les agents antifongiques naturels utilisés actuellement dans la thérapie des mycoses sont principalement des molécules de nature polyéniques et en particulier l’amphotéricine B et la nystatine [13,14], raison pour laquelle l’activité antifongique à été réalisée contre des germes cibles dont la souche C. tropicalis R2 CIP1275.81 : souche résistante à l’amphotéricine B et à la nystatine. Les résultats du test illustrés sur les Tableaux 1 et 2 montrent que tous les extraits purement aqueux (A) sont inactifs sur les levures pathogènes étudiées alors que pour les extraits hydroalcooliques (B), seul celui préparé à partir de
Variation de l’activité antifongique des extraits de deux éponges marines
31
Tableau 1 Activité antifongique saisonnière des extraits de C. tarentine. Seasonal antifungal activity of C. tarentine extracts. Extrait
A B C Nystatine 100 UI
C. albicans
C. tropicalis
C. neoformans
Été
Hiver
Été
Hiver
Été
Hiver
R R T 25
R R 11
R R T R
R R 12
R R T 24
R 9 14
La zone d’inhibition est mesurée en millimètre ; R : Résistante ; T : traces.
Tableau 2 Activité antifongique des extraits de C. viridis. Antifungal activity of C. viridis extracts. Extrait
A B C Nystatine 100 UI
C. albicans
C. tropicalis R2
C. neoformans
Site 1
Site 2
Site 1
Site 2
Site 1
Site 2
R R 8 25
R R 13
R R 10 R
R R 14
R R 10 24
R R 14
La zone d’inhibition est mesurée en millimètre ; R : Résistante.
C. tarentine récoltée en hiver est actif et seulement sur C. neoformans. Les extraits organiques (C) des deux éponges sont tous actifs contre toutes les souches fongiques mais avec des diamètres d’inhibition variable selon la saison de récolte pour C. tarentine et selon la zone de récolte pour C. viridis. L’extrait C de C. tarentine récolté en hiver présente une forte activité sur toutes les levures par rapport à l’extrait de la même éponge récoltée en été. Cette différence dans l’activité antifongique peut s’expliquer par un changement dans les conditions de la zone d’échantillonnage (climat, pollution). Pour C. viridis, l’activité est plus importante pour l’échantillon récolté dans le port de Jorf lasfar que celle des échantillons récoltés au large d’El Jadida (zone ouverte et moins polluée). Le port commercial constitue un bassin où l’échange avec le large marin est très limité, ce qui favorise le développement microbien et par la suite l’éponge se trouve dans l’obligation de synthétiser en grande quantité le métabolite secondaire à activité antifongique ce qui peut expliquer la variation de l’activité antifongique de cette éponge. Plusieurs auteurs ont étudié et discuté la composition biochimique et l’activité biologique des éponges marines [1— 4,6,8,9,10—12,16—18,20—25], dont certains, [4,6,10,16,18] ont indiqué avec précision le lieu, la date et la profondeur de récolte de leurs échantillons. Leur travail est mené sur des activités biologiques des extraits préparés ou des molécules purifiées et identifiées à partir de ces éponges, mais aucun de ces auteurs n’a évoqué une étude de la variation du métabolisme secondaire de ces spongiaires selon le paramètre environnemental du lieu de récolte. Le métabolisme secondaire peut varier avec le cycle de croissance et avec la bioactivité de l’éponge. Les facteurs environnementaux ont un effet très important sur la
bioactivité (culture, croissance et survie) des éponges [7]. Donc selon les conditions physicochimiques et biologiques de leur biotope (température, salinité, pollution microbiologique et chimique, intensité de prédation), les spongiaires peuvent secréter ou non un métabolite secondaire. Par exemple une éponge qui vie dans un lieu où la prédation est absente n’aura pas besoin d’un métabolite toxique alors que la même espèce vivant dans une zone polluée se trouve dans l’obligation de secréter un métabolite pour se défendre ou son sort sera l’extinction. Dans le cas de l’éponge C. viridis, l’échantillon récolté d’une zone peu profonde et polluée (site 2) présente une forte activité antifongique contre les trois levures pathogènes par rapport à l’échantillon récolté d’une zone profonde et non polluée (site 1). Il faut noter que même la morphologie externe des deux échantillons de la même espèce récoltée des deux zones est très différente à tel point que nous les avions pris pour deux espèces différentes avant qu’un systématicien, Maria-Jésus Uriz, nous indique qu’il s’agit de la même espèce. Plusieurs études ont démontré la richesse des genres Cliona et Cynachirella en métabolites secondaires à activité biologique qui peuvent être une source importante de molécules originales [4,6,8,9,16,22,24,26]. L’espèce C. tarentine n’est pas très étudiée ce qui nous a incité à une purification bioguidée du principe antifongique de cette éponge. Pour la purification, il nous a fallu une grande quantité de cette éponge et lors de la récolte estivale (août) nous avions remarqué que l’activité de cet échantillon est très faible par rapport à l’échantillon utilisé pour le screening [8] et qui a été récolté en hiver (Tableau 1). La zone de récolte est la même ; les seuls facteurs qui ont subit un changement sont les conditions climatiques. Il est évident que le développement fongique est très favorisé par la baisse de température en hiver alors qu’il se ralentit par la température élevée en été. Là aussi l’éponge se trouvant dans l’obligation de
32 sécréter en quantité suffisante l’antifongique pour son autodéfense n’en aura pas besoin en été où l’infection fongique est ralentie par l’élévation de la température. C. tropicalis R2, résistante à la nystatine et à l’amphotéricine B, est sensible aux extraits des deux éponges marines étudiées.
Conclusion Malgré le développement et la découverte de différents antifongiques, les infections fongiques représentent une complication et marquent un taux de mortalité très élevé. La recherche de nouveaux antifongiques à large spectre reste une priorité. Vu que les océans présentent 75 % de la surface de la Terre, le milieu marin devient le centre d’intérêt des chercheurs pour accéder à des nouvelles substances naturelles bioactives. Les invertébrés marins peuvent constituer une source alternative pour lutter contre les microorganismes pathogènes résistants. La composition chimique ainsi que le métabolisme secondaire des invertébrés (Spongiaires) peuvent changer selon les facteurs environnementaux de leur biotope.
Conflit d’intérêt Pas de conflits d’intérêt.
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