Z Lebensm Unters Forsch (1992) 194:520-523

Zeitschrift for

9 Springer-Verlag 1992

Originalarbeit Empfindliches und selektives HPLC-Verfahren mit priichromatographischer Derivatisierung zur Bestimmung von Cyclamat in Lebensmitteln Jochem Riiter und D.I. Ulrich Raczek Zentrale Analytik Bayer AG, W-5090 Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland Eingegangen am 27. Januar 1992 Sensitive and selective HPLC procedure with prechromatographical derivatisation for the determination of cyclamate in food stuffs Summary. A sensitive and selective high pressure liquid chromatography (HPLC) procedure for the determination of sodium cyclamate in juices and preserves is presented. The method depends on the oxidation of cyclamate to cyclohexylamine, which then is converted prechromatographically into a fluorescent derivative. It is analyzed by HPLC on a C18: reversed-phase column and determined with fluorescence detection (exitation at 350 nm, emission at 440-650 nm). The detection limit of sodium cyclamate was 0.5-5 mg/kg, depending on the nature and dilution of the samples. The relative standard deviations thus obtained were _+1.0 to _+2.6%. The average recovery was 90%. Zusammenfassung. Es wird eine empfindliche und selektive-HPLC Methode zur Bestimmung yon (Na-) Cyclamat in diversen Lebensmittelproben vorgestellt. Das Verfahren beruht auf der Oxidation des Cyclamats zum Cyclohexylamin. Das gebildete Cyclohexylamin wird prfichromatographisch zu einem fluoreszenzaktiven Derivat umgesetzt, anschlieBend an einer C18-Umkehrphase chromatographiert und bei einer Anregungswellenl/inge yon 350nm sowie einer Emissionwellenl/inge von 440650 nm vermessen. Die Bestimmungsgrenze liegt zwischen 0,5-5 mg Na-Cyclamat/kg Lebensmittel, abh/ingig von Probenart und -verdfinnung. Die ermittelten relativeu Standardabweichungen liegen in einem Bereich von __ 1,0% bis +_2,6%. Die Wiederfindungsrate betr/igt im Durchschnitt 90%.

Einleitung Die Bedeutung von SfiBstoffen als Lebensmittelzusfitzen ist im letzten Jahrzehnt stark gestiegen. In der VerganOffprint requests to: J. Riiter

genheit wurden Sfigstoffe haupts/ichlich in di/itetischen Lebensmitteln ffir Diabetiker verwendet. Heute hat sich deren Einsatzgebiet auf brennwertarme Produkte ffir ,calorienbewugte" Konsumenten erweitert. Zu den wichtigsten verwendeten Sfigstoffen z~hlt neben dem Saccharin-Natrium, Aspartam und Acesulfam K das Natriumcyclamat (Natriumcyclohexylsulfamat). In der Literatur werden eine Vielzahl an Verfahren zur quantitativen Cyclamatbestimmung beschrieben. Als klassisch anzusehen sind nagchemische Verfahren, bei denen das Cyclamat mit Nitrit zu Cyclohexen, Stickstoff und Sulfat oxidiert wird. Je nach Methode wird der Cyclamatgehalt entweder titrimetrisch fiber den Nitritverbrauch oder gravimetrisch fiber das Sulfat als Bariumsulfat bestimmt [1, 2]. Die publizierten DC-Methoden sind zum Teil aufwendig und besitzen eine mangelhafte Pr/izision [3-5]. Uber eine vorausgehende Oxidation zu Cyclohexen 1/iBt sich Cyclamat mit Kopfraum-Gaschromatographie analysieren [6]. Zache und Griinding ver6ffentlichen ein Capillar-Isotachophoretisches Verfahren, bei dem das Cyclamat mittels seiner Leitffihigkeit detektiert wird [7]. Die fiblicherweise angewandten HPLC-Verfahren werden beeintr/ichtigt durch die ungenfigende UVAbsorption des Cyclamats. Eine Direktbestimmung yon Cyclamat bei einer Wellenlfinge von 200 nm ist praktisch nur bei reinen SfiBstoff-Formulierungen m6glich [8]. Hermann, Damawandi und Wagmann beschrieben ein flfissigchromatographisches System, bei welchem eine indirekte photometrische Detektion angewendet wurde. Hierbei wird dem Elutionsmittel Tetrabutylammoniump-toluolsulfonat zugesetzt. Dessen hohe Absorption bei 260 nm erm6glicht eine empfindliche Detektion des Cyclamats als negativen Peak. Dadurch, dab alle Probenkomponenten sichtbar werden, ist diese indirekte Methode, ebenso wie die direkte Detektion bei 200 nm, wenig geeignet ffir eine Cyclamatbestimmung in komplexen Matrices. Erst in jfingster Zeit wurden Methoden ver6ffentlicht, bei denen das Cyclamat pr/ichromatographisch derivatisiert wird, mit dem Ziel, eine photometrisch aktive Verbindung zu erhalten [10]. Allerdings gibt es auch hier

521 N a c h w e i s p r o b l e m e bei speziellen Probengemischen (z. B. Gurkenaufgfissen). Eine wesentliche Verbesserung der Selektividit u n d der Nachweisgrenze l~il3t sich d u r c h die U m s e t z u n g v o n C y c l a m a t zu einer fluorimetrisch detektierbaren V e r b i n d u n g erzielen [11]. Die vorliegende M e t h o d e nutzt die Vorteile einer pr~ic h r o m a t o g r a p h i s c h e n Derivatisierung zu einer fluorop h o r e n Verbindung. H i e r d u r c h k a n n der ( N a - ) C y c l a m a t gehalt diverser Lebensmittel bestimmt werden. D a s Prinzip der M e t h o d e basiert a u f der Oxidation des Cyclamats z u m Cyclohexylamin. D a s gebildete Cyclohexylamin wird mit o r t h o - P h t h a l d i a l d e h y d (OPA), einem in der Aminos~iurenanalytik verwendeten Derivatisierungsreagenz [12, 13], zu einem fluorescensaktiven Isoindolderivat umgesetzt ( R e a k t i o n s s c h e m a 1). D a s entstandene Rea k t i o n s p r o d u k t wird mittels H P L C an einer R P - C 1 8 Phase anatysiert. S-(CH2)2-COOH

,-,

LC)j.." + H2N_~x_ 2 v

CH O

HS-(CH2)2COOH > RT, 5 min

N-O

Reaktionsschema1. Umsetzung yon Cyclohexylamin zum Fluorescenzderivat

filtrieren. - Konfitfire, Obst und Gemi~sekonserven: Die Probe in einem Haushaltsmixer zerkleinern und homogenisieren. Hiervon ca. i 0 g in einem Becherglas einw~igen, mit 50 ml Wasser versetzen und 30 min auf einem Magnetriihrer dihren. Die Probensuspension in Zentrifugengl~iser fiberffihren und 20 min mit 3000 g zentrifugieren. Die fiberstehende Fliissigkeit in einen 100-ml-MeBkolben iiberffihten. Den Rfickstand im Zentrifugenglas erneut mit 10 ml Wasser suspendieren, nochmals zentrifugieren, den Oberstand in den Me6kolben iiberfiihren und mit Wasser auffiillen.

5 Derivat&ierung 5.1 Oxidation des Cyclamats. 2 ml Probel6sung in ein 10-ml-Reagensglas mit Schliff pipettieren. 1 ml 30%ige H2Oz-L6sung und 0,3 ml 37%ige Salzsfiure zusetzen. Nach dem Aufsetzen eines Steigrohres das Reaktionsgef'~i6 ffir 60 min in einen auf 100 ~ temperierten Thermostaten einsetzen. Nach erfolgter Oxidation die L6sung auf Raumtemperatur abkiihlen und zur Neutralisation 0,4 ml 40% ige Natronlauge zusetzen. AnschlieBend die Probel6sung in einen 25-ml-Me6kolben iiberffihren und mit Boratpuffer (pH 10,0) aufffillen. 5.2 Umsetzen zum Fluorescensderivat. 1 ml der oxidierten Probel6sung in einen 10-ml-MeBkolben pipettieren und mit OPA-Reagens16sung bis zur Marke auffiillen. Dieses Reaktionsgemisch nach exakt 5 min in das chromatographische System injizieren.

Experimentelles 1 Chemikalien Acetonitril, chromasolv (Riedel de Haen 34851); Natriumdihydrogenphosphat-2-hydrat (Riedel de Haen 4269); Dinatriumhydrogenphosphat-12-hydrat (Riedel de Haen 30414); H/O2, 30%ige L6sung (Riedel de Haen 31642); Salzsfiure pro anal. mind. 37%ig (Riedel de Haen 30721); Kaliumhydroxid 85%ig (Riedel de Haen 30603); Natriumhydroxid, P1/itzchen zur Analyse (Reinighaus Chemie); Bors~iure pro anal. (Merck 165); o-Phthaldialdehyd (Merck 821027); Ethanol absolut (Riedel de Haen 32205); 3-Mercaptopropions~iure (Aldrich M 580-1); Cyclohexylamin (Merck 802885).

6 Chromatographische Bedingungen Trenns~iule: Licrospher 100 RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 Ixm, Fa. Merck. Injektionsvolumen: 10 gl. Sfiulentemperatur: 40 ~ Volumenstrom: 1,0 ml/min. Eluent: Acetonitril/Puffer 64 + 36 (v/v), Puffer= 3 g Dinatriumhydrogenphosphat x 12 H20 + 3 g Natriumdihydrogenphosphat x H20 auf 1 L mit deionisiertem Wasser auffiillen. Fluorescensdetektion: Anregung 350 nm max.; Emission 440650 nm.

7 Auswertung 2 Reagensl6sungen 40%ige Natriumhydroxidl6sung. - Boratpuffer: 25 g Bors~iure mit ca. 900 ml Wasser 16sen. Den pH-Wert yon 10,0 mit konz. Kalilauge einstellen. AnschlieBend mit Wasser auf 1 L auffiillen. - OPA-Reagensl6sung: 200 mg o-Phthaldialdehyd in 5 ml Ethanol 16sen, 1,0 ml 3-Mercaptopropions~iure zugeben und anschlieBend mit Boratpuffer auf 100 ml auffiillen. Das Reagens sollte mindestens 16 h ausreagieren und bei Verwendung nicht ~ilter als 10 Tage sein. Lagerung im Dunkeln. - Kalibrierl6sung: 100 mg Cyclohexylamin in einen a00-ml-Me6kolben einw~igen, mit Wasser 16sen und bis zur Marke aufffillen. Zur Messung 1 ml dieser Stamml6sung zu 100 ml mit Wasser verdiinnen. 3 Instrumentation - Gerdte Sigma Laborzentrifuge 2-15; Thermostat Paratherm HTU5 Juchheim Labortechnik; 10 ml-Reagensglas mit Schliff und Steigrohr (15 cm); Filtereinheiten 0,45 gm Millipore Millex HA; Varian Vista 5500 HPLC-Chromatograph; Biotronik Fluorescensdetektor BT 0320. 4 Probenvorbereitung Sdfte: Den Saft 20 min bei 3 000 g zentrifugieren, die iiberstehende Fliissigkeit abdekantieren und mit einem 0,45-1am-Millex HA-Filter

Die Messungen wurden nach der Methode des externen Standards gegen entsprechende Cyclohexylamin-Kalibrierl6sungen ausgewertet.

Ergebnisse und Diskussion Zuerst erfolgte die Optimierung der einzelnen M e t h o d e n parameter. Die Derivatisierung (Dauer, Zusammensetzung des Derivatisierungsreagenses) wurde a n h a n d v o n Cyclohexylaminkalibrierl6sungen u n d oxidierten P r o b e n v o n O r a n g e n n e k t a r verbessert. Die O p t i m i e r u n g der Oxidation v o n N a - C y c l a m a t z u m Cyclohexylamin wurde mittels O r a n g e n n e k t a r vollzogen. Der O r a n g e n n e k t a r wurde bei 100 ~ 15-120 min oxidiert. N a c h 30 min war die U m s e t z u n g z u m Cyclohexylamin bereits abgeschlossen u n d erst nach 90 min D a u e r war ein leichter A b b a u des gebildeten Cyclohexylamins erkennbar. Aus diesem G r u n d e wurde die Reaktionszeit a u f 60 min limitiert. Die genauen M e t h o d e n b e d i n g u n g e n sind in Abschnitt Experimentelles beschrieben. Die Linearit~it der Kalibrierfunktion ist zwischen 0 , 1 1 0 0 m g C y c l o h e x y l a m i n / L (entsprechend 0,2-203 m g

522 Cyclamat Cyclamat

\ ohannisbeernektar auerkonserve Cornichons

/ ~ O b s t k o n s e r v e Rote GrOTe BrombeerkonfitOre I

I

I

I

I

0

5

iO

15

2C

Zeit

I 0

I 5

I 10 Zeit

( rain )

i 15

( rain )

Abb. 1. HPLC-Chromatogramme von Cyclamatanalysen im Orangennektar. A ohne Cyclamatzusatz, B mit Cyclamatzusatz von 1 mg/kg Nektar

Abb. 2. HPLC-Chromatogramme von Cyclamatanalysen in diversen Lebensmittelproben

Na-Cyclamat/L) gegeben. Der Korrelationskoeffizient der Kalibriergeraden ist 0,99995. Die Nachweisgrenze fiir Cyclohexylamin liegt bei 0,02 mg/L, daraus resultierend fiir Na-Cyclamat 0,04 mg/L. Die Bestimmungsgrenze ffir Na-Cyclamat ist auf Grund der hervorragenden chromatographischen Trennbedingungen auch in den Lebensmittelproben nur unwesentlich h6her (Abb. 1). Durch die Verdfinnung bei der Probenaufarbeitung ergibt sich je-

doch eine Erh6hung der Bestimmungsgrenze auf 0,5 mg Na-Cyclamat/L (ffir flfissige Proben), bzw. 5 mg Na-Cyclamat/kg (ffir feste Proben). Die Reproduzierbarkeit wurde innerhalb vier verschiedener Probenmatrices untersucht. Hierbei wurden von jedem Lebensmittel jeweils 10 vollst/indige Probenaufarbeitungen durchgefiihrt, diese doppelt vermessen, so dab jede Me6reihe 20 Einzelmessungen umfa6te (Ausnahme: Mandarine-, Cornichons-Reproduzierbarkeit; 5 Einw/igungen mit jeweils 2 Oxidationen, jede oxidierte Probe wurde 2fach bestimmt. Gesamtzahl der Messungen ebenso 20). Die festgestellten guten Reproduzierbarkeiten sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Oberpriifung der Richtigkeit erfolgte durch den definierten Zusatz von Na-Cyclamat (200 mg/L) zu einem reinen Orangennektar. Aus 10 Messungen ergab sich eine mittlere Wiederfindungsrate yon 90,0%. Des weiteren wurden verschiedene di/itetische Lebensmittel beziiglich ihres Na-Cyclamatgehaltes analysiert und die

Tabelle 1. Reproduzierbarkeit Produkt

Relative Standardabweichung %

Orangennektar Grapefruitnektar Obstkonserve Mandarin-Orangen Sauerkonserve Cornichons

+ 1,0 _ 2,2 ___2,6

Tabelle 2. Richtigkeit: Vergleich der analysierten Gehalte mit den Herstellerangaben

+2,0

Produkt

Gehalt Na-Cyclamat mg/kg HPLC mit Fluoreszenzdetektion

Orangennektar Grapefruitnektar Mandarinen Fruchtsaftgetr/ink Limonade Orange Multivitamin Mehrfruchtnektar Brombeerkonfitiire Obstkonserve Rote Griitze Johannisbeernektar Obstkonserve Rhabarber Pfirsich-MaracujaKonfitiire Obstkonserve Mandarin-Oralxgen Sauerkonserve Cornichons

Wiederfindungsrate %

Herstellerangaben

175,3 183,6 121,0

195,5 195,5 136,0

90 94 89

534,4 269,4

600,0 313,6

89 86

976,8 711,8 341,3 1629 1083

1364 909,1 340,9 1363 1364

72 78 100 120 79

701,7

909,1

77

271,3

272,7

100

523 steht hier eine M6glichkeit, durch eine matrixspezifische Dosierung des Oxidationsmittels die Wiederfindungsraten weiter zu verbessern.

Cyc2amat

l/

.i

Literatur

Umonade Orange < Multivitamin Mehrfrucht-

I

I

0

5

t 10 Zeit

( min

Mandarinen FruchtsaftgetrAnk I J.5

)

Abb.3. HPLC-Chromatogramme von Cyclamatanalysen in diversen Lebensmittelproben

festgestellten Werte mit den Herstellerangaben verglichen (Tabelle2). Die zugeh6rigen C h r o m a t o g r a m m e sind in Abb. 2 und 3 dargestellt. Die C h r o m a t o g r a m m e sind n u t qualitativ vergleichbar. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, konnte eine befriedigende Ubereinstimmung mit den Herstellerangaben erzielt werden. Die vorliegenden Ergebnisse bescheinigen der ausgearbeiteten Methode eine gute Verwendbarkeit. Die festgestellten Wiederfindungsraten sind zum Teil weniger befriedigend. Es ist bekannt, dab Oxidationsmittel die Derivatisierung mit O P A st6ren k6nnen. Eventuell be-

1. Acker L, Bergner KG, Diemair W, Heimann W, Kiermeier F, SchormiiUer J, Souci SW (1970) Handbuch der Lebensmittelchemie, VI. Springer, Berlin Heidelberg New York, S 733 2. Amtliche Sammlung yon Untersuchungsverfahren nach w35 LMBG (1988) L 57.22.99 - 2 3. Rymon Lipinski GW von, Britus HC (1979) Z Lebensm Unters Forsch 168:212-213 4. Miiller B, Ludwig J (1972) Mitteilungsbl GDC Fachgruppe Lebensmittelchem 26: 3-5 5. The Nordic Commitee on Food Analysis (1984) Z Lebensm Unters Forsch 179:453-454 6. Groebel W, Wessels A (1972) Dtsch Lebensm Rundsch 68 (12) 393 7. Zache U, Griinding H (1987) Z Lebensm Unters Forsch 184:503-509 8. GDCH Fortbildungkurs-Analytik von SiiBstoffen und Zuckeralkoholen, Vortrag D. Rohrdanz Staatl. Chem. Untersuchungsamt 2120 Liineburg: Probenvorbereitung und Nachweis yon Siil3stoffen in Lebensmitteln 9. Hermann A, Damawandi E, Wagrnann M (1983) J Chromatogr 280: 85-90 10. Schwedt G, Hauck M (1988) Z Lebensm Unters Forsch 187:127-129 11. Hauck M, K6bler H (1990) Z Lebensm Unters Forsch 191:322324 12. Schneider H, H6pker H (1985) Firmenpublikation HPLCAminos/iure Analyse. LKB Instrument, Gr/ifelfing 13. Legrer J, Schuster R (1987) Laborpraxis 9:922-925